CN102671185A

CN102671185A - 少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1a的应用

Info

Publication number: CN102671185A
Application number: CN2012101748805A
Authority: CN
Inventors: 赖仞; 杨仕隆; 容明强
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明涉及少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1a的应用，属于生物医学领域。omega-SLPTX-Ssm1a一级序列包括83个氨基酸残基，其中六个半胱氨酸形成三对二硫键，分子量为8811.3 Da。编码该毒素基因包括426个核苷酸，其中包括信号肽、前提肽和成熟肽。少棘蜈蚣毒素omega-SLPTX-Ssm1对大鼠背根神经节上的钙离子通道电流有非常显著的增强作用，是一种新型的钙通道的激动剂。本发明中的少棘蜈蚣毒素omega-SLPTX-Ssm能够增加钙通道的开放使钙离子内流，能够用于制备治疗钙通道疾病的药物，也能作为一种新的钙通道研究的工具试剂。

Description

少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1a的应用

技术领域：

本发明涉及少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1a的应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

钙离子通道是细胞膜上的一类重要的跨膜蛋白，不仅调节Ca²⁺跨膜运动的速度和量，而且参与一系列Ca²⁺依赖生理活动，包括肌肉收缩，激素和神经递质的释放以及细胞内的信号传导等。Cav1家族与骨骼和平滑肌收缩以及神经内分泌有关；Cav2在神经递质的释放和神经元兴奋的控制中有非常重要的作用。钙离子通道由α亚基和β亚基等一些辅助型亚基构成，其中α亚基包括四个相同的结构域构成，每个结构域包含六个跨膜片段。虽然钙离子通道具有非常重要的功能，但是到目前为止钙通道的结构和功能的关系以及药物作用靶点还有待进一步的研究。

钙离子通道的抑制剂广泛的存在于动物毒液中，如蜘蛛、芋螺等，许多小分子药物如二氢吡啶等都能选择性的抑制钙离子通道。但是到目前为止，从未有多肽毒素作为钙离子通道的激活剂的报道。Bay K8644是目前为止唯一研究比较清楚的钙通道激活剂, 能促进L型钙通道的开放增加内向钙通道电流，并作为工具试剂来研究钙通道的结构和功能关系。缺血再灌注损伤是指组织缺血一段时间，当血流重新恢复后，细胞功能代谢障碍及结构破坏反而较缺血时进一步加重，器官功能进一步恶化的综合征。钙超载是缺血再灌注损伤最主要的损伤机制之一。在心肌和肺部缺血再灌注损伤的预处理过程中，用钙通道激动剂 Bay K8644能诱导出短暂的钙内流，能防止心肌和肺部缺血后再灌注时对心肌和肺部造成损伤，提高组织对缺血的耐受性，因此BayK8644也作药物来防止组织在缺血再灌注的过程中发生损伤。

发明内容：

本发明提供一种少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1a的应用。

本发明提供的少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1a，是从少棘蜈蚣粗度中通过分子筛和反向高效液相色谱分离纯化得到，其氨基酸顺序为：EECPSLSGGSSNYCSKKETFTSNGNLEQTRRYCNSVAAPSTACTDLKTGGKLCEYSCNTDGCNSVAGMEPTRAVYFIAILMLA。该多肽包括83个氨基酸残基分子量为8810.4 Da，等电点为5.23，分子内含三对二硫键。

少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1a的基因克隆包括：

少棘蜈蚣毒腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选少棘蜈蚣钙离子通道激活剂多肽基因。扩增引物长度为14个核苷酸，其序列为5’-GAGTATGA ATGAGG -3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH 公司SMART TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5＇ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3＇。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码少棘蜈蚣钙离子通道激活剂的基因由426个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:

基因序列包括了信号肽、前体肽和成熟肽，其中下划线部分为成熟肽。

本发明的少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1，对大鼠背根神经节上的钙离子通道电流有非常显著的增强作用，是一种新型的钙通道的激动剂，能够用于制备治疗钙通道疾病的药物，也能作为一种新的钙通道研究的工具试剂。

