CN112048005A - 新型冠状病毒s蛋白片段多倍体及其制备方法、检测试剂盒、疫苗及药物 - Google Patents

新型冠状病毒s蛋白片段多倍体及其制备方法、检测试剂盒、疫苗及药物 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种新型冠状病毒S蛋白片段多倍体及其制备方法、检测试剂盒、疫苗及药物，其中，新型冠状病毒S蛋白片段多倍体由至少两个新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段串联构成。本申请提供的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，与ACE2结合能力强，稳定性好，可以应用于新型冠状病毒的抗体检测和疫苗制备中，适用性强，适用范围广，其中，将新型冠状病毒S蛋白片段多倍体应用于新型冠状病毒的抗体检测中，可以有效提高抗体检测的特异性、灵敏度和敏感性，进而有效提高抗体检测的准确率。将新型冠状病毒S蛋白片段多倍体应用于疫苗制备中，疫苗可以刺激机体快速产生抗体，以使机体产生免疫作用。

Description

新型冠状病毒S蛋白片段多倍体及其制备方法、检测试剂盒、 疫苗及药物
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，特别涉及一种新型冠状病毒S蛋白片段多倍体及其制备方法、检测试剂盒、疫苗及药物。
背景技术
新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，新型冠状病毒S蛋白(SARS-CoV-2 spike蛋白)是Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是病毒最大的结构蛋白，由1255个氨基酸残基组成，能够刺激机体产生中和抗体和介导免疫反应。
现有研究证明，S蛋白与病毒侵入细胞的过程密切相关。S蛋白由两个结构域组成，靠近N端的部分形成球形结构域，靠近C端的部分形成穿膜的棒状结构域。S蛋白前体在宿主细胞质中合成后会被切成S1(球形部分)和S2(棒状部分)，其中，S1部分参与受体的识别和结合，其包含受体结合区域(Receptor Binding Domain，RBD)，S2部分参与病毒入侵宿主细胞。
由于S蛋白的RBD区域可以与受体结合，重组S蛋白可以被用于冠状病毒感染的抗原检测和疫苗制备，因此，如何高效利用S蛋白是诊治新型冠状病毒的一个重要基础。
但是，将S蛋白的编码序列克隆入一些表达载体后，其表达量很低，难以有效表达，此外，新型冠状病毒来势汹汹，至今未找到高效、高准确率的新型冠状病毒抗体检测方法和预防方法，因此如何利用新型冠状病毒S蛋白准确高效地检测、预防新型冠状病毒成为了亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种新冠病毒S蛋白片段多倍体及其制备方法、检测试剂盒、疫苗及药物，以解决现有技术中存在的技术缺陷。
本申请提供一种新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白片段多倍体由至少两个新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段串联构成。
进一步地，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段的核苷酸序列N端位于S蛋白核苷酸序列的第319-328位之间，C端位于S蛋白核苷酸序列的529-596位之间，更进一步地，C端位于S蛋白核苷酸序列的529-535位或560-596之间。
进一步地，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段的核苷酸序列为S蛋白核苷酸序列的第319-592位、第328-529位、第328-596位或第322-586位。
其中，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段的核苷酸序列优选为S蛋白核苷酸序列的第319-592位。
更进一步地，新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段二倍体的核苷酸序列可以表示为RBD-连接单元-RBD，如SEQ ID NO：1所示；新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段三倍体的核苷酸序列可以表示为RBD-连接单元-RBD-连接单元-RBD；新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段四倍体的核苷酸序列可以表示为RBD-连接单元-RBD-连接单元-RBD-连接单元-RBD；新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段五倍体的核苷酸序列可以表示为RBD-连接单元-RBD-连接单元-RBD-连接单元-RBD-连接单元-RBD，其他多倍体可以以此类推，不再赘述。其中RBD表示上述型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段的核苷酸序列，连接单元表示GG/GS序列、Fc片段、蛋白酶或蛋白交联剂。
所述新冠病毒S蛋白片段多倍体通过以下一种或几种连接方式形成：
(1)所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段之间通过GG或GS序列串联。
具体地，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段之间通过GGS、GGGS、GSGS、SGGS、GGGGS、GSGGS、GGSGS、GGSGGS、GGGSGS、GGGGGS或GGGSGGS序列串联。
(2)所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段的C端与人免疫球蛋白的Fc片段连接。
