CN108815094A - 一种细胞外基质冻干粉的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞外基质冻干粉的用途，所述细胞外基质冻干粉由新鲜哺乳动物组织，经漂洗，消毒，脱脂，漂洗，脱细胞，清洗，匀浆，提取，冻干所得。本发明细胞外基质冻干粉保留了动物组织中多型胶原、蛋白多糖和生长因子等多种活性物质，具有多种生物学活性，生物相容性好，可促进组织再生，具有抗氧化、修复、抗衰等优点，也可以诱导细胞的增殖、迁移和分化，还可作为结构支撑，具备填充功能。

Description

一种细胞外基质冻干粉的用途
技术领域
本发明涉及一种细胞外基质冻干粉的用途，具体涉及一种具有多种生物学活性、生物相容性好的细胞外基质冻干粉的用途。
背景技术
随着人类生活环境的不断恶化，人体每天都要承受来自外界的伤害。紫外线、废气污染、雾霾、生活压力等都会导致细胞受损。与此同时，人们的生活水平提高后，对生活品质的要求也越来越关注，比如对身体健康、医学美容等的需求。
环境污染带来的皮肤问题主要有五大类，干、斑、暗疮、皱纹、敏感。1、干：皮脂分泌少，皮肤干燥，缺少光泽，容易产生皱纹，起皮，有紧绷的感觉。主要原因是肌肤内结水含量低下，细胞容易受损害。深层次的原因就是紫外线照射，使皮肤表皮温度升高，表皮层的保湿因子，脂类物质受损，角质细胞受损，胶原减少，使皮肤细胞间隙增大，水分流失，造成缺水。另外一个原因也是由于不正常的生活习惯，压力过大和护理不当，环境气候干燥，导致肌肤皮质和汗水分泌减少，外层皮肤受到损伤，失去水分，造成干燥缺水。2、斑：环境大气污染，劣质化妆品，内分泌失调等因素，会刺激黑色素细胞的活跃，是黑色素增多，通过角质细胞上移到表皮，分布不均衡形成色斑。3、暗疮：油脂分泌增加角质层，过度角化，堵塞毛孔。表层有细菌、痤疮丙酸杆菌的侵扰，炎症不断产生。肌肤缺水，导致水分代谢异常，肌肤排泄不通畅，形成暗疮。4、皱纹：随着年龄的增加，真皮和表皮内的细胞和细胞间质含量减少，真皮层的胶原弹力纤维，胶原蛋白分解加大，网状纤维结构疏松，导致皮肤内部向外张力不断减少，胶原合成能力下降，纤维受损不能及时修复，使皮肤抵抗紫外线能力降低，令肌肤出现凹陷，局部沉陷，形成皱纹。另外紫外线的照射，会导致真皮胶原纤维的变性，使网状纤维结构失去弹性。使基底真皮细胞、包囊、表皮组织受损，肌肤屏障功能降低，细胞功能降低，肌肤合成胶原的总量减少。5、敏感：敏感肌肤是现在越来越多人面临的肌肤困扰，长期暴露于恶劣的气候或污染的环境中、过度使用碱性洁肤产品、在祛斑过程中采用过激途径“换肤”，长期使用药物(类固醇激素的外用药)的化妆品等，使得角质层变薄，抵抗力变弱。激素脱敏，防御系统机能下降，形成恶性依赖。本发明的细胞外基质冻干粉通过冻干的形式保存了多种生物学活性，且含有的胶原、蛋白多糖、生长因子等通过与不同的化妆品原料配伍，能够制备出多种改善上述的肌肤问题不同产品。
另外，整形美容在世界市场范围内已经形成为新兴的产业，美国、日本、韩国整形手术比例是中国的两倍左右。随着整体健康观念的形成，中国美容业的发展将快速提升，每年以超过20％的速度增长，2004年有100万人整过容，中国正规医美疗程量全球市场占有率为10％，已为全球第三大市场；2016年，全球医疗美容市场规模约为100亿美元，预计将以7.27％的年复合增长率增长，于2020年达到133.4亿美元规模。而中国未来5年内增速有望维持在40％以上，2017年的医疗美容市场规模可超过千亿人民币，行业前景广阔。
但是目前市场是以玻尿酸和肉毒素注射为主，填充是以医用硅橡胶、自体软骨、自体脂肪、膨体(聚四氟乙烯)等。自体组织由于来源于自身，一般不会出现排异现象和致敏，但是制作过程中塑形比较困难。固体硅橡胶等材料因为无毒无害，组织相容性相对稳定，是主要的医用假体隆鼻材料，制作过程中易于塑形，但是硅橡胶植入体植入体内后容易发生移位及磨损。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种细胞外基质冻干粉的用途，所述细胞外基质冻干粉含有多种活性成分，具有多种生物学活性，生物相容性好，可促进组织再生，具有抗氧化、修复、抗衰等优点，也可以诱导细胞的增殖、迁移和分化，还可作为结构支撑，具备填充功能。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种细胞外基质冻干粉在制备美白祛斑抗衰老护肤品中的用途，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取动物组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)步骤(1)获得的细胞外基质粗提物经过酶提取、尿素提取、酸提取或水提取后，离心取上清液或者过滤取滤液，然后通过透析法、有机沉淀法或者盐沉淀法获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(2)获得的细胞外基质提取物进行过滤或者离心，滤液或者上清液与单糖或二糖混合，混合液先于-20℃中冷冻3～6h，然后于-40～-80℃中冷冻干燥12～72h，即得所述细胞外基质冻干粉。