附图说明：

图1是少棘蜈蚣分子筛分离纯化图。其中箭头表示目的峰，横坐标表示收集的数目，纵坐标表示洗脱峰在280nm的吸收值。

图2是目的峰第一次反向HPLC分离纯化图。其中箭头表示目的峰，横坐标表示洗脱时间，纵坐标表示洗脱峰在280nm的吸收值。

图3是目的峰第二次反向HPLC分离纯化图。其中箭头表示目的峰，横坐标表示洗脱时间，纵坐标表示洗脱峰在280nm的吸收值。

图4是omega-SLPTX-Ssm1a的基因序列和氨基酸序列。其中下划线部分为ω-SLPTX-Ssm1a的成熟肽。

图5是omega-SLPTX-Ssm1a的质谱图。

图6是omega-SLPTX-Ssm1a 对DRG神经元上的钙通道的激活作用。

具体实施方式：

1、omega-SLPTX-Ssm1a的分离纯化

omega-SLPTX-Ssm1a的分离纯化分为三个步骤：⑴分子筛；4mL的少棘蜈蚣毒液（在280 nm下的吸收值为200 OD）采用自装柱（填料为Sephadex G-50，2.6 × 100 cm）分离。采用0.1 M PBS（PH=6.0）洗脱,流速为0.3mL/min，每十分钟更换收集管。收集后的溶液用紫外分光光度计检测每管溶液在280 nm的吸收值，绘制洗脱曲线。⑵找出目的多肽所在的洗脱峰，进一步采用反向HPLC分离纯化。将分子筛的洗脱峰冻干后重新溶解在2ml的去离子水中，采用Phenomenex C18（250 x 4.6 mm）色谱柱分离。洗脱溶液为乙腈（含0.1%TFA）,流速为3ml/min,检测波长为280/215 nm。 ⑶将第二步中目的样品的洗脱峰冻干后再采用反向HPLC分离纯化。采用Phenomenex C18（250x 4.6 mm）色谱柱分离。洗脱溶液为乙腈（含0.1% TFA）,流速为0.7ml/min,检测波长为280/215 nm。

如图1所示，少棘蜈蚣粗毒经过分子筛分离后形成7个峰，其中五号峰（箭头标示）为目的峰，五号峰经过第一次反向HPLC分离产生大量的分离峰（如图2）其中箭头标记的为目的峰，第二次反向HPLC分离产生两个峰（图3）。

2、omega-SLPTX-Ssm1a质谱鉴定

毒素分子质量的鉴定均使用美国 Bruker 公司生产 ProFLEXTMIII型质谱仪，采用 MALDI-TOF 进行检测：反射模式检测毒素分子量；激光重复率5.00 Hz；N2激光波长337nm；离子源加速电压1(IS/1)20Kv；仪器的控制和数据的处理由Brucker公司开发的控制软件和Sun工作站完成。用0.1%TFA-50%乙腈-49.9%去离子水混合液制备基质CCA(α-cyano-4-hydroxyc- innamic acid)的饱和液，然后取1µl样品与 1µl CCA 的饱和液混合，再取0.5µl 混合液点样于质谱的样品盘上，室温干燥后检测分子量。用外标法或内标法进行校正。

结果如图5，少棘蜈蚣毒素omega-SLPTX-Ssm1a的分子量为8811.3 Da分子内有含有三对二硫键。

3、omega-SLPTX-Ssm1a 氨基酸序列以及基因序列

3.1经质谱鉴定纯度达到99.9%的omega-SLPTX-Ssm1a采用Edman降解原理，利用全自动氨基酸测序仪测得部分序列，再根据omega-SLPTX-Ssm1a的基因序列最终确定完整的氨基酸序列。

3.2少棘蜈蚣毒腺mRNA的纯化：

少棘蜈蚣毒腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的 PolyATtract®mRNA Isolation Systems 试剂盒。

A. 取少棘蜈蚣毒腺总RNA 500 μg 溶于 500 μl DEPC 水中，放入65℃水浴10分钟，加人 3 μl 的 Oligo(dT) 探针和13μl 20×SSC 溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加 0. 5× SSC 0. 3m1，至磁力架吸附30秒，最后加 0.1ml 0. 5×SSC 悬浮，称之为B液。

C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0. 1 × SSC洗涤4次，最后弃上清，加0. l ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0. 15 m1DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的华南雨蛙皮肤mRNA。

D.加入1/10体积3 M乙酸钠，pH 5. 2，等体积异丙醇，于 -70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

3.3少棘蜈蚣毒腺cDNA文库构建

采用CLONTECH公司 CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit 质粒cDNA文库构建试剂盒。

A. cDNA第一链合成( mRNA 反转录 )：

1.在0.5ml 无菌的离心管加入1 μl少棘蜈蚣毒腺mRNA、1 μl SMART IV 寡聚核苷酸、1 μl CDS III/3’ PCR引物，加 2μl 去离子水使总体积达到 5μl 。