具体地，一个或多个所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段构成多倍体单元，所述多倍体单元通过所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段连接的Fc片段形成二聚体，并将所述二聚体作为新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
(3)所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段之间或所述新型冠状病毒S蛋白片段多倍体之间通过蛋白酶或蛋白交联剂相连。
具体地，所述酶包括转肽酶和联用蛋白连接酶，所述蛋白交联剂包括聚乙二醇、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、琥珀酸辛二酸戊二酸盐、二甲基二亚胺酯、二甲基亚胺酯、二甲基苯二酸亚胺酯和马来酰亚胺己烷。
本申请还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒为能够检测新型冠状病毒存在与否的试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
本申请还提供一种疫苗，所述疫苗为能够预防新型冠状病毒传染的疫苗，所述疫苗包括如上所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
进一步地，所述疫苗为mRNA疫苗、蛋白疫苗或腺病毒疫苗。
进一步地，所述疫苗中的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体激活聚集的B细胞受体，产生新型冠状病毒抗体。
本申请还提供一种药物，所述药物为能够预防或治疗新型冠状病毒的药物，所述药物包括如上所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
进一步地，所述药物中的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体与ACE2受体结合，抑制新型冠状病毒的侵袭。
本申请提供一种新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的制备方法，包括：
S1、获取新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的核苷酸序列；
S2、将所述新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的核苷酸序列插入至真核表达载体中，获得目标表达载体；
S3、采用所述目标表达载体转染哺乳动物细胞，在预设培养条件下采用无血清培养基对转染后的细胞摇床培养5-7天，直至细胞存活率降至50％；
S4、收集哺乳动物细胞培养的上清液，使用亲和层析的方法对上清液进行分离纯化处理，获得如上所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
本申请提供的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，由至少两个新型冠状病毒S蛋白受体结合区域(RBD)片段串联构成，与ACE2结合能力强，表达量高，稳定性好，可以应用于新型冠状病毒的抗体检测和疫苗制备中，适用性强，适用范围广，其中，将新型冠状病毒S蛋白片段多倍体应用于新型冠状病毒的抗体检测中，可以有效提高抗体检测的特异性、灵敏度和敏感性，进而有效提高抗体检测的准确率，将新型冠状病毒S蛋白片段多倍体应用于疫苗制备中，疫苗可以刺激机体快速产生抗体，以使机体产生免疫作用，并且疫苗稳定性好，质量易于监控。
本申请提供的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的制备方法，其通过获取多倍体的核苷酸序列、将核苷酸序列插入至表达载体中、采用目标表达载体转染哺乳动物细胞、对培养上清液进行纯化，可以有效提高新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的表达量，有效提高新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的纯度，为新型冠状病毒S蛋白片段多倍体在抗体检测、疫苗制备等方面的应用提供助力。
附图说明
图1是本申请一实施例所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的电泳结果图；
图2是本申请一实施例所述的带有Fc片段的新型冠状病毒S蛋白片段及其多倍体的电泳结果图；
图3是本申请一实施例所述的新型冠状病毒S蛋白受体血管紧张素转换酶2(ACE2)稳定表达细胞株的激光共聚焦图；
图4是本申请一实施例所述的采用流式分析的不带有Fc片段的新型冠状病毒S蛋白片段及其多倍体与ACE2表达细胞的结合能力图；
图5是本申请一实施例所述的采用流式分析的带有Fc片段的新型冠状病毒S蛋白片段及其多倍体与ACE2表达细胞的结合能力图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请的具体实施方式进行描述。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本申请中，血管紧张素转换酶2(ACE2)是一种可将血管紧张素II有效降解为血管紧张素1-7的羧肽酶，其已被确定为SARS-CoV的功能受体和SARA-CoV-2的潜在受体。
免疫球蛋白G(IgG)是血清中免疫球蛋白的主成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75％。IgG有4个亚型，即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG是体内最主要的抗体，具有抗病毒、中和病毒、抗菌及免疫调节的功能。
实施例1
本实施例提供一种新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，该新型冠状病毒S蛋白片段多倍体由至少两个新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段串联构成。
