CN112745394A - 一种重组类人胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组类人胶原蛋白(rhLEC)及其制备方法和应用，所述蛋白具有温敏特性，为类人源胶原蛋白(rhCOL)和弹性蛋白各自不同的功能域结合获得的融合蛋白，包含弹性蛋白五肽重复序列Val‑Pro‑Gly‑Xaa‑Gly(VPGXG)n和类人胶原蛋白肽。所述融合蛋白可利用可逆相变循环法纯化，实现融合蛋白的快速粗提及初步纯化，减少工艺流程和纯化成本。本发明的rhLEC相比于类人源胶原蛋白，显著改善了其稳定性。rhLEC显著促进了细胞粘附和创伤修复，促进毛细血管生成和组织胶原新生。可作为组织工程基质材料，细胞培养的活性添加剂，以及化妆品原料，具有较大的应用前景。

Description

一种重组类人胶原蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种重组类人胶原蛋白(rhLEC)及其制备方法和应用。
背景技术
重组类人胶原蛋白肽是一种生物性高分子物质，具有水溶性强、生物活性高、无免疫源性低和生物相容性高的优点。其常用于组织工程和创面敷料，有效提高皮肤再生速度，缩短创伤愈合时间。中国专利CN104098701A公开了一种重组类人胶原蛋白融合蛋白及其制备方法与应用，该融合蛋白热稳定性较差，常温下容易降解，保存难度较大，且不易纯化。因此亟需开发稳定性好、易纯化的重组类人胶原融合蛋白。
弹性蛋白是弹性纤维的主要成分，弹性纤维主要存在于韧带和脉管壁，与胶原纤维共同存在，赋予组织以弹性和抗张能力。另外，弹性蛋白作为细胞外基质的主要成分，起着一定的细胞间粘附和支持作用。人体皮肤衰老与真性弹性纤维被弹性蛋白酶降解有关。
五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n是类弹性蛋白多肽基本序列单元，其中Xaa称为客座残基，是除了Pro以外的任意一种氨基酸。类弹性蛋白是仿照天然弹性蛋白氨基酸序列特性人工合成的蛋白质，具有良好的细胞相容性、并能够在体内自然降解成氨基酸。另外，弹性蛋白来源于细胞外基质，具有与弹性蛋白相似结构的类弹性蛋白能向细胞组织提供相似的细胞外基质环境。类弹性蛋白具有依赖于自身的序列、盐度、温度敏感性的可逆相变过程。基于ELP的可逆相变特性，使用ELP作为纯化标签纯化蛋白的方法被称为可逆相变循环法(ITC，Inverse Transition Cycling)法，ITC纯化融合蛋白的方法是一种新型、发展潜力大、应用前景广的非色谱纯化技术，而且具有回收率高、操作简单、可对目标蛋白浓缩富集等优势。目前，也还未见有关于人源胶原蛋白和弹性蛋白融合的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种重组类人胶原蛋白(rhLEC)。
本发明的第二个目的在于提供所述重组类人胶原蛋白的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供所述重组类人胶原蛋白的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种重组类人胶原蛋白(rhLEC)，包含五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n和类人胶原蛋白肽(rhCOL，此类人胶原蛋白肽序列与中国专利CN104098701A中SEQ ID NO:1相同)。
本发明通过融合类人胶原蛋白肽和类弹性蛋白多肽各自不同的功能域得到上述rhLEC。所述融合蛋白可在大肠杆菌中进行可溶性表达，并通过逆相变循环法纯化，解决了现有类人胶原蛋白肽蛋白粗提及纯化步骤复杂、蛋白损耗大的问题。同时所述融合蛋白中类弹性蛋白能与水分子形成氢键，还可以与其他蛋白分子形成氢键增加融合蛋白的热稳定性，另外，本发明还意外发现所述rhLEC在促细胞粘附和创伤修复方面具有显著效果。
优选地，所述类人胶原蛋白肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n中Xaa为异亮氨酸，n＝40～60。
进一步优选地，所述五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n和类人胶原蛋白肽两者通过连接肽连接。
优选地，所述rhLEC还包含连接在融合蛋白一端的组氨酸标签，更有助于后续蛋白纯化，所述组氨酸标签序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步优选地，所述rhLEC序列从N端到C端依次包括：五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n、类人胶原蛋白肽(rhCOL)序列、His标签序列；具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种编码SEQ ID NO:4所示rhLEC的重组基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明还提供含有上述SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的的重组载体，所述重组载体优选为pET20b。
本发明还提供含有上述重组载体的宿主菌，所述宿主菌优先选自大肠杆菌。
上述任一所述的重组类人胶原蛋白的制备方法，为先构建体外表达所述rhLEC的重组基因表达载体，再转化宿主菌，诱导表达产生融合蛋白，收集、破裂菌体，收集上清，再利用可逆相变循环方法纯化上清中的融合蛋白。
优选地，所述重组基因表达载体含有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列。
优选地，所述宿主菌为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21(DE3)。
优选地，所述诱导表达产生融合蛋白选用浓度为0.1mM至10mM的诱导剂IPTG，在37℃诱导。
优选地，所述破碎菌体的方法为高压匀浆、渗透压冲击、冻融或超声波破碎
优选地，所述可逆相变循环方法纯化上清中的融合蛋白步骤为：
(1)向上清液中添加NaCl，浓度最终达到3mol/L，60℃水浴、60分钟，离心力12000g离心15min，弃上清；
(2)加入20mL预冷的PBS重悬沉淀，冰浴60分钟，离心力10000g于4℃离心15分钟，弃沉淀，将上清移入新管，此即为一轮ITC循环；所得上清继续进行ITC纯化，经过3轮可逆相变循环纯化重组后，该蛋白即为本发明重组类人胶原蛋白。
本发明的rhLEC稳定性好，在促细胞粘附和创伤修复方面具有协同增效，可促进组织胶原、毛细血管生成，可直接添加于药品及护肤品，作为组织修复的活性原料。
因此，本发明还提供上述任一所述rhLEC的在制备用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂中的应用。
还提供一种用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂，所述添加剂包含权利上述任一所述的rhLEC。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的重组类人胶原蛋白热稳定性好，利用可逆相变循环法纯化容易，实现了快速粗提及初步纯化，减少工艺流程和纯化成本。同时本发明的重组类人胶原蛋白显著促进了细胞粘附和创伤修复，促进毛细血管生成和组织胶原新生，可作为组织工程基质材料，细胞培养的活性添加剂，以及化妆品原料，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为大肠杆菌表达质粒pET20b-rhLEC图谱。