2.混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃ 保温 2 分钟。

3.将离心管在冰上孵育2分钟。

4.在离心管中加入以下试剂2.0 μl 5×第一链缓冲、1.0 μl 20 mM二硫苏糖醇、1.0 μl 10 mM dNTP 混合物、1.0 μl PowerScript 反转录酶。

5.混合离心管中试剂并短暂离心，在42℃ 保温 1 小时。

6.将离心管置于冰上中止第一链的合成。

7.从离心管取2 μl所合成的cDNA第一链备用。

B. 采用长末端聚合酶链式反应(LD- PCR )方法扩增第二链

1. 95℃预热PCR仪。

2.将2 μl cDNA第一链（mRNA 反转录）、8 0μl 去离子水、10 μl 10 × Advantage 2 PCR 缓冲、2 μl 50 × dNTP 混合物、2 μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’ PCR引物以及2 μl 大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。

3.在PCR仪中按以下程序扩增：

①95℃ 20 秒钟

②22个循环：

95℃ 5 秒钟

68℃ 6 分钟

4.循环结束后，将离心管中合成的 cDNA 双链进行抽提。

C. PCR 产物用 PROMEGA 公司的 Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System 试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

1.将通过PCR得到的cDNA 双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000 g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

2. 加入700 µl的洗脱液（含乙醇）于离心纯化柱中，16,000g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

3. 重复步骤2。

4. 16,000 g 离心5分钟。

5. 将离心纯化柱置于新的离心管中。

6. 加入30 µl超纯水，在室温下静置5分钟。

7. 16,000 g 离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

D. 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

1. 挑取单个DH5α菌落，接种于3m1不含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50 m1 LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD₆₀₀值达到0.35时，收获细菌培养物。

2. 将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 m1聚丙烯管中，在冰上方置10 min，使培养物冷却至0℃。

3. 于4℃以4100 r/min离心10 min，以回收细胞。

4. 倒出培养液，将管倒置l min以使最后的痕量培养液流尽。

5. 每50ml初始培养液且30 ml预冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶液(80 mmol/L MgCl₂,20 mmol/L CaCl₂)重悬每份细胞沉淀。

6. 于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

7. 倒出培养液，将管倒置l min以使最后的痕量培养液流尽。

8. 每50 m1初始培养物用2m1用冰预冷的0.1 mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀，分装后备用。

3.4. 酶切、连接以及连接产物的转化：

1. 在微量离心管中加入1 μl Takara pMD19-T 载体、4 μl少棘蜈蚣毒腺cDNA双链溶液，全量为5 μl。

2. 加入5 μl（等量）的连接酶缓冲混合物。

3. 16℃反应2 小时。

4. 全量（10 μl）加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5. 42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6. 加入37℃温浴过的LB培养基890 μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。

7. 取200 μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。

8. 每个LB平皿用5 m1 LB液体培养基洗涤菌落，加30%甘油冻存。构建的cDNA大约含1 × 10⁶个单独克隆。

3.5、少棘蜈蚣毒素ω-SLPTX-Ssm1a基因克隆筛选：

扩增引物长度为14个核苷酸其序列为5’-GAGTATGA ATGAGG -3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH 公司SMART ^TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5＇ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3＇。

PCR反应在如下条件下进行：94 ℃ 30秒钟，56℃ 30秒钟和72 ℃45秒钟，30个循环。

将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带，用DNA纯化试剂盒进行纯化。将纯化的目的片段连接到pMD19-T载体中，即得连接产物。将连接产物转化预先制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞。最后，取适量转化产物涂布至含Amp的LB平板上，经37℃培养16 h形成的单菌落即为含目的片段的阳性克隆。

挑取单菌落用M13引物检测插入片段的大小。挑选含目的片段的阳性克隆送DNA测序公司测序。

3.6、少棘蜈蚣毒素omega-SLPTX-Ssm1a基因序列测定和结果：

提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M和BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47，BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M序列：5` GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’， BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。基因测序结果自5’端至3’端序列如图4所示。