优选地，所述步骤(1)中动物组织选自小肠、神经、膀胱、皮肤、心包、肾脏、胎盘、脂肪或肌肉；
所述动物组织来源于猪、牛或羊。
优选地，所述步骤(2)中酶提取的方法为：将浓度为0.01～1％的酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，然后震荡12～36h。
更优选地，所述步骤(2)中酶提取的方法为：将浓度为0.1％的酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，然后震荡24h。
优选地，所述酶选自胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶中的至少一种。
优选地，所述步骤(2)中尿素提取的方法为：将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍中的至少一种混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为1～8mol/L、0.05～1mol/L、0.001～0.1mol/L、0.1～2mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，然后震荡6～24h。
更优选地，所述步骤(2)中尿素提取的方法为：将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍中的至少一种混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为2mol/L、0.1mol/L、0.01mol/L、1mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，然后震荡12h。
优选地，所述步骤(2)中酸提取的方法为：将酸与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，使混合物最终的pH值为1～3，然后震荡6～24h。
更优选地，所述步骤(2)中酸提取的方法为：将酸与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，使混合物最终的pH值为2，然后震荡12h。
优选地，所述酸选自盐酸、硫酸、醋酸、乳酸和乙醇酸中的至少一种。
优选地，所述步骤(2)中水提取的方法为：将pH值为4～7的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液中的至少一种与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，然后震荡6～24h。
更优选地，所述步骤(2)中水提取的方法为：将pH值为6.5的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液中的至少一种与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，然后震荡12h。
优选地，所述步骤(2)中透析法为：所述上清液或滤液使用截留分子量为1000～50000Da的透析袋，流水透析8～24h，至电导率为1.5um/s以下即可；
所述有机沉淀法为：向所述上清液或滤液中加入乙醇、异丙醇、丙醇和丙二醇中的至少一种，使其终浓度为60～90％，搅拌均匀即可；
所述盐沉淀法为：向所述上清液或滤液中加入氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙和硫酸镁中的至少一种，使其终浓度为0.5～4mol/L，搅拌均匀即可。
优选地，所述步骤(3)中滤液或上清液与单糖或二糖混合后，混合液中单糖或二糖的质量浓度为0.2～10％。
优选地，所述单糖或二糖选自甘露醇、海藻糖、葡萄糖、乳糖、果糖或蔗糖。
优选地，所述步骤(3)中混合液先于-20℃中冷冻4h，然后于-55℃中冷冻干燥60h，即得所述细胞外基质冻干粉。
优选地，所述步骤(3)中细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤。
本发明所述细胞外基质冻干粉可用于制备美白祛斑抗衰老护肤品。
本发明还提供了一种美白祛斑抗衰老护肤品，包含所述的细胞外基质冻干粉和护肤品领域可接受的辅料。
优选地，所述美白祛斑抗衰老护肤品包括洗面奶、洁面乳、洁面膏、面膜、面霜、乳液、爽肤水和精华液。
优选地，所述细胞外基质冻干粉在所述美白祛斑抗衰老护肤品中的质量百分含量为0.1～10％。
本发明还提供了所述细胞外基质冻干粉在制备整形美容产品中的用途。
