CN110204608A

CN110204608A - 一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110204608A
Application number: CN201910388775.3A
Authority: CN
Inventors: 阮仁全; 温龙平
Original assignee: Meierjian (shenzhen) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Meierjian (shenzhen) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2019-09-06
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: WO2020228390A1; US20220220190A1; CN110204608B

Abstract

本发明公开了一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽，包括至少一个钠钾ATP酶β亚基结合域，所述钠钾ATP酶β亚基结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了该酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽的制备方法以及该酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽的应用。本发明的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽能够有效被皮肤吸收，对创伤型皮损或角质完整的皮下损伤有优秀的愈合和修复作用。

Description

一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽及其制备方法和应用。

背景技术

纤连蛋白(Fibronectin，FN)是一种大分子糖蛋白，含糖4.5％～9.5％，分子量约为450kd，它广泛存在于血浆、多种细胞表面及细胞基质中，作为一种重要的黏附分子与11种整合素受体结合，在细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用中发挥极其重要的功能。大量研究发现，纤连蛋白(FN)参与伤口愈合、组织修复、胚胎分化、免疫反应、肿瘤分化与转移、分娩等过程，与多种疾病有着密切的联系。纤维连接蛋白基质聚合也促进I型胶原沉积，并增强胶原基组织结构。

纤连蛋白是一种蛋白质二聚体，由两个几乎相同的单体通过一对二硫键连接而成。由一对c末端的二硫键相连。每一个纤连蛋白亚基的分子量为230-250kDa，它们由三种重复的模块(modular structures)组成，其中包括：12个纤连蛋白I型重复位点(纤连蛋白I)，2个纤连蛋白II型重复位点(纤连蛋白II)，15-17个纤连蛋白III型重复位点(纤连蛋白III)，还有2个选择性剪接位点(EIIIA和EIIIB)以及1个可变区(V)。以上各种模块组成了纤连蛋白的功能性结构域，其中包括：N末端的70kDa结构域(纤连蛋白I1-9)；120kDa的中心结合结构域(central binding domain，CBD；纤连蛋白 III1-12)，以及肝素结合结构域(heparin-binding domain，HepII；纤连蛋白 III12-14)。两个纤连蛋白III通过可变剪接生成ED(extradomain)A与B(血浆纤连蛋白没有EDA和EDB，但细胞纤连蛋白含有数量可变的EDA或EDB)。绝大多数的细胞纤连蛋白都含有可变区V。纤连蛋白通过纤连蛋白III10上的精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp，RGD)识别整合素异二聚体并与之结合，进而影响细胞黏附、迁移等。纤连蛋白分子也具有其他黏附位点，分别与胶原、纤维蛋白、肝素等结合，共同决定了细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的稳定性。

纤连蛋白在医疗、美容以及科研领域有广泛的应用市场，但从人体或动物血液和组织中提取的天然纤连蛋白产量极为有限，成本昂贵，加上纤连蛋白分子太大(由2000 多个氨基酸组成，约45万的分子量)，难以被角质结构完整的皮肤吸收。因此限制了 FN的市场应用，尤其是美容护肤领域。

发明内容

为了解决上述问题，本发明基于酵母系统获得重组纤连蛋白活性结构。因此，本发明的第一个目的是提供一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽，以解决现有的大肠杆菌表达系统获得的产量低、稳定性低的问题。本发明的第二个目的是提供表达载体 Chimeric FN。本发明的第三个目的是提供一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽的制备方法。本发明的第四个目的是提供一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽，包括如下氨基酸序列:钠钾ATP酶β亚基结合域，所述钠钾ATP酶β亚基结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明，所述酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽，还包括如下氨基酸序列:

纤维蛋白结合结构域，所述纤维蛋白结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

胶原蛋白结合结构域，所述的胶原蛋白结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

肝素的结构域，所述的肝素的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的；

纤连蛋白的结构域，所述纤连蛋白的结构域包括如SEQ ID NO：6所示的纤连蛋白的整联蛋白结合结构域。

进一步的，一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽，包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列顺序连接而成。

作为本发明的第二个方面，一种编码上述所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列如权利要求7所示。

作为本发明的第三个方面，一种表达载体Chimeric FN，所述表达载体ChimericFN 包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

进一步的，所述表达载体Chimeric FN是在pPIC9K的基础上插入如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

