CN109431856A - 一种模拟细胞外基质的冻干产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种模拟细胞外基质的冻干产品及其制备方法。该冻干产品主要由透明质酸、胶原蛋白、蛋白多糖和细胞因子组成。本发明所述的冻干产品具有良好的抗敏修复作用。本发明采用了真空冷冻干燥技术，使得以上活性成分在无防腐剂的情况下能够长期稳定保存，并发挥协同作用给皮肤细胞提供良好的微环境。各种成分复合配比后与单一成分比较，对外界水分、热、紫外线的影响具有更好的抵御作用，从而具有更佳的皮肤抗敏效果。

Description

一种模拟细胞外基质的冻干产品

技术领域

本发明属于化妆品配方领域，具体涉及一种模拟细胞外基质(extracellularmatrix,，ECM)的冻干产品及其制备方法。

背景技术

细胞外基质是由细胞合成并分泌，围绕细胞相互作用的一类大分子物质，主要由四大类分子组成：胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白(蛋白多糖)及多糖(透明质酸)。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动，构成了细胞生存所必须的微环境，并且通过其分子间不同的精细巧妙缠结交织，构成各种各样的精美三维立体结构，赋予肌肤弹性、抗张强度，使肌肤看起来饱满、充满活力。胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，约占人体蛋白质总量的30％以上，是细胞外基质中的框架结构，是由成纤维细胞合成的最强韧的人体蛋白质之一，胶原蛋白和弹性蛋白是细胞外基质的结构蛋白，分别赋予胞外基质强度和韧性，使得皮肤具有弹韧性。透明质酸一般存在于胶原与弹力纤维的末稍和接合处，对细胞成长、粘着有着相当重要的作用。透明质酸具有特殊的保水作用，目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。纤维连接蛋白(纤连蛋白)广泛存在于动物组织和组织液中，是一种大分子糖蛋白，分子量约为450KD，具有多种生物活性。在纤维连接蛋白的很多功能中，最基本最重要的一项是促进细胞的黏连生长，而细胞的黏连是机体结构得以维持、细胞生长完成的必要条件。然而，纤维连接蛋白分子量较大，不利于肌肤吸收。

随着环境污染日益加重和精神压力增加等，敏感性皮肤发生率逐渐升高，越来越受到人们的重视。敏感性皮肤(sensitive skin，SS)特指皮肤在生理或病理条件下发生的一种高反应状态，主要发生于面部，临床表现为受到物理、化学、精神等因素剌激时皮肤易出现灼热、剌痛、瘙痒及紧绷感等主观症状，伴或不伴红斑、鳞屑、毛细血管扩张等客观体征。修复受损的皮肤屏障是治疗敏感性皮肤的重要措施，宜选用经过试验和临床验证，安全性好的医学护肤品。因此，如何获得安全、有效的抗敏感配方一直是困扰护肤行业的课题。

在日本上市的生胶原冻干絮主要包含生胶原蛋白、寡肽-1、寡肽-3、光果甘草、海藻糖、母菊花、虎杖等活性成分，通过纤维细胞刺激胶原蛋白合成，能修复肌肤的三维结构，增加皮肤的组织量、凝聚力和弹性，防止肌肤过早松弛和皱纹的生成，同时具有抗氧化效果，实现对皮肤表皮层、真皮层的重建。然而，该产品售价昂贵，而且来源受限。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种模拟细胞外基质(extracellular matrix,，ECM)的冻干产品，由多糖(优选透明质酸)、胶原蛋白、糖蛋白、细胞因子等成分混合而成。所述的透明质酸是一种多功能基质，能够模拟细胞外基质ECM中的多糖成分，具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质。所述的胶原蛋白是细胞外基质ECM中的主要成分，由三条多肽链构成，遍布于各器官和组织，是重要的结构蛋白。所述的糖蛋白主要是结构糖蛋白，为细胞外基质中的不溶性大分子糖蛋白，如各种非胶原糖蛋白(纤维连接蛋白、层粘连蛋白等)。它们的功能不仅仅是作为细胞外基质的结构成分起支持、连接及缓冲作用，更重要的是参与细胞的识别、粘着及迁移，并调控细胞的增殖及分化。所述的细胞因子包括细胞生长因子、转化生长因子、干扰素等，是一种多功能强力细胞因子，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能。