本发明所述细胞外基质冻干粉可用于制备整形美容产品。
本发明还提供了一种整形美容产品，包含所述的细胞外基质冻干粉和整形美容产品领域可接受的辅料。
优选地，所述整形美容产品包括除皱产品、眼部修复产品、疤痕修复产品、填充材料、美白针剂、胶原蛋白制剂和玻尿酸产品。
本发明还提供了所述细胞外基质冻干粉在制备细胞培养产品中的用途。
本发明所述细胞外基质冻干粉可用于制备细胞培养产品。
优选地，所述细胞包括微生物和动物细胞。
优选地，所述细胞培养产品为细胞培养基。
本发明还提供了一种细胞培养基，包含所述的细胞外基质冻干粉和基础培养基。
优选地，所述细胞外基质冻干粉在细胞培养基中的浓度为20～2000μg/mL。
更优选地，所述细胞外基质冻干粉在细胞培养基中的浓度为100～500μg/mL。
本发明还提供了所述细胞外基质冻干粉在制备治疗创面修复药物中的用途。
本发明所述细胞外基质冻干粉可用于制备治疗创面修复的药物。
本发明还提供了一种治疗创面修复的药物，包含所述的细胞外基质冻干粉和药物学可接受的载体。
优选地，所述药物剂型包括溶液型、混悬型、乳浊液型、软膏、乳膏、凝胶剂、酊剂、擦剂、醑剂、粉剂、油剂、糊剂、硬膏剂、涂膜剂和气雾剂。
本发明还提供了所述细胞外基质冻干粉在制备治疗创面修复医疗器械中的用途。
本发明所述细胞外基质冻干粉可用于制备治疗创面修复的医疗器械。
本发明还提供了一种治疗创面修复的医疗器械，包含所述的细胞外基质冻干粉和医疗器械领域可接受的辅料。
优选地，所述医疗器械包括慢性创面修复敷料、生物型创面基质材料和喷剂敷料。
由于细胞外基质含有多种活性成分，尤其是胶原等大分子物质，对于生物活性的保存具有很高的要求，因此，细胞外基质产品必须能保持细胞外基质的理化特性和生物活性。本申请发明人发现，冻干法能有效的防止细胞外基质理化及生物特性的改变，对其结构和特征的损伤较小，蛋白质不会变性和失去活性；其次，冻干粉在干燥后形态疏松，颜色基本不发生改变，加水后能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性；第三，细胞外基质经冻干后水分含量非常低，其稳定性提高，受污染的机会减少，方便运输和长期保存。
本发明所述细胞外基质冻干粉保留了动物组织中多型胶原、蛋白多糖、生长因子等多种活性物质，具有多种生物学活性，生物相容性好，可促进组织再生，具有抗氧化、修复、抗衰等优点，也可以诱导细胞的增殖、迁移和分化，还可作为结构支撑，具备填充功能。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明所述细胞外基质冻干粉通过冻干的形式保存了多种生物学活性，且含有的胶原、蛋白多糖、生长因子等，可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必须的养分，使皮肤中的胶原蛋白活性增强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增强循环，滋润皮肤，能有效解决干燥、色斑、暗疮、皱纹、敏感等多种肌肤问题，具有很好的补水保湿、修复脱敏和祛斑抗衰功效；(2)本发明所述细胞外基质冻干粉富含多种生物活性物质，通过加入其它辅料，可以制备成结构与人体组织相似，生物相容性好的美容整形产品，具有植入后不引起免疫排斥反应，可诱导组织再生等优势；(3)本发明所述细胞外基质冻干粉含有多种生物活性物质，可以促进细胞、微生物的生长；(4)本发明所述细胞外基质冻干粉可以输送给组织生长因子、蛋白多糖等生物活性物质，可以诱导细胞的增殖、迁移和分化，具有很好的组织修复的功能。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪小肠组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将浓度为0.01％的酸性蛋白酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:20混匀，震荡36h后，离心取上清液，使用截留分子量为50000Da的透析袋，流水透析24h，至电导率为1.5um/s，获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与甘露醇混合，使混合液中甘露醇的浓度为10％，混合液先于-20℃中冷冻6h，然后于-40℃中冷冻干燥72h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例2
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪心包组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将浓度为1％的胃蛋白酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:5混匀，震荡12h后，过滤取滤液，向滤液中加入乙醇，使其终浓度为60％，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行离心，上清液与葡萄糖混合，使混合液中葡萄糖的浓度为0.2％，混合液先于-20℃中冷冻3h，然后于-80℃中冷冻干燥12h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例3