作为本发明的第四个方面，一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：

步骤A、在pPIC9K的基础上插入如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，获得编码Chimeric FN蛋白的表达质粒；

步骤B、提取步骤A的编码Chimeric FN蛋白的表达质粒的基因组DNA，并线性化，然后与感受态毕赤酵母混合，转入电转杯；并放置于冰上；然后加入预冷的山梨醇，接着，将内容物涂于MD平板上，孵育，至克隆产生，筛选Mut+/Muts表型菌株，即筛选可表达重组纤连蛋白的菌株；

步骤C、将步骤B筛选的Mut+/Muts表型菌株进行表达纯化。

作为本发明的第五个方面，一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽在促细胞粘附和生长中的应用。

作为本发明的第六个方面，一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽在制备治疗皮肤损伤愈合和修复的药物中的应用。

作为本发明的第七个方面，一种药物组合物，包括上述所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽。

作为本发明的第八个方面，一种美容组合物，包括上述所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽。

本发明的有益效果：本发明使用毕赤酵母作为宿主表达糖基化的纤连蛋白，具有良好的耐热性，糖基化程度高，产量高，活性强，能够有效被皮肤吸收，对创伤型皮损或角质完整的皮下损伤有优秀的愈合和修复作用。本发明获得重组纤连蛋白分子在临床上可用于皮肤损伤修复，在美容领域可用于敏感肌修复等方面。

附图说明

图1为pPIC9k载体的序列图谱。

图2为重组纤连蛋白的发酵表达量。

图3为纯化后的重组纤连蛋白的表达量，为同一个洗脱峰的三个位置。

图4为重组纤连蛋白的蛋白分子量。其中，A为大肠杆菌发酵，无糖基化；B为毕赤酵母发酵，含糖基化。

图5为重组纤连蛋白促细胞贴附作用的结果图。

图6为重组纤连蛋白促进细胞生长作用的结果图。其中，A为胶原蛋白；B为明胶； C为血浆纤连蛋白；D为大肠杆菌表达纤连蛋白；E为毕赤酵母表达纤连蛋白。

图7为待测样品在37℃环境下的稳定性结果图。

图8为待测样品在55℃环境下的稳定性结果图。

图9为Pichia-FN、Plasma-FN和Ecoli-FN的透皮吸收量。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1构建编码Chimeric FN蛋白的表达质粒

本实施例使用商用载体pPIC9K(如图1所示)，购自武汉三鹰生物科技有限公司，根据图1相关序列位置设计选择酶切位点EcoR I和Not I，编码Chimeric FN的基因序列都是人工优化过的毕赤酵母偏爱密码子，经人工合成获得。所合成的重组纤连蛋白全长DNA片段的5’和3’端各有一个限制性内切酶位点，分别对应EcoR I和Not I。重组纤连蛋白的目的片段将插在这两个酶切位点之间，获得编码Chimeric FN蛋白的表达质粒。其中，重组纤连蛋白的氨基酸序列为：

ACSPPHSKSHCGGGGSIQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQL ISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSTGGSAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITG YRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSDVPRDLEVVAATP TSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：1)

所述纤连蛋白具体包括如下氨基酸序列：(1)至少一个钠钾ATP酶β亚基结合域，所述钠钾ATP酶β亚基结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；(2)至少一个纤维蛋白结合结构域，所述纤维蛋白结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；(3) 至少一个胶原蛋白结合结构域，所述的胶原蛋白结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO： 4所示；(4)至少一个肝素的结构域，所述的肝素的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO： 5所示的；(5)至少一个纤连蛋白的结构域，所述纤连蛋白的结构域至少包括如SEQ ID NO：6所示的纤连蛋白的整联蛋白结合结构域。

重组纤连蛋白的核苷酸序列为：

重组DNA片段委托上海纽普生物公司合成；编码Chimeric FN蛋白的表达质粒委托上海纽普生物公司构建。

实施例2重组纤连蛋白的表达纯化及电泳鉴定方法

1)酵母菌克隆的制备。提取表达载体Chimeric FN的基因组DNA，用核酸酶切，获得线性化的DNA，将线性化的DNA溶于5-10ulTE(购自纽普生物)。取80ul商业化的感受态毕赤酵母GS115(购买自天根生物)与10ug线性化DNA混合，转入预冷的 0.2cm电转杯中。在冰上放置5min。设定机器参数，立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中分成200ul等份，涂于MD平板上，在30℃孵育平板至克隆产生，由于转化的载体含有mut基因，只有转化成功的菌种可以通过 mut表型进行筛选，因此筛选Mut+/Muts表型菌株进行保存。

