KR20210133227A - 뉴런 세포 흥분성을 정상화하고 드라베 증후군을 치료하기 위한 개재뉴런-특이적 치료제 - Google Patents

뉴런 세포 흥분성을 정상화하고 드라베 증후군을 치료하기 위한 개재뉴런-특이적 치료제 Download PDF

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조던 디미치슈타인
고든 피셸
오린 데빈스키
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더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드
프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
뉴욕 유니버시티
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Abstract

벡터에 함유된 이펙터 유전자 (예를 들어, SCN1A-코딩 폴리뉴클레오티드, Gq-DREADD-코딩 폴리뉴클레오티드, 또는 PSAM-코딩 폴리뉴클레오티드)의 발현을 뇌 내의 PV-발현 GABA작동성 개재뉴런에 또는 뉴런 세포 집단에 특이적으로 제한하는 인핸서 서열을 함유하도록 디자인된 치료 바이러스 벡터, 특히, 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터가 제공된다. rAAV 벡터, 그의 조성물 및 방법은 중증 발작, 인지 손상 및 조기 사망과 연관된 영아 간질의 형태인 드라베 증후군 (DS)을 포함하여 간질의 신경병리증상, 발작, 약리학상-난치성 형태로 고통받는 대상체를 치료하는데 유용하며, 이는 DS의 원인이 SCN1A 유전자에 의해 코딩되는 나트륨 채널의 기능의 소실을 포함하기 때문이다. 기재된 벡터는 유리하게는 유전자-요법 (SCN1A로) 또는 약물유전학의 수단에 의해 흥분-억제 균형을 복원함으로써 질환의 근원을 다루는, 특이성 및 민감성을 갖는 적절한 개재뉴런 또는 뉴런 세포 집단에 대한 이펙터 유전자의 발현을 복원한다.

Description

뉴런 세포 흥분성을 정상화하고 드라베 증후군을 치료하기 위한 개재뉴런-특이적 치료제
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 2월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 62/801,483, 2019년 3월 25일에 출원된 미국 가출원 번호 62/823,281, 및 2019년 10월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/916,477에 대한 우선권 및 그의 이익을 주장하는 국제 PCT 출원이며, 이들의 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방정부 지원된 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 허가 번호 MH111529 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 갖는다.
뇌 회로의 적절한 기능화 및 이들 회로 내에서 기능하는 뉴런 세포의 활성을 위해 주의 깊게 유지되어야 하는 흥분 및 억제 사이의 섬세한 균형이 존제한다. 뇌 회로망에서의 흥분 대 억제의 균형의 변경, 결함, 또는 붕괴는 다수의 신경학적, 신경원성, 또는 신경변성 질환 및 장애를 발생시키는 것으로 나타났다. 더욱이, 적절한 피질 개재뉴런 기능의 결여는 신경발달 및 신경학적 질환 및 장애와 관련된다.
비정상적 또는 이상 개재뉴런 기능 및 활성은 개재뉴런 발달의 과정으로부터의 일탈 (예를 들어, 유전적 돌연변이로 인한 배아 발달 동안의 이상 운명 선별화)의 결과일 수 있다. 이상 GABA작동성 신경전달 및 억제성 피질 회로의 변경은 심각한 신경학적 질환 및 장애, 예컨대 인지 손상 및 조기 사망과 연관된 영아 간질의 약물-저항성 형태인 드라베 증후군 (DS)을 갖는 환자를 고통스럽게 하는 임상적 특색 및 증상, 예를 들어, 발작 및 간질을 유발하고 유도할 수 있다.
특이성 및 민감성을 갖는 GABA작동성 개재뉴런, 또는 다른 피질 뉴런의 활성을 조정할 수 있는 치료 조성물 및 방법의 부족은 간질의 폭넓게 다양한 사례에서, 특히, 초점성 발작 및 DS를 앓고 있는 환자에서 발작을 경감시키는 의학계의 능력을 심하게 저해한다. 이러한 조성물 및 방법은 이들 파괴적인 상태, 뿐만 아니라 다른 신경정신 질환의 중증 증상을 퇴치하고 치료하기 위해 긴급히 필요하다. 본원에 기재된 생성물, 조성물 및 방법은 이들 필요를 다루고 충족시키기 위해 제공된다.
개시내용 및 실시양태의 요약
본원에서는 바이러스 벡터, 특히, 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터, 바이러스 입자, 및 그의 조성물 및 방법을 특색으로 한다. rAAV 벡터는 적어도 1종의 트랜스진 (예를 들어, 이펙터 유전자, 예컨대 hM3Dq 변형된 무스카린성 수용체 (Gq-DREADD), 약리학상 선택적 작동자 분자 (PSAM), 또는 치료 유전자, 예컨대 SCN1A), 및 트랜스진의 발현을 개재뉴런 (IN) 세포, 특히 급속-스파이킹 파르브알부민-발현 GABA작동성 개재뉴런 (본원에서 PV-개재뉴런 (PV IN)으로 지칭됨), 또는 뇌 피질의 뉴런 세포에 제한하는 특이적 조절성 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다 (함유하도록 분자적으로 조작된다). 한 실시양태에서, 특이적 조절성 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 SCN1A 부근의 인핸서 서열로부터 유래되며, rAAV에 의해 운반된 트랜스진의 발현을 뇌 내의 급속-스파이킹 파르브알부민-발현 GABA작동성 개재뉴런 집단에 제한한다. 한 실시양태에서, 치료 유전자는 SCN1A이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 개재뉴런 세포, 특히, 피질 개재뉴런 세포에서 염화나트륨 채널 Nav1.1을 코딩하는 SCN1A 유전자의 발현에 있어서 결핍성이거나 결함성인 개재뉴런 세포를 특이적으로 형질도입하고, SCN1A-결핍성 또는 결함성 개재뉴런의 흥분성을 정상화하며, 그에 의해 드라베 증후군 (DS)을 앓고 있는 대상체에서 발작 및 발작 증상을 경감시킨다.
한 측면에서, 적합한 바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 특히, 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터는 포유동물에서 GABA-작동성 PV-발현 개재뉴런, 또는 피라미드형 (PYR) 뉴런, 또는 혈관활성-장 펩티드 (VIP)-발현 피질 개재뉴런에서의 트랜스진의 발현을 제한하는데 사용되며, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 요소 폴리뉴클레오티드 (본원에서 조절 요소로도 지칭됨)를 포함한다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 시스로 제공된다. 한 실시양태에서, 조절 요소는 S5E1, S5E2, S5E3, S5E4, S5E5, S5E6, S5E7, S5E8, S5E9., 또는 S5E10, 특히 본원에 기재된 바와 같은 인간 E1-E10이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 본원에 기재된 바와 같은 인간 E11-E35이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 S5E1 (E1)이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 S5E2 (E2)이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 S5E3 (E3)이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 S5E4 (E4)이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 E5이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 E6이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 E11이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 E14이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 E22이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 E29이다.
한 측면에서, 인핸서를 포함하는 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 DS의 치료 및 요법을 위한 형질도입된 PV-발현 개재뉴런 세포에서의 SCN1A의 카피의 발현을 유도한다. 다른 실시양태에서, 인핸서를 포함하는 벡터 또는 rAAV 벡터는 초점성 및 약리학상 난치성 간질을 포함하여, 간질의 모든 형태의 치료를 위한 및 DS의 치료를 위한 PV-개재뉴런 활성의 화학유전적 조정을 위한 이펙터 유전자, 예컨대 Gq-DREADD 수용체 또는 예컨대 약리학상 선택적 작동자 분자 (PSAM), 직교 리간드-게이팅된 이온 채널, (및 그의 약리학상 선택적 이펙터 분자 (PSEM))의 발현을 유도한다.
한 측면에서, 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열 및 뇌의 파르브알부민 (PV)-발현 개재뉴런 세포에서의 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 제공된다.
한 측면에서, SCN1A 유전자 발현과 특이적으로 연관된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 및 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 인핸서 서열이 뇌의 PV-발현 개재뉴런 세포에서의 트랜스진의 발현을 제한하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다.
한 측면에서, 적합한 바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 특히, 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터는 포유동물에서의 뇌의 GABA-작동성, 혈관활성-장 펩티드-발현 피질 개재뉴런 세포 (VIP cIN)에서의 트랜스진의 발현을 제한하는데 사용되며, 여기서 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 요소는 시스로 제공된다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 본원에 기재된 바와 같은 S5E6이다.
한 측면에서, 적합한 바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 특히, 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터는 포유동물에서의 뇌 내의 GABA-작동성 개재뉴런 및 글루타메이트성 피라미드형 뉴런 둘 다에서의 트랜스진의 발현을 제한하는데 사용되며, 여기서 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 요소는 시스로 제공된다. 한 실시양태에서, 피라미드형 뉴런은 포유동물에서의 뇌의 피질층 5 내에 있다. 한 실시양태에서, 피라미드형 뉴런에 발현을 제한하는 인핸서 요소는 본원에 기재된 바와 같은 S5E5이다.
상기 기재된 측면의 바이러스 벡터의 실시양태에서, 트랜스진은 리포터 유전자, 디자이너 약물에 의해 배타적으로 활성화된 디자이너 수용체 (DREADD)-코딩 유전자, 약리학상 선택적 작동자 분자 (PSAM)-코딩 유전자, 또는 치료 유전자, 예를 들어, SCN1A이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 SCN1A 유전자이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 DREADD-코딩 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, DREADD-코딩 폴리뉴클레오티드는 케모겐 클로자핀-N4-옥시드 (CNO)에 의해 활성화된 Gq-DREADD-코딩 유전자이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 약리학상 선택적 작동자 분자 (PSAM)-코딩 유전자이다. 한 실시양태에서, 발현된 PSAM은 PSEM 리간드와 특이적으로 상호작용한다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터이다.
또 다른 측면에서, SCN1A 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분, 및 뇌의 개재뉴런 세포에서의 SCN1A 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터가 제공된다.
상기 기재된 측면의 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터의 실시양태에서, SCN1A 트랜스진에 의해 코딩되는 Nav1.1 나트륨 채널은 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터에 의한 개재뉴런 또는 뉴런 세포의 형질도입 후 개재뉴런 세포 또는 뉴런 세포에서 기능적으로 발현된다. 상기 기재된 측면의 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터의 실시양태에서, SCN1A 트랜스진에 의해 코딩되는 Nav1.1 나트륨 채널은 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터에 의한 개재뉴런 또는 뉴런 세포의 형질도입 후 GABA-작동성 개재뉴런 및 글루타메이트성 피라미드형 뉴런 둘 다에서 기능적으로 발현된다. 한 실시양태에서, 개재뉴런 세포는 GABA작동성 개재뉴런 세포이다. 한 실시양태에서, 개재뉴런 세포는 뇌 종뇌 내의 GABA작동성 개재뉴런 세포이다. 한 실시양태에서, GABA작동성 개재뉴런 세포는 파르브알부민 (PV)을 발현한다. 한 실시양태에서, 뉴런 세포는 뇌 피질 내의 피라미드형 뉴런 세포, 예를 들어, 글루타메이트성 피라미드형 세포이다. 상기 기재된 측면 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 마우스 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10 (각각 서열식별번호(SEQ ID NO): 5-14)의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 오르토로그, 예컨대 인간 오르토로그를 포함한다. 한 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10 (각각 서열식별번호: 15-24)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 인간 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10 (각각 서열식별번호: 15-24)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 인간 인핸서 요소 E2 (서열식별번호: 16)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 기재된 측면의 한 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 인간 인핸서 요소 E2 (서열식별번호: 16)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 기재된 측면의 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 또는 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 기재된 측면의 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 인간 인핸서 요소 E11 (서열식별번호: 25) 내지 E35 (서열식별번호: 49)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나 (또는 하나 이상)를 포함한다. 한 실시양태에서, 약 4.7 kb 초과의 폴리뉴클레오티드 서열을 패키징하는 벡터의 용량은 상동성 재조합에 의한 또는 억셉터 부위에 의해 매개되는 스플라이싱에 의한 다수의 rAAV 벡터의 재어셈블리를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 뇌 내의 SCN1A-발현 GABA작동성 개재뉴런 또는 글루타메이트성 피라미드형 뉴런 세포에 SCN1A 유전자를 전달하며, 여기서 SCN1A 유전자는 기능적으로 발현되며, 그에 의해 대상체에의 벡터의 투여 후 개재뉴런 및 뉴런 세포에서의 SCN1A의 정상 수준을 복원한다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간 환자이다. 한 실시양태에서, 인간 환자는 드라베 증후군 (DS)을 앓고 있는 영아이다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 측면 중 임의의 것의 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자가 제공된다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 측면 중 임의의 것의 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 한 실시양태에서, 세포는 상기 기재된 바와 같은 바이러스 입자를 포함한다.
또 다른 측면에서 상기 기재된 측면 중 임의의 것의 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터, 및 제약상 허용되는 비히클, 담체, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에서 상기 기재된 측면 중 임의의 것의 바이러스 입자, 및 제약상 허용되는 비히클, 담체, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 상기 기재된 측면의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 액체 투여 형태이다.
한 측면에서, SCN1A 발현 수준이 결핍성 또는 결함성인 GABA작동성 개재뉴런 세포에서의 SCN1A 발현의 정상 수준을 복원하는 방법으로서, 세포를 상기 기재된 측면 중 임의의 것의 바이러스 또는 rAAV 벡터, 또는 바이러스 입자 또는 그의 제약 조성물의 유효량과 접촉시켜, GABA작동성 개재뉴런 세포에서의 SCN1A 발현의 정상 수준을 복원하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 간질, 발작, 또는 드라베 증후군 (DS)을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 영아에서 영아 간질 및/또는 발작을 치료하는 방법으로서, 상기 기재된 측면 중 임의의 것의 바이러스 또는 rAAV 벡터, 상기 기재된 측면 중 임의의 것의 바이러스 입자, 또는 상기 기재된 측면 중 임의의 것의 제약 조성물의 치료 유효량을 영아에게 투여하여, 대상체에서 발작, 간질, 또는 DS를 치료하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 드라베 증후군 (DS)을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 대상체에서 DS를 치료하는 방법으로서, 상기 기재된 측면 중 임의의 것의 바이러스 또는 rAAV 벡터, 또는 바이러스 입자 또는 그의 제약 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하여, 대상체에서 DS를 치료하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 발작 및/또는 간질을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 대상체에서 발작 및/또는 간질을 억제하거나 또는 예방하는 방법으로서, SCN1A 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분, 대상체의 대뇌 피질의 개재뉴런 세포에서의 SCN1A 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 및 개재뉴런 세포 내로의 벡터의 형질도입을 향상시키는 캡시드를 포함하는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터를 대상체에게 전신적으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
상기 기재된 측면 중 임의의 것에서의 방법의 한 실시양태에서, 영아 또는 대상체는 인간 환자이다. 상기 기재된 측면 중 임의의 것에서의 방법의 한 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터에서의 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10, 또는 E11-E35 (각각 서열식별번호: 25-49)로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 인간 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10 (각각 서열식별번호: 15-24) 또는 E11-E35 (각각 서열식별번호: 25-49)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 E2 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이거나, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10 (각각 서열식별번호: 15-24) 또는 E11-E35 (각각 서열식별번호: 25-49)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유한다. 한 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 E5 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이다. 한 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 E6 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 인핸서 요소 E2 (서열식별번호: 16)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유한다. 다른 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)의 폴리뉴클레오티드 서열과 또는 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유한다.
한 측면에서, SCN1A 유전자를 발현하는 개재뉴런 세포 또는 뉴런 세포에서의 제한된 발현을 위한 트랜스진을 전달하여 발작 및/또는 간질의 억제 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 발작 및/또는 간질을 억제하거나 또는 예방하는 방법으로서, 세포를 SCN1A 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분, 및 대상체의 대뇌 피질의 개재뉴런 또는 뉴런 세포에서의 SCN1A 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터와 접촉시키며, 그에 의해 대상체에서 발작 및/또는 간질을 억제하거나 또는 예방하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
상기 기재된 측면 중 임의의 것에서의 방법의 한 실시양태에서, rAAV 벡터, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 또는 제약 조성물은 전신적으로 투여된다. 상기 기재된 측면 중 임의의 것에서의 방법의 한 실시양태에서, rAAV 벡터, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 또는 제약 조성물은 비경구로 또는 정맥내로 투여된다. 상기 기재된 측면 중 임의의 것에서의 방법의 한 실시양태에서, rAAV 벡터, 바이러스 입자, 또는 제약 조성물은 뇌내로 투여된다. 상기 기재된 측면 중 임의의 것에서의 방법의 한 실시양태에서, rAAV 벡터, 바이러스 입자, 또는 제약 조성물은 예방제로서 투여된다. 상기 기재된 측면 중 임의의 것에서의 방법의 한 실시양태에서, 방법은 부가적 항-간질 치료를 영아 또는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열 및 뇌의 혈관활성-장 펩티드-발현 피질 개재뉴런 세포 (VIP cIN)에서의 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 제공된다. 또 다른 측면에서, SCN1A 유전자 발현과 특이적으로 연관된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 및 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 인핸서 서열이 뇌의 혈관활성-장 펩티드-발현 피질 개재뉴런 세포 (VIP cIN)에서의 트랜스진의 발현을 제한하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다. 한 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20)이다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 SCN1A 유전자이다.
또 다른 측면에서, 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열 및 뇌의 피라미드형 뉴런에서의 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 제공된다. 또 다른 측면에서, SCN1A 유전자 발현과 특이적으로 연관된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 및 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 인핸서 서열이 뇌의 피라미드형 뉴런에서의 트랜스진의 발현을 제한하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다. 한 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 인핸서 서열은 뇌의 피질층 5 내의 피라미드형 뉴런에서의 트랜스진의 발현을 제한한다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 SCN1A 유전자이다.
한 측면에서, 서열식별번호: 15-24로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 SCN1A를 발현하는 뉴런 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다. 한 실시양태에서, 뉴런 세포는 파르브알부민 피질 개재뉴런 (PV cIN), 피라미드형 (PYR) 뉴런, 또는 혈관활성-장 펩티드 피질 개재뉴런 (VIP cIN)이다.
한 측면에서, 서열식별번호: 25-27로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Pvalb를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다.
한 측면에서, 서열식별번호: 28-31로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Acan을 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다.
한 측면에서, 서열식별번호: 32-39로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Tmem132c를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다.
한 측면에서, 서열식별번호: 40 또는 서열식별번호: 41로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Lrrc38을 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다.
한 측면에서, 서열식별번호: 42 또는 서열식별번호: 43으로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Inpp5j를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다.
한 측면에서, 서열식별번호: 44-47로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Mef2c를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다.
한 측면에서, 서열식별번호: 48 또는 서열식별번호: 49로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Pthlh를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다.
한 측면에서, 서열식별번호: 15-49로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 PV-발현 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터가 제공된다.
상기 기재된 측면 중 임의의 것의 바이러스 벡터의 한 실시양태에서, 표적 세포는 PV-발현 뉴런 세포이다. 상기 기재된 측면 중 임의의 것의 바이러스 벡터의 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터이다.
한 측면에서 상기 기재된 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 바이러스 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
한 측면에서 상기 기재된 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자가 제공된다. 한 측면에서 상기 기재된 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 세포가 제공된다.
한 측면에서 상기 기재된 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 바이러스 벡터, 또는 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자 및 제약상 허용되는 비히클, 담체, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에서, 대상체의 뉴런 세포에서의 트랜스진의 발현을 제한하는 방법으로서, 서열식별번호: 15-49의 서열을 포함하는 적어도 1종의 인핸서 요소 폴리뉴클레오티드 및 트랜스진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전달 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 트랜스진이 뉴런 세포에서 특이적으로 발현되는 것인 방법이 제공된다. 방법의 한 실시양태에서, 트랜스진은 SCN1A이다. 한 실시양태에서, 뉴런 세포는 파르브알부민을 발현하는 피질 개재뉴런 (PV cIN)이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 15-18 또는 서열식별번호: 21-24에 제시된 서열을 포함한다.
상기 방법의 또 다른 실시양태에서, 뉴런 세포는 피라미드형 (PYR) 세포이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 19에 제시된 서열을 포함한다.
상기 방법의 또 다른 실시양태에서, 뉴런 세포는 혈관활성-장 펩티드를 발현하는 피질 개재뉴런 (VIP cIN)이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 20에 제시된 서열을 포함한다.
상기 기재된 방법 및 그의 실시양태의 한 실시양태에서, 전달 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 rAAV이다. 방법의 한 실시양태에서, 전달 벡터는 뇌에 투여된다. 방법의 한 실시양태에서, 전달 벡터는 국소적으로 또는 전신적으로 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 측면에서, 서열식별번호: 15-49로부터 선택된 인간 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 제공된다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터이다. 실시양태에서, 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자는 상기 기재된 바이러스 벡터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 상기 기재된 바이러스 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포는 상기 기재된 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자를 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 상기 기재된 바이러스 벡터, 또는 상기 기재된 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자, 및 제약상 허용되는 비히클, 담체, 또는 희석제를 포함한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 기재된 측면 및 실시양태가 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 통상의 기술자에게 기재된 실시양태에 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 제공한다: 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)]; [The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)]; [The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 [Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에 사용된 바와 같은 하기 용어는 달리 특정되지 않는 한, 하기 그들에 할당된 의미를 갖는다.
"투여하는"이란 조성물, 작용제, 치료 생성물, 예를 들어, 트랜스진 (예를 들어, 이펙터 또는 치료 유전자)을 함유하는 바이러스 벡터 (rAAV) 등을 대상체에게 제공하거나, 공급하거나, 분배하거나, 조성물 등을 대상체에게 적용하거나 그와 접촉시키는 것을 의미한다. 투여하는 또는 투여는 다수의 경로, 예컨대, 예를 들어, 제한 없이, 비경구 또는 전신, 정맥내 (IV), (주사), 피하, 경막내, 두개내, 근육내, 진피, 진피내, 흡입, 직장, 질내, 국소, 경구, 피하, 근육내, 또는 안구내 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 실시양태에서, 투여는 전신성, 예컨대 접종, 주사, 또는 정맥내 주사에 의해서이다.
"작용제"란 펩티드, 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 소분자 화학적 화합물, 항체, 또는 그의 단편을 의미한다.
"변경"이란 표준 기술 공지된 방법, 예컨대 본원에 기재된 것들에 의해 검출된 바와 같은 유전자 또는 폴리펩티드의 발현 수준 또는 활성의 변화 (증가 또는 감소)를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 변경은 발현 수준의 10% 변화, 25% 변화, 40% 변화, 또는 발현 수준의 50% 이상의 변화를 포함한다.
"개선시키다" 및 "개선"이란 질환의 발달 또는 진행을 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나, 감소시키거나, 정지시키거나, 안정화시키는 것을 의미한다.
"유사체" 또는 "유도체"란 동일하지 않지만, 유사한 기능적 또는 구조적 특색을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드 유사체는 천연 발생 폴리펩티드에 비해 유사체의 기능을 향상시키는 특정 생화학적 변형을 가지면서, 상응하는 천연-발생 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유한다. 이러한 생화학적 변형은 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 결합 활성을 변경시키지 않으면서, 유사체의 프로테아제 저항성, 막 투과성, 또는 반감기를 증가시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오티드 유사체는 천연 발생 폴리뉴클레오티드에 비해 유사체의 기능을 향상시키는 특정 변형을 가지면서, 상응하는 천연-발생 폴리뉴클레오티드의 생물학적 활성을 보유한다. 이러한 변형은 DNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 친화도, 반감기, 및/또는 뉴클레아제 저항성을 증가시킬 수 있으며, 유사체는 비천연 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다.