新型冠状病毒S蛋白以三聚体形态存在，每一个单体中约有1300多个氨基酸，其中300多个氨基酸构成了“受体结合区域片段”(RBD)，即S蛋白与ACE2相联结的地方。
在本实施例中，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段的核苷酸序列为S蛋白核苷酸序列的第319-592位、第328-529位、第328-596位或第322-586位。优选地，C端位于S蛋白核苷酸序列的529-535位或560-596之间。
需要说明的是，由于S蛋白序列很长，若在S蛋白中随意截取一段片段会有无数种可能性，所以在经过对S蛋白空间结构、作用特性的大量研究以及大量的试验后才得出“在新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段为S蛋白的第319-592位、第328-529位、第328-596位或第322-586位时，其能够发挥最强的结合作用与受体进行结合，效果最佳”的结论。以二倍体为例，在RBD片段为S蛋白第319-592位、第328-529位、第328-596位或第322-586位时，在空间结构上两个RBD片段刚好能与受体的两端均进行结合，而若RBD片段过短，即使其形成了二倍体，也只能与其中受体的一端结合，结合能力弱；若RBD片段过长，则会导致其不易表达，表达效果欠佳，同样会对其受体结合能力等方面产生负面影响。
其中，新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段优选为S蛋白核苷酸序列的第319-592位。在新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段为S蛋白核苷酸序列的第319-592位的情况下，其二倍体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
新型冠状病毒S蛋白片段多倍体可以为新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段即RBD的二倍体、三倍体、四倍体、五倍体、六倍体、七倍体、八倍体、九倍体、十倍体等。优选为RBD的二倍体至五倍体。
具体地，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段之间优选通过GG或GS序列串联，更为具体地，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段之间可以通过GGS、GGGS、GSGS、SGGS、GGGGS、GSGGS、GGSGS、GGSGGS、GGGSGS、GGGGGS或GGGSGGS等序列串联。
以新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段之间可以通过GGGS序列串联为例，在新型冠状病毒S蛋白片段多倍体为二倍体的情况下，其核苷酸序列可以为两个S蛋白片段通过GGGS序列串联而成，参见SEQ ID NO：1；在新型冠状病毒S蛋白片段多倍体为三倍体的情况下，其核苷酸序列可以为三个S蛋白片段通过GGGS序列串联而成；在新型冠状病毒S蛋白片段多倍体为四倍体的情况下，其核苷酸序列可以为四个S蛋白片段通过GGGS序列串联而成，在新型冠状病毒S蛋白片段多倍体为五倍体的情况下，其核苷酸序列可以为五个S蛋白片段通过GGGS序列串联而成，其他情况可以此类推，不再赘述。
分别对RBD二倍体、RBD三倍体、RBD四倍体和RBD五倍体进行蛋白质SDS-PAGE电泳处理，结果如图1所示，四个泳道分别表示RBD二倍体、RBD三倍体、RBD四倍体和RBD五倍体的SDS-PAGE电泳结果，从图1中可以看出，RBD二倍体、RBD三倍体、RBD四倍体和RBD五倍体均能够稳定表达。
由此可见，本实施例提供的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，由至少两个新型冠状病毒S蛋白受体结合区域(RBD)片段构成，表达量高，稳定性好，可以应用于新型冠状病毒的抗体检测和疫苗制备中，适用性强，适用范围广，其中，将新型冠状病毒S蛋白片段多倍体应用于新型冠状病毒的抗体检测中，可以有效提高抗体检测的特异性、灵敏度和敏感性，进而有效提高抗体检测的准确率，将新型冠状病毒S蛋白片段多倍体应用于疫苗制备中，疫苗可以刺激机体快速产生抗体。
实施例2
本实施例提供一种新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，该新型冠状病毒S蛋白片段多倍体由至少两个新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段构成。
在本实施例中，新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段的C端与人免疫球蛋白的Fc片段连接。
其中，一个或多个所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段构成多倍体单元，所述多倍体单元通过其中所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段连接的Fc片段形成二聚体，并将所述二聚体作为新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
具体地，该多倍体单元既可以为RBD片段(单倍体)，也可以为RBD多倍体。比如，两个新型冠状病毒二倍体通过Fc片段能够形成新型冠状病毒四倍体；两个新型冠状病毒三倍体通过Fc片段能够形成新型冠状病毒六倍体；两个新型冠状病毒四倍体通过Fc片段能够形成新型冠状病毒八倍体；两个新型冠状病毒五倍体通过Fc片段能够形成新型冠状病毒十倍体等。
在本实施例中，创新的为RBD片段、RBD多倍体的C端添加Fc片段，使RBD片段与RBD片段之间、RBD片段与RBD多倍体之间、RBD多倍体与RBD多倍体之间能够更加灵活的组合，以形成活性更强、与ACE2结合能力更高的二聚体，即新的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，为新型冠状病毒的检测与预防提供更多选择。