2)重组纤连蛋白的表达纯化。挑取单克隆，接种至25ml BMGY培养基(BufferedGlycerol-complex Medium)中，250ml摇瓶，30℃，250rpm摇至OD600＝4，室温 3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY培养基重悬细胞至OD600＝1.0，进行诱导表达。在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。每24小时，加甲醇至终浓度为0.5％以继续诱导。在多个时间点，取1ml 培养基至1.5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。分泌表达时，将上清转移至单独管中，将上清及细胞沉淀存于-80度直至开始检测。用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，western blot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达(SDS-PAGEp47)。

经检测，重组纤连蛋白酵母克隆的表达量随着时间的变化而变化，经过4天的诱导，蛋白的产量达到2g/L。如图2所示。

结论：采用毕赤酵母表达系统，可以获得高产量的酵母发酵小分子重组纤连蛋白。

3)将发酵后的菌液3000g离心5分钟，收集上清，弃沉淀。让上清中的蛋白与苯基凝胶柱结合，结合完毕后再使用20mM磷酸盐pH7.5缓冲液洗脱。将洗涤下来的蛋白液结合到阴离子交换树脂上，再用150mM NaCl，20mM磷酸盐0.5M尿素溶液进行洗脱。所获得的蛋白纯度经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白条带单一，无降解条带，纯度大于95％。

4)对照组的设置：将酵母菌克隆的制备的步骤中的毕赤酵母替换成大肠杆菌BL21，其他步骤和条件相同，且纤连蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，获得在大肠杆菌宿主中表达的重组纤连蛋白。

结果，通过大肠杆菌系统表达的纤连蛋白的表达量与酵母菌系统表达的纤连蛋白的表达量接近。

但是，大肠杆菌宿主中表达的重组纤连蛋白没有糖基化；酵母表达的FN分子量比预计的分子大。这是因为酵母表达的重组纤连蛋白含有糖基化修饰，糖基化是纤连蛋白保持活性的重要组成部分。结果请请参阅图3及图4。

结论：采用毕赤酵母作为宿主表达的重组纤连蛋白有糖基化，表达的纤连蛋白更接近于天然状态。

实施例3重组纤连蛋白进行促细胞粘附和生长试验

将实施例2纯化的重组纤连蛋白配制成多个浓度(1、6、9、15、24ug/ml)后包被96孔板30分钟，用PBS洗涤两遍。再加1％BSA于37℃封闭30分钟后，加入大鼠成纤维细胞(用无血清培养基培养)，1h后轻轻吸取孔中培养基，用PBS轻轻漂洗未吸附的细胞，用CCD8法检测吸附在孔板底部活细胞的数量，验证重组纤连蛋白的活性，结果请请参阅图5及图6。

图5结果显示，重组纤连蛋白的细胞贴附活性都优于天然结构的纤连蛋白。酵母发酵的蛋白在细胞贴附方面效果显著高于大肠杆菌发酵的蛋白，这是由于糖基化对细胞贴附具有重要作用。

图6结果显示，各种细胞贴附剂对细胞生长的影响，A组为胶原蛋白购自于上海生物工程公司、B组为明胶购自于上海生物工程公司，C组为血浆纤购买于thermafisher 公司的人纤连蛋白(人血浆中提取纯化，代表天然来源的纤连蛋白)、D组为大肠杆菌表达的纤连蛋白(与实施例2的对照组一致)、E组为通过实例2获得的毕赤酵母表达的重组纤连蛋白。从图6可知，本发明得到的重组纤连蛋白具有优良的促细胞生长的活性，其效果与大肠杆菌表达的纤连蛋白有显著差异，而更优于血浆纤连蛋白和和其他常规的细胞贴附剂。