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取牛膀胱组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将浓度为0.1％的中性蛋白酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，震荡24h后，离心取上清液，向上清液中加入氯化钠，使其终浓度为0.5mol/L，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与海藻糖混合，使混合液中海藻糖的浓度为1％，混合液先于-20℃中冷冻4h，然后于-55℃中冷冻干燥60h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例4
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取羊神经组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为1mol/L、1mol/L、0.1mol/L、0.1mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:5混匀，震荡24h后，离心取上清液，向上清液中加入异丙醇，使其终浓度为90％，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与葡萄糖混合，使混合液中葡萄糖的浓度为2.5％，混合液先于-20℃中冷冻4h，然后于-80℃中冷冻干燥20h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例5
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪皮肤组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为8mol/L、0.05mol/L、0.001mol/L、2mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:20混匀，震荡6h后，过滤取滤液，使用截留分子量为8000Da的透析袋，流水透析8h，至电导率为1.3um/s，获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行过滤，滤液与乳糖混合，使混合液中乳糖的浓度为4％，混合液先于-20℃中冷冻6h，然后于-56℃中冷冻干燥70h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例6
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪脂肪组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为2mol/L、0.1mol/L、0.01mol/L、1mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，震荡12h后，过滤取滤液，向滤液中加入氯化钾，使其终浓度为4mol/L，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行离心，上清液与果糖混合，使混合液中果糖的浓度为5％，混合液先于-20℃中冷冻4.5h，然后于-60℃中冷冻干燥60h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例7
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪心包组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将盐酸与细胞外基质粗提物按照重量比为1:5混匀，使混合物最终的pH值为1，震荡24h后，离心取上清液，向上清液中加入硫酸钠，使其终浓度为2mol/L，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行使用0.8μm微孔滤膜过滤，滤液与海藻糖混合，使混合液中海藻糖的浓度为10％，混合液先于-20℃中冷冻3h，然后于-58℃中冷冻干燥55h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例8