需要说明的是，实施例1与实施例2提供了两种结构不同的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，以n倍体为例，其既可以通过实施例1所述的由n个RBD片段通过GGGS等类似序列串联起来形成，也可以通过实施例2所述的由2个带有Fc片段的n/2倍体形成二聚体得到，其中带有Fc片段的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，其蛋白表达量相对更高，且在体内的半衰期相对更长，药效持续时间更久，更加有利于后期的开发。
实施例3
本实施例提供一种新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，该新型冠状病毒S蛋白片段多倍体由至少两个新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段构成。
在本实施例中，新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段之间或新型冠状病毒S蛋白片段多倍体之间通过蛋白酶或蛋白交联剂相连。
其中，所述蛋白酶包括但不限于转肽酶(Sortase)和联用蛋白连接酶(Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases 1，OaAEP1)，所述蛋白交联剂包括但不限于聚乙二醇、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(Disuccinimidyl Suberate)、琥珀酸辛二酸戊二酸盐、二甲基二亚胺酯、二甲基亚胺酯、二甲基苯二酸亚胺酯和马来酰亚胺己烷。
需要说明的是，在本实施例中，既可以通过上述酶或蛋白交联剂将RBD片段进行连接获得RBD多倍体，也可以通过上述酶或蛋白交联剂将如实施例1或2所述的RBD多倍体进行连接获得更高聚集形式的RBD蛋白。
以通过使用蛋白连接酶(OaAEP1)将RBD三倍体片段连接成为多个RBD三倍体片段的串联为例，其方法为：在原有的RBD三倍体序列的基础上，在N端插入GL，在C端插入NGL，构成GL-RBD-RBD-RBD-NGL的表达质粒。将上述表达载体转染哺乳动物细胞，培养5-7天后，收集培养上清，采用亲和纯化的方法纯化GL-RBD-RBD-RBD-NGL蛋白。将纯化后的蛋白以适当比例加入联用蛋白连接酶，孵育适当时间后，终止反应。取适量蛋白，SDS-PAGE分析酶链接的结果，最后用分子筛分离链接好的高聚片段，即得由多个RBD三倍体形成的更高聚集形式的RBD蛋白。
由此可见，本实施例提供的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，由至少两个新型冠状病毒S蛋白受体结合区域(RBD)片段构成，稳定性好，可以应用于新型冠状病毒的抗体检测和疫苗制备中，适用性强，适用范围广，其中，将新型冠状病毒S蛋白片段多倍体应用于新型冠状病毒的抗体检测中，可以有效提高抗体检测的特异性、灵敏度和敏感性，进而有效提高抗体检测的准确率，将新型冠状病毒S蛋白片段多倍体应用于疫苗制备中，疫苗可以刺激机体快速产生抗体。
对于上述实施例1-3提供的新型冠状病毒S蛋白多倍体，有以下三点需要说明：
第一，并不是所有蛋白的多倍体均能够具有强于其单倍体的效果，在实施例1-3中，由于与RBD片段及其多倍体结合的ACE2受体蛋白以及B细胞受体在细胞膜表面均是呈现高度聚集形式，因此高度聚集形式的ACE2受体蛋白、B细胞受体才会更易与高度聚集形式的RBD片段即RBD多倍体结合，这是通过一系列的机理研究及试验得到的。相反，如果受体不是以聚集形式存在的，相对应的蛋白单倍体和多倍体对于受体的结合能力几乎没有差异。并且，蛋白截取片段长度及其所加连接单元存在差异，也会对多倍体的结合能力产生影响，进而导致多倍体与受体结合能力不如单倍体。所以，不论是单倍体还是多倍体，其受体结合能力、使用效果等均是由其自身的特性而决定的，而并不是所有多倍体的效果均强于单倍体。
第二，实施例1-3提供的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的效果是基于其自身多倍体结构、连接单元等共同得到的，缺一不可，若仅仅将RBD制成多倍体，而不采用上述实施例提供的连接单元连接，则效果会大打折扣，比如若通过二硫键形成RBD多倍体，其与ACE2受体的结合能力以及其产生抗体、抑制病毒的能力远远不如实施例1-3提供的通过串联形成的RBD多倍体。
并且，RBD片段之间通过GG、GS等连接单元进行连接能够增强其多倍体的柔性，使多倍体易于弯曲折叠，易于与受体结合，而若RBD片段之间不通过连接单元连接，则会导致多倍体刚性较大，不易弯折，难于与受体进行结合。
第三，实施例1-3提供的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体是一种靶向RBD，靶向RBD相对于整个S蛋白而言是一种更安全的选择，能触发较少的非中和抗体的产生。
综上所述，实施例1-3提供的新型冠状病毒S蛋白多倍体，通过特定的结构、特定的连接单元、特定的连接方式形成，能够大幅提高其受体结合能力，提高稳定性、安全性，增大适用范围，经济效益好，适用于检测试剂盒、疫苗及药物中，效果佳。
实施例4
在实施例1-3的基础上，本实施例提供一种检测试剂盒，该检测试剂盒为能够检测新型冠状病毒存在与否的试剂盒，该检测试剂盒包括实施例1-3任意一项所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
如上所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体可以作为包被抗原用于检测试剂盒中，对受试者血清进行IgM+IgG联检，即全周期(早、中晚)监控新冠感染。
其中，IgM和IgG是人体对病原微生物(含病毒)感染产生的两种不同抗体。IgM是感染后最先出现的抗体，新型冠状病毒感染3-7天后达到峰值，后续逐步减少，IgM检测可提示早期感染。IgG是感染中后期时，B细胞进入淋巴结分化成浆细胞，大量产生的抗体，IgG检测提示感染后康复或感染中。