图2为pET20b-rhLEC阳性克隆菌的PCR鉴定，Marker表示DNA Ladder，1为没有加模板的阴性对照；2为单菌落PCR，能扩增出rhLEC。
图3为重组质粒pET20b-rhLEC的酶切验证。Marker表示DNA Ladder，1为单菌落提取质粒后没有酶切；2为单菌落提取质粒后的Xba1、Nde1双切。
图4为IPTG诱导BL21(DE3)pLysS表达rhLEC融合蛋白的SDS-PAGE分析。其中泳道1～4为经IPTG诱导的BL21(DE3)pLysS裂解液的电泳，可见rhLEC分子量约为47kd，泳道5的BL21(DE3)pLysS没有经过IPTG诱导，没有表达rhLEC。
图5为重组类人胶原蛋白的western blot分析。其中泳道0为BL21(DE3)pLysS没有经过IPTG诱导裂解，WB呈阴性。泳道1～5为IPTG诱导BL21(DE3)pLysS表达重组类人胶原蛋白，WB呈阳性。
图6为通过NaCl和高温条件沉降菌体裂解液的杂质，脱盐降温复溶rhLEC，通过相分离纯化rhLEC(ITC循环)。图A为第一轮ITC，图B为第二轮ITC，图C为第三轮ITC。
图7为rhLEC及重组类人胶原蛋白肽的稳定性。rhLEC为重组类人胶原蛋白；rhCOL为重组类人胶原蛋白肽。
图8为rhLEC融合蛋白促进Hacat细胞粘附，A为DMEM培养基阴性对照；B为1mM的rhCOL；C为1mM的类弹性蛋白；D为1mM的rhLEC蛋白，培养时间为5小时。
图9(a)为rhLEC融合蛋白治疗大鼠烫伤模型的效果，(b)为各组大鼠烫伤创面愈合面积变化情况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1重组类人胶原蛋白(rhLEC)表达载体构建及表达
(1)构建一种rhLEC的表达载体：先设计rhLEC的氨基酸序列，其序列从N端到C端依次包括：五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n、类人胶原蛋白多肽(rhCOL)序列、His标签序列；五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n如SEQ ID NO:2所示，类人胶原蛋白多肽(rhCOL)序列如SEQ ID NO:1所示，His标签序列如SEQ ID NO:3所示，所述融合蛋白完整的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。再设计编码上述融合蛋白rhLEC核苷酸序列，其中，rhCOL核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，五肽重复序列的核苷酸序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，rhLEC完整的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。本发明为后续优化纯化条件，在rhCOL终止密码之前加上组氨酸标签，委托金唯智生物科技有限公司合成上述rhLEC完整的核苷酸序列，预先插在pET-20b(+)载体的Nde I和HindIII之间(图1)。热激法转入DH5α感受态，37℃卡那霉素抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌落PCR鉴定(引物rhLEC F：SEQ ID NO：8；引物rhLEC R：SEQ ID NO：9；(95℃变性10min后进入循环，循环参数第一步为95℃变性60秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，30个循环)，鉴定为单克隆菌阳性克隆菌(图2)，该挑该单克隆菌落在3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，用质粒提取试剂盒提取表达质粒，酶切鉴定阳性后(图3)，该质粒为pET20-rhLEC。
(2)rhLEC的诱导表达：将pET20-rhLEC热激转化感受态细胞BL21(DE3)plysS，并在LB(Amp)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，提取质粒后进行酶切验证。在15mL试管中加入3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，然后在50mL试管中加入10mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液加入0.5mL菌液37℃摇菌2h～3h，当OD值达到0.4～0.6时候，加入1mmol/L的IPTG 37℃摇菌表达4h，或先将菌液降温至15℃，再加入1mmol/L的IPTG 15℃摇菌表达16h。分别收集1mL表达菌，8000rpm离心5min，加入1mLTris-HCl，超声破碎，离心取上清SDS-PAGE电泳鉴定(图4)及WB鉴定(图5)，表明成功构建得到了表达rhLEC的重组表达菌。
实施例2 rhLEC纯化
(1)将实施例1中获得的菌体超声裂解液，4℃，8000rpm离心5min取上清液，(3)向上清液中添加NaCl，浓度最终达到3mol/L，60℃水浴、60分钟，离心力12000g离心15min，弃上清；(3)加入20mL预冷的PBS重悬复溶沉淀，冰浴60分钟，离心力10000g于4℃离心15分钟，弃沉淀，将上清复溶液移入新管，此即为一轮ITC循环，电泳鉴定该蛋白即为rhLEC，ITC循环3次如图6所示，重悬复溶的rhLEC纯度高，大部分杂质在难以复溶的沉淀当中，本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下。所得复溶的上清继续进行ITC纯化，经过多轮可逆相变循环纯化重组后，rhLEC的纯度会有所提高。
实施例3 rhLEC热稳定试验
取等量实施例2获得的液态状的rhLEC，类人胶原蛋白肽(rhCOL)，压盖密封后分别放置于-20℃，25℃(相对湿度60％)、40℃(相对湿度75％)的环境中，于0天，5天，10天，30天取样，通过12％SDS-PAGE电泳检测结果，通过软件分析电泳条带深浅，评估各时间点蛋白剩余百分比。实验结果见图7。
结论：该实验通过rhLEC和rhCOL在不同条件下进行稳定性对比，发现在相同温度下，随着天数的增加，样品类人胶原蛋白肽的蛋白剩余量的比例下降幅度比rhLEC要大，证明本发明rhLEC具有比类人胶原蛋白肽更好的稳定性。
实施例4 rhLEC促细胞粘附试验
取实施例2中纯化得到的rhLEC融合蛋白，类人胶原蛋白肽(rhCOL)和类弹性蛋白多肽，均用DMEM培养基稀释至1mM，取空白DMEM为阴性对照，分别加入到低细胞吸附96孔板内，每孔100μL，密封放置4℃过夜后封闭。PBS清洗2次，调整Hacat细胞浓度，按照每孔10000个铺板(2％FBS培养基)，37℃、5％CO2培养箱孵育5h PBS清洗1～2次，洗去未粘附的细胞，进行结晶紫染色，用甲醇(分析纯，AR)固定10min，超纯水洗涤2次，重新加入每孔100μL的PBS，于显微镜下观察。如图9所示，可得出rhLEC融合蛋白促进细胞粘附的能力明显优于类人胶原蛋白肽和类弹性蛋白多肽。