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取牛膀胱组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将醋酸和盐酸胍与细胞外基质粗提物按照重量比为1:20混匀，使混合物最终的pH值为3，震荡6h后，离心取上清液，使用截留分子量为1000Da的透析袋，流水透析15h，至电导率为1.2um/s，获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与果糖混合，使混合液中果糖的浓度为6.5％，混合液先于-20℃中冷冻5h，然后于-75℃中冷冻干燥12h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例9
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪胎盘组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将盐酸和醋酸与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，使混合物最终的pH值为2，震荡12h后，过滤取滤液，向滤液中加入丙醇，使其终浓度为70％，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行离心，上清液与葡萄糖混合，使混合液中葡萄糖的浓度为7％，混合液先于-20℃中冷冻4h，然后于-48℃中冷冻干燥30h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例10
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取羊肌肉组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将pH值均为4的磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液与细胞外基质粗提物按照重量比为1:20混匀，震荡24h后，离心取上清液，使用截留分子量为30000Da的透析袋，流水透析10h，至电导率为1um/s，获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与甘露醇混合，使混合液中甘露醇的浓度为8.5％，混合液先于-20℃中冷冻6h，然后于-52℃中冷冻干燥25h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例11
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取牛心包组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将pH值均为7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液与细胞外基质粗提物按照重量比为1:5混匀，震荡6h后，离心取上清液，向上清液中加入氯化钠和硫酸镁，使其终浓度为3mol/L，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行离心，上清液与蔗糖混合，使混合液中蔗糖的浓度为0.5％，混合液先于-20℃中冷冻3h，然后于-45℃中冷冻干燥72h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例12
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取羊神经组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将pH值均为6.5的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液和醋酸盐缓冲液与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，震荡12h后，离心取上清液，向上清液中加入丙二醇，使其终浓度为80％，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与甘露醇混合，使混合液中甘露醇的浓度为9％，混合液先于-20℃中冷冻5h，然后于-40℃中冷冻干燥70h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例13
本实施例以实施例1中的细胞外基质冻干粉为例，检测本发明细胞外基质冻干粉中的部分活性成分。
1、胶原检测
将本实施例1制备的细胞外基质冻干粉用生理盐水配制成浓度为1mg/mL的溶液。采用ELISA法检测溶液中总胶原和具有代表性的Ⅳ型胶原的含量。结果显示总胶原含量为0.94mg/mL，Ⅳ型胶原的含量为0.35mg/mL。