本发明所述的冻干产品具有良好的抗敏修复作用。本发明采用了真空冷冻干燥技术，使得以上活性成分在完全不用防腐剂、杀菌剂、添加剂等化学成分的情况下能够稳定长期保存，发挥协同作用，给皮肤细胞提供良好的微环境，并且各种成分复合配比后与单一成分比较，对外界水分、热、紫外线的影响具有更好的抵御作用，具有更好的皮肤抗敏效果。

本发明的冻干絮状产品与上述日本产品比较的一个优势是模拟了皮肤细胞生存的微环境组成，不复配其它的植物提取物，具备更好皮肤的相似性，对敏感肌修复来说，可减少外界产品刺激，有利于敏感肌表皮的健康重建。

附图说明

图1显示根据本发明的抗敏修复型冻干絮产品的外观图片：(A)、(B)、(C)分别为实施例1、实施例2、实施例3制备的抗敏修复型冻干絮的样品图片；

图2显示根据本发明实施例3的多重抗敏修复型冻干絮组合物对NIH/3T3细胞的促增殖活性；

图3显示根据本发明实施例3的多重抗敏修复型冻干絮组合物对嗜碱性白血病细胞RBL-2H3的抗敏感测试结果；

图4显示根据本发明实施例3的多重抗敏修复型冻干絮组合物对NIH/3T3细胞迁移的影响；

图5显示实施例3制备的多重抗敏修复型冻干絮组合物的抗炎抗敏功效的评价，其中(A)为使用实施例3产品前VISIA图像；(B)为使用实施例3的产品4W(4周)后VISIA图像；(C)为使用实施例3产品前VISIA图像；(D)为使用实施例3的产品4W后VISIA图像；(E)为使用实施例3的产品前皮肤镜图像(放大倍数为50×)；(F)为使用实施例3的产品4W后皮肤镜图像(放大倍数为50×)；(G)为使用实施例3的产品4W后红色素变化情况；和

图6显示根据本发明的多重修复型冻干絮组合物的滋润保湿功效评价的Visia评测结果，其中(A)为使用实施例4的产品的水分测试情况；(B)为使用实施例4的经皮水分丢失量。

具体实施方式

本发明通过模拟ECM的活性成分制备了一种冻干絮状或粉状产品(化妆品)，其中透明质酸既作为冻干产品的基质也是活性成分；聚合物分子间相互连结，形成空间网状结构，将细胞生长因子等活性成分浸入这个网状结构的孔隙中，一方面保护生长因子的活性，另一方面，对生长因子的释放起到缓释的作用。如后文实施例中实验证明，所述冻干产品(化妆品)具有皮肤抗敏修复、促进细胞增殖、抗炎和滋润保湿功效。

根据本发明的一个方面，提供一种模拟细胞外基质的化妆品，其包含或基本上由以下组成：多糖；胶原蛋白；糖蛋白；和细胞因子。

根据本发明的一个具体实施方案，所述化妆品为冻干形式，优选为絮状或粉状。

在本发明中，优选组合物中各组分含量(除了配料“水”)是按照干重计算。术语“干重”在本文中意思是含水量低于5％(wt)，优选低于4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％。

根据本发明的一个具体实施方案，在化妆品中，所述多糖、胶原蛋白、糖蛋白和细胞因子的重量比率为：多糖0.1-0.5％:胶原蛋白0.5-1％:糖蛋白0.01-0.05‰:细胞因子0.01‰-0.5‰。

根据本发明的一个具体实施方案，在化妆品中，所述多糖选自由以下组成的组：透明质酸、硫酸软骨素、海藻多糖、硫酸角质素、硫酸肝素、和它们的盐，优选透明质酸或其盐，更优选透明质酸是由如下重量份数的组分组成：水解透明质酸10-20份，透明质酸钠30-40份。