此外，如上所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体还可以用于检测试纸、检测仪器等其他具有新型冠状病毒检测功能的产品中，其应用原理与检测试剂盒相同，在此不再赘述。
本实施例提供的检测试剂盒，其通过新型冠状病毒S蛋白片段多倍体检测新型冠状病毒的存在与否，可以有效提高新型冠状病毒抗体检测的特异性、灵敏度和敏感性，进而有效提高抗体检测的准确率。
实施例5
在实施例1-3的基础上，本实施例提供一种疫苗，该疫苗为能够预防新型冠状病毒传染的疫苗，该疫苗包括如上所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
具体地，所述疫苗可以为mRNA疫苗、蛋白疫苗或腺病毒疫苗。将实施例1-3任意一项所述的新冠病毒多倍体用于预防新型冠状病毒的疫苗时，其进入机体细胞后可以通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主细胞产生细胞和体液免疫应答，以达到预防新型冠状病毒的效果。
具体地，由于B细胞受体(BCR)在B细胞表面呈现聚集形式，故相较于单个RBD蛋白，多聚形式的RBD蛋白即RBD多倍体更容易激活BCR，从而更易产生抗新冠病毒的抗体。
本实施例提供的疫苗，其中的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体可以刺激机体快速产生抗体，以使机体产生免疫作用，并且疫苗稳定性好，质量易于监控。
实施例6
在实施例1-3的基础上，本实施例提供一种药物，该药物为能够预防或治疗新型冠状病毒的药物，该药物包括如实施例1-3任意一项所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
本实施例提供的药物可以为片剂、胶囊剂、丸剂等各种剂型的药物，其还可以含有其他能够起到预防或治疗新型冠状病毒作用的组分，可视具体情况而定，本申请对此不做限制。
具体地，如图3所示，激光共聚焦结果显示ACE2受体蛋白在细胞膜表面呈现高度聚集形式，因此高度聚集形式的ACE2受体蛋白更易与高度聚集形式的RBD片段即RBD多倍体结合，RBD多倍体与ACE2受体蛋白的结合能力更强。
由于ACE2是新冠病毒的受体蛋白，故RBD多倍体与ACE2受体蛋白的结合力强也意味着其可以有效抑制新冠病毒与ACE2受体蛋白的结合，进而抑制新冠病毒对人体的侵袭。
本实施例提供的药物，其中的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体与ACE2受体蛋白结合能力强，可以有效抑制新冠病毒与ACE2受体蛋白的结合，以治疗新型冠状病毒，并且药物稳定性好，质量易于监控。
实施例7
本实施例提供一种新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的制备方法，包括步骤S1至步骤S4。
S1、获取新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的核苷酸序列。
S2、将所述新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的核苷酸序列插入至真核表达载体中，获得目标表达载体。
在实际应用中，可以基于每个所述新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的核苷酸序列合成其DNA片段，并在所述DNA片段的C端添加组蛋白标签，克隆至表达载体中，获得目标表达载体。
S3、采用所述目标表达载体转染哺乳动物细胞，在预设培养条件下采用无血清培养基对转染后的哺乳动物细胞摇床培养5-7天，直至细胞存活率降至50％。
具体地，可以在哺乳动物细胞转染24h后加入补料，在37℃、5％-8％CO2、100-150rpm的条件下采用无血清培养基对转染后的细胞进行摇床培养5-7天，每天记录细胞数目和存活率直至细胞存活率低于50％。
无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。无血清培养基包括基础培养基及添加组分两大部分。
在实际应用中，可以采用Gibco-Expi293表达培养基(Expi293TM ExpressionMedium，GibcoTM)、FreeStyteTM 293表达培养基(FreeStyleTM 293 Expression Medium，GibcoTM)、OPM-293 CD05培养基等对转染后的细胞进行培养，可视具体情况而定，本申请对此不做限制。
在本实施例中，采用无血清培养基对细胞即宿主细胞进行培养可以有效避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养效果，避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，避免血清组分对结果的影响，有利于体外培养细胞的分化，还有助于提高蛋白片段的表达水平并使细胞产品易于纯化。
S4、收集细胞培养的上清液，使用亲和层析的方法对上清液进行分离纯化处理，获得高效表达的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
在实际应用中，可以收集细胞培养的上清液，离心，收集第一次离心上清液，将所述第一次离心上清液再次进行离心，收集第二次离心上清液，并过滤，收集滤液；将所述滤液加入平衡的镍柱(Ni-NTA)中，加入低浓度咪唑去除杂蛋白，加入高浓度咪唑洗脱，收集洗脱液，即得如实施例1所述的高效表达的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
其中，离心处理的转速和时间、过滤处理选用的滤膜、咪唑的浓度值等均可以根据实际情况确定，本申请对此不做限制。第一次离心的转速优选为2000rpm，时间优选为10min，第二次离心的转速优选为15000rpm，时间优选为60min，在过滤处理的过程中，优选采用0.22μm的滤膜过滤，低浓度咪唑的浓度优选为10mM，高浓度咪唑的浓度优选为250mM。