2、透明质酸检测
将本实施例1制备的细胞外基质冻干粉用生理盐水配制成浓度为1mg/mL的溶液。采用ELISA法检测溶液中透明质酸的含量。结果显示透明质酸的含量为0.24mg/mL。
3、生长因子检测
将本实施例1制备的细胞外基质冻干粉用生理盐水配制成浓度为1mg/mL的溶液。采用ELISA法检测浸提液中碱性生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量，结果显示，bFGF含量为5.90±4.01pg/mg，VEGF含量为70.14±23.37ng/mg，TGF-β含量为11.93±4.31pg/mg，TNF-α含量为9.11±5.62pg/mg。
由上述结果可知，本发明细胞外基质冻干粉中至少包含胶原、Ⅳ型胶原、透明质酸、bFGF、VEGF、TGF-β和TNF-α等多种活性物质，具有多种生物学活性。
实施例14
本实施例以实施例3制备得到的细胞外基质冻干粉为例，研究本发明细胞外基质冻干粉的补水保湿、修复脱敏和祛斑抗衰功效。
所述细胞外基质冻干粉的使用方法：按照一定的浓度将溶媒注入实施例3制备的冻干粉中，溶解后均匀涂抹于面部。
所述细胞外基质冻干粉的补水保湿、修复脱敏和祛斑抗衰效果的检测方法：
1、补水保湿
按照2mg/mL浓度将纯水注入本发明细胞外基质冻干粉中，溶解后均匀涂抹于面部。受试部位测试基础值前2-3天不能使用化妆品或外用药品，1-3小时不能接触水。试验前，受试者使用香皂清洁双手前臂内侧，用干的面巾纸擦拭干净。受试者双手前臂内侧做好测试区域标记，包括空白对照区(b)和样品使用区(s)。试验区域面积3*3cm2，每个区域之间间隔2cm。正式测试前在恒温恒湿(温度：21±0.5℃；湿度：50％±2％)的房间内静坐30min。
测试基础值后，连续天，每天两次在样品使用区均匀涂抹细胞外基质冻干粉溶液。空白对照区不做任何处理。使用样品1、7、14、28、42天后，分别使用皮肤角质层水分量测试仪Corneometer和皮肤水分流失测试仪Tewameter测试两个区域皮肤角质层水分含量(CAP)和皮肤经表皮失水率(TEWL)。结果如表1所示。
表1皮肤角质层水分含量和经表皮失水率
保湿是通过防止皮肤内水分的丢失和吸收外界环境的水分来达到保持皮肤内含有一定水分的目的。通过上述实验检测可以得出，志愿者在使用细胞外基质冻干粉一段时间后，可以提高皮肤的含水量，减少皮肤内的水分经表皮丢失，起到补水保湿的效果。
2、修复脱敏
培养人角质细胞，由UV照射引发炎症后，实验组加入本发明细胞外基质冻干粉，加入量为2mg/mL；对照组加入相同剂量的地塞米松。培养一定的时间后，采用ELISA法测试细胞上清液中白细胞介素-1α、白细胞介素-8的含量，通过和对照组比较来判断细胞外基质冻干粉是否有促进皮肤的脱敏。
培养人成纤维细胞，由UV照射引发炎症后，实验组加入细胞外基质冻干粉，加入量为2mg/mL；对照组加入相同剂量的胶原。培养一定的时间后，采用ELISA法测试细胞上清液中胶原蛋白的含量，通过和对照组比较来判断细胞外基质冻干粉是否有促进皮肤的修复。
经检测，人角质细胞受到UV照射后，本发明细胞外基质冻干粉能使白细胞介素-1α和白细胞介素-8的释放量下降73％和85％。人成纤维细胞受到UV照射后，与对照组相比，本发明细胞外基质冻干粉能使胶原蛋白的生成量提高78％。说明本发明的细胞外基质冻干粉具有促进受损皮肤进行修复和脱敏的功效。
3、祛斑
酪氨酸酶是黑色素合成途径中的限速酶，主要通过影响酪氨酸转化成多巴，多巴氧化成为多巴醌来影响黑色素的生成。通过计算细胞外基质冻干粉对酪氨酸酶的抑制率与市面上常用的熊果苷和曲酸进行对比，来判断是否有祛斑美白的效果。
本实施例研究本发明细胞外基质冻干粉对酪氨酸酶的抑制率的实验方法为：取0.1mL浓度为2mg/mL的细胞外基质冻干粉溶液和相同浓度的丙硫氧嘧啶作为对照组，再同时加入1mL浓度为1.5mmol/L的左旋多巴和1.8mL的PBS缓冲液，在25℃水浴锅中水浴10min。再加入0.1mL酪氨酸酶溶液，于475nm波长下测定吸光度值，读取孵育0.5min和1.0min的吸光度，按照如下公式计算酪氨酸酶的抑制率。
抑制率(％)＝(A-B)/A*100
式中：
A——空白对照组0.5min和1min吸光度值之差；
B——实验组或阳性对照组0.5min和1min吸光度值之差。通过实验得出，本发明细胞外基质冻干粉对酪氨酸酶的抑制率为79.5％，优于熊果苷和曲酸，具体的结果见表2。说明本发明细胞外基质冻干粉具有祛斑美白的功效。
表2三种物质对酪氨酸酶的抑制率
4、抗衰老
皮肤中的弹性纤维由弹性蛋白和微原纤维构成，分布于真皮及皮下组织，使皮肤具有弹性。弹性蛋白酶是胰凝乳蛋白酶家族中的一员，会降解弹性蛋白，造成表皮中连接组织的损失，从而导致皮肤衰老，皱纹和光老化的产生。通过测定细胞外基质冻干粉对弹性蛋白酶的抑制率与空白对照组进行对比，来判断是否有抗衰的效果。