根据本发明的一个具体实施方案，在化妆品中，其中所述胶原蛋白为不同分子量的水溶性胶原，兼具了EMC框架结构的基质成分和营养细胞的活性成分功能，优选所述水溶性胶原为小分子胶原蛋白。

根据本发明的一个具体实施方案，在化妆品中，所述糖蛋白选自由以下组成的组：层粘连蛋白、蛋白多糖、纤维连接蛋白、RGD三肽或它们的组合，优选蛋白多糖，特别是酵母发酵得到的糖基化类人胶原蛋白。蛋白多糖与糖蛋白很容易根据性质、含量和糖侧链的排列区别开来。糖蛋白在重量上有1％-60％为由短的分支寡链所组成的碳水化合物。蛋白多糖的碳水化合物的含量可高达95％以上，大都形成不分支的长糖胺聚糖链，每条链大约有80个糖残基长。因此蛋白多煻分子要比糖蛋白大很多。蛋白多糖以蛋白为核心，糖蛋白以多糖为主体。常见蛋白多糖有聚集素，乙聚糖，装饰素，渗滤素，丝甘素，联合素-1。常见糖蛋白有酶、激素、载体、凝集素、抗体等。糖蛋白连接蛋白方式有N-连接和O-连接两种。

根据本发明的一个具体实施方案，在化妆品中，所述细胞因子选自由以下组成的组：酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、重组人角质细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、干扰素、趋化因子、转化生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)的一种或多种。

根据本发明的一个具体实施方案，在化妆品中，所述细胞因子是由如下重量份比例的组分组成：bFGF 0-20份、EGF 0-20份、KGF 0-20份、TGF-β0-20份、PDGF 0-20份和IGF0-20份。

根据本发明的一个具体实施方案，在化妆品中，不包含任何防腐剂、杀菌剂和/或添加剂。

根据本发明的另一方面，提供一种制备根据本发明任一实施方案所述的化妆品的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将多糖溶于水中，于室温溶胀过夜，高压灭菌(121℃，20min)，冷却到室温，得到溶液A；

(2)将胶原蛋白溶于水中后，加入糖蛋白和细胞因子，得到溶液B；

(3)将溶液B过滤除菌，得溶液C；和

(4)在无菌条件下将溶液A和溶液C混合，于﹣15℃～﹣25℃预冻0.5～24小时、﹣70℃～﹣80℃预冻0.5～1.5小时后，在冻干机中﹣25℃～﹣75℃真空冷冻干燥13～25小时，得到所需冻干絮产品。

如本文使用的术语“多糖”是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。由不同的单糖分子缩合而成的多糖，叫做不均一多糖。有一些不均一性多糖由含糖胺的重复双糖系列组成，称为糖胺聚糖(glyeosaminoglycans，GAGs)，又称粘多糖。糖胺聚糖是蛋白聚糖的主要组分，按重复双糖单位的不同，糖胺聚糖可以选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素和硫酸肝素等。本发明的多糖优选选自这些糖胺聚糖，并且还可以是海藻多糖。另外，本发明的多糖还可以以盐的形式存在，例如碱金属盐，特别是钠盐、钾盐等。

在根据本发明的一个优选实施方案中，模拟细胞外基质的化妆品中的多糖为透明质酸或其钠盐。透明质酸是一种高分子的聚合物，是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1,4-配糖键相连。透明质酸的分子量从5千到2千万道尔顿。优选透明质酸由水解透明质酸和透明质酸钠组成。更优选地，透明质酸是由如下重量份数的组分组成：水解透明质酸10-20(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20)份，透明质酸钠30-40(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40)份。如本文使用的术语“水解透明质酸”表示分子量范围为10到200万道尔顿的水解的透明质酸。