그것이 신경학적 또는 신경원성 질환, 장애, 또는 병리증상, 예컨대 발작 또는 간질에 적용될 때, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "위험이 있는"은 신경학적 또는 신경원성 질환, 장애, 또는 병리증상에 대한 가족력 또는 유전적 위험 인자 유전자를 갖는 환자 또는 개체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "담체"는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 또는 바이러스 입자를 포함하는 조성물 또는 제약 조성물이 함께 투여될 수 있는 희석제, 아주반트, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 제약 및 제약상 허용되는 담체는 석유, 동물, 식물성 또는 합성 기원의 것들을 포함하여, 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광물유, 참깨유 등을 포함한다. 물 또는 수성 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 특히 주사가능한 용액에 대한 담체로서 채용될 수 있다. 담체는 또한 결합제 (압축 환제에 대해), 활주제, 캡슐화제, 향미제, 및 착색제 중 1종 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 고체 투여 형태를 포함할 수 있다. 적합한 제약 담체는 이.더블유. 마틴(E.W. Martin)에 의한 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "포함하다", "포함하는", "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 그들에게 할당된 의미를 가질 수 있으며, "수반하다", "수반하는" 등을 의미할 수 있고; "로 본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어지다"는 마찬가지로 미국 특허법에서 할당된 의미를 가지며, 상기 용어는 개방-말단이어서, 나열된 것의 기본적 또는 신규한 특징이 나열된 것 초과의 존재에 의해 변화되지 않는 한, 나열된 것 초과의 존재를 허용하지만, 종래 기술 실시양태는 배제한다.
"DREADD"는 "디자이너 약물에 의해 배타적으로 활성화된 디자이너 수용체"에 대한 두문자어이며, 이는 바이러스 벡터 (DREADD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유함)의 사용에 의해 또는 유전적 번식을 통해, 대상체, 또는 그의 세포, 예를 들어, PV-발현 개재뉴런 내로 투여되거나 특이적으로 도입될 수 있는 변형된 G 단백질 커플링된 수용체 (GPCR)이다. DREADD는 뉴런의 흥분 및 억제에 대한 정확한 수준의 시간적 제어를 허용하는 화학 유전적 또는 "화학유전적" 분자로 공지되어 있다. DREADD의 발현 후, 이는 특이적 리간드 (또는 효능제)에 의해 활성화될 수 있으며, 이는 정맥내 주사에 의해 또는 경구로 투여될 수 있다. DREADD 및 그의 리간드는 직교이도록 디자인되며, 즉, 이들은 서로에 특이적으로 결합하고, 교차-반응하지 않는다. 비제한적 예로서, 5가지 상이한 부류의 DREADD가 사용을 위해 이용가능하다: hM3Dq는 세포에서 칼슘 수준을 상승시켜, 폭발 발화를 유발하고; hM4Di는 cAMP 및 특정 칼륨 채널의 활성화를 저하시켜, 뉴런 침묵을 유발하고, 또한 시냅스전 신경전달물질 방출을 억제하고; GsD는 cAMP를 향상시켜, 조정 신호전달을 유발하고; Rq(R165L)는 정신활성 약물의 메커니즘과 관련된 특이적 경로인 아레스틴 신호전달을 향상시키고; κ-오피오이드 수용체 DREADD 또는 KORD는 뉴런의 흥분을 감소시키거나 억제하고, 또한 시냅스전 신경전달물질 방출을 억제한다. (예를 들어, 문헌 [Kelly Rae Chi, 2015, The Scientist]; 및 [S.M. Sternson and B.L. Roth, 2014, Ann Rev Neuroscience, 37:387-407] 참조).
약리학상 선택적 작동자 분자 (PSAM) 및 약리학상 선택적 이펙터 분자 (PSEM)로 지칭되는 직교 리간드-게이팅된 이온 채널은 DREADD의 사용과 유사한 방식으로, 광유전적 작용제로서 및 광유전적 방법에서 사용되는 화학유전적 분자의 다른 유형이다. 각각의 PSAM은 PSEM 동종체 합성 효능제에 의해 배타적으로 활성화된다. 예로서, 3가지 특이적 PSAM/PSEM 도구가 디자인되었으며, 각각은 뉴런 흥분성을 제어하기 위한 상이한 이온 전도도 특성을 갖는다. (예를 들어, 문헌 [Shapiro, M.G. et al., 2012, ACS Chem. Neurosci., 3(8):619-629] 참조). 이들은 양이온-선택적 활성화제, PSAMQ79G,Q139G-5HT3HC/PSEM22S, 음이온-선택적 사일런서, PSAML141F,Y115F-GlyR/PSEM89S, 및 제3 Ca2+-선택적 채널, PSAMQ79G,L141S-nAChR V13'T/PSEM9S를 포함한다. (동일 문헌, 및 문헌 [Magnus, C.J. et al., 2011, Science, 333(6047):1292-1296] 참조). DREADDS 및 PSAM-PSEM 둘 다는 수 분 내지 수 시간의 시간적 방식으로 뉴런 활성에 대한 제어를 허용한다. (예를 들어, 문헌 [Kelly Rae Chi, 2015, The Scientist]; 및 [S.M. Sternson and B.L. Roth, 2014, Ann Rev Neuroscience, 37:387-407] 참조). 예로서, 상이한 PSAM은 뉴런, 예를 들어, 뉴런에서의 E/I 균형을 제어하기 위해 다양한 이온 채널 및 PSEM과 함께 사용되었다. 이러한 PSAM-PSEM 쌍은 제한 없이, 양이온이 세포 내로 유동하는 것을 허용하고 흥분성을 신장시키는, 리간드 PSEM89S에 의해 활성화되는 PSAML141F, Y115F- 5HT3 HC; 뉴런을 침묵시키는, 리간드 PSEM89S에 의해 활성화되는 PSAML141F, Y115F - GlyR; 및 칼슘 신호전달을 향상시키는, 리간드 PSEM9S에 의해 활성화되는 PSAMQ79G, L141S-nAChR V13을 포함한다. 2가지 상이한 PSEM 리간드가 있기 때문에, PSAM-PSEM은 또한 동일한 동물 (대상체)에서 조합될 수 있다.
"검출하다"는 검출되는 분자, 화합물, 또는 작용제의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 지칭한다.
"질환"이란 세포, 조직, 기관, 또는 신체의 일부, 예컨대 뇌의 대뇌 피질 및 뇌 조직을 포함하여 뇌의 정상적인 기능에 유해하게 영향을 미치거나, 이를 손상시키거나 이를 방해하는 임의의 상태 또는 장애를 의미한다. 한 실시양태에서, 질환은 발작 또는 간질이다. 또 다른 실시양태에서, 질환은 드라베 증후군이다.
"유효량"이란 비치료된 환자에 비해 질환의 증상을 개선시키는데 요구되는 양을 의미한다. 질환의 치료적 치료를 위한 기재된 방법을 실시하는데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여의 방식, 대상체의 연령, 체중, 및 일반적 건강에 따라 다양하다. 궁극적으로, 담당 의사, 임상의, 또는 수의사는 적절한 양 및 투여량 처방을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효"량으로 지칭된다. 한 실시양태에서, 유효량은 신경학적 질환 또는 장애, 예컨대 발작, 간질, 드라베 증후군 (DS)의 증상, 또는 그의 중증도를 감소시키거나, 개선시키거나, 약화시키거나, 억제하거나, 안정화시키는데 요구되는 특이적 인핸서 서열 (예를 들어, SCN1A-특이적 인핸서, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 E1-E10) 및 그 안에 삽입된 1종 이상의 트랜스진 서열 (예를 들어, SCN1A)을 포함하는 rAAV 벡터의 양이다. 또 다른 실시양태에서, 유효량은 개재뉴런 세포, 예컨대 GABA작동성 개재뉴런 세포 또는 PV-발현, GABA작동성 개재뉴런 세포의 특이적 억제 활성을 유발하는데 요구되는 특이적 인핸서 서열 (예를 들어, SCN1A-특이적 인핸서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 E1-E10) 및 그 안에 삽입된 1종 이상의 트랜스진 서열 (예를 들어, SCN1A)을 포함하는 rAAV 벡터의 양이다. 한 실시양태에서, 인핸서는 PV-개재뉴런 활성의 화학유전적 조정을 위해 트랜스진, 예를 들어, SCN1A 또는 Gq-DREADD 또는 PSAM과 같은 이펙터의 발현을 PV-개재뉴런 세포에 제한하는, 본원에 기재된 바와 같은 E2이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "내인성"은 특정 유기체 (예를 들어, 인간)에서 또는 유기체 내의 특정 위치 (예를 들어, 기관, 조직, 또는 세포, 예컨대 인간 세포)에서 천연적으로 발견되는 분자 (예를 들어, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 또는 보조인자)를 기재한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "외인성"은 특정 유기체 (예를 들어, 인간)에서 또는 유기체 내의 특정 위치 (예를 들어, 기관, 조직, 또는 세포, 예컨대 인간 세포)에서 천연적으로 또는 내인적으로 발견되지 않는 분자 (예를 들어, 폴리펩티드, 펩티드 핵산, 또는 보조인자)를 지칭한다. 외인성 물질은 외부 공급원으로부터 유기체로 또는 그로부터 추출된 배양된 물질로 제공되는 것들을 포함한다.
"조절 요소", "조절 서열", "인핸서", "인핸서 요소" 또는 "인핸서 서열"은 1종 이상의 결합 단백질(들), 예를 들어, 전사 인자(들)에 의해 인식되고 결합되는 1개 이상의 결합 부위를 함유하는, 약 50-2500개의 뉴클레오티드의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 영역, 예를 들어, DNA 또는 RNA를 지칭한다. 일반적으로, 결합 단백질은 특정 표적 유전자의 전사가 일어날 가능성을 증가시키는 활성화제로서 기능한다. 인핸서는 유전자의 프로모터에 대하여 그들의 위치, 거리 또는 배향에 독립적으로 전사를 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 인핸서 서열은 유전자의 상류에, 유전자의 하류에, 유전자의 코딩 영역 내에, 또는 유전자로부터 최대 100만개의 염기 쌍 떨어져 위치할 수 있다. 전형적으로, 인핸서에의 DNA 결합 단백질(들) 또는 전사 인자(들)의 결합은 DNA의 형태를 변화시키거나 변경시키며, 그에 의해 DNA에 결합된 전사 인자(들) 사이에 또는 중에서 상호작용이 일어나는 것을 허용한다.
인핸서는 전사 인자의 조합에 결합할 수 있고, 그 후 매개자 복합체 또는 TFIID의 성분과 상호작용하여 RNA 폴리머라제 II (RNAPII)를 동원하는 것을 돕는 DNA 서열의 클러스터로서 기재되었다. 이를 달성하기 위해, 인핸서-결합된 전사 인자는 개재하는 서열을 루프화하고, 유전자의 프로모터 영역에 접촉하고, 따라서 인핸서가 거리-독립적 방식으로 작용하는 것을 허용한다. 또한, 진핵생물 유전자의 활성화는 염색질 섬유의 탈-치밀화를 요구하며, 이는 염색질 구조를 변경시키고, 다른 단백질에의 DNA의 접근성을 증가시키는 히스톤 변형 효소 또는 ATP-의존적 염색질 리모델링 복합체를 동원할 수 있는 인핸서-결합된 전사 인자에 의해 수행된다. (인핸서 기능의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Ong, C.-T. and Corces, V.G., 2011, Nat. Rev. Genetics, 12(4):283-293] 참조).
본원에 기재된 바와 같이, SCN1A 유전자 부근의 10개의 인핸서를 트랜스진, 즉, SCN1A의 발현을 그의 대부분이 SCN1A 유전자를 발현하는 PV-발현 개재뉴런 세포 (PV-세포)에 제한하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 본원에서 S5E1 (E1) - S5E10 (E10)으로 지칭되는 단리된 인핸서 서열은 SCN1A의 발현을 GABA-작동성 개재뉴런에 제한하는 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예로서, E2 인핸서 (S5E2)는 SCN1A를 발현하는 PV-발현 개재뉴런에 트랜스진의 발현을 표적화하고 제한하는 것으로 입증되었다. SCN1A를 발현하는 세포의 대부분은 PV-발현 개재뉴런이 아님이 인식될 것이다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서는 모든 SCN1A-발현 뉴런에서라기 보다는 PV-개재뉴런에서, 트랜스진, 예를 들어, SCN1A 또는 또 다른 이펙터 유전자, 예를 들어, Gq-DREADD 또는 PSAM의 발현의 제한을 허용한다. 추가의 예로서, 단리된 E5 인핸서 (S5E5)는 뇌 내의 글루타메이트성 피라미드형 뉴런에 트랜스진의 발현을 표적화하고 제한하는 것으로 입증되었다. 실시양태에서, 이러한 인핸서는 본원에 기재된 바와 같은 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 천연 발생 환경으로부터 단리된다. 이러한 인핸서 요소는 세포, 조직, 또는 신체의 영역, 예컨대 뇌에의 전달을 위한 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터에 사용된다.
"단편"이란 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 부분을 의미한다. 이 부분은 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 함유한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90개, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
"기능적으로 발현된"이란 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 또는 rAAV 벡터의 폴리뉴클레오티드에 함유되거나 그 내로 삽입된 유전자 또는 트랜스진이 감염되거나 형질도입된 세포에서 발현되고, 세포에서 기능적 및/또는 활성인 그의 코딩된 생성물을 생산하는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 세포는 개재뉴런 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 GABA작동성 개재뉴런 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 파르브알부민 (PV)을 발현하는 GABA작동성 개재뉴런 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 뉴런, 특히, 글루타메이트성 피라미드형 개재뉴런 세포이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 검출가능한 리포터 유전자, 예컨대 d-토마토(d-Tomato), ChR2, GFP, RFP 등이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 디자이너 약물에 의해 배타적으로 활성화된 디자이너 수용체 (DREADD) 또는 Gq-DREADD이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 PSAM이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 나트륨 채널 Nav1.1을 코딩하는 SCN1A이다.
"혼성화"는 상보적 핵염기 사이에 왓슨-크릭, 후그스틴 또는 반전된 후그스틴 수소 결합에 의해서일 수 있는 수소 결합을 의미한다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 쌍형성하는 상보적 핵염기이다.
용어 "개재뉴런"은 감각 뉴런 및 운동 뉴런 사이의 자극을 중계하는 중추 신경계 (CNS)에서의 뉴런 (신경 세포), 또는 국소 회로 뉴런을 지칭한다. 일반적으로, 뉴런은 신경 자극의 전달에 있어서 주로 기능하는 특수화된 세포이다. 뉴런은 세포 프로세스, 예컨대 수상돌기 및 액손을 갖는다. 뉴런의 세포체에서 보다 짧은 프로세스인 수상돌기는 다른 뉴런으로부터 입력을 받고, 세포체로 신호를 전도한다. 액손은 세포체의 보다 긴 단일 프로세스이며, 뉴런의 끝 (시냅스 말단으로 지칭됨)을 향해 신호를 중계한다. 뉴런의 3가지 주요한 유형은 감각 뉴런, 개재뉴런 (CNS의), 및 운동 뉴런을 포함한다. 인간 뇌에는, 감각 뉴런으로부터 자극을 받는 약 1000억개의 개재뉴런이 있다. 개재뉴런은 '통합'으로 지칭되는 기능에서 적절한 반응을 위해 다른 뉴런으로부터 수신된 정보를 해석하고, 운동 뉴런으로 자극을 중계한다.
용어 "단리된", "정제된", 또는 "생물학적으로 순수한"은 그의 천연 상태에서 발견되는 바와 같은 그에 정상적으로 수반되거나 연관되는 성분으로부터 다양한 정도로 유리된 물질을 지칭한다. "단리하다"는 원래 공급원 또는 환경으로부터의 분리의 정도를 나타낸다. "정제하다"는 단리보다 더 높은 분리의 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 임의의 불순물이 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 생물학적 특성에 물질적으로 영향을 미치거나, 다른 유해 결과를 유발하지 않도록, 다른 물질이 충분히 없다. 즉, 폴리뉴클레오티드 (핵산), 폴리펩티드, 또는 펩티드는 그것이 재조합 DNA 기법, 또는 화학적 전구체에 의해 생산되는 경우 세포성 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지 또는 화학적으로 합성되는 경우 다른 화학물질이 실질적으로 없는 경우 정제된다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석적 화학 기법, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고-성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산, 단백질, 또는 펩티드가 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 발생시키는 것을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들어 인산화 또는 글리코실화로 처리될 수 있는 단백질에 대해, 상이한 변형은 별개로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 발생시킬 수 있다.
"단리된 폴리뉴클레오티드"란 핵산 분자, 예컨대 본원에 기재된 핵산 분자가 유래되는 유기체의 천연-발생 게놈에서의 유전자에 플랭킹된 유전자가 없는 핵산 (예를 들어, DNA)을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어, 벡터 내로; 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 내로; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 혼입된; 또는 다른 서열과 독립적으로 별개의 분자 (예를 들어, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 생산된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 상기 용어는 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자, 뿐만 아니라 추가적인 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
"단리된 폴리펩티드"란 천연적으로 그것을 수반하는 성분으로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 그것이 천연적으로 연관되는 단백질 및 천연-발생 유기 분자로부터 적어도 60 중량% 유리된 경우 단리된다. 바람직하게는, 제제는 적어도 75 중량%, 또는 적어도 85 중량%, 또는 적어도 90 중량%, 또는 적어도 99 중량%의 바람직한 폴리펩티드이다. 단리된 폴리펩티드는 예를 들어, 천연 공급원으로부터의 추출에 의해, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 단백질을 화학적으로 합성함으로써 얻어질 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해, 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
"마커"란 질환 또는 장애와 연관된 발현, 수준 또는 활성의 변경을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 한 실시양태에서, 마커는 SCN1A 폴리뉴클레오티드 또는 SCN1A 폴리펩티드이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어, 각각 핵산 또는 아미노산 서열 내의 뉴클레오티드 염기 또는 아미노산 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 1개 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는 전형적으로 본원에서 서열 내의 잔기의 위치에 이어진 원래 잔기를 확인함으로써 및 새롭게 치환된 잔기의 아이덴티티에 의해 기재된다. 본원에서 제공된 아미노산 치환 (돌연변이)을 생성하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 의해 제공된다.
"작용제를 얻는"에서와 같이 본원에 사용된 바와 같은 "얻는"은 작용제를 합성하거나, 구입하거나, 다르게는 획득하는 것을 포함한다.
"폴리뉴클레오티드"란 1개 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 예를 들어, 이중-가닥 (ds) DNA 폴리뉴클레오티드, 단일-가닥 (ss) DNA 폴리뉴클레오티드, dsRNA 폴리뉴클레오티드, 또는 ssRNA 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 용어는 양성-센스 (즉, 단백질-코딩) DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이는 전사되어 RNA 전사체를 형성할 수 있고, 이는 후속적으로 하나 이상의 임의적 RNA 프로세싱 사건 (예를 들어, RNA 스플라이싱에 의한 인트론 절제, 또는 5' 캡 또는 3' 폴리아데닐 꼬리의 라이게이션) 후 번역되어 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 상기 용어는 추가적으로 하나 이상의 임의적 RNA 프로세싱 사건 후 직접적으로 번역되어 폴리펩티드를 생산할 수 있는 양성-센스 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 예컨대 재조합 아데노-연관된 바이러스 벡터 (rAAV) 내에 함유될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 핵염기 및 산성 모이어티를 포함하는 화합물, 예를 들어, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 전형적으로, 중합체성 핵산, 예를 들어, 3개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 인접한 뉴클레오티드가 포스포디에스테르 연결을 통해 서로에 연결된 선형 분자이다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기 (예를 들어 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 3개 이상의 개별적인 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체 (예를 들어, 적어도 3개의 뉴클레오티드의 스트링)를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 핵산은 예를 들어, 게놈, 전사체, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, snRNA, 플라스미드, 코스미드, 염색체, 염색분체, 또는 다른 천연 발생 핵산 분자의 맥락에서 천연 발생일 수 있다. 한편, 핵산 분자는 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하여, 비-천연 발생 분자, 예를 들어, 재조합 DNA 또는 RNA, 인공 염색체, 조작된 게놈, 또는 그의 단편, 또는 합성 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드일 수 있다. 더욱이, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 예를 들어, 포스포디에스테르 백본 이외를 갖는 유사체를 포함한다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제되고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생산되고, 임의로 정제되고, 화학적으로 합성되는 등일 수 있다. 적절한 경우, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 및 백본 변형을 갖는 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 지시되지 않는 한, 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 천연 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화된 염기); 개재된 염기; 변형된 당 (2'-예를 들어,플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)이거나 이를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는"은 환자 (예를 들어, 인간 환자)에게 투여되는 경우, 생리학적으로 허용가능하고, 전형적으로 알레르기 또는 다른 유해 반응, 예컨대 위 연동, 현기증 등을 생성하지 않는 분자 실체, 생물학적 생성물 및 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 치료" 등은 장애 또는 상태를 갖지 않지만, 발달시킬 위험이 있거나, 그에 대해 감수성이거나, 성향을 갖는 대상체에서 장애 또는 상태를 발달시킬 개연성을 감소시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "위형화된"은 1종 이상의 외래 바이러스 구조적 단백질, 예를 들어, 외피 당단백질을 함유하는 바이러스 벡터를 지칭한다. 위형화된 바이러스는 외피화된 바이러스의 외피 당단백질 또는 비-외피화된 바이러스의 캡시드 단백질이 원래 바이러스 게놈 및 게놈 복제 장치의 공급원과는 상이한 바이러스로부터 기원하는 것일 수 있다. (D.A. Sanders, 2002, Curr. Opin. Biotechnol., 13:437-442). 위형화된 바이러스의 외래 바이러스 외피 단백질은 숙주 향성을 변경시키거나, 바이러스 입자의 안정성을 증가시키거나 감소시키는데 이용될 수 있다. 위형화된 바이러스 벡터의 예는 야생형 바이러스의 외부 상에 천연적으로 발생하지 않는 1종 이상의 외피 당단백질을 함유하는 바이러스를 포함한다. 위형화된 바이러스 벡터는 세포를 감염시키고, 바이러스 벡터 내에 함유된, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질 또는 분자, 예를 들어, 리포터 또는 이펙터 단백질 또는 분자, 예를 들어, SCN1A 유전자에 의해 코딩되는 나트륨 채널 Nav1.1을 발현하고 생산할 수 있다.
단백질 또는 핵산의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 자연에서 (또는 천연 발생 단백질 또는 핵산 서열에서) 발생하지 않지만, 종종 또는 전형적으로 분자 생물학적 또는 분자 유전학적 도구 및 관련 기술분야의 통상의 실시자에 의해 실시되는 기법을 이용한 인간 조작의 생성물인 단백질 또는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 재조합 단백질 또는 핵산 분자는 임의의 천연 발생 서열에 비해 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 돌연변이를 포함하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"감소시키다"란 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 음성 변경을 의미한다.