实施例4重组纤连蛋白的稳定性检测

分别制备三种同等浓度的500ug/ml的血清来源纤连蛋白(Plasma-FN)溶液(人血浆中提取纯化，代表天然来源的纤连蛋白，没有Na+K+ATP酶结合域)、大肠杆菌发酵的纤连蛋白(Ecoli.-FN)(与实施例2的对照组一致，代表无糖基化的纤连蛋白)和酵母来源的纤连蛋白(Pichia-FN，即实施例2纯化的重组纤连蛋白)(溶剂为：20mM PBS， pH7.5)存放于密封的10ml西林瓶中，并分别放置于不同的温度环境中。并于不同的时间观察溶液的澄清度。通过BCA蛋白定量测定蛋白浓度。本实施例设定的两个加速温度，分别为37℃和55℃，观察蛋白在37℃环境中的稳定性以及在55℃环境中达到稳定浓度的时间。本实施例设定的37℃实验的取样检测时间为：1h，3h，6h，12h，24h， 55℃实验的取样检测时间为：1h，3h，7h，15h，30h，60h。结果见图7和图8。

图7结果显示，在37℃环境下，在24小时内，酵母来源的蛋白浓度没有显著降低，而大肠杆菌发酵的以及血清来源的纤连蛋白含量显著降低，蛋白发生了不同程度的聚集，溶液呈现半透明混浊状。

图8结果显示，在55℃高温环境下通常大多数蛋白会失去发生聚集沉淀或降解。

结论：Pichia-FN具有良好的耐热性，在55℃环境下可以保持10小时的稳定。而Plasma-FN和Ecoli.-FN在高温环境下3小时左右开始发生聚集沉淀，其中，Plasma-FN 的损失率达到70％。

实施例5实施例2纯化的纤连蛋白的皮肤渗透效率

将脱完毛发的SD大鼠仰面平躺固定在实验桌上，将采血针插入大鼠心脏后用真空采血管收集血液，将大鼠血液放完。等待一段时间后确定大鼠已经死亡后，用手术刀片沿着裸露皮肤边缘划出裂口，用手术镊子夹住皮肤将皮肤剥离出来。将剥离的皮肤浸泡在PBS中漂洗，检查皮下组织残留，若皮下组织残留较多可用眼科剪对皮下组织进行修剪去除皮下组织。将剥离下的皮肤组织安装到Franz透皮扩散池中，固定给药槽和药物接收槽。往药物接收槽中加入药物接收液(PBS)，排除气泡，检查装置密封性。将安装了皮肤的扩散槽放入水浴槽中，设定转子搅拌速度300和水浴温度32℃。往给药槽中加入500μL适量浓度重组蛋白后，经过一段时间透皮给药，从接收槽中收集100μL样品使用纤连蛋白酶联免疫检测试剂盒进行定量加测，计算得 Pichia-FN/Plasma-FN和Ecoli-FN/Plasma-FN的值，检测试剂盒购自于博士德生物公司。结果如图9所示。

结果显示，重组纤连蛋白透过皮肤的含量显著高于血清中天然纤连蛋白，其中Ecoli-FN的透皮吸收量是Plasma-FN的5倍左右；而Pichia-FN则是Plasma-FN的8 倍左右。

结论：Pichia-FN的透皮量显著高于Ecoli-FN，这是由于Pichia-FN中的Na+K+ATP酶β亚基结合域有糖基团的保护，活性得到充分保护，该结合域和Na+K+ATP酶β亚基结合后改变皮肤细胞间隙，使得分子通过细胞间隙渗透的效率进一步提高。

综上所述，本发明的重组纤连蛋白拥有更好的皮肤吸收功能，其能够通过角质结构完整的表皮层，更好的应用于美容护肤领域。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。例如，本发明的实施例的序列，仅是用于解释说明本发明，本领域技术人员可以根据本发明的原理再设计引物和探针来用于检测其他靶基因序列。

序列表

<110> 美尔健（深圳）生物科技有限公司

<120> 一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽及其制备方法和应用

<130> 191035

<141> 2019-05-10

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Cys Ser Pro Pro His Ser Lys Ser His Cys Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys Tyr Ile Leu

20 25 30

Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser Val Gly Arg Trp Lys Glu Ala Thr Ile

35 40 45

Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys Pro Gly Val

50 55 60

Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly His Gln Glu

65 70 75 80

Val Thr Arg Phe Asp Phe Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Gly Gly Ser

85 90 95

Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp

100 105 110

Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn

115 120 125

Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu

130 135 140

Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu

145 150 155 160

Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His

165 170 175

Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro

180 185 190

Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His

195 200 205

Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His

210 215 220

Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser

225 230 235 240

Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val

245 250 255

Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val

275 280 285

Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val

290 295 300

Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser

305 310 315 320

Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile

325 330 335

Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val

340 345 350

Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn

355 360 365

Tyr Arg Thr

370

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Cys Ser Pro Pro His Ser Lys Ser His Cys Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 77