胶原蛋白存在于动物皮肤与骨胳中，如猪皮、牛筋、鸡及鸟的皮肤及骨骼中也含有大量的胶原蛋白。虽然胶原蛋白来源很多，工业上生产主要来自牛、猪、鸟及鱼的皮肤骨骼与筋肉等。在根据本发明的一个优选实施方案中，所述胶原蛋白包括作为基质成分的小分子胶原和作为活性成分的水溶性胶原中的至少一种，优选所述水溶性胶原为类人胶原蛋白。“小分子胶原蛋白”指分子量在500-3000道尔顿范围内的胶原蛋白。如本文使用的术语“水溶性胶原”表示分子量范围为500到50000道尔顿的胶原。“水溶性胶原”在本发明中特别是指“类人胶原蛋白”(Human-like Collagen)，其为通过生物工程技术将人体胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA，经酶切后的一段基因重组于真核或原核微生物如E.coli(大肠杆菌)和酵母内，经过高密度发酵、分离、复性、纯化工艺生产的一种高分子生物蛋白。在本发明的一个优选实施方案中，类人胶原蛋白是通过酵母发酵得到的糖基化类人胶原蛋白肽。酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点，具备培养条件普通、生长速度快、成本相对较低、能进行蛋白翻译后加工、易获得可溶性活性重组蛋白等特点，特别是毕赤酵母系统对表达的分泌蛋白在糖基化修饰及糖基人源化改造上具有独特优势。本发明特别优选类人胶原蛋白是酵母发酵得到的糖基化类人胶原蛋白肽(参考文献：张卉.重组类人胶原蛋白的表达纯化及在化妆品中的应用[D].2017；中国发明专利CN.104098701B)，其同时兼具了人源胶原蛋白维持ECM框架结构和糖蛋白的双重特性。

如本文使用的术语“糖蛋白”是分支的寡糖链与多肽链共价相连所构成的复合糖，主链较短，在大多数情况下，糖的含量小于蛋白质。在本发明中，模拟细胞外基质的化妆品中的糖蛋白优选为结构糖蛋白，其为细胞外基质中的不溶性大分子糖蛋白，包括非胶原糖蛋白(纤维连接蛋白、层粘连蛋白等)。在本发明的一个优选实施方案中，糖蛋白选自层粘连蛋白、蛋白多糖和纤维连接蛋白。纤维连接蛋白广泛存在于动物组织和组织液中，是一种大分子糖蛋白，分子量约为450KD，具有多种生物活性。在纤维连接蛋白的很多功能中，最基本最重要的一项是促进细胞的黏连生长，而细胞的黏连是机体结构得以维持、细胞生长完成的必要条件，但考虑到其分子量较大，不利于肌肤吸收，优选使用同样具有促进细胞粘附生长的三肽RGD(来自于纤维细胞附着域的氨基酸序列Arg-Gly-Asp)来代替纤维连接蛋白的作用。因此，本发明中的“糖蛋白”特别优选三肽RGD。

如本文使用的术语“细胞因子”是指免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。优选地，用于本发明的化妆品中的细胞因子选自由以下组成的组：aFGF、bFGF、EGF、KGF、NGF、血小板衍生因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、干扰素、趋化因子、转化生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)或它们的组合。更优选地，所述细胞因子是由如下重量份比例的组分组成：bFGF 0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20)份、EGF 0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20)份、KGF 0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20)份、TGF-β0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20)份、PDGF 0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20)份和IGF 0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20)份。上述细胞因子具有免疫调节、抑制肌肤加速老化、提高皮肤角质层细胞的利用率等作用。

另外，本发明采用的真空冻干技术，保证了在不用防腐剂、杀菌剂、添加剂等化学成分的情况下把成分迅速冷冻风干成棉花絮状或粉状，可长久保持复合生长因子的活性，使得完全无防腐剂和添加剂的产品能够长期保存，并且使各组分仍然保持活性。

在根据本发明的一个特别优选的实施方案中，所述该冻干产品是通过将如下组成的组合物冻干获得的(重量％)：透明质酸0.1-0.5％，胶原蛋白0.5-1％，三肽RGD 0.01-0.05‰，复合细胞因子0.01‰-0.1‰，余量为水。

本发明化妆品组合物中各组分发挥协同作用，可以有效模拟细胞外基质成分，渗入真皮层，改善细胞微环境，达到综合调理的抗敏感效果。

实施例

下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例和附图仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1抗敏修复型冻干絮组合物的制备