本实施例研究本发明细胞外基质冻干粉对弹性蛋白酶的抑制率的实验方法为：将100μL的0.2mol/L的tris-HCl缓冲液，25μL的10mmol/L的N-甲氧基丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-4-硝基苯胺和50μL的2mg/mL的细胞外基质冻干粉混匀，在25℃条件下孵育15min；然后加入25μL的0.3U/mL的弹性蛋白酶继续孵育15min。然后在410nm条件下检测OD值，并通过下列公式计算弹性蛋白酶抑制率：
抑制率(％)＝对照组OD值-实验组OD值/对照组OD值*100。
通过实验得出，细胞外基质冻干粉对弹性蛋白酶的抑制率为68.2％。说明本发明细胞外基质冻干粉具有抗衰的功效。
由上述实验结果可知，本发明所述细胞外基质冻干粉能有效解决干燥、色斑、暗疮、皱纹、敏感等多种肌肤问题，具有很好的补水保湿、修复脱敏和祛斑抗衰功效。本发明其他实施例制备得到的细胞外基质冻干粉的补水保湿、修复脱敏和祛斑抗衰功效与本实施例类似，具体数据省略。
实施例15
本实施例以实施例6制备得到的细胞外基质冻干粉为例，研究本发明所述细胞外基质冻干粉促进动物细胞生长的效果。
(一)实验方法
于55cm2无菌培养皿中常规培养小鼠成纤维细胞3T3，离心后重悬于培养基中，以5*104/mL的密度每孔100μL接种于96孔板，细胞培养板外周加入100μL PBS。置于37℃、湿度90％、5％CO2浓度的培养箱孵育24±1h。
培养24h后，去除上清液，用不含胎牛血清的DMEM培养基配制20μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL和2000μg/mL的细胞外基质冻干粉溶液作为实验组，空白对照组仅含培养基，阳性对照组为含10％胎牛血清的DMEM培养基。每个浓度设置6个平行，每孔添加100μL受试物、置于37℃、湿度90％、5％CO2浓度的培养箱孵育48±1h。
48±1h孵育结束后，每孔加入20μLMTT溶液，于37℃避光孵育3h，弃液，每孔100μL加入二甲基亚砜(DMSO)摇匀。在酶标仪上测定570nm波长下的吸光度(OD)值。
(二)实验结果
实验结果如表3所示：
表3细胞外基质冻干粉及对照组OD值
由上述实验结果可知，在无血清DMEM培养基中添加本发明细胞外基质冻干粉，细胞能够正常生长，说明本发明细胞外基质冻干粉可代替胎牛血清用于培养细胞。本发明其他实施例制备得到的细胞外基质冻干粉对动物细胞的培养效果与本实施例类似，具体数据省略。
实施例16
本实施例以实施例8制备得到的细胞外基质冻干粉为例，研究本发明所述细胞外基质冻干粉治疗创面修复的效果。
(一)实验方法
选30只大鼠，每只四个创面，每只大鼠的左上和右上(靠经头部的)创面用于试验组；左下和右下(靠经尾部的)创面用于对照组；试验组，创面外敷细胞外基质冻干粉和硅胶膜外层覆盖；对照组，创面用硅胶膜覆盖，外层用凡士林纱布覆盖，不做其他治疗。各组创面于制备当天均用消毒纱布包扎固定；于创面形成后第2天开始，按分组设计创面直接外敷相应材料于创面，再用无菌凡士林纱布覆盖，纱布四角缝1针固定。空白对照组只用凡士林纱布覆盖。
(二)实验结果
伤后第3天试验组大鼠创面即开始收缩，此后创面缩小进程较快，至伤后第21天创面基本愈合。对照组大鼠则不同，术后第3天有些个体出现创面增大或收缩不明显，而随后的愈合过程亦较为缓慢，至伤后第28天后基本愈合。
统计各时间点两组大鼠创面愈合率，结果见表4，在各个时间点上，试验组创面愈合平均面积明显大于对照组。
表4时间点动物创面愈合率的比较
注：与对照组比较：*P＜0.05。
由上述实验结果可知，本发明所述细胞外基质冻干粉能有效促进创面修复愈合。本发明其他实施例制备得到的细胞外基质冻干粉促进创面修复愈合的效果与本实施例类似，具体数据省略。
实施例17
本实施例以实施例9制备得到的细胞外基质冻干粉为例，研究本发明所述细胞外基质冻干粉对眼部的修复效果。
将所述细胞外基质冻干粉按以下配方制备得到眼部修复精华：细胞外基质冻干粉0.3g、六胜肽0.1g、海藻糖3.0g、维生素E1.5g、尿囊素2.5g、甘油5.0g和蒸馏水37.6g。
对照组眼部精华配方为：六胜肽0.3g、海藻糖3.0g、维生素E1.6g、尿囊素2.5g、甘油5.0g和蒸馏水37.6g，即不含本发明所述细胞外基质冻干粉。
(一)检测方法
选取60名女性，随机分成A、B和C三组，A组试用含有本发明细胞外基质冻干粉的眼部精华、B组试用不含本发明细胞外基质冻干粉的对照组眼部精华，C组不使用任何眼部修复产品。试验人员每天早晚将适量眼部精华均匀涂抹在眼部周围，连续涂抹60天。并对使用效果进行观察，结果见表5。
(二)检测结果
表5细胞外基质冻干粉眼部修复结果
由上述实验结果可知，本发明所述细胞外基质冻干粉制备的修复精华能够通过滋润保湿、淡化细纹和淡化黑眼圈来有效进行眼部修复。本发明其他实施例制备得到的细胞外基质冻干粉对眼部的修复效果与本实施例类似，具体数据省略。