"참조물"이란 표준 또는 대조군 상태를 의미한다. "참조 서열"은 서열 비교를 위한 기초로서 사용되는 한정된 서열이다. 참조 서열은 특정된 서열의 하위세트 또는 그의 전체, 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 절편, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다. 폴리펩티드에 대해, 참조 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16개의 아미노산, 적어도 약 20개의 아미노산, 적어도 약 25개의 아미노산, 또는 약 35개의 아미노산, 약 50개의 아미노산, 또는 약 100개의 아미노산일 것이다. 핵산에 대해, 참조 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50개의 뉴클레오티드, 적어도 약 60개의 뉴클레오티드, 적어도 약 75개의 뉴클레오티드, 또는 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 약 300개의 뉴클레오티드, 또는 그 주위의 또는 그 사이의 임의의 정수일 것이다.
"특이적으로 결합하다"란 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플에서 주어진 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자를 인식하고 그에 결합하지만, 다른 분자를 실질적으로 인식하고 그에 결합하지 않는 핵산 분자, 폴리펩티드, 또는 그의 복합체 (예를 들어, 결합 단백질, 예컨대 전사 인자 및 그의 동종체 핵산 결합 영역), 또는 화합물, 또는 분자를 의미한다.
"대상체"란 인간 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 예를 들어, 마모셋, 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 소, 말, 개, 양, 또는 고양이 포유동물, 또는 양, 염소, 라마, 낙타, 또는 설치류 (래트, 마우스), 페럿, 거빌, 햄스터, 또는 금화조를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 포유동물을 의미한다. 대상체는 전형적으로 본원에 기재된 바와 같은 특정 질환 또는 상태 (예를 들어, 신경정신, 신경학적, 또는 신경원성 질환, 장애, 또는 병리증상, 예컨대 발작, 간질, 또는 DS)에 대한 치료를 받는 환자, 예컨대 인간 환자이다. 대상체 및 환자의 예는 이러한 질환 또는 상태에 대한 치료를 받는 또는 이러한 질환 또는 상태를 가질 위험이 있는 포유동물, 예컨대 인간을 포함한다.
본원에서 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 처음 및 마지막 값을 포함하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료 유효량"은 치료를 필요로 하는 환자에의 투여 시 질환, 장애, 및/또는 상태의 하나 이상의 증상의 발병을 치료하고/거나, 약화시키고/거나, 감소시키고/거나, 진단하고/거나, 예방하고/거나, 지연시키는 치료제의 양을 지칭한다. 일부 경우에, 치료 유효량은 또한 질환 또는 그의 증상, 예컨대 신경학적, 신경변성, 또는 신경원성 질환 또는 장애를 발달시킬 위험이 있는 대상체에게 예방적으로 (예를 들어, 완전히-진행된 질환의 발달에 앞서) 투여되는 치료제의 양을 지칭할 수 있다. 한 실시양태에서, 장애는 드라베 증후군 (DS)이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 장애 및/또는 그와 연관된 증상을 감소시키거나 개선시키는 것을 지칭한다. 불가능하지는 않지만, 장애 또는 상태를 치료하는 것은 장애, 상태 또는 그와 연관된 증상이 완전히 제거될 것을 요구하지는 않음이 인식될 것이다. "치료하다" 또는 "치료"는 목적이 비바람직한 생리학적 변화 또는 장애를 예방하거나 감속시키는 (줄이거나 감소시키는) 것인 치료적 치료를 지칭할 수 있다. 유익한 또는 바람직한 임상적 결과는 검출가능하든 비검출가능하든, 증상의 경감, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 완화 (부분적이든 전체적이든)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 치료를 필요로 하는 것들은 상태 또는 장애를 이미 갖는 것들, 뿐만 아니라 상태 또는 장애를 가질 성향이 있는 것들 또는 상태 또는 장애가 예방되어야 할 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 치료" 등은 질환, 장애, 또는 상태를 갖지 않지만, 발달시킬 위험이 있거나, 발달시키기 쉬운 대상체에서 질환 상태, 또는 질환의 완전한 발달을 억제하거나 차단하는 것, 또는 대상체에서 질환, 장애 또는 상태를 발달시킬 개연성을 감소시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 핵산 (예를 들어, DNA 벡터, 예컨대 플라스미드), RNA 벡터, 바이러스 또는 다른 적합한 레플리콘 (예를 들어, 바이러스 벡터)을 지칭한다. "벡터"는 숙주 세포에서 발현되고/거나, 그에서 복제되고/거나, 그 내로 통합되는 벡터의 능력을 파괴하지 않으면서 외래 핵산이 삽입될 수 있는 핵산 (폴리뉴클레오티드) 분자를 추가로 지칭한다. 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내로의 외인성 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 다양한 벡터가 개발되었다. 벡터는 관심의 유전자 (예를 들어, 트랜스진, 예컨대 치료 유전자, 리포터 유전자, 또는, 보다 구체적으로, Nav1.1 나트륨 채널을 코딩하는 SCN1A 유전자)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 예를 들어, 세포의 게놈 내로의 이들 폴리뉴클레오티드 서열의 전사, 번역, 및/또는 통합을 조절할 수 있는 추가적인 서열 요소를 함유할 수 있다. 벡터는 유전자 전사를 지정하는 조절 서열, 예컨대 프로모터, 예를 들어, 서브게놈 프로모터, 영역 및 인핸서 영역을 함유할 수 있다. 벡터는 이들 유전자의 번역의 속도를 향상시키거나, 유전자 전사로부터 초래되는 mRNA의 안정성 또는 핵 이출을 개선시키는 폴리뉴클레오티드 서열 (인핸서 서열)을 함유할 수 있다. 이들 서열 요소는 발현 벡터 상에 운반되는 유전자의 효율적인 전사를 지정하기 위해, 예를 들어, 5' 및 3' 비번역된 영역, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES), 및/또는 폴리아데닐화 신호 부위를 포함할 수 있다. 벡터, 예컨대 본원에 기재된 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 또한 발현 벡터로 지칭될 수 있다.
"형질도입"은 바이러스 또는 바이러스 벡터에 함유된 DNA 또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 1종 이상의 트랜스진이 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 세포 내로 도입되거나 전달되는 프로세스를 지칭하며, 여기서 DNA 또는 폴리뉴클레오티드는 발현된다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터에 의해 세포 내로 형질도입된 DNA 또는 폴리뉴클레오티드는 세포에서 안정하게 발현된다. 일부 경우에, 바이러스 또는 바이러스 벡터는 세포를 감염시키는 것으로 이야기된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비히클"은 제약 조성물의 용매, 희석제, 또는 담체 성분을 지칭한다.
"바이러스 입자" (비리온으로도 지칭됨)란 코어 바이러스 게놈 또는 유전 물질 (RNA 또는 DNA); 유전 물질을 둘러싸고 이를 보호하는 캡시드로 지칭되는 단백질 코트; 및, 일부 경우에, 캡시드를 둘러싸는 지질의 외피를 포함하는 독립적인 입자로서 존재하는 바이러스 (감염성 작용제)를 의미한다. 바이러스 입자는 그것이 세포를 감염시키고, 세포내가 되기 전의 바이러스의 형태, 또는 세포를 감염시키는 바이러스의 형태를 지칭할 수 있다.
"바이러스-유사 입자 (VLP)"란 하나 이상의 바이러스 구조적 단백질로 구성되지만, 바이러스 게놈을 결여한 바이러스 입자를 의미한다. VLP는 바이러스 게놈을 결여하기 때문에, 이들은 비-감염성이고, 보다 안전하고 잠재적으로 보다-경제적인 백신 및 백신 생성물을 산출한다. 또한, VLP는 종종 이종 발현에 의해 생산될 수 있고, 용이하게 정제될 수 있다. 대부분의 VLP는 적어도 숙주 세포로부터의 입자의 버딩 및 방출을 유도하는 바이러스 코어 단백질을 포함한다.
"실질적으로 동일한"이란 참조 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열 중 어느 하나)과 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 예를 들어, 특정된 비교 창에 비해, 비교에 사용되는 서열과 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 80% 또는 85%, 및 가장 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다. 최적 정렬은 문헌 [Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 2개의 펩티드 또는 폴리펩티드 서열이 실질적으로 동일하다는 지시는 하나의 펩티드 또는 폴리펩티드가 제2 펩티드 또는 폴리펩티드에 대해 발생된 특이적 항체와 면역학적으로 반응성이라는 것이지만, 이러한 교차-반응성은 2개의 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 것으로 간주되는데 요구되지는 않는다. 따라서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 2개가 단지 보존적 치환에 의해 상이한 경우, 제2 펩티드 또는 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. "실질적으로 유사한" 펩티드 또는 폴리펩티드는 동일하지 않은 잔기 위치가 보존적 아미노산 변화에 의해 상이할 수 있음을 제외하고는 상기 언급된 바와 같은 서열을 공유한다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 군 내의 치환을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신, 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 다른 것들.
서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, 미국 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애브뉴 1710 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터(University of Wisconsin Biotechnology Center), 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 대한 상동성의 정도를 할당함으로써 동일하거나 유사한 서열을 매칭시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 군 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 결정하는 예시적인 접근법에서, BLAST 프로그램은 가깝게 관련된 서열을 지시하는 e-3 내지 e-100의 확률 점수와 함께 사용될 수 있다.
"실질적으로 동일한"이란 일반적으로 참조 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열 중 어느 하나)와 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 실시양태에서, 이러한 서열은 비교에 사용되는 서열과 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과, 또는 적어도 99% 동일하다.
본원에 기재된 바와 같은 방법 및 조성물에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 핵산 분자는 폴리펩티드, 또는 그의 단편을 코딩하는, 또는 본원에 기재된 바이러스 벡터의 성분을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예컨대 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 등에 의해 함유되는 폴리펩티드 생성물, 뿐만 아니라 펩티드 또는 그의 단편을 코딩할 수 있다. 이러한 핵산 분자는 내인성 서열 또는 바이러스 벡터 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열과 또는 바이러스 벡터 서열과 실질적 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 또는 바이러스 벡터 핵산 분자에 혼성화할 수 있다. 기재된 방법에 유용한 핵산 분자는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 또는 그의 단편을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. "혼성화하다"란 다양한 엄격성의 조건 하에서, 상보적 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 유전자 또는 핵산 서열), 또는 그의 부분 사이에 이중-가닥 분자를 형성하는 쌍형성 또는 핵산 분자를 의미한다. (예를 들어, 문헌 [Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399]; [Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507] 참조).
예를 들어, 엄격한 염 농도는 통상적으로 약 750 mM NaCl 및 75 mM 시트르산삼나트륨 미만, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 시트르산삼나트륨 미만, 및 보다 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 낮은 엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 부재 하에서 얻어질 수 있는 반면, 높은 엄격성 혼성화는 적어도 약 35% 포름아미드, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 포름아미드의 존재 하에서 얻어질 수 있다. 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 30℃의, 보다 바람직하게는 적어도 약 37℃의, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 다양한 추가적인 파라미터, 예컨대 혼성화 시간, 세정제, 예를 들어, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)의 농도, 및 담체 DNA의 포함 또는 배제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 다양한 수준의 엄격성은 필요에 따라 이들 다양한 조건을 조합함으로써 달성된다. 한 실시양태에서, 혼성화는 30℃에서 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨, 및 1% SDS에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 혼성화는 37℃에서 500 mM NaCl, 50 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 35% 포름아미드, 및 100 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA (ssDNA)에서 일어날 것이다. 또 다른 실시양태에서, 혼성화는 42℃에서 250 mM NaCl, 25 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 50% 포름아미드, 및 200 μg/ml ssDNA에서 일어날 것이다. 이들 조건에 대한 유용한 변화는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
대부분의 적용에 대해, 혼성화에 이어지는 세척 단계는 또한 엄격성에 있어서 다양할 것이다. 세척 엄격성 조건은 염 농도에 의해 및 온도에 의해 한정될 수 있다. 상기와 같이, 세척 엄격성은 염 농도를 감소시킴으로써 또는 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계를 위한 엄격한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 시트르산삼나트륨 미만, 및 가장 바람직하게는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 세척 단계를 위한 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 25℃의, 보다 바람직하게는 적어도 약 42℃의, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 한 실시양태에서, 세척 단계는 25℃에서 30 mM NaCl, 3 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS에서 일어날 것이다. 또 다른 실시양태에서, 세척 단계는 42℃에서 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS에서 일어날 것이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 세척 단계는 68℃에서 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS에서 일어날 것이다. 이들 조건의 추가적인 변화는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 혼성화 기법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Benton and Davis (Science, 196:180, 1977)]; [Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72:3961, 1975)]; [Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)]; [Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 기재되어 있다.
엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화하지 않는 핵산은 이들이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 경우, 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어, 핵산의 카피가 유전 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 생성되는 경우 일어난다. 이러한 경우, 핵산은 전형적으로 중간정도로 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화한다. "중간정도로 엄격한 혼성화 조건"의 비제한적 예는 37℃에서 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS의 완충액 중에서의 혼성화, 및 45℃에서 1 x SSC에서의 세척을 포함한다. 양성 혼성화는 적어도 2배의 배경이다. 통상의 기술자는 대안적인 혼성화 및 세척 조건이 유사한 엄격성의 조건을 제공하는데 이용될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
"오르토로그"란 또 다른 유기체로부터의 참조 단백질 또는 핵산 서열과 고도로 관련된 유기체의 임의의 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 관련성의 정도는 참조 단백질이 예를 들어, 블라스트 검색에서 서열을 확인할 확률로서 표현될 수 있다. 참조 서열이 무작위 서열을 오르토로그로서 확인할 확률은 극도로 낮은 e-10, e-20, e-30, e-40, e-50, e-75, e-100 미만이다. 통상의 기술자는 오르토로그가 참조 단백질 또는 핵산 서열과 기능적으로 관련될 가능성이 있음을 이해한다. 다시 말해서, 오르토로그 및 그의 참조 분자는, 그들의 각각의 유기체, 예를 들어, 마우스 및 인간 오르토로그에서 유사한 (등가가 아닌 경우) 기능적 역할을 수행할 것으로 예상될 것이다.
오르토로그는, 참조 서열과 정렬되는 경우, 참조 서열과 특정 정도의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이 요구되지 않는다. 단백질 오르토로그는 예를 들어, 단백질의 전체 길이에 걸쳐 유의한 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 대안적으로, 단백질의 단지 단일 기능적으로 중요한 도메인에 걸쳐 유의한 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있다. 이러한 기능적으로 중요한 도메인은 유전적 돌연변이에 의해 또는 구조-기능 검정에 의해 정의될 수 있다. 오르토로그는 관련 기술분야에서 실시되는 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 오르토로그의 기능적 역할은 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 검정될 수 있다. 예를 들어, 기능은 생화학적, 면역학적, 또는 효소적 검정; 또는 형질전환 구제를 사용하여 생체내에서 또는 시험관내에서 검정될 수 있다. 대안적으로, 생물검정은 조직 배양물에서 수행될 수 있으며; 기능은 또한 유전자 불활성화 (예를 들어, RNAi, siRNA, 또는 유전자 넉아웃에 의해), 또는 유전자 과발현에 의해, 뿐만 아니라 다른 방법에 의해 검정될 수 있다.
본원에서 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 처음 및 마지막 값을 포함하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50의 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
SCN1A란 SCN1A, 인간 이소형 1, 옴니프롯(OmniProt) 식별자 번호 P35498-1 (길이 2,009개의 아미노산; 질량 (Da): 228,972); RefSeq 번호 NP_001159435.1; NP_001189364.1; NP_001340877)의 정준 아미노산 서열의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 또는 그와 동등한, 또는 적어도 약 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그와 동등한, 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질 (나트륨 채널 Nav1.1) 또는 그의 단편을 의미한다. 인간 SCN1A의 폴리펩티드 (단백질) 서열은 하기와 같다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Nav1.1 나트륨 채널은 하기 제시된 바와 같은 수탁 번호 NCBI CCDS 54413.1 (RefSeq 번호 NM_001165963.2; NM_001202435.2; NM_001353948.1) 하의 SCN1A 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 85% 또는 그와 동등한, 또는 적어도 약 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그와 동등한, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 인간 SCN1A 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편에 의해 코딩된다. (게놈 레퍼런스 컨소시움(Genome Reference Consortium) GRCh38.p12로부터의 게놈 정보. 진뱅크(GenBank) 어셈블리 수탁번호: GCA_000001405.27 (최신); RefSeq 어셈블리 수탁번호: GCF_000001405.38 (최신))
SCN1A 뉴클레오티드 서열 (6030 nt):
Figure pct00003
Figure pct00004
SCN1A 유전자에 의해 코딩되는 나트륨 채널 Nav1.1은 피질 내의 다수의 별개의 뉴런 집단에서 발현된다. 이들은 3가지 비-중첩하는 뉴런 집단을 포함한다: 파르브알부민을 발현하는 급속-스파이킹 피질 개재뉴런 (PV cIN), 혈관활성-장 펩티드를 발현하는 탈-억제성 피질 개재뉴런 (VIP cIN) 및 층 5 피라미드형 뉴런.
비변형된 인간 무스카린성 아세틸콜린 수용체 M3의 아미노산 서열은 하기 제시된 바와 같이 NCBI 참조 서열 NP_000731.1 하에 제공된다. 또한, 하기 아미노산 서열과 적어도 약 85% 또는 그와 동등한, 또는 적어도 약 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그와 동등한, 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 단편이 본원에 포함된다:
Figure pct00005
인간 Gq-DREADD (hM3Dq) 흥분성 수용체의 아미노산 서열은 상기 제시된 비변형된 인간 무스카린성 아세틸콜린 수용체 M3의 아미노산 서열로부터 유래된다. Gq-DREADD (hM3Dq) 수용체 아미노산 서열 (590 aa)에서, 하기 나타내어진 바와 같이, 위치 149에서의 티로신은 시스테인에 의해 대체되고, 위치 239에서의 아르기닌은 글리신에 의해 대체된다 (미국 공개 번호 2018/0078658):
Figure pct00006
구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 자명하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 포함적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 자명하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 용어 단수 형태는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약" 또는 "대략"은 기재된 값의 유형 및 값을 측정하는데 사용되는 방법에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미한다. 예를 들어, 이들 용어는 주어진 값 또는 범위의 20% 내, 보다 바람직하게는 10% 내, 및 가장 바람직하게는 여전히 5% 내를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, "약"은 언급된 값 또는 범위의 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 내인 것으로 이해될 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약"은 1 로그 단위 (즉, 1 자릿수) 내, 바람직하게는 주어진 값의 2의 인수 내를 의미한다. 구체적으로 언급되거나 맥락으로부터 자명하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 관련 기술분야에서 정상적인 허용성의 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내로 이해된다. 맥락으로부터 달리 명백하지 않는 한, 본원에서 제공된 모든 수치 값은 용어 약에 의해 수식된다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 화학적 군 또는 성분 군의 목록의 나열은 임의의 단일 군 또는 열거된 군의 조합으로서 그 변수의 정의를 포함한다. 본원에서 변수 또는 측면에 대한 실시양태의 나열은 본 개시내용에 기재된 바와 같은 임의의 단일 실시양태로서 또는 임의의 다른 실시양태 또는 그의 부분과 조합으로 그 실시양태를 포함한다.
본원에서 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에서 제공된 다른 조성물 및 방법 중 임의의 것 중 하나 이상과 조합될 수 있다.
도 1A-1, 1A-2, 1A-3, 1B-1, 1B-2, 1C 및 1D는 본원에서 "E1-E35"로 지칭되는 특이적 인핸서 (조절) 서열의 발견 및 확인과 관련된 표 데이터 및 정보를 제시한다. SCN1A-제한된 유전자 발현에 대해 특이적인 인핸서, 예컨대 GABA작동성 개재뉴런, 예컨대 PV-발현 개재뉴런에서의 E1-E10, 뿐만 아니라 표에 제시된 다른 유전자를 표적화하는 인핸서가 나타내어진다. 도 1A-1은 마우스 게놈에서의 E1-E35로 지칭되는 35종의 인핸서 요소의 유전자, 표적 (예를 들어, 뉴런 세포 유형), 특이성, 위치 (예를 들어, 유전자간 또는 인트론성), 염색체 위치 및 게놈 서열 시작 및 정지 부위 특징을 나타내는 표 데이터를 제시한다. 유사하게, 도 1A-2 및 1A-3은 인간 게놈에서의 이들 35종의 E1-E35 인핸서 요소의 유전자, 표적 (예를 들어, 뉴런 세포 유형), 특이성, 위치 (예를 들어, 유전자간 또는 인트론성), 염색체 위치 및 게놈 서열 시작 및 정지 부위 특징을 나타내는 표 데이터를 제시한다. 예로서, 인핸서 (조절) 요소 E1-E10 (본원에서 S5E1-S5E10으로도 지칭됨)은 마우스 게놈에서 (도 1A-1) 및 인간 게놈에서 (도 1A-2 및 1A-3), 인간 SCN1A 유전자의 부근에서 확인되었다. 도 1A-1 내지 1A-3에서, 본원에 기재된 마우스 및 인간 인핸서 요소의 폴리뉴클레오티드 서열은 표에 (뿐만 아니라 도 15A-1, 15A-2, 16A-1 및 16A-2의 표에) 제시된 바와 같은 마우스 및 인간 게놈에서의 시작 및 정지 부위를 가지며; 마우스 및 인간 인핸서 서열은 도 1A-1 내지 1A-3의 표에 열거된 웹-접근가능한 게놈 정보를 통해 제공된다. 도 1B-1 및 1B-2는 뇌의 피질층 내의 PV-발현 개재뉴런에서의 E1-E10 인핸서 요소-제한된 리포터 유전자 발현을 나타내는 화상을 제시한다. 화상은 벡터에 의해 형질도입된 특이적 세포의 검출을 허용하는, 동물 (마우스) 내로의 pAAV-S5-E2-d토마토 벡터의 전신 생체내 주사 후의 뇌 섹션에서의 d토마토에 대한 면역조직화학적 (IHC) 염색 분석의 결과를 나타낸다. 도 1C 및 1D는 피질 내의 PV-발현 개재뉴런에서의 리포터 유전자의 발현의 특이성 (도 1C) 및 민감성 (도 1D)의 정도의 정량화를 나타내는 그래프를 나타낸다. 리포터 유전자의 발현은 rAAV 벡터에 함유된 E1-E10 인핸서 요소에 의해 제어된다. 특이성을 동물 (마우스) 내로의 pAAV-S5-E2-d토마토 벡터의 전신 생체내 주사 후의 뇌 섹션 상의 면역조직화학에 의해 평가된 PV-개재뉴런 마커 PV를 공동-발현하는 바이러스 리포터 d토마토를 발현하는 세포의 비율로서 정량화하였다. 민감성을 동물 (마우스) 내로의 pAAV-S5-E2-d토마토 벡터의 전신 생체내 주사 후의 뇌 섹션 상의 면역조직화학에 의해 평가된 바와 같은 바이러스 리포터 d토마토에서 공동-발현된 PV-개재뉴런 마커 PV를 발현하는 세포의 비율로서 정량화하였다. 막대 그래프는 평균 +/- 평균의 표준 오차 (s.e.m.)를 나타낸다.
도 2A 및 2B는 피질을 포함하여 뇌 구조에 걸쳐 E2 인핸서 요소 서열 및 리포터 트랜스진 (예를 들어, d-토마토) 또는 이펙터 유전자 (예를 들어 Gq-DREADD)를 함유하는 rAAV 벡터를 사용한 리포터 유전자 발현의 국재화를 나타내는 화상을 제시한다. 도 2A는 벡터에 의해 형질도입된 특이적 세포의 검출을 허용하는, 동물 (마우스) 내로의 pAAV-S5-E2-d토마토 벡터의 전신 생체내 주사 후의 뇌 섹션 (도면의 상부 부분에서의 시상 섹션; 도면의 하부 부분에서의 두정 섹션)에서의 d토마토 리포터에 대한 면역조직화학적 (IHC) 염색 분석의 결과를 나타내는 화상을 제시한다. 도 2B는 PV를 발현하는 특이적 세포의 검출을 허용하는, 동물 (마우스) 내로의 pAAV-S5-E2-d토마토 벡터의 전신 생체내 주사 후의 뇌 섹션에서 발현된 d토마토 리포터에 대한 면역조직화학적 (IHC) 염색 분석의 결과를 나타내는 화상을 제시한다. pAAV-S5-E2-d토마토 벡터로부터의 리포터 유전자 발현은 뇌 섹션에서 가시화된다 (도 2B의 좌측 패널에서 적색으로). pAAV-S5-E2-Gq-DREADD-d토마토로부터의 리포터 유전자 발현은 도 2B의 우측 패널에서 Gq-DREADD에 대해 녹색 및 d토마토에 대해 적색으로 가시화된다. 벡터에 의해 형질도입된 특이적 PV-발현 세포의 검출은 가시화된다 (도 2B의 좌측 패널에서, 및 도 2B의 우측 패널에서).
도 3A-3F는 SCN1A 인핸서의 확인과 관련된 개략도, 플롯, 그래프 및 공초점 현미경 화상을 나타낸다. 도 3A는 scATAC-seq 파이프라인의 개략적 제시를 제공한다. 개재뉴런을 성체 Dlx6aCre::Sun1-eGFP 마우스의 시각 피질로부터 수집하였다. 도 3B는 UMAP 공간에서의 3500개 핵의 플롯을 나타낸다. SnapATAC 파이프라인으로부터 얻어진 클러스터를 개재뉴런의 4가지 중요한 부류로 묶었다. 도 3C는 4가지 개재뉴런 집단, PV, SST, VIP 및 ID2에 걸친 고유하고 샤프한 피크의 수를 나타내는 벤 다이어그램을 제시한다. 도 3D는 본원의 방법 (실시예 8)에 기재된 바와 같은, SCN1A 로커스에서의 인핸서 선택 방법의 개략적 제시를 나타낸다. 도 3E 및 3F는 기재된 바와 같은 인핸서 요소를 함유하는 지시된 rAAV-E[x]-d토마토 벡터로의 성체 마우스의 전신 주사 후 얻어진 결과 및 주사 후 3주의 분석을 예시한다. S1 피질에서의 리포터 및 지시된 마커에 대한 면역조직화학적 (IHC) 평가를 사용하여 리포터의 발현의 강도 (도 3E, 상부 패널) 및 지시된 마커에 대한 바이러스 리포터의 발현의 특이성 (모든 다른 패널)을 평가하였다. 체성감각 피질에서의 지시된 바이러스 리포터의 대표적인 형광 화상 (도 3F, 좌측 패널). 파선은 해부학적 구조의 한계를 나타낸다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다. 그래프 상에서, 점은 개별적인 측정을 나타내고, 선은 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 4A-4E는 마우스에서의 PV 피질 개재뉴런 (PV cIN)의 바이러스 표적화와 관련된 화상, 그래프 및 기록 자취를 제시한다. 성체 마우스를 E2 조절 요소의 제어 하에서 리포터 d토마토를 발현하는 rAAV-E2-d토마토로 전신적으로 (도 4A-4B 화상) 또는 국소적으로 (도 4D) 주사하고, 주사 후 3주에 리포터 및 PV 마커 둘 다에 대해 면역조직화학 (IHC) 또는 ISH에 의해 분석하였다. 도 4C는 바이러스 표지된 뉴런의 내재적 특성의 슬라이스 기록을 나타낸다. 도 4D (우측 패널)는 리포터의 발현의 강도에 비해 PV를 공동-발현하는 리포터를 발현하는 세포의 비율로서 나타내어진 발현의 특이성을 예시하는 그래프를 제시한다. 도 4E는 마우스를 E2 조절 요소의 제어 하에서 리포터 d토마토를 발현하는 rAAV-E2-d토마토로 국소적으로 주사하고, 지시된 발달 단계에서 리포터 및 지시된 마커에 대해 분석한 실험으로부터 발생된 화상을 제시한다. 스케일 바는 250 μm (도 4A) 및 50 μm (도 4B, 4D, 4E)를 나타낸다. 그래프에서, 점은 개별적인 측정을 나타내고, 선은 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 5A-5E는 마우스에서의 PV 피질 개재뉴런 (PC cIN)의 바이러스 모니터링 및 조작과 관련된 화상, 전류 클램프 기록 자취 및 그래프를 제시한다. 마우스를 rAAV (도 5A - rAAV-E2-SYP-d토마토로의 P10 주사; 도 5B - rAAV-E2-GCaMP6f로의 P14 주사; 도 5D 및 5E - rAAV-E2-C1V1-eYFP로의 성체 주사)로 체성감각 (S1) 피질에서 국소적으로, 또는 전신적으로 (도 5C - rAAV-E2-PSAM4-5HT3-LC-GFP로의 성체 주사) 주사하였다. 도 5A는 주사 후 1주에 SYP-d토마토 리포터 및 시냅스 마커 Syt2 사이의 공동-국재화의 대표적인 화상 및 상응하는 정량화를 제시한다. 도 5B는 주사 후 2-3주에 수행된 휘스커 자극 시의 Ca2+ 화상화의 결과를 나타낸다. 우측 패널에서, 성공률을 휘스커 자극에 반응하여 역치 초과의 ΔF/F 피크의 비율로서 계산하였다. 도 5C는 주사 후 4주에 뇌 섹션 상에서 수행된 전류 클램프 기록의 결과를 나타낸다. 자취는 둘 다의 기준선에서 및 바레니클린의 조 적용 후의 지시된 전류에서의 대표적인 세포 반응을 나타낸다. 도 5D는 주사 후 1주에 뇌 섹션 상에서 수행된 전류 클램프 기록의 결과를 나타낸다. 바이러스 리포터를 발현하는 세포를 전압을 3초에 걸쳐 기록하면서, 2초의 일정한 레이저 자극 (550 nm)에 노출시켰다. 바이러스 리포터를 발현하지 않은 이웃하는 피라미드형 세포를 또한 레이저 자극 동안으로부터 기록하였다. 도 5E는 뉴런 활성의 생체내 단일-단위 분석을 예시하며, 레이저 자극 시의 바이러스 감염된 뉴런의 래스터(Raster) 플롯 및 상응하는 집단 정량화 데이터를 나타낸다. 좌측 패널은 급속-스파이킹 세포를 나타내고, 우측 패널은 규칙적 스파이킹 흥분성 세포를 나타낸다. 특히, 국소 바이러스 주사의 모자이크 성질로 인해, 개별적인 세포 반응은 이중모드였다. 이는 특정 세포가 감염되었는지 아닌지 여부를 반영할 가능성이 있다. 스케일 바는 5 μm를 나타낸다. "시행" 대 "시간" 그래프의 상부에서의 중간 막대는 레이저 자극을 나타낸다. 그래프에서, 점은 개별적인 측정을 나타내고, 선은 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 6A 및 6B는 인간을 포함하여 영장류에서의 바이러스 표적화 및 조작 PV 피질 개재뉴런 (PV cIN)과 관련된 도면, 그래프, 화상 및 기록 자취를 제시한다. 도 6A: 지시된 종으로부터의 동물을 rAAV-E2-C1V1-eYFP (마카크) 또는 rAAV-E2-d토마토 (래트 및 마모셋)로 국소적으로 (래트 및 마카크) 또는 전신적으로 (마모셋) 주사하고, 주사 후 2-8주에 분석하였다. 발현의 특이성은 PV를 공동-발현하는 바이러스 표지된 세포의 비율로서 나타내어진다. 도 6B: 외과적 절제로부터 얻어진 인간 뇌 조직을 rAAV-E2-d토마토 (i-iii) 또는 rAAV-E2-C1V1-eYFP (iv) 중 어느 하나에 노출시키고, 7-14일 동안 배양물에서 유지하였다. 상부 우측 패널은 내재적 특성의 전기생리학적 기록에 의해 평가된 바이러스-표지된 세포 중에서의 급속-스파이킹 뉴런의 비율을 나타낸다. (iv) 레이저 자극 시의 바이러스 표지된 세포의 전기생리학 전류 클램프 기록. 스케일 바는 25 μm를 나타낸다. "직접적 광활성화 (PV)" 자취의 상부에서의 막대는 레이저 자극을 나타내고, 화살촉은 PV를 공동-발현하는 뉴런 및 바이러스 리포터를 가리킨다. 그래프 상에서, 점은 개별적인 측정을 나타내고, 선은 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 7은 지시된 rAAV-E[x]-dTom 바이러스 리포터 벡터로 전신적으로 주사되고, IHC로 주사 후 3주에 바이러스 리포터에 대해 분석된 성체 마우스로부터의 시상 섹션의 형광 화상을 나타낸다. 스케일 바는 500 μm를 나타낸다.
도 8A-8D는 rAAV-E2-d토마토로의 성체 마우스의 전신 주사 후의 결과의 화상 및 그래프를 제시한다. 도 8A는 바이러스 표지된 뉴런의 내재적 특성의 슬라이스 기록과 관련된다. 좌측 패널은 바이러스 리포터를 발현하는 대표적인 세포를 나타낸다. 중간, 상부에서의 삼각형 자취는 기록 피펫을 나타낸다. 정량화는 지시된 파라미터를 나타낸다. "아이덴티티" 그래프에서의 보다 어두운 회색 점은 정형화된 급속-스파이킹 (FS) 특성을 갖는 세포를 나타낸다. 도 8B는 양성 및 음성 급속-스파이킹 세포 (각각 FS 및 nFS)의 대표적인 슬라이스 기록 자취를 나타낸다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. 그래프 상에서, 점은 개별적인 측정을 나타내고, 선은 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다. 도 8C 및 8D는 rAAV-E2-d토마토로의 성체 마우스의 전신 주사 후 및 주사 후 3주에 분석의 결과를 나타낸다. 도 8C: 두정 및 시상 섹션을 바이러스 리포터 및 PV에 대해 IHC로 분석하고, PV에 대한 특이성을 뇌 영역에 걸쳐 보고하였다. 도 8D: 천연 바이러스 발현을 지시된 기관으로부터 분석하였다. 스케일 바는 100 μm (도 8C) 및 250 μm (도 8D)를 나타낸다. 그래프 상에서, 점은 개별적인 측정을 나타내고, 선은 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 9A-9C는 화상, 기록 자취 데이터 및 그래프를 제시한다. 마우스를 체성감각 피질에서 전신적으로 (도 9A: rAAV-E2- GCaMP6f로의 P14 주사) 및 국소적으로 (도 9B: rAAV-E2-C1V1-eYFP; 도 9C: rAAV-E2- GqDREADD) 주사하였다. 도 9A: 마우스를 주사 후 1주에 분석하였다. 좌측 패널은 중간 패널에서 파운드 기호에 의해 나타내어진 2개의 대표적인 피크의 광시야 화상을 나타낸다. 우측 패널은 GCaMP 기록 후에 취해진 형광 화상을 나타낸다. 도 9B: 슬라이스 전기생리학 전류 클램프 기록을 주사 후 1주에 수행하였다. 바이러스 리포터를 발현하는 세포를 전압을 3초에 걸쳐 기록하면서, 10Hz 또는 40Hz 레이저 자극 (550 nm) 중 어느 하나로 표적화하였다. 도 9C: 슬라이스 전기생리학 전류 클램프 기록을 주사 후 1주에 수행하였다. 전압을 CNO의 조 적용 전 및 후에 기록하였다. 스케일 바는 500 μm를 나타낸다. "+CNO" 막대는 레이저 자극을 나타낸다. 그래프 상에서, 점은 개별적인 측정을 나타낸다.
도 10A 및 10B는 외과적 절제로부터 얻어진 인간 뇌 조직을 AAV-E2-d토마토에 노출시키고, 7-14일 동안 배양물에서 유지한 연구와 관련된 염색된 화상 및 데이터 플롯을 제시한다. 도 10A: 기록 세션 동안 비오시틴(Biocytin)으로 충전된 바이러스 표지된 세포의 수상돌기의 대표적인 화상. 도 10B: 바이러스 표지된 뉴런의 내재적 특성의 슬라이스 기록. 정량화는 지시된 파라미터를 나타낸다. "아이덴티티" 그래프에서 보다 어두운 최우측 점은 정형화된 급속-스파이킹 (FS) 특성을 갖는 세포를 나타낸다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다. 그래프에서, 점은 개별적인 측정을 나타내고, 선은 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 11은 마커/리포터를 발현하는 세포의 정량화를 나타내는 표를 제공한다. 실시예 7에 기재된 바와 같이, 정량화를 최소 2회의 독립적인 생물학적 반복실험을 사용하여 수행하였으며, 세포의 구체적인 수 및 조건은 표에서 각각의 개별적인 정량화에 대해 지시된다.
도 12는 지시된 정준 개재뉴런 마커의 프로모터 접근성을 반영하는 4마리의 Dlx6aCre::Sun1- GFP 마우스로부터 수집된 3500개의 뉴런 핵의 UMAP 플롯을 제시한다.
도 13A 및 13B는 영역 특이성을 갖는 바이러스 인핸서의 확인과 관련된 슬라이스, 화상 및 그래프를 제시한다. 도 13A: 성체 마우스를 인핸서 요소 폴리뉴클레오티드 서열 및 검출가능한 리포터 또는 마커 (예를 들어, GFP) 폴리뉴클레오티드, 즉, rAAV-E[x]-eGFP를 함유하는 지시된 rAAV 벡터로 전신적으로 주사하고, 주사 후 3주에 분석하였다. S1 피질에서의 리포터 및 지시된 마커에 대한 면역조직화학 (IHC)을 사용하여 바이러스 리포터를 발현하는 뉴런 세포체의 밀도 (좌측 패널) 및 지시된 마커에 대한 바이러스 리포터의 발현의 특이성 (우측 패널)을 평가하였다. E29 바이러스에 대해, 시상 망상 핵 (TRN)을 제외하고, 시상에서 세포체가 관찰되지 않는다. 도 13B: 성체 마카크를 V1에서 rAAV-E22-eGFP로 주사하고, 주사 후 8주에 IHC로 리포터 및 지시된 마커에 대해 분석하였다. 스케일 바는 100 μm (a), 50 μm (b, 좌측) 및 10 μm (b, 우측)를 나타낸다. 그래프 상에서, 점은 개별적인 측정을 나타내고, 선은 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 14는 성체 마우스를 지시된 변형된 rAAV-E2-d토마토 구축물로 주사하고, 주사 후 3주에 IHC로 바이러스 리포터 및 PV에 대해 분석한 연구와 관련된 화상 및 그래프를 제시한다. 상응하는 특이성은 그래프에서 우측에 나타내어진다. 스케일 바는 2 μm를 나타낸다. 그래프 상에서, 점은 개별적인 측정을 나타내고, 선은 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 15A-1 및 15A-2는 그들의 연관된 유전자, 표적 집단, 표적 집단에 대한 특이성, 위치, ATAC 피크의 존재, 및 인간 서열과의 보존을 포함하여, 모든 시험된 인핸서에 대한 명세를 함유하는 표를 제시한다.
도 16A-1 및 16A-2는 인핸서 명칭 (E1-E35), 유전자, 표적, % 특이성, 뮤린 염색체 위치 (마우스_mm10_Chr), 뮤린 게놈에서의 인핸서 서열 시작 부위 (마우스_mm10_시작), 뮤린 게놈에서의 인핸서 서열 정지 부위 (마우스_mm10_정지), 크기 (염기 쌍 (bp)), 인간 염색체 위치 (인간_hg38_Chr), 인간 게놈에서의 인핸서 서열 시작 부위 (인간_hg38_시작), 인간 게놈에서의 인핸서 서열 정지 부위 (인간_hg38_정지), 및 마우스 및 인간 인핸서 서열 사이의 보존의 백분율을 포함하여, 시험된 인핸서의 각각과 관련된 다양한 파라미터를 편집한 표를 제시한다. 도 15A-1 및 15A-2, 및 도 16-A1 및 16-A2에, 뿐만 아니라 도 1A1 내지 1A3에 제시된 표에서, 열거된 인핸서 E1-E35의 각각의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 나타내어진 염기 쌍 (bp)의 총 수는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것인 바와 같이, 서열에서 카운팅된 최초 염기 쌍 (bp)의 수치 값이 영 (0)으로 평가됨을 반영한다. 그럼에도 불구하고, 각각의 인핸서 (E1-E35)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 bp의 총 수는 본원에 기재된 도면에 제시된 표화된 데이터에 기반하여, 서열에서 총 bp의 수를 카운팅함으로써 간단히 얻어질 수 있다.
실시양태의 상세한 설명
본원에 특색화되고 기재된 실시양태는 예를 들어, 특히 대뇌 피질 내에서, 기능적으로 별개의 뉴런 하위유형을 표적화하기 위해, 바이러스 벡터, 예컨대 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터로 사용하기 위한 다수의 새로운 인핸서 (E1-E35)를 확인하기 위해 개발된 전략, 방법 및 생성물에 관한 것이다. 질환 유전자 SCN1A의 조절 경관의 조사는 비제한적 예로서, 파르브알부민 (PV) 및 혈관활성 장 펩티드 (VIP) 피질 개재뉴런에 대해 선택적인 2가지 인핸서를 포함하여, 그의 발현의 폭을 표적화하는 인핸서의 확인을 초래하였다. 이들 조절 요소의 기능적 유용성이 입증되었으며, PV-특이적 인핸서는 마우스로부터 인간까지, 종에 걸쳐 이들 뉴런의 선택적 표적화 및 조작을 허용하였음이 밝혀졌다. 더욱이, 본원에 기재된 바와 같은 선택 방법은 다른 유전자에 대해 일반화가능하며, 뇌의 별개의 영역에 대한 높은 정도의 특이성을 갖는 특정 PV-특이적 인핸서, 예컨대, 예를 들어, E11, E14, E22 및 E29를 특징규명하였다. 인핸서 서열을 함유하는 재조합 바이러스 벡터, 예를 들어, rAAV 벡터는 세포-유형 특이적 회로 조작에서 신경병리학적 또는 신경정신 질환, 상태 및 병리증상을 치료하고 개선시키는 치료적 개입에서 사용하기 위한 바이러스 도구를 제공한다.
신경학적, 신경발달성, 신경원성, 또는 신경정신 질환, 장애, 및 병리증상을 치료하거나 개선시키기 위한 특이적 바이러스-기반 치료 생성물, 조성물, 방법 및 접근법이 본원에 기재된다. 기재된 바와 같이, 바이러스 벡터 또는 비히클에 의한 개재뉴런 또는 뉴런 세포의 형질도입 후 특이적 개재뉴런 또는 뉴런 세포 집단에서 특이적으로 및 기능적으로 발현되는 특이적 인핸서 서열 (인핸서) 및 관심의 유전자, 예컨대 이펙터 유전자 (예를 들어, 트랜스진 또는 리포터 유전자)의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 유전자 전달을 위한 바이러스 벡터 및 비히클이 디자인되고 생산된다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 비히클에 의한 개재뉴런 또는 뉴런 세포의 형질도입 후 특이적 개재뉴런 또는 뉴런 세포 집단에서 특이적으로 및 기능적으로 발현되는 특이적 인핸서 서열 (인핸서)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터 또는 비히클이 제공된다. 한 실시양태에서, 바이러스에 의해 함유된 인핸서는 트랜스진의 발현을 특정 개재뉴런 세포 또는 뉴런 세포에 제한할 수 있다. 실시양태에서, 트랜스진의 발현은 그 유전자에 대해 결핍성인 세포에서의 발현에 제한된다. 한 실시양태에서, 트랜스진의 발현은 개재뉴런 세포 또는 다른 뉴런 세포에서 특이적으로 조정된다. 다른 실시양태에서, 트랜스진은 이펙터 유전자 또는 치료 유전자이다. 실시양태에서, 인핸서 요소는 유전자의 발현을 급속-스파이킹 피질 개재뉴런인 파르브알부민 (PV)-발현 피질 개재뉴런 세포 (PV-cIN 세포); 혈관활성-장 펩티드 (VIP)를 발현하는 탈-억제성 피질 개재뉴런 세포 (VIP cIN 세포); 및 피라미드형 (PYR) 뉴런, 특히, 뇌의 피질층 5의 피라미드형 뉴런을 포함하여, 1종 이상의 뉴런 세포 유형에 제한한다.
한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 신경학적, 신경발달성 또는 신경원성 질환, 장애, 또는 상태와 연관된 특이적 인핸서 서열 및 트랜스진 (이펙터 유전자)을 함유하며, 인핸서는 트랜스진의 발현을 유전자에 대한 기능의 소실을 갖거나, 유전자에 대해 결핍성이거나, 신경학적 또는 신경원성 질환, 장애, 및 병리증상과 연관된 유전자의 돌연변이체, 변이체, 또는 결함성 형태를 발현하는 개재뉴런 세포 집단에 제한할 수 있다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드에 삽입된 인핸서 서열은 Nav1.1 나트륨 채널을 코딩하는 SCN1A 유전자의 발현을 조절하고, SCN1A-발현 세포, 특히, GABA작동성 개재뉴런 세포에 발현을 제한하기 위한 특이성을 갖는 것으로 확인된다. SCN1A 유전자의 기능의 소실은 인지 손상 및 조기 사망과 연관된 영아 간질의 약물-저항성 형태인 약화시키는 질환 드라베 증후군 (DS)의 가장 우세한 원인이다. 특정 실시양태에서, 개재뉴런에서의 트랜스진 (이펙터 유전자)의 특이적 발현은 개재뉴런 세포에 대해 특이적인 마커, 예를 들어, 제한 없이, GABA GAD67, 또는 PV 개재뉴런 세포 마커의 검출에 의해 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 비히클은 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 또는 재조합 AAV (rAAV)이다. 용어 "AAV" 및 "rAAV"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "트랜스진"은 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터 또는 비히클에 함유된 관심의 유전자 (또는 유전자들) (이펙터 유전자)를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 특히 유전자의 발현을 세포의 한정된 집단, 예를 들어, PV-발현 또는 SCN1A-발현 개재뉴런 또는 그의 하위유형에 제한하는, rAAV 벡터에 또한 함유된 인핸서 서열에 의해, 본원에 기재된 바와 같은 특정 세포 유형 또는 집단에서 특이적으로 발현되고 기능적이다. 일부 경우에, 관심의 유전자 (이펙터 유전자)는 rAAV에 의해 형질도입된 세포 유형에서 발현되고, 그의 코딩된 생성물이 세포, 예컨대 트랜스진과 동일한 유전자의 기능의 소실이 있는 세포에서 정상적인 또는 정상적으로-기능하는 생성물을 제공하도록 기능하는 유전자의 정상적인 형태이다. 일부 경우에, 트랜스진 또는 이펙터 유전자는 rAAV 벡터에 의한 세포의 형질도입 후 검출가능한 신호를 제공하는 리포터 유전자, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)일 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진 또는 이펙터 유전자는 그의 발현 및 활성이 정상적인 세포 기능을 제공하는 생성물을 코딩하는 리포터 및 유전자 둘 다일 수 있다. 후자의 형태의 유전자는 치료 유전자인 것으로 간주될 수 있다. 특정 실시양태에서, rAAV는 SCN1A-특이적 인핸서 서열 및 SCN1A 트랜스진을 함유한다.
본원에 기재된 rAAV 벡터 및 방법은, 적어도 부분적으로, 특이적 인핸서가 바이러스 벡터에 의해 운반되는 트랜스진, 예컨대 신경학적 질환, 장애, 또는 병리증상과 연관된 유전자, 또는 리포터 유전자의 발현을 유전자가 발현되고, 코딩된 유전자 (트랜스진) 생성물이 기능적인 뇌 내의 개재뉴런 세포 ("개재뉴런")에 제한할 수 있다는 발견 및 입증에 기반한다. 한 실시양태에서, 이러한 발현된, 기능적 유전자는 개재뉴런 세포의 정상적인 기능화에 관여하는 생성물을 코딩하는 유전자의 비정상적, 일탈적, 또는 기능의 결여를 상쇄하거나, 대체하거나, 치환한다.
한 실시양태에서, 적합한 바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 또는 특히, 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터는 포유동물의 GABA-작동성 PV-발현 개재뉴런에서의 트랜스진의 발현을 제한하는데 사용되며, 여기서 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 요소는 시스로 제공된다. 실시양태에서, 인핸서 요소는 S5E1 (E1), S5E2 (E2), S5E3 (E3), S5E4 (E4), S5E6 (E6), S5E7 (E7), S5E8 (E8), S5E9 (E9), S5E10 (E10) 중 하나이다. 실시양태에서, 인핸서 요소는 바이러스 리포터의 발현을 파르브알부민 (PV)-발현 피질 개재뉴런 (PV cIN)에 제한할 수 있는 E2, VIP 개재뉴런에 대해 선택적인 E6; 또는 모든 피질층에 걸쳐 개재뉴런 집단을 표지하지만, 특히 뇌 피질의 층 5 내의 피라미드형 뉴런, 특히 본원에 기재된 바와 같은 글루타메이트성 피라미드형 뉴런에 대해 선택적인 E5이다. 특정 실시양태에서, 인핸서 요소는 E2이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 인핸서 요소는 E5이다. 추가의 또 다른 특정 실시양태에서, 인핸서 요소는 E6이다.
한 실시양태에서, 인핸서를 포함하는 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 발작, 모든 형태의 간질, 또는 DS의 치료 및 요법을 위한 형질도입된 PV-발현 개재뉴런 세포에서의 SCN1A의 카피의 발현을 유도한다. 다른 실시양태에서, 인핸서를 포함하는 벡터 또는 rAAV 벡터는 모든 형태의 발작, 초점성 및 약리학상 난치성 간질을 포함하여 간질의 치료를 위한, 및 또한 DS 및 그의 증상의 치료를 위한 PV-개재뉴런 활성의 화학유전적 조정을 위한 Gq-DREADD 또는 PSAM과 같은 이펙터의 발현을 유도한다.
일반적으로, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 S5E1-S5E10으로부터 선택된 인핸서 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 트랜스진 서열, 예컨대, SCN1A 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, hM3Dq 변형된 무스카린성 수용체 (Gq-DREADD) 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 PSAM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 E2, E5, 또는 E6으로부터 선택된 인핸서 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이를 필요로 하는 개체 (예를 들어, 인간 환자)에서 발작 및 간질, 및 보다 구체적으로, 드라베 증후군에 대한 치료적 및 예방적 치료를 위한 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 각각 SCN1A, Gq-DREADD, 또는 PSAM이 개체 또는 대상체의 개재뉴런에서, 특히 PV-발현 개재뉴런에서 발현되도록, 이를 필요로 하는 개체 또는 대상체, 예를 들어, 발작, 간질, 또는 DS로 고통받는 환자가 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열, 예컨대 E2, E5, 또는 E6, 및 예를 들어, SCN1A-코딩 폴리뉴클레오티드 서열, hM3Dq 변형된 무스카린성 수용체 (Gq-DREADD)-코딩 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 PSAM-코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터, 예컨대 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터로 투여되는 방법이 제공된다. 따라서, SCN1A, Gq-DREADD, 또는 PSAM을 발현하지 않는 필요로 하는 개체 또는 대상체에서의 개재뉴런, 특히, PV-발현 개재뉴런을 각각 SCN1A, Gq-DREADD, 또는 PSAM을 발현하는 개재뉴런으로 전환시키는 방법이 제공된다. 따라서, 유전자 및 코딩된 단백질의 발현은 또한 rAAV 벡터 게놈의 성분으로서 제공되는 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 요소 (E1-E10)의 존재와 관련된다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 E2, E5, 또는 E6이다. 한 실시양태에서, 필요로 하는 개체 또는 대상체, 예를 들어, 발작, 간질, 또는 DS로 고통받는 환자는 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열, 예컨대 E2, 및 SCN1A를 코딩하는 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터, 예컨대 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터로 투여된다.
한 실시양태에서, 개체 또는 대상체에 의해 경험되는 발작, 간질, 또는 DS 증상의 중증도가 감소되거나, 발작, 간질, 또는 DS 증상이 치료되거나 예방되도록, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열 (E1-E10), 및 SCN1A-코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터를 필요로 하는 개체 또는 대상체 내로 도입하는 것을 포함하는, 발작, 간질, 또는 DS에 대한 예방 및/또는 요법을 위한 예방적 또는 치료적 치료 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 E2, E5, 또는 E6이다. 한 실시양태에서, 필요로 하는 개체 또는 대상체는 벡터의 투여 시에 발작 (예를 들어, 간질성 발작) 또는 DS의 증상을 경험하고 있다. 개체 또는 대상체에의 벡터의 투여 후, 발작, 간질, 또는 DS 증상의 중증도는 감소되거나, 발작, 간질, 또는 DS 증상은 치료되거나 예방된다.
한 실시양태에서, 발작, 간질, 또는 DS 증상의 중증도가 감소되거나, 발작, 간질, 또는 DS 증상이 치료되거나 예방되도록, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열 (E1-E10), 및 hM3Dq 변형된 무스카린성 수용체 (Gq-DREADD)-코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터를 개체 내로 도입하고, 후속적으로 Gq-DREADD의 효능제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 발작, 간질, 또는 DS에 대한 예방 및/또는 요법을 위한 예방적 또는 치료적 치료 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 E2, E5, 또는 E6이다. 한 실시양태에서, 필요로 하는 개체 또는 대상체는 Gq-DREADD 수용체의 효능제의 투여 시 발작 (예를 들어, 및 간질성 발작)을 경험하고 있다. 효능제의 투여 후, 발작의 중증도는 감소된다. 실시양태에서, Gq-DREADD 수용체 효능제는 클로자핀-N4-옥시드 (CNO) 또는 관련 기술분야에 공지되고 사용되는 바와 같은 또 다른 적합한 Gq-DREADD 수용체 효능제이다.
본원에 기재된 치료적 및 예방적 방법의 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 부분적 발작 또는 전신성 발작을 경험하고 있거나, 이를 발달시킬 위험이 있다. 다른 실시양태에서 개체 또는 대상체는 제한 없이, 약물-저항성 간질을 포함하여 임의의 형태의 간질을 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 이로 진단되었다. 기재된 방법에 따르면, 발작, 간질, 또는 DS 증상은 억제되거나, 차단되거나, 감소되거나, 약화되거나, 예방된다.
한 실시양태에서, 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터를 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 요소, 예를 들어, E1-E10 및 SCN1A를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물 (또는 벡터 자체)의 투여는 뇌에서 SCN1A를 발현하지 않는 개체 또는 대상체의 개재뉴런 또는 PV-발현 개재뉴런의 SCN1A-발현 개재뉴런 또는 PV-발현 개재뉴런으로의 전환을 용이하게 한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 요소, 예를 들어, E1-E10 및 Gq-DREADD 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물 (또는 벡터 자체)의 투여는 뇌에서 Gq-DREADD 수용체를 발현하지 않는 개체 또는 대상체의 개재뉴런 또는 PV-발현 개재뉴런의 Gq-DREADD 수용체-발현 개재뉴런 또는 PV-발현 개재뉴런으로의 전환을 용이하게 하며, 그에 의해 Gq-DREADD 효능제에 반응성인 개재뉴런 또는 PV-발현 개재뉴런을 발생시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 요소, 예를 들어, E1-E10 및 PSAM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물 (또는 벡터 자체)의 투여는 뇌에서 PSAM을 발현하지 않는 개체 또는 대상체의 개재뉴런 또는 PV-발현 개재뉴런의 PSAM-발현 개재뉴런 또는 PV-발현 개재뉴런으로의 전환을 용이하게 한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 조성물 및 방법은 부분적 및/또는 전신성 발작의 예방적 또는 치료적 치료에 사용된다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 E2, E5, 또는 E6이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 조성물 및 방법은 제한 없이, 약물-저항성 간질을 포함하여 다양한 형태의 간질의 예방적 또는 치료적 치료에 사용되고/거나, 약물학적 치료의 대체물을 구성할 수 있다. 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 조성물 및 방법은 국재화-관련된 간질, 전신성 간질, 전신성 및/또는 국소 발작 둘 다를 갖는 간질 등을 포함하여 간질, 레녹스-가스토 증후군과 연관된 발작, 질환 또는 상태의 합병증으로서의 발작 (예컨대 뇌병증, 페닐케톤뇨증, 소아 고셰병, 운베리히트-룬드보르그 진행성 근간대성 간질, 뇌졸중, 두부 외상, 스트레스, 호르몬 변화, 약물 사용 또는 금단, 알콜 사용 또는 금단, 수면 방해, 열, 감염, 뇌암 등과 연관된 발작), 또는 화학적으로-유도된 발작 장애를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 발작 장애의 예방적 또는 치료적 치료에 사용된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 벡터 또는 rAAV 벡터, 조성물 및 방법은 필요로 하는 개체 또는 대상체, 예를 들어, 발작을 경험한, 및/또는 경험할 위험이 있는, 및 따라서 임의의 발작 장애로 진단되거나 가질 것으로 의심되는 것의 예방적 또는 치료적 치료에 사용된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 요소 및 트랜스진을 포함하는 바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터의 투여는 발작, 예를 들어, 간질성 발작, 또는 DS 증상의 발병 전의 시간에, 예를 들어, 투여 전 수 일, 수 주, 수 개월, 또는 수 년에 일어날 수 있다. 예로서, 관련 기술분야의 것들은 rAAV 유도된 발현이 비-인간 영장류 모델에서 적어도 6년 동안 지속될 수 있음을 입증하였다 (Rivera, V.M. et al., 2005, Blood, 105:1424-1430).
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열을 포함하는 rAAV 벡터는 또한 바이러스 벡터의 표적화 능력을 향상시키고, 벡터가 특히 뇌의 대뇌 피질 내의 개재뉴런 세포, 예컨대 GABA작동성 개재뉴런 세포, 및/또는 GABA작동성 개재뉴런 세포의 특이적 하위집단을 특이적으로 형질도입하는 것을 허용하는 캡시드 단백질을 포함한다. GABA작동성 개재뉴런을 형질도입하는 rAAV 벡터, 및 바이러스가 GABA작동성 개재뉴런, 특히, PV-발현 개재뉴런 (PV-발현 피질 개재뉴런으로도 지칭됨)으로 지칭되는 파르브알부민 (PV)을 또한 발현하는 GABA작동성 개재뉴런의 하위집단을 특이적으로 형질도입할 가능성을 증가시키는 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 벡터는 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기에 매우 적합하다. 또 다른 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열, 예를 들어, E5를 함유하는 rAAV 벡터는 또한 바이러스 벡터의 표적화 능력을 향상시키고, 벡터가 피라미드형 뉴런, 예를 들어, 뇌 피질의 글루타메이트성 피라미드형 뉴런 세포를 특이적으로 형질도입하는 것을 허용하는 캡시드 단백질을 포함한다.
한 실시양태에서, 바이러스 벡터 내로 삽입된 트랜스진 (이펙터 유전자)은 그의 기능 (또는 기능의 소실)이 발작 또는 간질, 예컨대 영아 열성 간질, 또는 드라베 증후군 (DS)의 유해한 증상을 특징으로 하는 신경학적 질환과 인과적으로 연관되는 것으로 밝혀진 것이다. 벡터에서의 인핸서 서열은 트랜스진의 발현을 개재뉴런 또는 그의 하위유형, 또는 뉴런, 예컨대 피라미드형 뉴런에 제한하고, 개재뉴런 세포에서의 이 유전자의 정상적, 기능적 버전의 발현을 조정하며, 예를 들어, 증가시키거나 향상시킨다. 한 실시양태에서, 개재뉴런 세포는 GABA작동성 개재뉴런 세포이다. 한 실시양태에서, 개재뉴런 GABA작동성 세포는 PV-발현 개재뉴런 세포이다. 한 실시양태에서, 뉴런 세포는 피라미드형 뉴런 세포이다. 한 실시양태에서, 피라미드형 뉴런 세포는 글루타메이트성 피라미드형 뉴런이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 AAV 벡터, 벡터-기반 조성물, 및 전달 및 치료 방법은 드라베 증후군 (DS), 및 그의 심각한 증상, 예컨대 간질 및 수반되는 발작으로 고통받는 환자를 치료하는데 유용하다. 한 실시양태에서, 환자는 DS로 고통받는 인간 환자, 특히, 영아 또는 어린 아동이다. 하기에 추가로 기재된 바와 같이, 드라베 증후군 (DS)은 인지 손상 및 생명을 위협하는 발작을 포함하여 많은 심각한 증상과 연관된 영아 간질의 형태이다. SCN1A 유전자에 의해 코딩되는 나트륨 채널 Nav1.1의 기능의 소실은 DS에 대한 가장 우세한 원인이다. DS의 마우스 모델을 사용한 이전의 연구는 이 증후군에서 가장 유해한 증상을 나타내는 발작의 기저에 있는 주요한 결함이 GABA작동성 개재뉴런에서의 SCN1A 유전자 기능의 소실임을 시사한다. DS 환자에서 발작을 제거하거나 감소시키는 신뢰성 있는 치료는 현재 없다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 생성물, 조성물 및 방법은 DS로 고통받는 환자를 위한 많이 필요하고 매우 유익한 치료를 제공한다.
따라서, 특정 실시양태에서, AAV 벡터 또는 비히클에 함유되는 트랜스진 또는 이펙터 유전자는 SCN1A이고, 인핸서는 SCN1A 유전자의 발현을 SCN1A-발현 개재뉴런에 제한하고, 개재뉴런 세포, 예를 들어, GABA작동성 개재뉴런, 또는 PV-발현, GABA작동성 개재뉴런에서의 SCN1A 유전자의 발현을 조정하는데 특이적인 핵산 서열 (예를 들어, AAV 벡터에서 시스-작용 제어 요소)이다. 또 다른 특정 실시양태에서, AAV 벡터 또는 비히클에 함유되는 트랜스진 또는 이펙터 유전자는 SCN1A이고, 인핸서는 SCN1A 유전자의 발현을 SCN1A-발현 피라미드형 뉴런에 제한하고, 뇌 피질, 예를 들어, 뇌의 피질층 5 내의 피라미드형 뉴런 세포, 예를 들어, 글루타메이트성 피라미드형 뉴런에서의 SCN1A 유전자의 발현을 조정하는데 특이적인 핵산 서열 (예를 들어, AAV 벡터에서 시스-작용 제어 요소)이다.
Nav1.1 나트륨 채널을 코딩하는 정상적인 SCN1A 이펙터 유전자의 발현을 개재뉴런 세포에 제한하는 특이적 인핸서를 함유하도록 디자인되고 분자적으로 조작된 AAV 벡터를 이용하는 방법은 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 바이러스 벡터 또는 입자를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 대상체 (예를 들어, DS를 갖는 인간 영아)에게 투여하여, 특히, SCN1A-특이적 인핸서 서열 및 SCN1A 유전자를 함유하는 벡터로 대상체에서의 개재뉴런 세포를 형질도입하고, 개재뉴런 세포에서 유전자를 발현하고, 투여 후 대상체의 개재뉴런 세포에서 기능적 반응, 예를 들어, 기능적 Nav1.1 나트륨 채널의 제공 또는 나트륨 채널의 기능의 증가를 제공하는 것을 포함한다. 형질도입된 개재뉴런 세포에서의 SCN1A의 기능적 발현은 SCN1A-결핍성 개재뉴런 세포 집단, 예컨대 GABA작동성 개재뉴런 및 PV-발현, GABA작동성 개재뉴런의 흥분성을 정상화한다. 이러한 결과는 뇌의 영역에서 섬세한 E/I 균형을 복원한다.
DS에 대한 요법의 형태로서 AAV에 함유된 유전자를 성공적으로 및 특이적으로 발현하기 위해, SCN1A 유전자의 조절 경관을 탐구하여 이 이펙터 유전자에 대해 결핍성인 뉴런 세포 집단에 특이적으로 발현을 제한할 수 있는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하는 접근법이 개발되었다. (도 3A-3D). 한 실시양태에서, 인핸서 서열은 특히 개재뉴런 세포, 예컨대 GABA작동성 개재뉴런 세포 또는 PV-발현 GABA작동성 개재뉴런 세포에서, 특히 SCN1A 유전자의 기능의 소실이 있는 개재뉴런에서 SCN1A 유전자의 발현을 조정하는, 예를 들어, 증가시키거나, 향상시키거나, 증강시키거나, 다르게는 개선시키는 시스-작용 요소이다. 한 실시양태에서, 인핸서 서열은 특히 피라미드형 뉴런, 예컨대 글루타메이트성 피라미드형 뉴런 세포에서 SCN1A 유전자의 발현을 조정하는, 예를 들어, 증가시키거나, 향상시키거나, 증강시키거나, 다르게는 개선시키는 시스-작용 요소이다. 용어 "인핸서" 및 "인핸서 요소"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 일부 경우에, 용어 "인핸서 요소"는 "조절 요소"로 지칭된다.
한 실시양태에서, 개재뉴런 세포에서의 SCN1A 유전자의 발현을 특이적으로 조절하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열은 약 25-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1650, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 또는 2500개의 뉴클레오티드 (염기 쌍 (bp)), 또는 그 초과, 예를 들어, 2500개 초과의 뉴클레오티드 (bp)의 길이 (이들 상기 언급된 bp 길이 사이에 있는 모든 더 큰 및 더 작은 값을 포함함)이다. 일부 실시양태에서, 사용하기에 적합한 PV-특이적 인핸서 서열은 261 bp, 521 bp, 547 bp, 606 bp, 618 bp, 663 bp, 832 bp, 1280 bp, 1644 bp, 또는 2430 bp이다. 다른 실시양태에서, 사용하기에 적합한 PV-특이적 인핸서 서열은 267 bp, 586 bp, 636 bp, 665 bp, 844 bp, 849 bp, 894 bp, 1636 bp, 1766 bp, 또는 5124 bp이다. 개재뉴런 세포에서의 SCN1A 유전자의 발현을 조정하는데 (예를 들어, 향상시키는데) 특이성을 갖는 인핸서 서열은 게놈 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA의 인트론성 또는 유전자간 서열로부터 유래될 수 있다. (도 1A-1 내지 1A-3).
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 도 1A-1에 나타내어진, 염색체 2 상에 시작/정지 위치 66256056/ 66257335에 위치한 "S5E1"로도 지칭되는 하기 마우스 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열 (E1), 또는 그의 인간 오르토로그와 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00007
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 도 1A-1에 나타내어진, 염색체 2 상에 시작/정지 위치 66364036/66364653에 위치한 "S5E2"로도 지칭되는 하기 마우스 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열 (E2), 또는 그의 인간 오르토로그와 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00008
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 도 1A-1에 나타내어진, 염색체 2 상에 시작/정지 위치 66383190/66384021에 위치한 "S5E3"으로도 지칭되는 하기 마우스 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열 (E3), 또는 그의 인간 오르토로그와 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00009
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 도 1A-1에 나타내어진, 염색체 2 상에 시작/정지 위치 66387764/66388024에 위치한 "S5E4"로도 지칭되는 하기 마우스 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열 (E4), 또는 그의 인간 오르토로그와 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00010
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 도 1A-1에 나타내어진, 염색체 2 상에 시작/정지 위치 66392447/66393109에 위치한 "S5E5"로도 지칭되는 하기 마우스 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열 (E5), 또는 그의 인간 오르토로그와 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00011
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 도 1A-1에 나타내어진, 염색체 2 상에 시작/정지 위치 66401767/66402372에 위치한 "S5E6"으로도 지칭되는 하기 마우스 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열 (E6), 또는 그의 인간 오르토로그와 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00012
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 도 1A-1에 나타내어진, 염색체 2 상에 시작/정지 위치 66407834/66410263에 위치한 "S5E7"로도 지칭되는 하기 마우스 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열 (E7), 또는 그의 인간 오르토로그와 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00013
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 서열은 도 1A-1에 나타내어진, 염색체 2 상에 시작/정지 위치 66439814/66441457에 위치한 "S5E8"로도 지칭되는 하기 마우스 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열 (E8), 또는 그의 인간 오르토로그와 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00014
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 도 1A-1에 나타내어진, 염색체 2 상에 시작/정지 위치 66441748/66442268에 위치한 "S5E9"로도 지칭되는 하기 마우스 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열 (E9), 또는 그의 인간 오르토로그와 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00015
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 도 1A-1에 나타내어진, 염색체 2 상에 시작/정지 위치 66450594/66451140에 위치한 "S5E10"으로도 지칭되는 하기 마우스 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열 (E10), 또는 그의 인간 오르토로그와 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00016
한 측면에서, 10가지 상기 기재된 뮤린 인핸서 서열에 대한 인간 서열 (인간 오르토로그 서열)은 100 kb 상류 및 하류 둘 다를 포함하여, SCN1A의 인간 게놈 서열에 대한 마우스 서열의 정렬에 기반하여 결정되었다. 따라서, 마우스 및 인간 서열 사이에 고도로 보존된 인간 오르토로그 서열이 확인되었다.
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 165953030/인간_hg38 정지 165954796에 위치한 본원에서 E1 또는 S5E1로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00017
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 166084035/인간_hg38 정지 166084884에 위치한 본원에서 E2 또는 S5E2로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00018
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 166090876/인간_hg38 정지 166091720에 위치한 본원에서 E3 또는 S5E3으로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00019
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 166094366/인간_hg38 정지 166094633에 위치한 본원에서 E4 또는 S5E4로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00020
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 166103693/인간_hg38 정지 166104587에 위치한 본원에서 E5 또는 S5E5로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00021
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 166118214/인간_hg38 정지 166118879에 위치한 본원에서 E6 또는 S5E6으로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00022
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 165892760/인간_hg38 정지 165897884에 위치한 본원에서 E7 또는 S5E7로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00023
Figure pct00024
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 166148156/인간_hg38 정지 166149792에 위치한 본원에서 E8 또는 S5E8로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00025
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 166150066/인간_hg38 정지 166150702에 위치한 본원에서 E9 또는 S5E9로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00026
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 166160023/인간_hg38 정지 166160609에 위치한 본원에서 E10 또는 S5E10으로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00027
한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 상기 기재된 E1 (S5E1) 내지 E10 (S5E10) 인핸서 요소 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 15-24)의 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서 서열은 상기 기재된 E2 (S5E2) 인핸서 요소 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 16)의 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 36816984 /인간_hg38 정지 36817612에 위치한 본원에서 E11로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00028
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 36817484 /인간_hg38 정지 36817720에 위치한 본원에서 E12로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00029
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 36818134 /인간_hg38 정지 36818727에 위치한 본원에서 E13으로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00030
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 88802240 /인간_hg38 정지 88802877에 위치한 본원에서 E14로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00031
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 88803290 /인간_hg38 정지 88803678에 위치한 본원에서 E15로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00032
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 88807290 /인간_hg38 정지 88807962에 위치한 본원에서 E16으로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00033
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 88833390 /인간_hg38 정지 88833984에 위치한 본원에서 E17로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00034
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 128377753 /인간_hg38 정지 128378783에 위치한 본원에서 E18로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00035
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 128289803 /인간_hg38 정지 128290279에 위치한 본원에서 E19로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00036
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 128323153 /인간_hg38 정지 128323718에 위치한 본원에서 E20으로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00037
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 128332503 /인간_hg38 정지 128332974에 위치한 본원에서 E21로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00038
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 128336003 /인간_hg38 정지 128336491에 위치한 본원에서 E22로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00039
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 128365603 /인간_hg38 정지 1283366181에 위치한 본원에서 E23으로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00040
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 128375853 /인간_hg38 정지 128376606에 위치한 본원에서 E24로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00041
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 128408553 /인간_hg38 정지 128408930에 위치한 본원에서 E25로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00042
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 13388723 /인간_hg38 정지 13390212에 위치한 본원에서 E26으로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00043
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 13469123 /인간_hg38 정지 13470861에 위치한 본원에서 E27로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00044
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 31124894 /인간_hg38 정지 31125629에 위치한 본원에서 E28로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00045
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 31132544 /인간_hg38 정지 31133831에 위치한 본원에서 E29로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00046
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 88655733 /인간_hg38 정지 88657379에 위치한 본원에서 E30으로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00047
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 88872683 /인간_hg38 정지 88872997에 위치한 본원에서 E31로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00048
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 88745133 /인간_hg38 정지 88745535에 위치한 본원에서 E32로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00049
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 88799783 /인간_hg38 정지 88801354에 위치한 본원에서 E33으로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00050
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 27969472 /인간_hg38 정지 27969690에 위치한 본원에서 E34로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00051
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 인간 게놈 서열에서 인간_hg38 시작 27973822 /인간_hg38 정지 27974489에 위치한 본원에서 E35로 지칭되는 하기 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 50-500 bp 이상, 50-250 bp 이상, 100-200 bp 이상, 또는 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 1A-2 및 1A-3):
Figure pct00052
한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열은 상기 기재된 E11 내지 E35 인핸서 요소 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 25-49)의 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 인핸서 서열은 예를 들어 상기 기재된 E1 (서열식별번호: 15), E2 (서열식별번호: 16), E5 (서열식별번호: 19), E6 (서열식별번호: 20), E11 (서열식별번호: 25), E14 (서열식별번호: 28), E22 (서열식별번호: 36), 또는 E29 (서열식별번호: 43) 인핸서 요소 서열의 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
열성 발작 플러스를 갖는 유전적 간질 (GEFS+) 및 드라베 증후군
열성 발작 플러스를 갖는 유전적 간질 (GEFS+)은 다양한 중증도의 발작 장애의 스펙트럼을 구성하는 희귀한 상태이다. GEFS+는 통상적으로 그의 구성원이 열과 관련되지 않는 발작 (무열성 발작)을 포함하여 다른 유형의 고열 및 재발성 발작 (간질)에 의해 촉발되는 열성 발작의 조합을 갖는 가족에서 진단된다. 전신성 발작으로 지칭되는 추가적인 발작 유형은 통상적으로 뇌의 양쪽 측을 포함하지만; 뇌의 단지 한쪽 측을 포함하는 발작 (부분적 발작)은 일부 병에 걸린 개체에서 발생한다. GEFS+를 갖는 개체에서 가장 통상적인 유형의 발작은 비자발적인 근육 연축을 유발하는 근간대성 발작; 약한 근육 긴장의 돌발성 에피소드를 포함하는 무긴장성 발작; 및 시작 발작으로서 나타나는 짧은 기간 동안의 의식의 소실을 유발하는 실신 발작을 포함한다. GEFS+는 통상적으로 가족에서 진단되지만, 이는 그들의 가족에서 상태의 내력이 없는 개체에서 발생할 수 있다.
GEFS+ 스펙트럼의 가장 통상적이고 가장 경도의 특색은 영아기에서 시작하고, 전형적으로 5세까지 중단되는 단순 열성 발작이다. 열성 발작이 5세 후에 계속되는 경우, 또는 다른 유형의 발작이 발달하는 경우, 상태는 열성 발작 플러스 (FS+)로 지칭되며, 이는 전형적으로 초기 청소년기에 중단된다.
영아기의 중증 근간대성 간질 (SMEI) 또는 초기 영아 간질성 뇌병증-6 (EIEE6)으로도 공지된 드라베 증후군 (DS)은 빈번히 GEFS+ 스펙트럼의 일부인 것으로 간주되는 상태이며, 이 군의 장애에서 가장 중증 장애이다. 용어 드라베 증후군은 바람직하게는 모든 병에 걸린 개체가 근간대성 간질을 나타내는 것은 아니기 때문에 사용된다. 병에 걸린 영아는 전형적으로 수 분을 지속하는 연장된 발작 (간질 지속상태)을 가지며, 열에 의해 촉발된다. 무열성 발작을 포함하여 다른 유형의 발작은 초기 아동기에 시작한다. 이들 발작 유형은 근간대성 또는 실신 발작을 포함할 수 있다. 드라베 증후군에서, 이들 발작은 의약으로 제어하기가 곤란하며, 이들은 시간 경과에 따라 악화될 수 있다. 뇌 기능의 감소는 또한 드라베 증후군에서 통상적이다. 드라베 증후군에 걸린 아동은 통상적으로 생후 첫 해에 정상적으로 발달하지만, 그 후 발달이 멈추며; 일부 병에 걸린 아동은 이전에 획득된 기술을 소실하고, 발달 퇴행에 시달린다. 드라베 증후군으로 고통받는 많은 아동은 조화 운동 곤란 (실조)을 가지며, 지적 장애를 갖는다.
GEFS+의 원인
확인되지 않은 일부를 포함하여 몇몇 유전자에서의 돌연변이는 GEFS+를 유발할 수 있다. 가장 통상적으로 연관된 유전자는 SCN1a이다. 드라베 증후군 사례의 80% 초과 및 다른 GEFS+ 사례의 약 10%는 이 유전자의 변화에 의해 유발된다. 다른 유전자에서의 돌연변이는 단지 소수의 병에 걸린 개체 또는 가족에서 발견되었다. GEFS+와 연관된 SCN1A 유전자 및 다른 유전자는 양으로 하전된 이온을 세포 내로 수송하는 이온 채널의 서브유닛을 코딩한다. 이들 이온의 수송은 뉴런 (신경 세포) 사이의 전기 신호를 생성하고 전송하는 것을 돕는다. SCN1A 유전자에서의 돌연변이는 나트륨 채널에 대한 다양한 효과를 갖는다. 드라베 증후군을 유발하거나 이와 연관된 많은 유전적 돌연변이는 각각의 세포에서 기능적 채널의 수를 감소시킨다. 보다 경도의 GEFS+ 장애를 유발하는 돌연변이는 채널의 구조를 변경시킬 가능성이 있다. 모든 이들 유전적 변화는 나트륨 이온을 뉴런 내로 수송하는 채널의 능력에 영향을 미친다. 일부 유해한 돌연변이는 채널 활성을 감소시키는 것으로 생각되지만, 다른 것들은 이를 증가시킬 수 있다. GABA작동성 수용체 서브유닛 유전자의 변화는 채널의 기능을 손상시켜, 뉴런 사이의 비제어된 신호전달을 유발하며, 이는 발작을 초래할 가능성이 있다. 이론에 구애되기를 원하거나 의도하지는 않지만, 일부 연구는 특정 SCN1A 유전자 돌연변이가 뉴런 사이의 신호전달의 일정한 자극을 유발함을 보고하였다. 뇌에서의 특정 뉴런의 이러한 과자극은 발작과 연관된 비정상적 뇌 활성을 촉발시킨다.
모든 SCN1A 유전자 돌연변이가 동일한 효과를 갖는지는 공지되어 있지 않지만, 게놈-범위 연관 연구는 SCN1A 유전자에 의해 코딩되는 전압-게이팅된 나트륨 채널 Nav1.1의 기능의 소실이 드라베 증후군에 대한 가장 우세한 원인임을 입증하였다. 드라베 증후군의 마우스 모델을 사용한 이전의 연구는 이 증후군의 가장 유해한 증상을 나타내는 발작의 기저에 있는 주요한 결함이 GABA작동성 개재뉴런에서의 SCN1A 유전자 기능의 소실임을 시사한다.
동물 연구에서, SCN1A -/- 마우스는 중증 실조 및 발작을 발달시켰으며, 출생후 제15일에 죽었음이 밝혀졌다. SCN1A +/- 마우스는 자발성 발작 및 출생후 제21일 후에 시작하여 산발성 사망을 가졌으며, 유전적 배경에 대한 주목할 만한 의존을 가졌다. SCN1A의 소실은 해마 뉴런에서 나트륨 채널의 전압-의존적 활성화 또는 불활성화를 변화시키지 않았다. 그러나, 나트륨 전류 밀도는 SCN1A -/- 및 +/- 마우스의 억제성 개재뉴런에서 실질적으로 감소되었다. (Yu, F.H. et al., 2006, Nat Neurosci, 9(9):1142-1149; Yu et al., 2007, Nat Neurosci, 10(1):134). 연구는 이형접합성 SCN1A 돌연변이로부터 발생된 GABA작동성 억제성 개재뉴런에서의 감소된 나트륨 전류가 SMEI를 갖는 환자에서 간질을 초래하는 과다흥분성을 유발할 수 있음을 시사하였다.
GABA작동성 피질 개재뉴런
신경전달물질 감마-아미노부티르산 (GABA)을 방출하는 GABA작동성 개재뉴런은 중추 신경계의 억제성 뉴런이며, 신경 회로망 및 활성을 조절하고 유지하는데 필수적이다. (Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19). 포유동물 대뇌 피질의 GABA작동성 개재뉴런은 그들의 발현된 단백질 마커에 의해 범주화되고 분류될 수 있는 몇몇 상이한 피질 개재뉴런 하위유형을 포함한다.
개재뉴런은 무척추동물 및 척추동물 유기체 둘 다의 발달하는 신경계의 배선 및 신경 회로망에서 핵심적 역할을 한다. 일반적으로, 개재뉴런은 그의 주요한 역할이 다른 유형의 뉴런 사이의 연결을 형성하는 것인 특수화된 유형의 뉴런 (신경 세포)이다. 운동 뉴런도 감각 뉴런도 아닌 개재뉴런은, 투영 뉴런은 그들의 신호를 보다 먼 위치, 예컨대 뇌 또는 척수로 보낸다는 점에서, 투영 뉴런과는 상이하다. 중요하게는, 개재뉴런은 신경 회로망 및 회로 활성을 조정하는 기능을 한다. 중추 신경계의 대다수의 개재뉴런은 억제성 유형의 것이다. 흥분성 뉴런과 대조적으로, 억제성 피질 개재뉴런은 전형적으로 신경전달물질 감마-아미노부티르산 (GABA) 및 글리신을 방출한다. 피질 개재뉴런은 뇌에서 대뇌 및 소뇌 구조를 커버하는 기능을 하는 외부 신경 조직의 쉬트로서 정의되는 대뇌 피질에 국재화된다. (동일 문헌)
GABA작동성 개재뉴런은 그들이 발현하는 표면 마커에 의해 범주화될 수 있는 다수의 개재뉴런 하위유형을 포함한다. 4가지 주요한 피질 개재뉴런 하위유형은 파르브알부민 (PV)-발현 개재뉴런, 소마토스타틴 (SST)-발현 개재뉴런 (이질적 집단을 구성함), 및 이오노트로픽 세로토닌 수용체 5HT3a (5HT3aR)-발현 개재뉴런이다. 이들 3가지 하위유형은 함께 마우스에서 신피질 GABA작동성 개재뉴런 집단의 대략 100%를 차지한다. 이들 개재뉴런은 대뇌 피질의 그들의 각각의 층으로 귀소하지만, 이들은 다양한 외피하 위치에서 생성되며, 이들은 후속적으로 대뇌 피질로 이동한다.
피질 회로 기능은 흥분성 입력 및 억제성 입력 사이의 균형에 의해 유지된다. 신경 회로의 균형의 붕괴는 신경학적, 신경발달성, 또는 신경정신 장애, 예컨대, 제한 없이, 간질, 자폐증 스펙트럼 장애, 및 지적 장애의 출현에 기여할 가능성이 있다.
GABA작동성 피질 개재뉴런의 역할
GABA작동성 뉴런은 억제성 역할을 하고, 신경전달물질 GABA를 시냅스적으로 방출하여 표적 뉴런의 발화율을 조절한다. 신경전달물질 방출은 전형적으로 뉴런 신호전달 경로를 촉발시키기 위해 시냅스후 GABAA 이오노트로픽 수용체를 통해 작용한다. 개재뉴런 역할/기능은 전형적으로 3가지 성분으로 범주화된다: (1) 수입성 입력, (2) 개재뉴런의 내재적 특성, 및 (3) 개재뉴런의 표적. 일반적으로, 개재뉴런은 피라미드형 세포, 뿐만 아니라 다른 피질 및 피질하 영역으로부터의 세포를 포함하여 다양한 공급원으로부터의 입력을 받는다. (Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19). 출력에 관하여, 피질 개재뉴런은 피드-포워드 및 피드백 억제에 관여한다. 출력의 방식과 무관하게, 피질 개재뉴런 네트워크는 단일 피질 개재뉴런이 그의 흥분성 뉴런 표적(들)과의 다수의 연결을 생성할 수 있다는 사실에 의해 추가로 복잡해진다.
피질 개재뉴런 하위유형
대뇌 피질에 GABA작동성 개재뉴런의 20가지 초과의 상이한 하위유형이 있는 것으로 추정된다. 하위유형은 또한 마커로서 기능하는 그들이 발현하는 칼슘-결합 단백질에 기반하여 서로로부터 구별된다. 마우스 및 래트 뇌 조직 둘 다에서 수행된 연구에 기반하여, 칼슘-결합 단백질, 파르브알부민 (PV), 및 신경펩티드 소마토스타틴 (SST)은 대뇌 피질 내에서 가장 우세한 개재뉴런 하위유형을 한정하는 것으로 밝혀진 핵심적 마커이다. 특히 주목할 만하게, PV-발현 개재뉴런 집단은, 이들 마커가 중첩하지 않는다는 점에서, SST-발현 집단으로부터 독립적이다. 함께 총 GABA작동성 피질 개재뉴런 집단의 대략 70%를 포함하는 PV- 및 SST-양성 GABA작동성 개재뉴런 외에도, 5HT3aR을 발현하는 개재뉴런의 또 다른 하위군은 모든 개재뉴런의 대략 30%를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이들 3가지 개재뉴런 하위집단은 모든 GABA작동성 피질 개재뉴런의 거의 100% 또는 그와 동등한 것을 차지하지만, 이들 집단의 각각, 특히 5HT3aR-발현 집단은 이질적이며, 그들의 특징규명에 기여하는 다른 단백질 또는 신경펩티드를 발현한다. (Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19).
파르브알부민 (PV)-발현 개재뉴런
PV-발현 개재뉴런은 GABA작동성 피질 개재뉴런 집단의 대략 40%를 나타낸다. 이 개재뉴런의 집단은 급속-스파이킹 패턴을 가지며, 짧은 활동 전위의 지속된 고-주파수 트레인을 발화시킨다. 이들 개재뉴런은 또한 모든 개재뉴런의 가장 낮은 입력 저항 및 가장 빠른 막 시간 상수를 갖는다.
2가지 유형의 PV-개재뉴런은 PV 개재뉴런 군을 포함한다: 바스켓 세포 및 샹들리에 세포. 바스켓 세포는 표적 뉴런의 소마 및 근위 수상돌기에서 시냅스를 생성하는 개재뉴런이며, 통상적으로 다극성 형태학을 갖는다. 몇몇 연구는 급속-스파이킹 바스켓 뉴런이 신피질에서 우세한 억제성 시스템이며, 여기서 이들은 많은 다른 기능 중에서 표적 뉴런의 급속한 억제를 매개함을 보였다. 이러한 급속-스파이킹 바스켓 뉴런은 대뇌 피질에서 흥분성 및 억제성 입력 사이의 섬세한 균형을 조절하는데 있어서 큰 역할을 할 가능성이 있다. 바스켓 뉴런과는 다리, PV-발현 개재뉴런의 샹들리에 세포 하위군은 피라미드형 뉴런의 액손 초기 절편을 표적화한다. 바스켓 세포 및 샹들리에 세포 둘 다는 급속-스파이킹이지만, 이들은 전기생리학적 특성에 있어서 상이하다. 다른 개재뉴런과 대조적으로, 샹들리에 세포는 막 전위에 대한 그들의 탈분극 효과로 인해 억제성이라기 보다는 흥분성일 수 있다. (Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19).
신피질, 예를 들어, 마우스 신경피질 내의 샹들리에 및 바스켓 뉴런으로부터 독립적인 PV-발현 세포의 또 다른 군은 다극성 폭발 세포로 지칭되며, 이는 전기생리학 및 연결성 둘 다에 있어서 샹들리에 및 바스켓 세포와는 상이하다. 다극성 폭발 뉴런은 쌍형성한-펄스 용이화를 입증하는 피라미드형 세포 (또는 다른 다극성 폭발 세포)와의 시냅스를 가지며; 대조적으로, 샹들리에 및 바스켓 세포는 통상적으로 강하게 감압성이다. (Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19).
소마토스타틴 (SST)-발현 개재뉴런
SST-발현 개재뉴런은 마우스 신피질에서 두번째로 가장 큰 개재뉴런 군을 구성하며, 총 피질 개재뉴런 집단의 대략 30%를 나타낸다. SST GABA작동성 개재뉴런은 피질 개재뉴런의 이질적 집단을 나타낸다. SST-양성 개재뉴런은 마르티노티 세포로 지칭되며, 대뇌 피질의 층 I을 수지상화하고, 피라미드형 뉴런의 수지상 다발 상으로 시냅스를 확립하는 상행 액손을 갖는다. 마르티노티 세포는 또한 피질층 II-VI 전반에 걸쳐 발견되지만, 층 V에 가장 풍부하다. PV-양성 개재뉴런과 대조적으로, 마르티노티 세포 상으로의 흥분성 입력은 강하게 촉진성이다. SST-발현 피질 개재뉴런의 추가적인 하위집단은 이 집단 내에서 발화 특성, 분자 마커의 발현 및 상이한 뉴런의 연결성에 있어서 차이를 나타낸다. (Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19).
5HT3aR-발현 개재뉴런
GABA작동성 피질 개재뉴런의 제3 집단은 5HT3aR 개재뉴런 군으로 지정되며, 이는 GABA작동성 피질 개재뉴런 집단의 대략 30%를 차지한다. 마우스 연구에 기반하여, 피질 내의 GABA작동성 개재뉴런의 이 집단은 5HTa3 수용체를 발현하지만, PV도 SST도 발현하지 않는다.
5HT3aR 개재뉴런은 이질적 집단을 나타낸다. 5HT3aR 개재뉴런 군 내에서, 혈관활성 장 펩티드 (VIP)를 포함하여 다른 단백질 또는 신경펩티드 마커를 또한 발현하는 개재뉴런의 몇몇 하위세트가 있다. VIP-발현 개재뉴런은 피질층 II 및 III에 국재화된다. VIP-발현 개재뉴런은 PV 또는 SST를 발현하지 않지만, 5HTa3 수용체를 발현하며, 5HT3aR 집단의 대략 40%를 차지한다. VIP 개재뉴런은 일반적으로 수상돌기 상으로 시냅스를 생성하며; 일부는 다른 개재뉴런을 표적화하는 것으로 관찰되었다. 다른 피질 개재뉴런에 비해, VIP 개재뉴런은 매우 높은 입력 저항을 가지며, 개재뉴런 중 가장 흥분성이다.
5HT3aR-발현 집단에서 피질 개재뉴런의 60%는 VIP를 발현하지 않는다. 이 VIP-음성 5HT3aR 군 중, 거의 80%는 개재뉴런 마커 리엘린을 발현한다. 피질 개재뉴런의 이 후자의 범주에서, 거미줄 세포로 지칭되는 신경아교형 세포 집단은 신경펩티드 Y (NPY)를 발현하며, 둥근 소마로부터 방사하는 다수의 수상돌기를 나타낸다. 신경아교형 개재뉴런은 단지 동종 뉴런 상으로만 시냅스를 생성할 수 있는 다른 유형의 개재뉴런과 대조적으로, 서로와 뿐만 아니라 다른 개재뉴런 유형과 시냅스 연결을 형성할 수 있다. 따라서, 신경아교형 세포는 신경 회로망을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하며, 피라미드형 뉴런 및 다른 개재뉴런 상으로 장기-지속성 억제성 시냅스후 전위를 유발하기 위해, 저속 GABAA 및 GABAB 수용체를 활성화시킴으로써 기능한다.
피라미드형 뉴런
피라미드형 세포로도 공지된 피라미드형 뉴런은 20-120 μm의 직경의 범위인 피라미드형 형상의 세포체 (소마), 및 2개의 별개의 수지상 나무를 갖는 뉴런이다. 기저 수상돌기는 기부로부터, 첨단 수상돌기는 피라미드형 세포체의 정점으로부터 나온다. 대부분의 뉴런과 같이, 피라미드형 뉴런은 다수의 수상돌기 및 단일 액손을 갖지만, 수상돌기 및 액손 둘 다는 광범위하게 분기한다. 피라미드형 뉴런의 수상돌기는 통상적으로 다른 뉴런으로부터 시냅스 접촉을 받는 입력 구조로서 간주되는 반면, 액손은 다른 뉴런에의 그의 출력으로서 기능한다. 피라미드형 뉴런 수상돌기는 또한 역행성 신호전달 분자 (예를 들어 엔도칸나비노이드)를 방출할 수 있으며, 따라서 통신은 다소 양방향성이다. 수상돌기 및 액손의 광범위한 분기화는 단일 뉴런이 네트워크에서 수 천개의 다른 뉴런과 통신하는 것을 허용한다. (Spruston, N., 2009, Scholarpedia, 4(5):6130).
피라미드형 뉴런은 포유동물, 뿐만 아니라 조류, 어류 및 파충류의 전뇌 구조, 예컨대 대뇌 피질, 해마, 및 편도에서 발견되지만, 후각 망울, 선조체, 중뇌, 후뇌, 또는 척수에서는 발견되지 않는다. 피라미드형 뉴런은 뉴런의 흥분성 패밀리의 가장 조밀한 구성원, 예를 들어, 그들이 서식하는 뇌 영역, 예컨대 뇌 피질 구조에서 신경전달물질 글루타메이트를 방출하는 뉴런이다. 그들의 풍부성은 이들이 신경계의 기능화에 있어서, 뿐만 아니라 인지 프로세싱에 있어서 중요한 역할을 함을 시사한다. 피라미드형 뉴런은 포유동물 대뇌 피질에서 모든 뉴런의 약 2/3를 포함하며, 여기서 이들은 시냅스 입력을 활동 전위의 패턴화된 출력으로 변환하는 기능을 한다. 피라미드형 뉴런은 수만의 흥분성 시냅스 및 몇몇 수천 억제성 시냅스로부터 시냅스 입력을 받는다. 대부분의 흥분성 입력은 신경전달물질로서 글루타메이트를 사용하는 반면 (예를 들어, 글루타메이트성 피라미드형 뉴런), 억제성 입력은 GABA를 사용한다.
자극의 성질은 피라미드형 뉴런에 의해 생성된 출력의 유형 (예를 들어, 단일 스파이크 대 폭발)을 결정할 수 있지만, 내재적 뉴런 흥분성은 어떻게 뉴런이 입력에 반응하는지의 또 다른 중요한 결정자이다. 전형적으로, 뉴런은 어떻게 이들이 전류 주입에 반응하는지에 따라 분류되며, 이는 피라미드형 뉴런의 한 유형에서 다음 것까지 다양할 수 있다. 대부분의 피라미드형 뉴런은 스파이크-주파수 적응 (순응)을 나타내는 일련의 스파이크로의 연속적 탈분극 전류 주입에 반응한다. 많은 피라미드형 뉴런은 활동 전위의 하나 이상의 폭발과 함께 반응한다. 이 반응의 성질은 대개 뉴런에서 발현되는 전압-게이팅된 이온 채널의 유형에 의해 결정되지만, 수지상 나무의 구조는 또한 중요하다 (Mainen, Z.F. et al., 1996, Nature, 382:363-366; Spruston, N., 2008, Nature Reviews Neuroscience, 9:206-221; Spruston, 2009, Scholarpedia, 4(5):6130).
아데노-연관된 바이러스 (AAV)
AAV는 바이러스 캡시드 내로 패키징된 선형 단일-가닥 DNA 게놈을 함유하는 작은 (25 nm), 비외피화된 바이러스이다. 이는 파르보비리다에(Parvoviridae) 과에 속하며, 디펜도비루스(Dependovirus) 속의 것인데, 이는 AAV에 의한 증식성 감염이 단지 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 헬퍼 바이러스 중 어느 하나의 존재 하에서 발생하기 때문이다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에서, AAV (혈청형 2)는 염색체 19q13.4 내로의 특이적이지만 드문 통합에 의한 세포 내로의 형질도입 후에 잠복기를 확립할 수 있다. 따라서, AAV는 부위-특이적 통합이 가능한 것으로 공지된 유일한 포유동물 DNA 바이러스이다. (Daya, S. and Berns, K.I., 2008, Clin. Microbiol. Rev., 21(4):583-593).
성공적인 감염 후의 AAV 생활 주기에 대한 2가지 단계가 있다: 용해 단계 및 용원 단계. 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 헬퍼 바이러스의 존재 하에서, 용해 단계가 존속된다. 이 기간 동안, AAV는 게놈 복제, 바이러스 유전자 발현, 및 비리온 생산을 특징으로 하는 증식성 감염을 겪는다. AAV 유전자 발현을 위한 헬퍼 기능을 제공하는 아데노바이러스 유전자는 E1a, E1b, E2a, E4, 및 VA RNA를 포함한다. 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스는 헬퍼 기능을 위한 유전자의 상이한 세트를 제공하지만, 이들은 둘 다 세포 유전자 발현을 조절하고, 증식성 AAV 감염을 위한 허용성 세포내 환경을 제공한다. 헤르페스바이러스는 바이러스 DNA 폴리머라제 및 헬리카제 뿐만 아니라 HSV 전사에 필요한 초기 기능을 제공함으로써 AAV 유전자 발현을 돕는다.
아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스의 부재 하에서, AAV 복제는 제한되고; 바이러스 유전자 발현은 억제되고; AAV 게놈은 AAVS1로 지칭되는 염색체 19 (q13.4) 상의 4-kb 영역 내로 통합함으로써 잠복기를 확립할 수 있다. AAVS1 로커스는 몇몇 근육-특이적 유전자, TNNT1 및 TNNI3 부근에 있다. AAVS1 영역 자체는 그의 생성물이 액틴 조직화에 관여하는 것으로 나타난 유전자 MBS85의 상류 부분이다. 조직 배양 실험은 AAVS1 로커스가 안전한 통합 부위임을 시사한다.
유전자 전달 및 치료적 치료를 위한 벡터로서의 재조합 AAV (rAAV)
AAV는 신경계에의 유전자 전달을 위한 벡터 및 비히클로서 사용하기에 매우 적합한데, 이는 이들이 유전자 발현 및 넉다운, 유전자 편집, 회로 조정, 생체내 화상화, 질환 모델 발달, 및 신경학적 질환의 치료를 위한 치료 후보의 평가를 가능하게 하기 때문이다. AAV는 신경계에서 안전한 장기 발현을 제공한다. 상기 적용의 대부분은 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 우회하고, 트랜스진 발현을 시간적으로 및 공간적으로 제한하는 성체 뇌 내로의 국소 AAV 주사에 의존한다.
AAV 벡터는 전달 비히클을 위한 바람직한 모든 특색, 예컨대 표적 세포에 부착하고 진입하는 능력, 핵에의 성공적인 전달, 지속된 시간의 기간 동안 핵에서 발현되는 능력, 및 병원성 및 독성의 일반적 결여를 수행하는데 있어서 매우 성공적이었다. 재조합 AAV (rAAV)는 특히 뇌 조직에서의 개재뉴런에의 전달을 위한 전달 벡터로서 유리한데, 이는 그것이 초점적으로 주사가능하고; 시간 경과에 따라 안정한 발현을 나타내고; 그것이 형질도입되는 세포의 게놈 내로 비-병원성 및 비-통합성 둘 다이기 때문이다. AAV의 12가지 인간 혈청형 (AAV 혈청형 1 (AAV-1) 내지 AAV-12) 및 비인간 영장류로부터의 100가지 초과의 혈청형이 지금까지 보고되었다. (Daya, S. and Berns, K.I., 2008, Clin. Microbiol. Rev., 21(4):583-593). 또한, rAAV는 몇몇 상이한 인간 임상 시험을 위한 적어도 38가지 프로토콜에서 벡터로서 사용하기 위해 FDA에 의해 승인되었다. AAV의 병원성의 결여, 존속성 및 그의 많은 이용가능한 혈청형은 기재된 조성물 및 방법에 따른 유전자 요법 적용을 위한 전달 비히클로서의 바이러스의 잠재성을 증가시켰다.
복제 (Rep) 단백질을 코딩하지 않고, 빈번한 부위-특이적 통합에 요구되는 시스-작용성 38 염기 쌍 통합 효율 요소 (IEE)를 결여한 재조합 AAV (rAAV) 벡터가 구축되었다. 역위 말단 반복부 (ITR)는 이들이 패키징에 요구되는 시스 신호이기 때문에 보유된다. 따라서, 현재의 재조합 AAV (rAAV) 벡터는 주로 염색체외 요소로서 존속한다.
유전자 요법을 위한 재조합 AAV (rAAV) 벡터는 대부분 AAV-2 혈청형에 기반하였다. AAV-2-기반 rAAV 벡터는 근육, 간, 뇌, 망막, 및 폐를 형질도입할 수 있으며, 이는 최적 발현을 위해 수 주를 요구한다. rAAV 형질도입의 효율은 AAV 감염의 각각의 단계, 즉, 바이러스 결합, 진입, 트래피킹, 핵 진입, 탈외피, 및 제2-가닥 합성에서의 효율에 의존한다.
AAV에 대한 게놈 용량을 증가시키거나 유전자 발현을 향상시키기 위한 몇몇 신규한 AAV 벡터 기술이 개발되었다. 트랜스-스플라이싱 AAV 벡터는 ITR에서의 재조합을 통해 머리-대-꼬리 연쇄체를 형성하는 AAV의 능력을 이용함으로써 이종 폴리뉴클레오티드를 함유하기 위한 벡터의 용량을 증가시키는데 사용되었다. 이 접근법에서, 트랜스진 카세트는 적당하게 정치된 스플라이스 공여자 및 수용자 부위를 함유하는 2개의 rAAV 벡터 사이에 분할된다. 재조합된 AAV 분자로부터의 전사, 이어서 mRNA 전사체의 올바른 스플라이싱은 기능적 유전자 생성물을 발생시킨다. rAAV 벡터보다 다소 덜 효율적이지만, 트랜스-스플라이싱 AAV 벡터는 최대 9 kb의 크기의 치료 유전자의 전달을 허용하며, 망막, 폐 및 근육에서의 유전자 발현에 성공적으로 사용되었다.
본원에 기재된 바와 같은 rAAV를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SCN1A 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인핸서로서의 그의 성질 때문에, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열의 배향, 즉, 5'-3' 또는 3'-5'는 그의 기능에 중요하지 않다. 따라서, 인핸서 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 E1-E10, 예를 들어, E2, PV-특이적 인핸서 서열, 또는 E5 또는 E6)은 역 배향에서 사용될 수 있으며, 역-상보적 서열로서 사용될 수 있다. "PV-특이적 인핸서"는 본원에 기재된 바와 같은 PV-발현 피질 개재뉴런 (PV-cIN)에서의 트랜스진의 발현을 표적화하고 제한하는 본원에 기재된 인핸서 서열을 지칭한다.
더욱이, 인핸서는 다른 서열, 예컨대 SCN1A 코딩 서열에 비해 특이적으로 간격화될 필요가 없다. 또한, rAAV 폴리뉴클레오티드는 추가적인 요소, 예를 들어, 리포터 또는 검출가능한 마커, 예컨대 형광 단백질을 코딩하는 서열, 또는 RNA 안정성 및 단백질 수율을 증가시킬 수 있는 마멋 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)와 같은 요소를 포함할 수 있다. rAAV 폴리뉴클레오티드는 또한 역위 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입된 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 (유전자)의 전사를 유도하는 프로모터를 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호, 예컨대 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 및/또는 SV40 폴리오마바이러스 원숭이 바이러스 40 폴리아데닐화 신호는 rAAV 폴리뉴클레오티드에서 요소로서 포함될 수 있다. rAAV 폴리뉴클레오티드는 최소 프로모터, 예를 들어, 인간 베타-글로빈 최소 프로모터 (phβg) 및 키메라 인트론 서열을 포함할 수 있다 (Hermeming et al., 2004, J Virol Methods, 122(1):73-77). 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, ITR은 단일-가닥, AAV 벡터 DNA가 숙주 세포 DNA 폴리머라제 복합체에 의해 이중 가닥 (ds) DNA로 전환된 후에 핵에서 연쇄체 형성을 도울 수 있다. 따라서, 기재된 rAAV의 투여는 그들이 형질도입되는 개재뉴런 세포의 핵에서 에피솜 연쇄체를 형성할 수 있다. 비-분열 세포, 예컨대 성체 개재뉴런에서, 연쇄체는 개재뉴런의 일생 동안 이들 세포에서 무손상으로 잔류할 수 있다. 유리하게는, 숙주 염색체 내로의 rAAV 폴리뉴클레오티드의 통합은 무시가능하거나 부재할 가능성이 있으며, 임의의 다른 인간 유전자의 발현 또는 조절을 변경시키거나 이에 영향을 미치지 않을 것이다.
재조합 AAV 벡터는 관련 기술분야의 표준 및 실시되는 기법을 사용하여 및 상업적으로 입수가능한 시약을 채용하여 제조될 수 있다. 몇몇 임상 시험에 사용된 rAAV 벡터는 유망한 결과를 산출하였음이 통상의 실시자에 의해 인식될 것이다. 예로서, rAAV 기반 요법은 문헌 [Kotterman, M.A. et al., 2014, Nat. Rev. Genet., 15:445-451]에 의해 보고된 바와 같이, 2012년에 유럽 연합에 의한 마케팅 승인을 받았다. 일부 실시양태에서, 플라스미드 벡터는 널리-공지된 복제 (rep), 캡시드 (cap) 및 아데노-헬퍼 성분의 전부 또는 일부를 코딩할 수 있다. rep 성분은 AAV 생활 주기에 요구되는 Rep 단백질을 코딩하는 4가지 중첩하는 유전자 (예를 들어, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)를 포함한다. cap 성분은 함께 상호작용하여 정20면체 대칭의 캡시드를 형성하는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3의 중첩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 헬퍼 성분을 코딩하고, AAV 벡터를 위한 헬퍼 기능을 제공하는 제2 플라스미드는 또한 세포 내로 공동-형질감염될 수 있다. 헬퍼 성분은 바이러스 복제를 위한 아데노바이러스 유전자 E2A, E4orf6, 및 VA RNA를 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 생성물, 조성물, 및 용도를 위한 rAAV를 제조하는 방법은 기재된 바와 같은 rAAV 폴리뉴클레오티드 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하고; 세포를 배양하여 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하여 세포 내에서 rAAV를 생산하고, 세포 배양물에서의 세포로부터 및/또는 세포 배양 배지로부터 rAAV를 분리하거나 단리하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지되고 실시된다. rAAV는 통상적인 기법을 사용하여 세포 및 세포 배양 배지로부터 임의의 바람직한 정도의 순도로 정제될 수 있다.
한 실시양태에서, rAAV 벡터는 SCN1A-제한된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 및 화학유전적 DREADD ('디자이너 약물에 의해 배타적으로 활성화된 디자이너 수용체')-코딩 서열, 예를 들어, Gq-DREADD 수용체를 함유한다 (Hu, J. et al., 2016, J Biol Chem, 291:7809-7820). Gq-DREADD 수용체의 아미노산 서열은 문헌 [Armbruster et al. (2007, Proc Natl Acad Sci USA, 104:5163-5168)]에 의해 보고되었다. Gq-DREADD 수용체의 아미노산 서열은 인간 무스카린성 아세틸콜린 수용체, M3의 아미노산 서열의 유도체이며, 여기서 위치 149에서의 티로신은 시스테인에 의해 대체되고, 위치 239에서의 아르기닌은 글리신에 의해 대체된다. 비변형된 인간 서열은 NCBI 수탁 번호 NP 000731.1 하에 제공된다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터에서 Gq-DREADD 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 인간 개재뉴런에서 Gq-DREADD 수용체의 발현을 위한 최적화된 코돈을 포함함으로써 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, rAAV 벡터는 SCN1A-제한된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 및 화학유전적 PSAM-코딩 서열을 함유한다.
작은 크기 (약 5 kb)의 게놈을 갖는 재조합 AAV 벡터는 보다 큰 게놈 (트랜스진), 예를 들어 4.7 kb 초과인 것들을 패키징하고 함유하도록 조작될 수 있다. 예로서, 보다 많은 양의 유전 물질 (유전자, 폴리뉴클레오티드, 핵산)을 패키징하기 위해 개발된 2가지 접근법은 분할 AAV 벡터 및 단편 AAV (fAAV) 게놈 재어셈블리를 포함한다 (Hirsch, M.L. et al., 2010, Mol Ther 18(1):6-8; Hirsch, M.L. et al., 2016, Methods Mol Biol, 1382:21-39). rAAV 게놈이 형질도입 후 세포에서 자연적으로 연쇄체화되고, 향상된 상동성 재조합 (HR)을 위한 기질이라는 사실을 이용하는 분할 rAAV 벡터 적용이 개발되었다 (Hirsch, M.L. et al., 2016, Methods Mol Biol, 1382:21-39). 이 접근법은 대형 트랜스진을 2개의 별개의 벡터로 "분할하는" 것을 포함하며, 공동-형질도입 시, 벡터 게놈 연쇄체화를 통한 세포내 대형 유전자 재구축은 HR 또는 비상동성 말단 연결 (NHEJ)을 통해 일어난다. 일반적으로, 분할 rAAV 접근법 내에 3가지 전략이 존재한다: 중첩, 트랜스-스플라이싱, 및 하이브리드 트랜스-스플라이싱.
AAV-매개된 대형 유전자 전달을 위한 접근법으로서의 단편 AAV (fAAV)는 AAV 캡시드의 패키징 용량을 초과하는 트랜스제닉 카세트의 시도된 캡시드화가 둘 다의 극성의 이질적 단일-가닥 게놈 단편 (<5 kb)의 패키징을 발생시켰다는 보고에 기반하여 개발되었다. 다수의 fAAV 입자에 의한 형질도입 후, 게놈 단편은 반대 가닥 어닐링, 이어서 숙주-매개된 DNA 합성을 겪어 세포 내에서 의도된 과대한 게놈을 재구축할 수 있다. (Hirsch, M.L. et al., 2016, Methods Mol Biol, 1382:21-39).
본원에 기재된 벡터, 조성물 및 방법의 이점 및 이익은 유전자 발현을 세포, 예를 들어, 개재뉴런 세포의 한정된 집단에 특이적으로 제한할 수 있는 충분히 작은 인핸서 요소 (시스-작용 요소)의 확인 및 사용이다. 한 실시양태에서, 인핸서 요소는 SCN1A-특이적이고, 유전자 발현, 예를 들어, SCN1A 유전자를 개재뉴런 세포, 예컨대 GABA작동성 개재뉴런 및 PV-발현 GABA작동성 개재뉴런, 또는 피라미드형 뉴런, 예컨대 글루타메이트성 피라미드형 뉴런에 제한하는 본원에 기재된 바와 같은 E1-E10 인핸서 서열 중 적어도 하나이다. 본원에 기재된 rAAV 벡터에 의해 전달되는 유전자 (트랜스진)는 이들이 발현되는 특이적 세포에서 활성 및 기능적이며, 즉, 이들이 코딩하는 생성물은 세포에 의해 생산되고, 기능적으로 발현된다. 구체적인 예로서, 트랜스진, 예를 들어, 리포터 유전자 또는 SCN1A의 발현을 GABA작동성 개재뉴런 세포 또는 GABA작동성, PV-발현, 피질 개재뉴런 세포에 특이적으로 제한하는 인핸서 서열을 함유하도록 조작된 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터는 이들 특이적 세포 유형을 형질도입하고, 코딩된 리포터 단백질, 또는 SCN1A의 경우 Nav1.1 나트륨 채널은 특이적 세포 유형에서 기능적으로 발현된다. 또 다른 구체적인 예로서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터는 트랜스진, 예를 들어, 리포터 유전자 또는 SCN1A의 발현을 뇌 피질 내의 피라미드형 세포, 예컨대 글루타메이트성 피라미드형 세포에 특이적으로 제한하는 인핸서 서열을 함유하도록 조작된다.
또 다른 이점으로서, 기재된 SCN1A-특이적 인핸서 제어 요소 E1-E10은 다른 이펙터 요소 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 리포터 폴리뉴클레오티드, DREADD, 트랜스진과 함께 rAAV 벡터에서의 그들의 삽입을 허용하는 크기/길이 (kb), 예를 들어, 대략 2 kb 미만의 것이다. 예로서, 단독으로, 또는 각각 평균 약 700bp 내지 2kb인 이펙터 또는 리포터 요소, (예를 들어 채널로돕신 (ChR2), DREADD)와 조합으로, 리포터 요소 (예를 들어, 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP), 오렌지색 형광 단백질 (d토마토))의 필수적인 최소 크기를 고려하여, 패키징 용량에 있어서 최대 ~2kb는 rAAV 벡터 내로의 시스-작용 DNA 제어 요소, 예컨대 인핸서 서열의 삽입을 위해 잔류한다. 본원에서 확인되고 기재된 SCN1A-제한적 인핸서 서열은 세포, 예를 들어, 개재뉴런 또는 GABA작동성 개재뉴런, 또는 피라미드형 뉴런 세포의 한정된 집단에 발현을 제한할 수 있으며, 추가적인 핵산 서열, 리포터 요소 및 트랜스진이 또한 AAV 벡터 내로 클로닝되는 것을 허용하는 충분히 작은 요소이다.
세포-특이적 AAV 캡시드
선택적 조직/기관 표적화를 나타내는 AAV 벡터의 합리적인 디자인은 유전자 요법을 위한 벡터/비히클로서의 AAV의 적용을 넓혔다. 직접적 및 간접적 표적화 접근법 둘 다는 AAV 벡터 세포 표적화 특이성 및 재표적화를 향상시키는데 사용되었다. 예로서, 직접적 표적화에서, 특정 세포 유형에 대한 AAV 벡터 표적화는 바이러스 캡시드 서열 내로 직접적으로 삽입된 작은 펩티드 또는 리간드에 의해 매개된다. 이 접근법은 내피 세포를 표적화하는데 성공적으로 채용되었다. 직접적 표적화는 펩티드 또는 리간드가 캡시드 표면에 노출된 부위에 위치되고; 삽입이 캡시드 구조 및 어셈블리에 유의하게 영향을 미치지 않고; 천연 향성이 제거되어 특이적 세포 유형에 대한 표적화를 최대화하도록 캡시드 구조의 상세한 지식을 요구한다. 간접적 표적화에서, AAV 벡터 표적화는 바이러스 표면 및 특이적 세포 표면 수용체 둘 다와 상호작용하는 회합 분자에 의해 매개된다. 이러한 AAV 벡터를 위한 회합 분자는 이중특이적 항체 및 비오틴을 포함할 수 있다. 간접적 표적화의 이점은 상이한 어댑터가 캡시드 구조의 유의한 변화를 발생시키지 않으면서 캡시드에 커플링될 수 있고, 천연 향성이 용이하게 제거될 수 있다는 것이다. 표적화를 위한 어댑터를 사용하는 것의 단점은 생체내에서 캡시드-어댑터 복합체의 감소된 안정성에 대한 잠재성을 포함한다.
또한, 세포의 증가된 형질도입 및 맥관구조를 통한 중추 신경계 및 뇌에의 유전자 전달을 허용하는 캡시드를 포함하는 AAV 벡터가 생산될 수 있다. (Chan, K.Y. et al., 2017, Nat. Neurosci., 20(8):1172-1179). 이러한 벡터는 개재뉴런을 포함하여 뉴런 세포의 왕성한 형질도입을 용이하게 한다. 인핸서 및 세포-유형 특이적 프로모터와 함께 사용되는 경우, 이러한 AAV는 신경계의 뉴런 세포에서 표적화된 유전자 발현을 제공한다.