处方组成：

制备方法：

步骤1：分别称取配方量的水解透明质酸(西安奥赛生物科技有限公司，分子量10～200万道尔顿)，透明质酸钠(郑州嵩桦商贸有限公司，分子量1.2×10⁶道尔顿)置于锥形瓶中，加入1/2配方量的超纯水，于室温溶胀过夜，高压灭菌(121℃，20min)，冷却到室温，得溶液A。

步骤2：称取配方量的水解胶原蛋白(厦门海优明胶有限公司，分子量500-3000道尔顿)，先用1/2配方量的超纯水搅拌溶解后再加入配方量的类人胶原肽(广州暨南大学医药生物技术研究开发中心；参考文献：张卉.重组类人胶原蛋白的表达纯化及在化妆品中的应用[D].2017；中国发明专利CN.104098701B)、EGF(广州暨南大学医药生物技术研究开发中心)，得溶液B。

步骤3：于超净工作台，将溶液B用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，得溶液C。

步骤4：于超净工作台，将A和C混合后，分装到5mL的西林瓶中，每瓶装3mL，于﹣20℃预冻12小时、﹣75℃预冻1小时后，在冻干机中﹣25℃～﹣75℃真空冷冻干燥20小时，得到所需冻干絮产品。

实施例2双重抗敏修复型冻干絮组合物的制备

处方组成：

制备方法：

步骤1：分别称取配方量的硫酸软骨素，海藻多糖置于锥形瓶中，加入1/2配方量的超纯水，于室温溶胀过夜，高压灭菌(121℃，20min)，冷却到室温，得溶液A。

步骤2：称取配方量的水解胶原蛋白，先用1/2配方量的超纯水搅拌溶解后再加配方量的类人胶原肽、EGF、bFGF(广州暨南大学医药生物技术研究开发中心)，得溶液B。

其余步骤同实施例1中的步骤3和步骤4。

实施例3多重抗敏修复型冻干絮组合物的制备

处方组成：

制备方法：

步骤1：分别称取配方量的水解透明质酸，透明质酸钠置于锥形瓶中，加入1/2配方量的超纯水，于室温溶胀过夜，高压灭菌(121℃，20min)，冷却到室温，得溶液A。

步骤2：称取配方量的水解胶原蛋白，先用1/2配方量的超纯水搅拌溶解后再加入配方量的RGD、类人胶原肽、EGF、bFGF、KGF(广州暨南大学医药生物技术研究开发中心)，得溶液B。

其余步骤同实施例1中的步骤3和步骤4。

实施例4多重抗敏修复型冻干絮组合物的制备

处方组成：

制备方法：

步骤1：分别称取配方量的水解透明质酸，透明质酸钠置于锥形瓶中，加入1/2配方量的超纯水，于室温溶胀过夜，高压灭菌(121℃，20min)，冷却到室温，得溶液A。

步骤2：称取配方量的水解胶原蛋白，先用1/2配方量的超纯水搅拌溶解后再加入配方量的类人胶原肽、EGF、bFGF、KGF(广州暨南大学医药生物技术研究开发中心)、PDGF、IGF、TGF-β、VEGF，得溶液B。上述生物活性蛋白类美容多肽由广州暨南大学医药生物技术研究开发中心按照常规蛋白制备和纯化方法制备(郑丹丹,叶景佳,杨蓓蓓,et al.同时表达活化型IGF1、EGF和FGF2的慢病毒载体的构建[J].中国细胞生物学学报,2014(11):1497-1505)。

其余步骤同实施例1中的步骤3和步骤4。

实施例5多重抗敏修复型冻干絮组合物细胞增殖实验

具体步骤如下：

步骤1：小鼠胚胎细胞(NIH/3T3细胞)(南京科佰生物科技有限公司，No.CBP60317)用含10％FBS的DMEM培养基常规培养至80-90％汇合，用0.25％胰酶消化，离心收集细胞，用含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞悬液密度，以细胞密度5000个/孔接种于96孔板中(边缘孔用无菌PBS填充)。