实施例5 rhLEC的烫伤修复试验
实验动物要求：SD大鼠，160g～220g，雌性，6～8周龄，伦理饲养。
烫伤模型制备：造模前4％的水合氯醛(3ml/kg)进行麻醉，大鼠背部脱毛，随机分3组，每组6只。将纱布裁剪成约3×3cm，于100℃沸水中加热5分钟后取出，对大鼠背部进行10s的烫伤。
创伤修复试验：以无纺布作为载体，将3mL生理盐水，或实施例2的rhLEC(100μg/mL)或类人胶原蛋白肽(rhCOL)(100μg/mL)滴加于无纺布。设置组别：阴性对照组，大鼠接受生理盐水无纺布治疗,阳性对照组，接受rhCOL治疗；C组：实验组，接受rhLEC治疗。大鼠均用无纺布包扎，每天无纺布贴敷4小时，连续包扎贴敷9天。隔天拍照，IPP 6.0软件计算创面像素面积。具体结果如图9(a)和图9(b)所示，在第9天，实验组大鼠创面愈合率为83.42±14.78％显著性优于阴性对照组65.79±11.54％愈合率，同时也优于阳性对照组(愈合率为78.88±12.33％)。
序列表
<110> 肽源（广州）生物科技有限公司
广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司
<120> 一种重组类人胶原蛋白及其制备方法和应用
<141> 2020-12-09
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthetic sequences)
<400> 1
Thr Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln
1 5 10 15
Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser
20 25 30
Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly
35 40 45
Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu
50 55 60
Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val
65 70 75 80
Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly
85 90 95
Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu
100 105 110
Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu
115 120 125
Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly
130 135 140
Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro
145 150 155 160
Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg
165 170 175
Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly
180 185 190
Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu
195 200 205
Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala
210 215 220
Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly
225 230 235 240
Ala Ser
<210> 2
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthetic sequences)
<400> 2
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
20 25 30
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
35 40 45
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
50 55 60
Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
85 90 95
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
100 105 110
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
115 120 125
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
130 135 140
Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
145 150 155 160
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
165 170 175
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
180 185 190
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
195 200 205
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
210 215 220
Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
225 230 235 240
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
245 250
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthetic sequences)
<400> 3
His His His His His His
1 5
<210> 4
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthetic sequences)
<400> 4
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
20 25 30
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
35 40 45
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
50 55 60
Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
85 90 95