在实际应用中，可以收集细胞培养的上清液，离心，收集第一次离心上清液，将所述第一次离心上清液再次进行离心，收集第二次离心上清液，并过滤，收集滤液；将所述滤液加入平衡的ProteinA柱中，加入磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)去除杂蛋白，加入Glycine-HCl溶液洗脱，并在洗脱液中立即加入Tris-HCl溶液以中和洗脱液，收集中和后的洗脱液，即得如实施例2所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
其中，离心处理的转速和时间、过滤处理选用的滤膜、Glycine-HCl溶液及Tris-HCl溶液的浓度、酸碱度等均可以根据实际情况确定，本申请对此不做限制。第一次离心的转速优选为2000rpm，时间优选为10min，第二次离心的转速优选为15000rpm，时间优选为60min，在过滤处理的过程中，优选采用0.22μm的滤膜过滤，Glycine-HCl溶液的浓度优选为0.1M，pH值优选为2.8，Tris-HCl溶液的浓度优选为1M，pH值优选为8.5。
本实施例提供的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的制备方法，其通过获取多倍体的核苷酸序列、将核苷酸序列插入至表达载体中、采用目标表达载体转染哺乳动物细胞、对培养上清液进行纯化，可以有效提高新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的表达量，有效提高新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的纯度，为新型冠状病毒S蛋白片段多倍体在抗体检测、疫苗制备等方面的应用提供助力。
实施例8
本实施例设置试验组1-10。其中，试验组1-5分别为不带有Fc片段的RBD片段(单倍体)、二倍体、三倍体、四倍体和五倍体，试验组6-10分别为带有Fc片段的RBD片段(单倍体)、二倍体、三倍体、四倍体和五倍体。其中，RBD片段的核苷酸序列为S蛋白核苷酸序列的第319-592位。
在本试验例中，通过以下方法制备RBD片段及RBD多倍体：
(1)分别合成上述试验组1-10的DNA片段并在C端加上组蛋白或者Fc标签，克隆到真核表达载体中；
(2)悬浮培养细胞，于对数生长期时将上述4种质粒分别转染细胞，转染24h后加入补料，每天记录细胞数目和存活率直至细胞存活率低于50％；
(3)收集细胞培养上清液，于2000rpm离心10分钟，以去除Expi293细胞，收集离心上清液，于15000rpm离心60分钟，进一步Expi293去除细胞碎片。收集第二次离心的上清液，并用0.22μm的滤膜过滤。收集滤液，按照实施例7所述采用亲和层析的方法，即得到试验组1-10的蛋白片段。
对试验组2-10的蛋白片段进行蛋白质SDS-PAGE电泳处理，结果如图1和图2所示。
图1是试验组2-5的不带有Fc片段的RBD多倍体表达产物的SDS-PAGE结果图，图2是试验组6-10的带有Fc片段的RBD片段及多倍体表达产物的SDS-PAGE结果图。从图中可以看出，RBD的各种多倍体均能够在哺乳动物细胞中稳定表达。
我们构建了带有mCherry荧光标签的新型冠状病毒刺突蛋白受体ACE2高表达的稳转细胞株，如图3所示，从该激光共聚焦图中可以看出，构建的ACE2稳定表达细胞株中，ACE2受体主要以高度聚集的形式稳定的表达于细胞膜上。
采用Alexa488标记试验组1-10的RBD片段，采用FACs检测试验组1-10的RBD蛋白片段与新型冠状病毒刺突蛋白受体ACE2表达细胞的结合能力，结果如图4和图5所示。图4是试验组1-5不带有Fc片段的RBD片段、RBD二倍体、RBD三倍体、RBD四倍体、RBD五倍体与ACE-2表达细胞的相互作用折线对比图，图5是试验组6-10带有Fc片段的RBD片段、RBD二倍体、RBD三倍体、RBD四倍体、RBD五倍体与ACE-2表达细胞的相互作用折线对比图，其中横轴表示RBD片段及RBD多倍体摩尔浓度的log值(M)，纵轴表示mCherry阳性细胞中Alexa488的平均荧光强度(MFI)，即表示与ACE2结合的RBD片段或RBD多倍体的数量。结果显示，单个RBD片段的IC50值和Kd值最高，RBD五倍体的IC50值和Kd值最低。可以看出，RBD蛋白与新型冠状病毒蛋白受体ACE2结合能力与RBD片段的数量呈正比。并且在RBD片段的核苷酸序列为S蛋白核苷酸序列的第319-592位的情况下，其IC50值和Kd值按照五倍体、四倍体、三倍体、二倍体、单倍体的顺序依次呈近乎指数级别的降低，这说明RBD多倍体相对于其单倍体片段而言，其与ACE受体的结合能力得到了显著提高。
可见，相对于普通RBD片段而言，本申请提供的RBD多倍体即新型冠状病毒S蛋白片段多倍体不仅表达稳定，更重要的是其与新型冠状病毒蛋白受体ACE2结合能力有了进一步地提升，这意味着其对于新型冠状病毒的检测能力、预防能力、治疗能力同样得到了进一步地提升。
实施例9
本实施例设置试验组1-6。其中，试验组1-3分别为S蛋白第328-596位的RBD片段(单倍体)、二倍体和三倍体，试验组4-6分别为S蛋白第328-529位的RBD片段(单倍体)、二倍体和三倍体。
在本实施例中，通过以下方法制备RBD片段及RBD多倍体：
(1)分别合成上述试验组1-3和4-6的DNA片段并在C端加上组蛋白或者Fc标签，克隆到真核表达载体中；
(2)悬浮培养细胞，于对数生长期时将上述4种质粒分别转染细胞，转染24h后加入补料，每天记录细胞数目和存活率直至细胞存活率低于50％；
(3)收集细胞培养上清液，于2000rpm离心10分钟，以去除Expi293细胞，收集离心上清液，于15000rpm离心60分钟，进一步Expi293去除细胞碎片。收集第二次离心的上清液，并用0.22μm的滤膜过滤。收集滤液，按照实施例7所述采用亲和层析的方法，即得到试验组1-3和4-6的蛋白片段。
分别采用Alexa488标记试验组1-3和4-6的RBD片段，采用FACs检测试验组1-3和4-6的RBD蛋白片段与新型冠状病毒刺突蛋白受体ACE2表达细胞的结合能力，结果如表1所示。