步骤2：放入5％CO2培养箱，37℃培养12h后，换0.4％维持培养液饥饿4h，加入含不同浓度梯度的实施例3产品的培养基，每孔200μL，每个浓度设3个复孔。

步骤3：于5％CO2培养箱，37℃培养48h。

步骤4：每孔加入10μL MTT溶液(0.5mg/mL)，继续培养4h。

步骤5：终止培养，小心吸去孔内培养液。

步骤6：每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。通过酶标仪测定570nm波长处的吸光值。

该实验可以检测实施例3的多重修复型冻干絮组合物对NIH/3T3细胞的促增殖活性，结果如图2所示，与空白对照组有显著差异(P<0.05)，多重修复型冻干絮组合物对NIH/3T3细胞具有促增殖活性。

实施例6多重抗敏修复型冻干絮组合物敏感细胞模型测试实验

敏感细胞模型测试实验具体方法和步骤如下：

方法：采用30ng/ml的2,4-二硝基对苯酚-牛血清白蛋白(DNP-BSA)完全抗原(基因有限公司)及小鼠特异性IgE抗体(武汉博士康生物工程有限公司)刺激大鼠嗜碱性粒细胞性白血病细胞RBL-2H3细胞(上海名劲生物科技有限公司，参考文献：朱远洪.利用RBL--2H3细胞与肥大细胞评价中药注射剂致类过敏性研究[D].广州中医药大学,2014.)24小时以致敏细胞，时间结束，洗去多余的IgE抗体，加入不同浓度的实施例3产品与致敏细胞再孵育24小时，同时设置对照组(不添加待测物)。孵育时间结束，加入10ng/ml DNP-BSA抗原激发2小时，收集上清液和细胞。以细胞脱颗粒释放的β-氨基己糖苷酶水平为指标，采用酶标仪于波长405nm处测OD值，计算β-氨基己糖苷酶的释放率。

上清液和胞内β-氨基己糖苷酶的检测：

步骤1：取各孔细胞上清液50μl转入96孔培养板中，同时加入50μl底物(1mmol/Lp-硝基苯-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖胺(北京希凯创新科技有限公司)溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶液，pH4.5)，37℃孵育60min，最后加入150μl终止液(0.1mol/L Na2CO3/NaHCO3溶液，pH 10)终止反应。

步骤2：BioRad 680酶标仪测定405nm各孔反应液吸光度，吸光度间接反映细胞β-氨基己糖苷酶释放量。

步骤3：移去细胞板中各孔剩余的上清液，然后每孔加入200μl 0.5％Triton X-100细胞裂解液，冰浴30min，裂解液3000r/min离心1min。

步骤4：取上清50μl转入96孔培养板中，同上操作，测定细胞裂解液中β-氨基己糖苷酶含量，即为细胞内未释放的β-氨基己糖苷酶含量。

步骤5：计算β-氨基己糖苷酶释放率即为不同处理组细胞脱颗粒率，脱颗粒率＝上清液吸光度/(上清液吸光度+裂解液吸光度)×100％。

实验结果：全部数据用GraphPad Prism 6.0进行处理并绘制图表，若两组间数据方差齐，用非配对t检验进行分析；若两组间数据方差不齐，用t’检验进行分析。

实验结果显示(见图3)，不同浓度的样品(实施例3的多重修复型冻干絮组合物)与致敏细胞共孵育后，与不加样品的对照组比较，β-氨基己糖苷酶的释放率下降，其中，25-100ng/mL浓度范围具有显著性差异(P<0.05)。说明该样品具有抗炎抗过敏作用。

实施例7多重抗敏修复型冻干絮组合物细胞迁移实验

多重修复型冻干絮组合物细胞迁移实验具体步骤如下：

步骤1：培养板接种NIH/3T3细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记(方便拍照时定位同一个视野，画法：用直尺和marker笔横竖各划3条平行线，形成9个交叉点)。

步骤2：细胞消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜(数量少时可培养一段时间至铺满板底，确保细胞达到100％融合的密度)。