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
100 105 110
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
115 120 125
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
130 135 140
Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
145 150 155 160
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
165 170 175
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
180 185 190
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
195 200 205
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
210 215 220
Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
225 230 235 240
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Asp Asp Asp Asp Lys Thr
245 250 255
Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg
260 265 270
Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly
275 280 285
Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val
290 295 300
Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg
305 310 315 320
Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly
325 330 335
Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp
340 345 350
Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg
355 360 365
Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly
370 375 380
Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu
385 390 395 400
Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln
405 410 415
Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly
420 425 430
Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile
435 440 445
Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg
450 455 460
Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly
465 470 475 480
Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala
485 490 495
Ser His His His His His His
500
<210> 5
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences)
<400> 5
atgaccagcg gcgaacgtgg cgatctgggc ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg 60
gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc 120
ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt 180
ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg 240
gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc 300
ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt 360
ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg 420
gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc 480
ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt 540
ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg 600
gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc 660
ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt 720
ggcgcgagc 729
<210> 6
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences)
<400> 6
gtgccgggca tcggcgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 60
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 120
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 180
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 240
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 300
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 360
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 420
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 480
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 540
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 600
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 660
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 720
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 750
<210> 7
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences)
<400> 7
gtgccgggca tcggcgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 60
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 120
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 180
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 240
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 300
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 360
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 420
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 480
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 540
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 600
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 660
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt 720
gttcctggta ttggtgttcc tggtattggt gatgatgatg acgacaaaat gaccagcggc 780
gaacgtggcg atctgggccc gcagggcatt gcgggccagc gtggcgtggt gggcgaacgt 840
ggcgaacgtg gcgaacgtgg cgcgagcggc gaacgtggcg atctgggccc gcagggcatt 900
gcgggccagc gtggcgtggt gggcgaacgt ggcgaacgtg gcgaacgtgg cgcgagcggc 960
gaacgtggcg atctgggccc gcagggcatt gcgggccagc gtggcgtggt gggcgaacgt 1020
ggcgaacgtg gcgaacgtgg cgcgagcggc gaacgtggcg atctgggccc gcagggcatt 1080
gcgggccagc gtggcgtggt gggcgaacgt ggcgaacgtg gcgaacgtgg cgcgagcggc 1140
gaacgtggcg atctgggccc gcagggcatt gcgggccagc gtggcgtggt gggcgaacgt 1200
ggcgaacgtg gcgaacgtgg cgcgagcggc gaacgtggcg atctgggccc gcagggcatt 1260
gcgggccagc gtggcgtggt gggcgaacgt ggcgaacgtg gcgaacgtgg cgcgagcggc 1320
gaacgtggcg atctgggccc gcagggcatt gcgggccagc gtggcgtggt gggcgaacgt 1380
ggcgaacgtg gcgaacgtgg cgcgagcggc gaacgtggcg atctgggccc gcagggcatt 1440
gcgggccagc gtggcgtggt gggcgaacgt ggcgaacgtg gcgaacgtgg cgcgagccat 1500
catcatcatc atcattaa 1518
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences)
<400> 8
atggtgccgg gcatcggc 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences)
<400> 9
ttaatgatga tgatgatgat 20

Claims (10)

1.一种重组类人胶原蛋白，其特征在于，包含五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n和类人胶原蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于，所述类人胶原蛋白肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于，所述五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n中Xaa为异亮氨酸，n＝40～60。
4.根据权利要求3所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于，所述五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求1～4任一所述的重组类人胶原蛋白，其特征在于，所述融合蛋白序列从N端到C端依次包括：五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n、类人胶原蛋白多肽序列、His标签序列；其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.一种编码权利要求5所述重组类人胶原蛋白的重组基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
7.一种含有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的重组载体或宿主菌。
8.权利要求1～5任一所述重组类人胶原蛋白的制备方法，其特征在于，先构建体外表达所述重组类人胶原蛋白的重组基因表达载体，再转化宿主菌，诱导表达产生融合蛋白，收集、破裂菌体，收集上清，再利用可逆相变循环方法纯化上清中的融合蛋白。
9.权利要求1～5任一所述重组类人胶原蛋白的在制备用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂中的应用。
10.一种用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂，其特征在于，所述添加剂包含权利要求1～5任一所述的重组类人胶原蛋白。
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