表1试验组1-3和4-6的RBD片段及其多倍体受体结合能力对比表
组别 Kd值 IC50值
试验组1 53.60 1.609e-007
试验组2 4.41 1.324e-008
试验组3 0.95 2.867e-009
试验组4 54.14 1.626e-007
试验组5 6.75 2.027e-008
试验组6 1.83 5.522e-009
结果显示，在RBD片段的核苷酸序列为S蛋白核苷酸序列的第328-596位和第328-529位的情况下，其IC50值和Kd值均按照五倍体、四倍体、三倍体、二倍体、单倍体的顺序依次呈近乎指数级别的降低，这说明本申请提供的RBD多倍体相对于其单倍体片段而言，能够显著提升其与ACE受体的结合能力，这意味着其对于新型冠状病毒的检测能力、预防能力、治疗能力同样得到了进一步地提升。
实施例10
本实施例设置试验组1-3和对照组1-3。其中，试验组1-3分别为RBD片段(单倍体)、二倍体和三倍体，其中试验组的RBD片段的核苷酸序列为S蛋白核苷酸序列的第319-592位，对照组1-3分别为RBD片段(单倍体)、二倍体和三倍体，其中对照组的RBD片段的核苷酸序列为S蛋白核苷酸序列的第319-540位。
在本实施例中，通过以下方法制备RBD片段及RBD多倍体：
(1)分别合成上述试验组1-3及对照组1-3的DNA片段并在C端加上组蛋白或者Fc标签，克隆到真核表达载体中；
(2)悬浮培养细胞，于对数生长期时将上述4种质粒分别转染细胞，转染24h后加入补料，每天记录细胞数目和存活率直至细胞存活率低于50％；
(3)收集细胞培养上清液，于2000rpm离心10分钟，以去除Expi293细胞，收集离心上清液，于15000rpm离心60分钟，进一步Expi293去除细胞碎片。收集第二次离心的上清液，并用0.22μm的滤膜过滤。收集滤液，按照实施例7所述采用亲和层析的方法，即得到试验组1-3以及对照组1-3的蛋白片段。
采用Alexa488标记试验组1-3以及对照组1-3的RBD片段，采用FACs检测试验组1-3以及对照组1-3的RBD蛋白片段与新型冠状病毒刺突蛋白受体ACE2表达细胞的结合能力，结果如表2所示。
表2试验组及对照组RBD片段及其多倍体受体结合能力对比表
组别 Kd值 组别 Kd值
试验组1 50.54 对照组1 55.40
试验组2 5.31 对照组2 45.57
试验组3 0.72 对照组3 37.29
横向对比表2可以看出，试验组1的RBD片段Kd值小于对照组1的RBD片段Kd值，这说明试验组1的RBD片段受体结合能力强于对照组1，试验组2的RBD二倍体Kd值小于对照组2的RBD二倍体Kd值，这说明试验组2的RBD片段受体结合能力强于对照组2，试验组3的RBD三倍体Kd值小于对照组3的RBD三倍体Kd值，这说明试验组3的RBD片段受体结合能力强于对照组3。
纵向对比表2可以看出，试验组的RBD二倍体、三倍体相对于其RBD片段Kd值属于指数级别的降低，即其结合能力呈现指数级别的增强，而对照组的RBD二倍体、三倍体相对于其RBD片段Kd值降低并不明显，可见对于对照组的RBD片段而言，即使使其形成多倍体，其与受体的结合能力也并未有显著的提高。
此外需要说明的是，本实施例提供的是能够模拟真实环境的细胞试验，可参考性高于纯蛋白试验。在纯蛋白试验中，对照组1的RBD片段Kd值为1.85，对照组2的RBD片段Kd值为1.23，可见其二倍体受体结合能力相对于单倍体同样无显著提高。
因此，本申请的RBD片段并不是随意选择的，而是基于其空间结构并经过严密的计算、大量的试验确定的，在RBD片段为S蛋白第319-592位时，其受体结合能力最强。
在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。
除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。
上面结合附图对本申请优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本申请并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请构思的前提下做出各种变化。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省中国科学院植物研究所、南京大学
<120> 新冠病毒S蛋白片段多倍体及其制备方法、检测试剂盒、疫苗及药物
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 563
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn
210 215 220
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys
225 230 235 240
Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp
245 250 255
Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe
275 280 285
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
290 295 300
Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys
305 310 315 320
Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
325 330 335
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr
340 345 350
Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln
355 360 365
Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