步骤3：细胞长满板底后，用100μl黄枪头垂直于孔板，沿板背面划线的相同位置制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。

步骤4：吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。

步骤5：加入含多重抗敏修复型冻干絮组合物(0、0.1、0.5、1.0mM)的无血清培养基，拍照记录(拍照记录只选9个交叉点)。

步骤6：将培养板放入培养箱培养12～24h，每隔12小时取出拍照。

步骤7：根据收集图片数据分析实验结果，结果见图4，证明根据本发明的多重抗敏修复型冻干絮组合物复溶后能够促进细胞迁移。

实施例8多重抗敏修复型冻干絮组合物抗炎抗敏功效评价

受试部位测试前2天～3天不能使用包含化妆品或外用药品在内的其他任何产品，1h～3h不能接触水。实验前，符合纳入条件的受试者需要统一用清水清洁脸部，并自然晾干。

纳入条件：

1.年龄：18～65岁

2.症状：灼热、瘙痒、刺痛、紧绷等不适

3.体征：红斑、脱屑、痤疮样皮损、毛细血管扩张等

4.病史在1个月以上。

排除标准：

1.精神疾病，癌症，严重心、肝、肾疾病，自身免疫性疾病；

2.近一周使用抗组胺药或近一个月内使用免疫抑制剂；

3.近两个月内受试部位应用任何抗炎药物；

4.患有炎症性皮肤病临床未愈；

5.面部由于瘢痕、色素、萎缩、鲜红斑痣或其他瑕疵；

6.哺乳期或妊娠妇女；

7.参加其它的临床试验研究。

受试者脸部测试区域为双侧脸颊(鼻尖和目外眦的交点)及双侧嘴角外2cm处。试验区域面积至少3cm×3cm，正式测试前应该在符合标准的房间内静坐至少20min，不能喝水和饮料，保持轻松状态。期间操作者会与受试者就受试者皮肤状况进行交流并填写多重修复型冻干絮组合物敏感肌修复疗效评价评测表。30min后进行实验前皮肤测试，测试结束后当日按照产品要求均匀涂抹产品(涂抹量：1元硬币厚度及大小)，并于涂抹后7、14、28天回访进行相应的皮肤测试，并进行受试前后比较。

Visia皮肤成像(美国Canfield公司，第六代visia皮肤测试仪-皮肤分析仪-系统)显示，使用实施例3产品1周前受试者脸颊、鼻翼、下颌等部位红斑较明显，且红斑的程度较深，如图5，(A)所示。受试者使用产品1周后，红斑较使用前有明显减弱(结果见图5，(B))。皮肤红色素与使用前比较明显降低(红色素测量方法参考：温竹,黄正梅,高艳玲.VISIA全脸分析与黑红色素测定相结合评价化妆品的美白功效[J].日用化学品科学,2009,32(4):23-26)，使用前红色素见图5，(C)，受试者使用产品1周后，红斑较使用前有明显减弱见图5，(D)。Visia皮肤成像显示，使用实施例3产品后皮肤脱皮掉屑的情况明显改善(结果见图5，(E)为使用前，(F)为使用后)，皮肤发红情况也有所改善(数据结果见图5，(G))。

检测使用产品4W后受试者面部皮肤各功效指标，检测L值与使用前比较具有统计学意义(P<0.05)，表示亮度上升；a值4W与使用前下降0.59％；ITA值上升2.78％；以上指标均表明，使用实施例3产品4W后，皮肤发红情况有改善，即本发明所提供产品具有抗炎抗敏功效(1976年国际照明委员会确定L、a、b颜色空间，称之为CIELAB系统，所有颜色可以用L、a、b三个轴的坐标来表示：L为垂直轴，a、b为水平轴。其中L反映颜色的亮度，即从白到黑的颜色变化，L值越大，颜色越偏向白色，反之偏向黑色；a值反映从红到绿的颜色变化，+a为红色方向，-a为绿色方向；b反映从黄到蓝的颜色变化，+b为黄色方向，-b为蓝色方向。ITA为各值的综合指标，数值越高，就表明皮肤越白。L值、a值及ITA测量方法参考：孙常磊,于晓霞,朱丽平.美白面膜临床功效测试与分析[J].日用化学工业,2018(3))。