实施例18
本实施例提供一种下巴填充材料，所述下巴填充材料含有实施例11制备得到的细胞外基质冻干粉，配方如下：将细胞外基质冻干粉与自体富血小板血浆按照1g:3mL混合均匀作为下巴填充材料。
实施例19
本实施例提供一种美白针剂，所述美白针剂含有以实施例12制备得到的细胞外基质冻干粉细胞外基质冻干粉，配方如下：细胞外基质冻干粉0.9g、小分子胶原多肽0.2g、熊果苷0.2g、海藻糖1.5g、维生素E0.2g、尿囊素1.0g和甘油6.0g，用90％的注射用水溶解，磁力搅拌至完全溶解；向配好的溶液中加入0.1％的药用活性炭，室温搅拌20分钟，用0.22μm滤膜过滤两次，灌装后进行冷冻干燥冻干，即得所述美白针剂。
同时对所述的美白针剂的美白效果进行检测，具体如下：
(一)检测方法
以自愿为原则，选择有美白淡斑需求的客户，共40例，分为A和B两组，A组使用含有本发明所述细胞外基质冻干粉的美白针剂，B组使用不含细胞外基质冻干粉，其他成分及配制方法均相同的美白针剂。将美白针剂用注射用水溶解后，均匀涂抹于面部，指腹按摩促进吸收。早晚各一次，连续涂抹60天。
(二)检测结果
检测结果如表6所示：
表6皮肤美白评价结果
由上述实验结果可知，本发明所述细胞外基质冻干粉制备的美白针剂能有效对肌肤进行美白，且无副作用。本发明其他实施例制备得到的细胞外基质冻干粉制备的美白针剂的美白效果与本实施例类似，具体数据省略。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (17)

1.一种细胞外基质冻干粉在制备美白祛斑抗衰老护肤品中的用途，其特征在于，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取动物组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)步骤(1)获得的细胞外基质粗提物经过酶提取、尿素提取、酸提取或水提取后，离心取上清液或者过滤取滤液，然后通过透析法、有机沉淀法或者盐沉淀法获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(2)获得的细胞外基质提取物进行过滤或者离心，滤液或者上清液与单糖或二糖混合，混合液先于-20℃中冷冻3～6h，然后于-40～-80℃中冷冻干燥12～72h，即得所述细胞外基质冻干粉。
2.一种美白祛斑抗衰老护肤品，其特征在于，包含权利要求1所述的细胞外基质冻干粉和护肤品领域可接受的辅料。
3.根据权利要求2所述的美白祛斑抗衰老护肤品，其特征在于，所述护肤品包括洗面奶、洁面乳、洁面膏、面膜、面霜、乳液、爽肤水和精华液。
4.根据权利要求2或3所述的美白祛斑抗衰老护肤品，其特征在于，所述细胞外基质冻干粉在护肤品中的质量百分含量为0.1～10％。
5.一种细胞外基质冻干粉在制备整形美容产品中的用途，其特征在于，所述细胞外基质冻干粉制备方法如权利要求1所述。
6.一种整形美容产品，其特征在于，包含权利要求5所述的细胞外基质冻干粉和整形美容产品领域可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的整形美容产品，其特征在于，所述整形美容产品包括除皱产品、眼部修复产品、疤痕修复产品、填充材料、美白针剂、胶原蛋白制剂和玻尿酸产品。
8.一种细胞外基质冻干粉在制备细胞培养产品中的用途，其特征在于，所述细胞外基质冻干粉制备方法如权利要求1所述。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述细胞包括微生物和动物细胞。
10.一种细胞培养基，其特征在于，包含权利要求8所述的细胞外基质冻干粉和基础培养基。
11.根据权利要求10所述的细胞培养基，其特征在于，所述细胞外基质冻干粉在细胞培养基中的浓度为20～2000μg/mL。
12.一种细胞外基质冻干粉在制备治疗创面修复药物中的用途，其特征在于，所述细胞外基质冻干粉制备方法如权利要求1所述。
13.一种治疗创面修复的药物，其特征在于，包含权利要求12所述的细胞外基质冻干粉和药物学可接受的载体。
14.根据权利要求13所述的治疗创面修复的药物，其特征在于，所述药物剂型包括溶液剂、混悬剂、乳浊液剂、软膏、乳膏、凝胶剂、酊剂、擦剂、醑剂、粉剂、油剂、糊剂、硬膏剂、涂膜剂和气雾剂。
15.一种细胞外基质冻干粉在制备治疗创面修复医疗器械中的用途，其特征在于，所述细胞外基质冻干粉制备方法如权利要求1所述。
16.一种治疗创面修复的医疗器械，其特征在于，包含权利要求15所述的细胞外基质冻干粉和医疗器械领域可接受的辅料。
17.根据权利要求16所述的治疗创面修复的医疗器械，其特征在于，所述医疗器械包括慢性创面修复敷料、生物型创面基质材料和喷剂敷料。
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