370 375 380
Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
385 390 395 400
Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
405 410 415
Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
420 425 430
Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr
435 440 445
Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
450 455 460
Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro
465 470 475 480
Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys
485 490 495
Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr
500 505 510
Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile
515 520 525
Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu
530 535 540
Asp Ile Thr Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His
545 550 555 560
His His His

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白片段多倍体由至少两个新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段串联构成。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段的核苷酸序列N端位于S蛋白核苷酸序列的第319-328位之间，C端位于S蛋白核苷酸序列的529-596位之间；
优选地，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段的核苷酸序列为S蛋白核苷酸序列的第319-592位、第328-529位、第328-596位或第322-586位。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段之间通过GG或GS序列串联；
优选地，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段之间通过GGS、GGGS、GSGS、SGGS、GGGGS、GSGGS、GGSGS、GGSGGS、GGGSGS、GGGGGS或GGGSGGS序列串联。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段的C端与人免疫球蛋白的Fc片段连接；
一个或多个所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段构成多倍体单元，所述多倍体单元通过所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段连接的Fc片段形成二聚体，并将所述二聚体作为新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区域片段之间或所述新型冠状病毒S蛋白片段多倍体之间通过蛋白酶或蛋白交联剂相连；
其中，所述蛋白酶包括转肽酶和联用蛋白连接酶，所述蛋白交联剂包括聚乙二醇、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、琥珀酸辛二酸戊二酸盐、二甲基二亚胺酯、二甲基亚胺酯、二甲基苯二酸亚胺酯和马来酰亚胺己烷。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为能够检测新型冠状病毒存在与否的试剂盒，所述检测试剂盒包括权利要求1-5任意一项所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
7.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗为能够预防新型冠状病毒传染的疫苗，所述疫苗包括权利要求1-5任意一项所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为mRNA疫苗、蛋白疫苗或腺病毒疫苗；
所述疫苗中的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体激活聚集的B细胞受体，产生新型冠状病毒抗体。
9.一种药物，其特征在于，所述药物为能够预防或治疗新型冠状病毒的药物，所述药物包括权利要求1-5任意一项所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
10.一种新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的制备方法，其特征在于，包括：
S1、获取新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的核苷酸序列；
S2、将所述新型冠状病毒S蛋白片段多倍体的核苷酸序列插入至真核表达载体中，获得目标表达载体；
S3、采用所述目标表达载体转染哺乳动物细胞，在预设培养条件下采用无血清培养基对转染后的细胞摇床培养5-7天，直至细胞存活率降至50％；
S4、收集哺乳动物细胞培养的上清液，使用亲和层析的方法对上清液进行分离纯化处理，获得权利要求1-5任意一项所述的新型冠状病毒S蛋白片段多倍体。
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