4、omega-SLPTX-Ssm1a对DRG神经元上钙通道的活性

挑选出生±4 周、体重约为 140～200 g的 SD大鼠，麻醉后断颈处死，迅速挑出脊椎并将其剪成2～4段，将椎管沿与肋骨垂直的方向剪开，然后在盛有少量培养液的烧杯中浸泡椎管;仔细撕破附在椎管内壁上的无色黏膜，暴露椎管和肋骨交汇处的背根神经纤维。在胸椎和腰椎部分，挑选10～15个较好的背根神经节放入装有2 mL 临时培养液的培养皿中。分离出神经节以及神经纤维后，用维娜斯剪切除神经节外的絮状物和轴索，放入盛有约0.5 mL 临时培养液的培养皿中。倒去临时培养液，用维娜斯剪将分离的神经节剪碎。然后将剪碎后神经细胞转入含有15 mL 消化液的指管中,在34℃下、110 rpm的环境中用消化液酶解20～30 min。酶解期间每隔8～10 min取出指管吹打细胞以防止细胞成团；酶解终止后向消化液中加入胰蛋白酶抑制剂，终止酶解反应。将酶解后的溶液转入离心管中离心（1000 rpm、2-5 min），去除上清。用含10%小牛血清的培养液重悬细胞，重悬后的细胞分成 3～4 皿，每皿加入2 mL 培养液，放入37℃恒温培养箱（5% CO₂、95% 空气）中，培养 3～4 小时后用于记录电流。

实验前必须将细胞外液置于室温下平衡后再更换培养皿内的培养液，以防止溶液温度的剧烈变化。更换溶液时要防止细胞从培养皿底部脱落。倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20～25℃条件下进行膜片钳实验。选用 100 μ l 硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(PC-10，Narishige)上经两步拉制而成，玻璃电极热抛光后电极尖端口径为1.5～3.0 μ m，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极初始电阻为 1.5～2.5 MΩ 比较好。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧（GΩ ）封接后，补电极快电容（fast capacitance）。然后将细胞钳制在-60 mV，给予一短而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容（Slow capacitance）。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为-80 mV，细胞稳定4～6 min 开始记录电流。系统电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5～10 MΩ 的范围之内最好能维持不变，系统串联电阻（Rseries compensation）补偿一般在 30～60%之间。

结果如图6所示, omega-SLPTX-Ssm1a对DRG神经元上的钙通道电流有明显的增强作用，1µM omega-SLPTX-Ssm1a对钙电流的增加幅度为70%，10 µM omega-SLPTX-Ssm1a对钙电流的增加幅度为120%。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> 少棘蜈蚣多肽毒素 omega-SLPTX-Ssm1a的应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 426

<212> DNA

<213> Scolopendra subspinipes mutilans

<400> 1

atgccatccc tctgcataat tgcattattc ggaacgctaa cattttacac cctcatcccg 60

tcaatccaca ccctaaaatg cgtaagatgc gatggcccta tgagtaacta cgactgcaaa 120

actacctatc cggcagctga ggagtgtcca agcttgagcg gaggttcaag caattactgt 180

agcaaaaaag aaacctttac cagcaacgga aacttagagc aaaccaggcg ttattgcaat 240

tcagtggccg cgccttccac agcctgtacc gatttgaaaa ccggtggtaa attgtgcgaa 300

tattcgtgca ataccgatgg ttgcaattca gtcgccggca tggaaccgac ccgagccgtt 360

tatttcatag caatactgat gctggcatga tacaccttcg tacgtctgta ataaccacag 420

ttggat 426

<210> 2

<211> 83

<212> PRT

<213> Scolopendra subspinipes mutilans

<400> 2

Glu Glu Cys Pro Ser Leu Ser Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Cys Ser Lys

1 5 10 15

Lys Glu Thr Phe Thr Ser Asn Gly Asn Leu Glu Gln Thr Arg Arg Tyr

20 25 30

Cys Asn Ser Val Ala Ala Pro Ser Thr Ala Cys Thr Asp Leu Lys Thr

35 40 45

Gly Gly Lys Leu Cys Glu Tyr Ser Cys Asn Thr Asp Gly Cys Asn Ser

50 55 60

Val Ala Gly Met Glu Pro Thr Arg Ala Val Tyr Phe Ile Ala Ile Leu

65 70 75 80

Met Leu Ala

Claims

1.分子量为8811.3 Da，等电点为5.23的少棘蜈蚣毒素omega-SLPTX-Ssm1a在制备治疗钙通道疾病药物中的应用。

2.分子量为8811.3 Da，等电点为5.23的少棘蜈蚣毒素omega-SLPTX-Ssm1a作为钙通道研究的工具试剂应用。