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys Tyr Ile Leu

1 5 10 15

Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser Val Gly Arg Trp Lys Glu Ala Thr Ile

20 25 30

Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys Pro Gly Val

35 40 45

Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly His Gln Glu

50 55 60

Val Thr Arg Phe Asp Phe Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr

65 70 75

<210> 4

<211> 94

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Gly Ser Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile

1 5 10 15

Gly Pro Asp Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp

20 25 30

Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp

35 40 45

Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr

50 55 60

Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr

65 70 75 80

Glu Gln His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr

85 90

<210> 5

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn

1 5 10 15

Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr

20 25 30

Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp

35 40 45

Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro

50 55 60

Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu

65 70 75 80

Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr

85 90

<210> 6

<211> 94

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr

1 5 10 15

Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr

20 25 30

Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe

35 40 45

Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro

50 55 60

Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp

65 70 75 80

Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr

85 90

<210> 7

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttgttctc cgcctcattc taaatctcat tgcggtggtg gcggttccat ccagtggaac 60

gctccgcagc cgtctcatat ctctaagtac atcctgcgct ggcgtccgaa aaactctgtg 120

ggtcgttgga aagaagctac catccctggt catctgaact cctacacgat taaaggtctg 180

aaaccgggcg ttgtttatga aggtcagctg atctctatcc agcagtacgg tcaccaagaa 240

gttactcgtt ttgacttcac taccacttct acttctaccg gtggttctgc tgtaccgccg 300

ccaaccgacc tgcgttttac gaacatcggt ccggatacta tgcgtgttac ttgggcaccg 360

ccgccttcca ttgatctgac caactttctg gtacgttact ctccggtcaa aaatgaagag 420

gacgttgctg aactgtctat ttctccgtcc gacaacgcag ttgttctgac taacctgctg 480

ccaggtaccg aatatgtggt gtctgtgagc tctgtttatg aacagcacga aagcaccccg 540

ctgcgtggtc gtcagaaaac cggcctggat tccccgaccg gtatcgattt ttctgatatc 600

accgcaaata gcttcaccgt acattggatc gcaccgcgtg caaccatcac cggttatcgc 660

atccgtcacc acccggagca cttttctggc cgccctcgtg aagatcgtgt tccacattct 720

cgtaattcta tcaccctgac caacctgact ccgggcactg aatacgtggt cagcatcgtg 780

gcactgaacg gtcgcgaaga atctccgctg ctgatcggtc aacagagcac tgtgagcgac 840

gttcctcgtg acctggaagt agttgctgca acgccgacct ccctgctgat ctcttgggac 900

gctccagctg ttaccgttcg ttactatcgt attacttacg gtgaaaccgg cggtaactct 960

ccggtgcagg aatttaccgt cccgggcagc aaatctaccg ccacgatttc cggtctgaag 1020

ccgggcgttg attatactat caccgtttac gctgttaccg gtcgtggtga ctcccctgct 1080

tcctctaaac cgatctctat caactaccgt acg 1113

Claims

1.一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽，其特征在于，包括如下氨基酸序列:钠钾ATP酶β亚基结合域，所述钠钾ATP酶β亚基结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽，其特征在于，还包括如下氨基酸序列:

3.如权利要求1所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽，其特征在于，所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列顺序连接而成。

4.一种编码如权利要求3所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如权利要求7所示。

5.一种表达载体Chimeric FN，其特征在于，所述表达载体Chimeric FN包括如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。

6.一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤A、在pPIC9K的基础上插入如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，获得编码ChimericFN蛋白的表达质粒；

步骤B、提取步骤A的编码Chimeric FN蛋白的表达质粒的基因组DNA，并线性化，然后与感受态毕赤酵母混合，至克隆产生后，筛选可表达重组纤连蛋白的菌株；

步骤C、将步骤B筛选的可表达重组纤连蛋白的菌株进行表达纯化，获得酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽。

7.一种如权利要求1-3任一项所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽在促细胞粘附和生长中的应用。

8.一种如权利要求1-3任一项所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽在制备治疗皮肤损伤愈合和修复的药物中的应用。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽。

10.一种美容组合物，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽。