CN109206503A - 一种蛋白用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述蛋白包含TREM2受体蛋白的胞外段1‑171位氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述蛋白具有增加小胶质细胞的密度，促进小胶质细胞对Aβ的内吞及降解，降低大脑内Aβ水平及Aβ淀粉样斑沉积；增加小鼠海马区域CA3‑CA1的长时程增强和提高小鼠的学习记忆能力的用途。

Description

一种蛋白用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别是一种蛋白用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种以渐进性认知功能丧失为主要特征的神经退行性疾病，是最为常见的老年痴呆类型。在65岁以上的人群中，约7-10％患有AD；而超过80岁的人群中，罹患该病的数目高达40％。目前在中国，AD患者人数已超过800万，居世界第一位。由于AD严重危害老年人的身心健康并影响其生存质量，因而给病人及其家庭造成沉重的负担，成为当今严重的社会问题。因此，研究AD的发病机制并以此指导开发AD的早期预防和诊断手段、研制有效的治疗药物均有着十分重要的经济和社会意义。目前AD的发病机制还不清楚，也未研制出预防和治疗AD的理想药物。

AD患者早期出现记忆丧失、意识错乱、注意力差、失语、失用、缺乏方向感等症状，逐渐丧失思考及判断能力，难以与人沟通，生活无法自理。最终因神经细胞大量死亡影响到大部分脑区时，身体各组织器官受损，病人出现死亡。对AD病人尸检发现其大脑中具有两个主要的病理学特征：神经元内神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)及神经细胞外淀粉样斑(Amyloid plaques)沉积。淀粉样斑主要由β-淀粉样肽(Amyloid-β，通常缩写为Aβ)聚集而成，Aβ沉积引起大脑中神经突触的退化和神经元凋亡，最终引发认知功能损伤及痴呆。因而，抑制Aβ产生或促进Aβ降解对于AD的防治具有重要的意义。除了上述两种主要病理特征外，AD病人大脑内还有其他的病理特征：包括神经炎症过度激活、神经元丢失、神经突触丧失等。

2型髓系细胞触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)属于Ig(Immunoglobulin,Ig)超家族，其编码基因位于染色体6p21上，编码的核苷酸和氨基酸序列在Genbank中的编号为NM_018965.3。目前认为TREM2是晚发型AD的重要风险基因，主要调节神经炎症、小胶质细胞的存活及吞噬作用、小胶质细胞在淀粉样斑块周围的聚集等生理功能。在AD病人大脑中，TREM2蛋白水平显著增加。TREM2在代谢过程中受到金属蛋白酶ADAM的切割，释放其胞外可溶性片段(Soluble TREM2,sTREM2)。AD病人脑脊液中的sTREM2蛋白水平显著增加，并且与已知的AD标记物——磷酸化Tau及总Tau蛋白水平成正相关。但sTREM2在AD中的功能目前在国际范围内未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。

为实现上述目的，本发明提供一种氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。

进一步的，所述蛋白包含TREM2受体蛋白的胞外段1-171位氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述蛋白具有增加小胶质细胞密度的用途。

进一步的，所述蛋白具有增加小胶质细胞对Aβ内吞的用途。

进一步的，所述蛋白具有增加小胶质细胞对Aβ降解的用途。

进一步的，所述蛋白具有增加小鼠脑片海马区域CA3到CA1的长时程增强的用途。

进一步的，所述蛋白具有增加AD小鼠模型在水迷宫行为学检测中的学习记忆能力的用途。

进一步的，所述蛋白具有降低大脑中Aβ水平及Aβ淀粉样斑数目的用途。

表达所述蛋白的重组载体用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。

氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白，表达所述蛋白的mRNA脂质体、表达所述蛋白的DNA质粒载体或者携带表达所述蛋白基因的病毒载体在制备防治阿尔茨海默病药物领域将具有广阔的应用前景。

sTREM2的核苷酸序列为：

ATGGAGCCTCTCCGGCTGCTCATCTTACTCTTTGTCACAGAGCTGTCCGGAGCCCACAACACCACAGTGTTCCAGGGCGTGGCGGGCCAGTCCCTGCAGGTGTCTTGCCCCTATGACTCCATGAAGCACTGGGGGAGGCGCAAGGCCTGGTGCCGCCAGCTGGGAGAGAAGGGCCCATGCCAGCGTGTGGTCAGCACGCACAACTTGTGGCTGCTGTCCTTCCTGAGGAGGTGGAATGGGAGCACAGCCATCACAGACGATACCCTGGGTGGCACTCTCACCATTACGCTGCGGAATCTACAACCCCATGATGCGGGTCTCTACCAGTGCCAGAGCCTCCATGGCAGTGAGGCTGACACCCTCAGGAAGGTCCTGGTGGAGGTGCTGGCAGACCCCCTGGATCACCGGGATGCTGGAGATCTCTGGTTCCCCGGGGAGTCTGAGAGCTTCGAGGATGCCCATGTGGAGCACAGCATCTCCAGGAGCCTCTTGGAAGGAGAAATCCCCTTCCCA SEQ ID NO：1其中下划线为信号肽对应的核苷酸序列。

sTREM2的氨基酸序列为：

MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFP SEQ ID NO：2(其中下划线为信号肽的氨基酸系列)

sTREM2的氨基酸序列SEQ ID NO：2表达得到的第1-18位氨基酸为信号肽。

sTREM2在HEK 293T细胞中表达后呈现的氨基酸序列为：

HNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFP

SEQ ID NO：3

由实施例可得，通过脑立体定位注射sTREM2蛋白到5xFAD小鼠大脑中，能够显著增加小胶质细胞的密度，并促进小胶质细胞对寡聚体Aβ42的内吞和降解，降低5xFAD小鼠大脑海马与皮层组织中的淀粉样斑沉积。利用AAV病毒过表达sTREM2，能够显著降低5xFAD小鼠海马与皮层组织中盐酸胍可溶性Aβ水平，减少大脑内的淀粉样斑沉积，增加与学习记忆相关的LTP，增加5xFAD小鼠模型在水迷宫行为学检测中的学习记忆能力。

附图说明

图1是sTREM2蛋白的构建示意图；

图2是sTREM2-Fc融合蛋白的构建示意图；

图3是sTREM2-Fc融合蛋白及sTREM2蛋白的SDS-PAGE银染电泳图；

图4是sTREM2-Fc融合蛋白及sTREM2蛋白的Western blotting结果图；

图5是sTREM2蛋白增加原代小胶质细胞对Aβ42的内吞图；

图6是sTREM2蛋白增加原代小胶质细胞对Aβ42的降解图；

图7是sTREM2-Fc融合蛋白增加原代小胶质细胞对Aβ42的内吞图；

图8是sTREM2-Fc融合蛋白增加原代小胶质细胞对Aβ42的降解图；

图9是sTREM2-Fc融合蛋白诱导野生型小鼠(WT)及5xFAD小鼠脑片海马区域EPSP幅度增加趋势图；

图10是sTREM2-Fc融合蛋白诱导野生型小鼠(WT)及5xFAD小鼠脑片海马区域0-3分钟、51-60分钟的EPSP幅度增加图；

图11是sTREM2-Fc融合蛋白对海马区域Aβ淀粉样斑沉积的影响结果图；

图12是sTREM2-Fc融合蛋白对海马区域小胶质细胞密度的影响结果图；

图13是过表达sTREM2对5xFAD小鼠在水迷宫行为学检测中到达平台时间的影响结果图；

图14是过表达sTREM2对5xFAD小鼠在水迷宫行为学检测中停留在各个象限时间的影响结果图；

图15是过表达sTREM2对5xFAD小鼠脑片海马区域EPSP幅度增加趋势的影响结果图；

图16是过表达sTREM2对5xFAD小鼠脑片海马区域0-3分钟、51-60分钟的EPSP幅度增加的影响结果图；

图17是过表达sTREM2对5xFAD小鼠海马组织的盐酸胍可溶性Aβ水平的影响结果图；

图18是过表达sTREM2对5xFAD小鼠皮层组织的盐酸胍可溶性Aβ水平的影响结果图；

图19是sTREM2蛋白对5xFAD小鼠海马和皮层组织中Aβ淀粉样斑沉积的影响结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1sTREM2蛋白的制备

pFUSE-sTREM2-TEV-hIgG1-Fc1表达质粒构建：选用pFUSE-hIgG1-Fc1(可购买)为真核表达载体，克隆位点选用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，构建pFUSE-sTREM2-hIgG1-Fc1表达质粒。步骤如下：设计上游引物：5’-CGGAATTCATGGAGCCTCTCCGGCTGC-3’SEQ ID NO：5其中下划线为EcoR Ⅰ酶切位点；

下游引物：5’-CCGCTCGAGTTTGGGAAGGGGATTTCTC-3’SEQID NO：6其中下划线为XhoⅠ酶切位点；其中双下划线对应TEV酶切位点编码序列：GAAAACCTGTATTTTCAGGGA SEQ ID NO：7，TEV酶切位点的氨基酸序列为：ENLYFQG SEQ IDNO：8。

TREM2的核苷酸序列为(购买自北京义翘神州生物技术有限公司，货号HG11084-M)：

ATGGAGCCTCTCCGGCTGCTCATCTTACTCTTTGTCACAGAGCTGTCCGGAGCCCACAACACCACAGTGTTCCAGGGCGTGGCGGGCCAGTCCCTGCAGGTGTCTTGCCCCTATGACTCCATGAAGCACTGGGGGAGGCGCAAGGCCTGGTGCCGCCAGCTGGGAGAGAAGGGCCCATGCCAGCGTGTGGTCAGCACGCACAACTTGTGGCTGCTGTCCTTCCTGAGGAGGTGGAATGGGAGCACAGCCATCACAGACGATACCCTGGGTGGCACTCTCACCATTACGCTGCGGAATCTACAACCCCATGATGCGGGTCTCTACCAGTGCCAGAGCCTCCATGGCAGTGAGGCTGACACCCTCAGGAAGGTCCTGGTGGAGGTGCTGGCAGACCCCCTGGATCACCGGGATGCTGGAGATCTCTGGTTCCCCGGGGAGTCTGAGAGCTTCGAGGATGCCCATGTGGAGCACAGCATCTCCAGGAGCCTCTTGGAAGGAGAAATCCCCTTCCCACCCACTTCCATCCTTCTCCTCCTGGC CTGCATCTTTCTCATCAAGATTCTAGCAGCCAGCGCCCTCTGGGCTGCAGCCTGGCATGGACAGAAGCCAGGGACAC ATCCACCCAGTGAACTGGACTGTGGCCATGACCCAGGGTATCAGCTCCAAACTCTGCCAGGGCTGAGAGACACGTGASEQ ID NO：4

其中下划线为蛋白的跨膜(TM)和胞内段对应的核苷酸序列。

以cDNA(SEQ ID NO：4)为模板，可人工合成，SEQ ID NO：5为上游引物，SEQ ID NO：6为下游引物PCR克隆sTREM2-TEV表达基因，胶回收纯化目的产物，再利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切pFUSE-hIgG1-Fc1质粒，胶回收大片段，用相同的酶对PCR产物进行酶切并胶回收纯化酶切产物，利用T4 DNA连接酶连接sTREM2-TEV酶切产物和pFUSE-hIgG1-Fc1酶切产物，获得重组质粒pFUSE-sTREM2-TEV-hIgG1-Fc1，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并培养在含有Zeocin抗性的培养基中，挑选阳性克隆，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确认编码框正确，得到正确的重组质粒pFUSE-sTREM2-TEV-hIgG1-Fc1。

sTREM2蛋白的表达及纯化：蛋白构建如图1，将鉴定正确的重组质粒pFUSE-sTREM2-TEV-hIgG1-Fc1进行纯化，利用TurboFect转染试剂将此质粒转染到HEK 293T细胞系中。24小时后，将培养基更换成无血清的DMEM继续培养24小时，收集培养基并通过0.45μm滤膜去除细胞碎片，将培养基与Protein A-珠子4℃孵育过夜，于4℃中1000g离心5分钟，取沉淀利用PBS洗涤Protein A-珠子两次，最后用TEV酶切溶液(50mM pH 8.0Tris-HCl,0.5mMEDTA,1mM DTT)洗涤一次，加入TEV酶切溶液及TEV酶(含有His标签，购买自Promega)于4℃孵育过夜，1000g离心5分钟，取上清加入Complete His-Tag Purification Resin(购买自Roche)4℃孵育1小时以去除TEV酶，将蛋白溶液置于4kDa的透析膜内并在4℃PBS溶液中进行透析，利用4kDa的蛋白浓缩管(Millipore,UFC801024)离心浓缩sTREM2蛋白，测定蛋白含量、活性和纯度后，分装sTREM2蛋白，置于-80℃保存备用。

实施例2sTREM2-Fc融合蛋白的制备

pFUSE-sTREM2-hIgG1-Fc1表达质粒构建：选用pFUSE-hIgG1-Fc1为真核表达载体，克隆位点选用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，构建pFUSE-sTREM2-hIgG1-Fc1表达质粒。步骤如下：设计上游引物：5’-CGGAATTCATGGAGCCTCTCCGGCTGC-3’SEQ ID NO：5其中下划线为EcoRⅠ酶切位点；

下游引物：5’-CCGCTCGAGTTTGGGAAGGGGATTTCTC-3’SEQ ID NO：9其中下划线为XhoⅠ酶切位点；

以cDNA(SEQ ID NO：4)为模板，可人工合成，PCR克隆sTREM2表达基因。胶回收纯化目的产物，再利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切pFUSE-hIgG1-Fc1质粒，胶回收大片段。用相同的酶对PCR产物进行酶切并胶回收纯化酶切产物。利用T4DNA连接酶连接sTREM2和pFUSE-hIgG1-Fc1酶切产物，获得重组质粒pFUSE-sTREM2-hIgG1-Fc1，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并培养在含有Zeocin抗性的培养基中，挑选阳性克隆，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确认sTREM2-Fc编码框正确，得到正确的重组质粒pFUSE-sTREM2-hIgG1-Fc1。

sTREM2-Fc融合蛋白的表达及纯化：蛋白构建如图2，将鉴定正确的重组质粒pFUSE-sTREM2-hIgG1-Fc1进行纯化，利用TurboFect转染试剂将此质粒转染到HEK 293T细胞系中。24小时后，将培养基更换成无血清的DMEM继续培养24小时，收集培养基并通过0.45μm滤膜去除细胞碎片，将培养基与Protein A-珠子4℃孵育过夜，4℃中1000g离心5分钟，取沉淀利用PBS洗涤Protein A-珠子三次。再加入IgG Elution Buffer(购买自ThermoFisher)振荡10秒后，10000g离心30秒，迅速将上清加入含有1M pH8.0Tris-HCl溶液(1/10体积的IgG Elution Buffer)的离心管中进行中和，混匀后取2μL滴于pH试纸进行验证。将蛋白溶液置于10kDa的透析膜内并在4℃PBS溶液中进行透析。利用10kDa的蛋白浓缩管(Millipore,UFC801024)离心浓缩sTREM2-Fc蛋白，测定蛋白含量、活性和纯度后，分装得到的sTREM2-Fc融合蛋白，置于-80℃保存备用。

实施例3sTREM2蛋白、sTREM2-Fc融合蛋白的鉴定

蛋白纯度鉴定：将实施例2所得的sTREM2-Fc融合蛋白及实施例1所得的sTREM2蛋白经SDS-PAGE电泳，随后进行银染鉴定其纯度。鉴定结果如图3所示，sTREM2-Fc融合蛋白及sTREM2蛋白条带单一、纯度较高。

蛋白种类鉴定：将实施例2所得的sTREM2-Fc融合蛋白及实施例1所得的sTREM2蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，用特异性识别人源TREM2胞外段的抗体(R&Dsystems,AF1828)进行免疫印迹鉴定。鉴定结果如图4所示，sTREM2-Fc融合蛋白及sTREM2均可被识别人源TREM2的抗体识别，表明所构建的蛋白种类正确。

实施例4sTREM2蛋白对Aβ42内吞和降解的影响

用20nM的sTREM2蛋白(即实施例1所得的蛋白)或PBS处理原代小胶质细胞，12小时后加入带FAM荧光标签的寡聚体形式的Aβ42继续培养3小时后，收集细胞进行流式细胞仪检测胞内的荧光强度。结果如图5所示，sTREM2蛋白处理后，小胶质细胞对带FAM荧光标签的寡聚体形式的Aβ42的内吞水平为PBS处理对照组的1.7倍，说明sTREM2蛋白能够显著增加小胶质细胞对寡聚体Aβ42的内吞。

用20nM的sTREM2蛋白(即实施例1所得的蛋白)或PBS处理原代小胶质细胞，培养12小时后，使用溶酶体抑制剂处理30分钟，再加入寡聚体形式的Aβ42继续培养3小时，收集细胞并裂解，利用Aβ42ELISA方法检测经过处理的小胶质细胞胞内Aβ42的水平。Aβ42降解的量是由溶酶体抑制剂处理组减去没有抑制剂组的水平得到。结果如图6所示，sTREM2蛋白处理后，小胶质细胞内Aβ42的降解水平为PBS处理对照组的1.6倍，说明sTREM2蛋白能够显著增加小胶质细胞对寡聚体Aβ42的降解。

实施例5sTREM2-Fc融合蛋白对Aβ42内吞和降解的影响

用20nM的sTREM2-Fc融合蛋白(即实施例2所得的蛋白)或Fc对照蛋白处理原代小胶质细胞，12小时后加入带FAM荧光标签的寡聚体形式的Aβ42继续培养3小时后，收集细胞进行流式细胞仪检测胞内的荧光强度。结果如图7所示，sTREM2-Fc融合蛋白处理后，小胶质细胞对带FAM荧光标签的寡聚体形式的Aβ42的内吞水平为Fc对照组的2.2倍，说明sTREM2-Fc蛋白能够显著增加小胶质细胞对寡聚体Aβ42的内吞。

用20nM的sTREM2-Fc融合蛋白(即实施例2所得的蛋白)或Fc对照蛋白处理原代小胶质细胞，培养12小时后，使用溶酶体抑制剂处理30分钟，再加入寡聚体形式的Aβ42继续培养3小时，收集细胞并裂解，利用Aβ42ELISA方法检测经过处理的小胶质细胞胞内Aβ42的水平。Aβ42降解的量是由溶酶体抑制剂处理组减去没有抑制剂组的水平得到。结果如图8所示，sTREM2-Fc融合蛋白处理后，小胶质细胞内Aβ42的降解水平为Fc对照组的1.6倍，说明sTREM2-Fc蛋白能够显著增加小胶质细胞对寡聚体Aβ42的降解。

由于sTREM2-Fc融合蛋白促进小胶质细胞内吞和降解Aβ的能力与不带Fc标签的sTREM2蛋白十分类似，且起作用的都是sTREM2部分，Fc标签对蛋白的作用没有影响，因而后续实验例主要显示以sTREM2-Fc融合蛋白处理的结果图。

实施例6sTREM2-Fc融合蛋白对小鼠海马区域LTP的影响

分别从6月龄的C57BL/6J野生型小鼠和5xFAD小鼠中分离获得400μm脑片，将脑片置于人工脑脊液(126mM NaCl,2.5mM KCl,1.25mM NaH₂PO₄,2mM MgSO₄,2mM CaCl₂,26mMNaHCO₃,10mM Glucose)中并用20nM sTREM2-Fc融合蛋白(即实施例2所得的蛋白)或Fc对照蛋白处理脑片，于室温下孵育1小时，然后进行LTP记录，每组记录6-9片脑片。结果如图9、10所示，野生型小鼠及5xFAD小鼠的EPSP幅度增加随时间的推移逐渐减小。同一时间经过sTREM2-Fc融合蛋白处理的小鼠的EPSP幅度增加大于Fc对照组，说明sTREM2-Fc融合蛋白增加野生型小鼠及5xFAD小鼠脑片海马区域的LTP。

实施例7sTREM2-Fc融合蛋白对5xFAD小鼠大脑内Aβ淀粉样斑沉积的影响

取4只5xFAD小鼠，异氟烷麻醉后置于脑立体定位仪上，小心剪开头皮找到前囟位置，以前囟为原点找到位置(海马区域：±2.0mm，-2.2mm)，并在此位置打孔。利用微量注射器以0.2μL/min速度、深度2.0mm注射蛋白。左右半脑分别注射sTREM2-Fc融合蛋白(即实施例2所得的蛋白)或Fc对照蛋白，蛋白浓度为2μg/μL，各注射2.5μL。注射完成后让针头停留5min使蛋白充分扩散，缓慢抽出注射器，缝合伤口并涂上红霉素，将小鼠放回饲养笼饲养。注射7天后，收取脑组织，利用Aβ抗体(Abcam，MOAB2)进行淀粉样斑免疫荧光染色，统计分析Aβ淀粉样斑的分布。结果如图11所示，注射Fc对照蛋白的区域Aβ淀粉样斑沉积2.5％，注射sTREM2-Fc融合蛋白的区域Aβ淀粉样斑沉积2.0％。以上结果表明，sTREM2-Fc融合蛋白注射到海马区域后，能够显著降低该区域的Aβ淀粉样斑沉积。同时利用小胶质细胞特异性抗体Iba1进行免疫荧光染色，结果如图12所示，注射Fc对照蛋白的区域中小胶质细胞面积为2.9％，注射sTREM2-Fc融合蛋白的区域中小胶质细胞面积为6.8％。上述结果说明，sTREM2蛋白注射到海马区域后，能够显著增加小胶质细胞的密度。

实施例8过表达sTREM2对5xFAD小鼠学习记忆能力的影响

取24只5xFAD新生鼠(P1)，其中12只进行侧脑室注射AAV对照病毒(AAV2/8)(购自和元生物技术(上海)股份有限公司)，另外12只注射过表达sTREM2的AAV病毒(AAV2/8-sTREM2)(购自和元生物技术(上海)股份有限公司)。病毒注射6个月后，进行水迷宫实验检测小鼠的空间记忆能力。水迷宫检测完成后，分别取5只小鼠进行海马LTP记录。结果如图13、图14、图15、图16所示，图13中注射AAV2/8-sTREM2病毒的小鼠随着训练天数的增加，到达平台的时间越来越短，且其到达平台的时间显著低于注射AAV2/8对照病毒的小鼠。图14中注射AAV2/8-sTREM2病毒的小鼠在目标象限的时间为47.5％，显著高于AAV2/8对照组(其在目标象限的时间为27.6％)，说明过表达sTREM2蛋白的5xFAD小鼠在水迷宫行为学检测中展现出较优的记忆力，表明sTREM2蛋白能够增加AD小鼠模型的学习记忆能力。

图15中所示，5xFAD小鼠的EPSP幅度增加随时间的增加逐渐减小，同一时间注射AAV2/8-sTREM2病毒的小鼠的EPSP幅度增加大于注射AAV2/8对照病毒的小鼠；图16中所示，注射AAV2/8对照病毒的小鼠0-3min的EPSP幅度增加201％，51-60min的EPSP幅度增加128％，注射AAV2/8-sTREM2病毒的小鼠0-3min的EPSP幅度增加241％，51-60min的EPSP幅度增加174％，表明过表达sTREM2能够显著增加与学习记忆相关的LTP。

将剩余的7只注射AAV2/8-sTREM2病毒的小鼠和7只注射AAV2/8对照病毒的小鼠的大脑分为左半脑和右半脑：左半脑分离出海马和皮层组织，利用三步提取法(逐步用TBS，TBSX及5M盐酸胍溶液进行裂解)，利用ELISA方法分别检测这三种溶液中的Aβ40和Aβ42的蛋白水平，结果如图17、图18所示。右半脑进行Aβ淀粉样斑免疫荧光染色，并统计分析皮层和海马中Aβ淀粉样斑的分布，结果如图19所示。

图17中，注射AAV2/8对照病毒的小鼠的左半脑海马组织中，盐酸胍溶液提取的Aβ40水平为1402ng/mg，Aβ42水平为1352ng/mg；注射AAV2/8-sTREM2病毒的小鼠的左半脑海马组织中，盐酸胍溶液提取的Aβ40水平为1070ng/mg，Aβ42水平为902ng/mg。图18中，注射AAV2/8对照病毒的小鼠的左半脑皮层组织中，盐酸胍溶液提取的Aβ40水平为480ng/mg，Aβ42水平为496ng/mg；注射AAV2/8-sTREM2病毒的小鼠的左半脑皮层组织中，盐酸胍溶液提取的Aβ40水平为405ng/mg，Aβ42水平为404ng/mg。以上结果共同表明，过表达sTREM2能够显著降低5xFAD小鼠大脑海马和皮层组织中盐酸胍可溶性(表示纤维化等不可溶的Aβ形式)的Aβ40和Aβ42水平。

图19中，注射AAV2/8对照病毒的小鼠的右半脑海马组织中Aβ淀粉样斑沉积为1.3％,皮层组织中Aβ淀粉样斑沉积为2.1％；注射AAV2/8-sTREM2病毒的小鼠的右半脑海马组织中Aβ淀粉样斑沉积为1.0％；皮层组织中Aβ淀粉样斑沉积为1.5％。这些数据表明，过表达sTREM2能够显著降低5xFAD小鼠大脑海马和皮层组织中Aβ淀粉样斑的沉积。

综上所述，sTREM2蛋白能够显著增加小胶质细胞的密度，并促进小胶质细胞对寡聚体Aβ42的内吞和降解，降低5xFAD小鼠大脑海马与皮层组织中的淀粉样斑沉积；过表达sTREM2能够显著降低5xFAD小鼠海马与皮层组织中盐酸胍可溶性Aβ水平，减少大脑内的淀粉样斑沉积，增加与学习记忆相关的LTP，增加5xFAD小鼠模型在水迷宫行为学检测中的学习记忆能力。因而，sTREM2蛋白或表达该蛋白的mRNA脂质体、DNA质粒载体或者携带其编码基因的病毒载体在制备防治阿尔茨海默病药物领域将具有广阔的应用前景。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

厦门大学深圳研究院

<120> 一种蛋白用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途

<130> XMDX-17009-CNI

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggagcctc tccggctgct catcttactc tttgtcacag agctgtccgg agcccacaac 60

accacagtgt tccagggcgt ggcgggccag tccctgcagg tgtcttgccc ctatgactcc 120

atgaagcact gggggaggcg caaggcctgg tgccgccagc tgggagagaa gggcccatgc 180

cagcgtgtgg tcagcacgca caacttgtgg ctgctgtcct tcctgaggag gtggaatggg 240

agcacagcca tcacagacga taccctgggt ggcactctca ccattacgct gcggaatcta 300

caaccccatg atgcgggtct ctaccagtgc cagagcctcc atggcagtga ggctgacacc 360

ctcaggaagg tcctggtgga ggtgctggca gaccccctgg atcaccggga tgctggagat 420

ctctggttcc ccggggagtc tgagagcttc gaggatgccc atgtggagca cagcatctcc 480

aggagcctct tggaaggaga aatccccttc cca 513

<210> 2

<211> 171

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser

Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro

<210> 3

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu Gln Val

Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys Ala Trp

Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val Ser Thr

His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly Ser Thr

Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr Leu Arg

Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser Leu His

Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val Leu Ala

Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro Gly Glu

Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser Arg Ser

Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro

<210> 4

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atggagcctc tccggctgct catcttactc tttgtcacag agctgtccgg agcccacaac 60

accacagtgt tccagggcgt ggcgggccag tccctgcagg tgtcttgccc ctatgactcc 120

atgaagcact gggggaggcg caaggcctgg tgccgccagc tgggagagaa gggcccatgc 180

cagcgtgtgg tcagcacgca caacttgtgg ctgctgtcct tcctgaggag gtggaatggg 240

agcacagcca tcacagacga taccctgggt ggcactctca ccattacgct gcggaatcta 300

caaccccatg atgcgggtct ctaccagtgc cagagcctcc atggcagtga ggctgacacc 360

ctcaggaagg tcctggtgga ggtgctggca gaccccctgg atcaccggga tgctggagat 420

ctctggttcc ccggggagtc tgagagcttc gaggatgccc atgtggagca cagcatctcc 480

aggagcctct tggaaggaga aatccccttc ccacccactt ccatccttct cctcctggcc 540

tgcatctttc tcatcaagat tctagcagcc agcgccctct gggctgcagc ctggcatgga 600

cagaagccag ggacacatcc acccagtgaa ctggactgtg gccatgaccc agggtatcag 660

ctccaaactc tgccagggct gagagacacg tga 693

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cggaattcat ggagcctctc cggctgc 27

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ccgctcgagt ttccctgaaa atacaggttt tctgggaagg ggatttctc 49

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gaaaacctgt attttcaggg a 21

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ccgctcgagt ttgggaaggg gatttctc 28

Claims (9)

1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白包含TREM2受体蛋白的胞外段1-171位氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白具有增加小胶质细胞密度的用途。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白具有增加小胶质细胞对Aβ内吞的用途。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白具有增加小胶质细胞对Aβ降解的用途。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白具有增加小鼠脑片海马区域CA3到CA1的长时程增强的用途。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白具有增加AD小鼠模型在水迷宫行为学检测中的学习记忆能力的用途。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白具有降低大脑中Aβ水平及Aβ淀粉样斑数目的用途。

9.表达权利要求1所述蛋白的重组载体用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。