实施例9：多重抗敏修复型冻干絮组合物滋润保湿功效评价

受试部位在测试前2天～3天不能使用任何产品(化妆品或外用药品)，测试前1h～3h不能接触水。实验前，受试者需要统一用清水清洁脸部(清洁方法为用干的面巾纸擦拭干净)。

受试者脸部测试区域为双侧脸颊(鼻尖和目外眦的交点)及双侧嘴角外2cm处。试验区域面积至少3cm×3cm，正式测试前应该在符合标准的房间内静坐至少20min，不能喝水和饮料，保持轻松状态。期间操作者会与受试者就受试者皮肤状况进行交流并填写皮肤评测表。30min后进行实验前皮肤测试(皮肤水分含量、经皮水分流失量，获得初始基础值)，测试结束后当日按照产品要求均匀涂抹实施例4产品，并于涂抹后2周、4周回访进行相应的皮肤测试，并进行受试前后比较。水分含量测量方法参考：吴金昊.如何测定皮肤表面的水分？[J].北京日化,2016(4):52-53。

对受试者使用前后皮肤状况进行分析，随着时间的推移，肉眼观察可见肌肤的干燥、脱皮、起屑及红血丝等均呈下降趋势，症状得到显著改善，其中皮肤含水量明显增加，增加达20％以上见图6中(A)；TEWL值(经皮水分流失量)明显下降，滋润度明显提升，见图6中(B)。

本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种模拟细胞外基质的化妆品，其包含或基本上由以下组成：多糖、胶原蛋白、糖蛋白、细胞因子。

2.根据权利要求1所述的化妆品，其为冻干形式，优选为絮状或粉状。

3.根据权利要求1所述的化妆品，其中所述多糖、胶原蛋白、糖蛋白和细胞因子的重量比率为：多糖0.1-0.5％:胶原蛋白0.5-1％:糖蛋白0.01-0.05‰:细胞因子0.01‰-0.5‰。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的化妆品，其中所述多糖选自由以下组成的组：透明质酸、硫酸软骨素、海藻多糖、硫酸角质素、硫酸肝素、和它们的盐，优选透明质酸或其盐，更优选透明质酸是由如下重量份数的组分组成：水解透明质酸10-20份，透明质酸钠30-40份。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的化妆品，其中所述胶原蛋白为不同分子量的水溶性胶原，兼具了EMC框架结构的基质成分和营养细胞的活性成分功能，优选所述水溶性胶原为小分子胶原蛋白。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的化妆品，其中所述糖蛋白选为选自：层粘连蛋白、蛋白多糖、纤维连接蛋白或RGD三肽的一种或多种；优选蛋白多糖，特别是酵母发酵得到的糖基化类人胶原蛋白。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的化妆品，其中所述细胞因子为选自：酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、重组人角质细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、干扰素、趋化因子、转化生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的化妆品，其中所述细胞因子是由如下重量份比例的组分组成：bFGF 0-20份、EGF 0-20份、KGF 0-20份、TGF-β0-20份、PDGF 0-20份和IGF 0-20份。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的化妆品，其不包含任何防腐剂、杀菌剂和/或添加剂。

10.一种制备根据权利要求1-8中任一项所述的化妆品的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将多糖溶于水中，于室温溶胀过夜，高压灭菌(121℃，20min)，冷却到室温，得到溶液A；

(2)将胶原蛋白溶于水中后，加入糖蛋白和细胞因子，得到溶液B；

(3)将溶液B过滤除菌，得溶液C；和

(4)在无菌条件下将溶液A和溶液C混合，于﹣15℃～﹣25℃预冻0.5～24小时、﹣70℃～﹣80℃预冻0.5～1.5小时后，在冻干机中﹣25℃～﹣75℃真空冷冻干燥13～25小时，得到所需冻干絮产品。