세포당 높은 발현 수준을 요구하지 않는 적용을 위해, 사용되는 바이러스의 양, 즉, 바이러스 용량은 저하될 수 있다. 전신 유전자 전달에 사용되는 바이러스 로드를 저하시키는 것은 비용 및 생산 부담을 감소시키고, 바이러스 성분에 대한 유해 반응에 대한 잠재적 위험을 최소화할 수 있다.
재조합 아데노-연관된 바이러스 벡터의 전달 및 치료 접근법
일반적으로, 예를 들어, 유전자 발현을 변형시키거나 교정함으로써, 예컨대 유전자 요법에 의해, 유전자 수준에서 신경학적 질환을 치료하기 위한 이펙터 유전자의 전달은 적절하고 효과적인 벡터, 예컨대 바이러스 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 또는 rAAV를 사용하여 달성될 수 있다. rAAV 벡터의 사용은 유전자가 발현되는 세포에의 치료 유전자의 효율적인 전달을 제공한다. 세포에 유전자를 전달하기 위한 다른 방법 및 접근법은 예를 들어, 수력학적 압력 하에서의 정제된 DNA의 사용, 금 입자, 또는 지질-DNA 복합체에 부착하는 DNA를 사용하는 샷건 접근법을 포함하지만, 이러한 방법 및 접근법은 빈번히 효율적인 유전자 전달을 제공하지 않으며, 치료 효능에 요구되는 것 미만인 유전자 발현을 발생시킨다. 더욱이, 이러한 방법은 인간 용도에 적용가능하지 않다. 한편, 바이러스는 생체내에서 숙주 세포에서의 외인성 유전자의 전달 및 발현을 위한 천연 벡터를 나타낸다.
바이러스 벡터로서 rAAV의 사용과 연관된 이점은 동물 모델에서 입증된 바와 같이, rAAV 트랜스진 발현이 전형적으로 수 년 동안 또는 일생 동안 존속한다는 것이다. 이는 종종 상대적으로 짧은 시간, 예를 들어, 수 주 후에 통상적으로 사라지는 트랜스진 발현의 초기 폭발을 초래하는 비-rAAV 바이러스 벡터와 대조적이다.
향상된 요법 또는 치료를 달성하기 위해, 치료 반응에 요구되는 rAAV 벡터의 용량은 예를 들어, 특정 rAAV 혈청형을 사용함으로써 감소될 수 있다. 대안적으로, rAAV 벡터 캡시드의 표면은 상기 기재된 바와 같이 표적 조직 및 세포에의 부착을 위한 특이적 리간드를 포함하도록 변경될 수 있다. 또 다른 접근법은 세포질내 소포로부터 핵으로의 바이러스 입자의 트래피킹을 고려한다. (Zhao, W. et al., 2007, Gene Ther., 14:545-550; Daya, S. and Berns, K.I., 2008, Clin. Microbiol. Rev., 21(4):583-593). 전형적으로, rAAV 벡터 제제의 바이러스 입자-대-감염력 비는 10:1 내지 100:1의 범위이다. 높은 비는 불완전하거나 비어 있는 벡터 입자, 뿐만 아니라 세포질내 소포로부터 핵으로의 트래피킹을 반영한다. 트래피킹 동안, 벡터 입자는 트랜스진이 발현될 수 있는 핵으로라기 보다는, 분해를 위한 프로테아솜으로 편재되고 지향될 수 있다. 프로테아솜으로의 편재화 및 지향은 rAAV 벡터 캡시드의 표면 상의 티로신 잔기의 인산화를 요구하는 것으로 밝혀졌다. AAV-2 캡시드의 표면 상의 7개의 티로신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 대체된 경우, 트랜스진 발현의 검출에 요구되는 감염 다중도 (MOI)는 세포 배양물에서 및 간 및 눈에서의 세포의 형질도입의 몇몇 마우스 모델에서 둘 다 크게 감소되었다. 결과적으로, 질환의 치료에 있어서 트랜스진 발현을 치료 수준으로 증가시키는 능력은 향상될 수 있다.
발작에 대한 제어를 얻는 하나 이상의 치료 접근법은 최첨단의 유전자 요법 또는 약물-유전적 접근법을 포함하는 본원에 기재된 치료 생성물, 조성물 및 방법에 의해 포함된다. 이러한 접근법은 DS의 발작 증상을 경감시키는 임상적으로 관련된 요법의 개발을 발생시킬 가능성이 있을 수 있다.
뇌에의 직접적 전달을 위해, rAAV 벡터는 트랜스진 발현을 시간적으로 및 공간적으로 제한하고, 뇌의 특이적 영역, 예를 들어, 개재뉴런 세포 및 이들 세포를 포함하는 뇌 조직을 표적화하기 위해 혈액-뇌-장벽을 우회하기 위해, 개방 신경외과적 절차에 의해 또는 초점성 주사에 의해 투여될 수 있다.
전신 rAAV 전달 (정맥내 주사에 의한)은 신경계에의 폭넓은 유전자 전달을 위한 비-침습적 대안을 제공하지만; 요구되는 높은 바이러스 로드 및 상대적으로 낮은 형질도입 효율은 이 방법의 폭넓은 채택을 제한하였다. 몇몇 그룹은 정맥내 전달 후 CNS 및 특정 조직 및 세포 집단에의 유전자 전달을 향상시키는 rAAV 캡시드를 개발하였다. 예로서, AAV-AS 캡시드18은 특히 선조체에서 보다 높은 뉴런 형질도입을 제공하는 AAV9.4719 VP2 캡시드 단백질로의 폴리알라닌 N-말단 연장을 이용한다. AAV2에 기반한 AAV-BR1 캡시드20은 뇌 내피 세포의 보다 효율적이고 선택적인 형질도입에 유용할 수 있다. 또 다른 AAV 캡시드, AAV-PHP.B는 정맥내 주사 후 성체 마우스 뇌 및 척수의 많은 영역에 걸쳐 대다수의 뉴런 및 성상세포를 형질도입하는 캡시드를 포함한다. 한 실시양태에서, rAAV는 대뇌 피질 (뇌) 내의, PV 개재뉴런을 포함한 개재뉴런을 특이적으로 형질도입한 캡시드를 포함한다.
rAAV 벡터 투여의 다른 방식은 지질-매개된 벡터 전달, 수력학적 전달, 및 유전자 총을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, rAAV 벡터는 개재뉴런 세포, 예컨대 GABA작동성 개재뉴런 세포 및 GABA작동성, PV-발현 개재뉴런 세포, 또는 피라미드형 세포, 예를 들어, 글루타메이트성 피라미드형 세포, 및 이들 세포를 포함하는 뇌 조직을 직접적으로 감염시키거나 형질도입할 가능성을 증가시키는 캡시드를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 및 그의 조성물은 신경학적, 신경발달성 및 신경변성 질환 및 장애의 치료에, 특히 간질 및 그의 수반증, 종종 중증, 발작 증상을 포함하는 DS의 치료를 위해 사용될 수 있다. 발작의 범주를 구별하는 특징은 발작 활성이 부분적 (예를 들어, 초점성)인지 전신성인지 여부이다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 및 그의 조성물은 부분적 및/또는 전신성 발작을 치료하는데 사용된다. 부분적 발작은 전형적으로 발작 활성이 대뇌 피질의 별개의 영역에 제한되는 것들인 것으로 간주된다. 통상의 실시자에 의해 인식될 것인 바와 같이, 발작은 의식이 발작의 과정 동안 완전히 보존되는 경우 단순-부분적 발작으로서 특징규명된다. 의식이 손상되는 경우, 발작은 복합-부분적 발작으로서 특징규명된다. 복합-부분적 발작은 또한 부분적 발작으로 시작하고, 후속적으로 피질을 통해 연장되는 것들을 포함하며; 따라서, 이들 유형의 발작은 2차 전신화를 갖는 부분적 발작인 것으로 간주된다.
전신성 발작은 동시에 양측으로 대칭적인 방식으로 뇌의 먼 영역을 포함하며, 자세 제어의 소실 없이, 예컨대 실신 또는 소발작의 경우, 의식의 돌발적인 단기 소멸을 포함할 수 있다. 비정형 실신 발작은 통상적으로 의식의 보다 긴 기간의 소멸 및 보다 점진적인 발병 및 종결을 포함한다. 전신성 발작의 주요한 유형으로 간주되는 전신성 강직-간대성 또는 대발작은 전형적으로 경고 없는 돌연한 발병을 갖는다. 발작의 초기 상은 통상적으로 근육의 강직 수축, 손상된 호흡, 증가된 심박동수, 혈압 및 동공 크기를 초래하는 교감신경 긴장의 현저한 증진을 포함한다. 대략 10-20초 후, 발작의 긴장 상은 전형적으로 간대성 상으로 진화하며, 이는 강직 근육 수축에 겹쳐진 근육 이완의 기간에 의해 생성된다. 이완의 기간은 통상적으로 1분 이하 지속되는 발작 상의 종료까지 점진적으로 증가한다. 발작후 상은 비반응성, 근육 무기력, 및 천명양 호흡 및 부분적 기도 폐색을 유발할 수 있는 과다 침흘림을 특징으로 한다.
무긴장성 발작은 대략 1-2초 지속되는 자세 근육 긴장의 돌발적 소실을 특징으로 한다. 의식이 단기적으로 손상되지만, 통상적으로 발작후 착란은 없다. 근간대성 발작은 신체의 한 부분 또는 전체 신체를 포함할 수 있는 돌발적 및 단기적 근육 수축을 특징으로 한다. 제한 없이, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 생성물, 조성물 및 그의 사용 방법은 DS를 갖는 것들을 고통스럽게 하는 발작을 포함하여, 상기 기재된 발작의 예방적 및/또는 치료적 치료를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 생성물, 조성물 및 그의 사용 방법은 SCN1A 유전자에 의해 코딩되는 나트륨 채널 Nav1.1의 기능의 소실 또는 기능의 손상과 연관된 간질의 예방적 및/또는 치료적 치료에 사용된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 생성물, 조성물 및 그의 사용 방법은 드라베 증후군 (DS)의 예방적 및/또는 치료적 치료에 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 생성물, 조성물 및 그의 사용 방법은 이 유형의 간질을 치료하기에 적합하고, 최대 허용 용량 (MTD)으로 투여된 2종 이상의 약물의 사용에도 불구하고 비제어되는 간질성 상태를 지칭하는 약물-저항성 간질의 예방적 및/또는 치료적 치료에 사용된다. 실시양태에서, 약물저항성 간질은 발작이 이전의 항-간질 약물 치료 또는 치료 조합에 의해 제거되는데 실패한 상태를 포함한다.
약물유전적 접근법
약물유전적 접근법은 본원에 기재된 바이러스 벡터, rAAV 벡터, 그의 조성물, 및 방법과 함께 사용하기 위해 고려된다. 이러한 접근법은 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 요소 (예를 들어, E1-E10) 및 Gq-DREADD 수용체 또는 PSAM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터, 예컨대 rAAV 벡터를 사용하여 Gq-DREADD 수용체 또는 PSAM 중 어느 하나를 PV-개재뉴런 내로 특이적으로 전달한다. 치료되는 병리증상의 유형에 의해 좌우되는 바와 같이, 초점성 주사 시 특이적 영역에 또는 전신 주사 시 피질 전반에 걸쳐 표적화된 PV-뉴런은 수용체 (Gq-DREADD 또는 PSAM)를 안정하게 발현한다. 그 후, 개체 (환자)는 수용체 (예를 들어 각각 CNO 또는 PSEM)를 활성화시키는 약물로 투여된다. 이 접근법은 수용체를 발현하는 PV-개재뉴런의 흥분성의 제어된 변경을 발생시키며, 뉴런 (개재뉴런 및 PV-발현 개재뉴런)에서 흥분/억제 (E/I) 균형의 용량-의존적 및 시간-의존적 조정을 허용하여, 뇌 활성의 정상화를 발생시킨다.
제약 조성물
신경학적 또는 신경원성 질환, 장애, 또는 병리증상, 예컨대 DS로 고통받거나, 이를 발달시킬 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 제약 조성물 또는 제형이 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 AAV 벡터 또는 바이러스 입자, 예컨대 SCN1A-특이적 인핸서 서열을 함유하는 것 (활성제로서) 및 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함한다. 제약 조성물에서 제형화되는 경우, 치료 화합물 또는 생성물로서의 rAAV 벡터는 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 혼합될 수 있다.
치료제(들)는 임의의 적합한 담체 물질에 임의의 적절한 양으로 함유될 수 있고/거나, 일반적으로 조성물의 총 중량의 1-95 중량%의 양으로 존재한다. 조성물은 작용제, 예컨대 본원에 기재된 바이러스 벡터가 전신적으로 전달되도록, 비경구 (예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내, 또는 복강내) 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터의 전신 주사는 특히 리포터 생성물이 또한 벡터에 의해 코딩되는 경우, 뇌 영역에 걸쳐 발현의 특이성의 특징규명을 허용한다. 제약 조성물은 통상적인 제약 관행에 따라 제형화될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000] 및 [Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York] 참조).
제약 조성물은 실질적으로 투여 즉시 또는 임의의 미리 결정된 시간 또는 투여 후 시간에 활성제를 방출하도록 제형화될 수 있다. 후자의 유형의 조성물은 일반적으로 제어 방출 제형으로 공지되어 있으며, 이는 (i) 연장된 시간의 기간에 걸쳐 신체 내에서 작용제의 실질적으로 일정한 농도를 생성하는 제형; (ii) 미리 결정된 지체 시간 후에 연장된 시간의 기간에 걸쳐 신체 내에서 약물의 실질적으로 일정한 농도를 생성하는 제형; (iii) 활성 물질의 혈장 수준의 변동 (톱니 동역학 패턴)과 연관된 비바람직한 부작용의 수반 최소화를 갖는 신체에서 상대적으로 일정한 유효 수준을 유지함으로써 미리 결정된 시간 기간 동안 작용을 지속하는 제형; (iv) 예를 들어, 표적 부위 또는 위치에 인접한 또는 그와 접촉하여, 예를 들어, 조직 또는 기관의 영역에서 제어 방출 조성물의 공간적 정치에 의해 작용을 국재화하는 제형; (v) 용량이 예를 들어, 1주, 2주, 또는 수 주마다 1회 투여되도록, 편리한 투여를 허용하는 제형; 및 (vi) 담체, 화학적 유도체, 또는 특이적으로 디자인된 벡터 (예를 들어, 특정 캡시드 조성물을 포함함)를 사용하여 특이적 조직 또는 세포 유형을 표적화하여 치료제를 예를 들어, 개재뉴런 또는 PV-발현 GABA작동성 개재뉴런, 또는 피라미드형 뉴런, 예를 들어, 글루타메이트성 피라미드형 뉴런에 전달하는 제형을 포함한다. 일부 적용을 위해, 제어 방출 제형은 투여되는 작용제의 혈장 수준을 치료 수준에서 지속시키기 위한 하루 동안 빈번한 투여에 대한 필요를 제거한다.
방출의 속도가 해당 작용제의 대사의 속도를 능가하는 제어 방출을 얻는 방법은 제한적인 것으로 의미되지 않는다. 예로서, 제어 방출은 예를 들어, 다양한 유형의 제어 방출 조성물 및 코팅을 포함하여, 다양한 제형 파라미터 및 성분의 적절한 선택에 의해 얻어진다. 따라서, 치료제는 투여 시, 제어된 방식으로 작용제를 방출하는 제약 조성물 내로의 적절한 부형제로 제형화된다. 예는 단일 또는 다중 단위 정제 또는 캡슐 조성물, 오일 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로캡슐, 미소구, 분자 복합체, 나노입자, 패치, 및 리포솜을 포함한다.
신경학적 질환 또는 장애, 예컨대 DS의 치료를 위한 작용제의 조합을 포함하는 조성물의 투여는 다른 성분과 조합되어, 대상체에서 발작을 개선시키거나, 약화시키거나, 감소시키거나, 감소시키거나, 안정화시키는데 유효한 치료제의 농도를 발생시키는 임의의 적합한 수단에 의해서일 수 있다. 조성물은 전신적으로 투여될, 예를 들어, 제약상-허용되는 완충액, 예컨대 생리학적 염수에서 제형화될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터의 전신 주사는 특히 리포터 생성물이 또한 벡터에 의해 코딩되는 경우, 뇌 영역에 걸쳐 발현의 특이성의 특징규명을 허용한다.
투여의 경로는 예를 들어, 환자에서 작용제의 연속적인 지속된 수준을 최적으로 제공하는 두개내, 비경구, 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 복강내 (i.p.), 근육내 (i.m.), 또는 진피내 투여, 예를 들어, 주사에 의해서를 포함한다. 투여되는 치료제의 양은 투여의 방식, 환자의 연령, 신체 상태 및 체중에 따라, 및 신경학적 질환 또는 장애, 예컨대 DS의 임상적 증상에 따라 다양하다. 일반적으로, 양은 특히 뇌에서 신경학적 질환 및 장애의 치료에 채용되는 다른 바이러스 벡터-기반 작용제에 사용되는 것들의 범위에 있을 것이지만, 특정 경우에, 작용제가 증가된 특이성을 나타내는 경우 보다 낮은 양이 필요하다. 조성물은 치료 효과, 예컨대, 예를 들어, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 환자에서 발작을 개선시키거나, 약화시키거나, 감소시키거나, 감소시키거나, 안정화시키는 것을 나타내는 투여량으로 투여된다.
제약 조성물은 투여 형태, 제형에서 주사, 주입 또는 삽입 (피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 두개내 등)에 의해, 또는 통상적인 비-독성 제약상 허용되는 담체 및 아주반트를 함유하는 적합한 전달 장치 또는 삽입물을 통해 비경구로 투여될 수 있다. 이러한 조성물의 제형 및 제제는 제약 제형의 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 상기 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy]에서 발견될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여는 전신 및 비경구, 예컨대 주사 또는 정맥내 전달에 의해서이다.
비경구 전달 및 투여를 위한 조성물은 단위 투여 형태로 (예를 들어, 단일-용량 앰풀에), 또는 몇몇 용량을 함유하고, 적합한 보존제가 첨가될 수 있는 바이알에 (하기 참조) 제공될 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 주입 장치, 또는 삽입을 위한 전달 장치의 형태일 수 있거나, 이는 사용 전에 물 또는 또 다른 적합한 비히클로 재구성되는 건조 분말로서 제공될 수 있다. 활성제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 서열, 및 이펙터 유전자 및 연관된 조절 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터 또는 입자) 외에도, 조성물은 적합한 비경구로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 활성 치료제(들)는 제어 방출을 위해 미소구, 마이크로캡슐, 나노입자, 리포솜 등 내로 혼입될 수 있다. 더욱이, 조성물은 현탁화제, 가용화제, 안정화제, pH-조정제, 긴장성 조정제, 및/또는 분산화제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 활성 치료제(들) (즉, 본원에 기재된 바이러스 벡터 또는 입자)를 포함하는 조성물은 정맥내 전달을 위해 제형화된다. 상기 언급된 바와 같이, 기재된 실시양태에 따른 제약 조성물은 멸균 주사에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위해, 적합한 치료제(들)는 비경구로 허용되는 액체 비히클에 용해되거나 현탁된다. 채용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매는 물, 적절한 양의 염산, 수산화나트륨 또는 적합한 완충액의 첨가에 의해 적합한 pH로 조정된 물, 1,3-부탄디올, 링거 용액, 등장성 염화나트륨 용액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 수성 제형은 또한 1종 이상의 보존제 (예를 들어, 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트)를 함유할 수 있다. 작용제 중 하나가 단지 물에 드물게 또는 약간 가용성인 경우, 용해 향상제 또는 안정화제가 첨가될 수 있거나, 용매는 10-60% w/w의 프로필렌 글리콜 등을 포함할 수 있다.
투여 및 전달 방법
대상체, 예를 들어, DS를 갖는 환자 또는 영아 환자에의 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 또는 제약 조성물의 투여. 실시양태에서, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 또는 제약 조성물은 바이러스 벡터, 입자 또는 조성물이 벡터 또는 바이러스 입자에 함유된 서열을 발현하기 위해 기능적이고 활성이도록 하는 임의의 방식으로 세포 (표적 세포, 예컨대 개재뉴런 또는 개재뉴런을 포함하는 뇌 층)에 전달될 수 있다. 예시적으로, SCN1A-특이적 인핸서 및 이펙터 유전자 (예를 들어 SCN1A) 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV는 개재뉴런 세포 또는 개재뉴런 세포를 포함하는 조직에 전달되어 개재뉴런에서의 SCN1A의 표적화된 발현을 제공할 수 있다. 따라서, 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자는 세포를 바이러스 벡터, 또는 바이러스 입자를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 및 세포에서 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자에 의해 함유된 폴리뉴클레오티드의 이종 발현에 의해 세포에 전달된다. rAAV 벡터에 의해 함유된 폴리뉴클레오티드는 코딩되는 생성물의 치료 유효 수준이 생성될 수 있도록 이들이 흡수될 수 있는 형태로 대상체의 세포에 전달되어야 한다.
형질도입 rAAV 벡터는 특히 그들의 높은 감염의 효율 및 안정한 통합 및 발현 때문에, 세포에의 바람직한 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 코딩하는 유전자의 전달 및 발현에 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Cayouette et al., Human Gene Therapy, 8:423-430, 1997]; [Kido et al., Current Eye Research, 15:833-844, 1996]; [Bloomer et al., Journal of Virology, 71:6641-6649, 1997]; [Naldini et al., Science, 272:263-267, 1996]; 및 [Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:10319, 1997] 참조). 예로서, rAAV는 특이적 개재뉴런 세포 유형에서 유전자 발현을 우선적으로 지정하는 본원에 기재된 바와 같은 SCN1A-특이적 인핸서 핵산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하도록 조작되며, GABA작동성 개재뉴런 표적 세포에서의 또는 피라미드형 표적 세포, 예컨대 글루타메이트성 피라미드형 세포에서의 유전자, 예를 들어, SCN1A의 발현을 지정하거나 제한하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 유전자의 발현은 임의의 적합한 프로모터, 예컨대 표적 세포에 대해 특이적인 프로모터로부터 유도될 수 있다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 전신적으로 투여된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터의 전신 주사는 예를 들어, 리포터 생성물이 또한 벡터에 의해 코딩되는 경우, 뇌 영역에 걸쳐 발현의 특이성의 특징규명을 허용한다.
유전자 전달은 또한 시험관내 형질감염 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 방법은 인산칼슘, DEAE 덱스트란, 전기천공, 및 원형질체 융합의 사용을 포함한다. 리포솜은 또한 세포 내로의 DNA의 전달에 잠재적으로 유익할 수 있다.
치료 방법 및 프로토콜
본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자, 또는 본원에 기재된 조성물의 유효량이 대상체에게 투여되어 치료 효과를 생성하는, 치료제를 필요로 하는 대상체, 예컨대 신경학적 질환 또는 장애, 보다 특히, 발작, 간질, 또는 DS를 갖는, 겪는, 경험한, 및/또는 경험할 위험이 있는, 및 또한 발작 장애로 진단되거나, 가질 것으로 의심되거나, 그의 증상을 갖는, 또는 이러한 치료를 필요로 하는 것으로 확인된 대상체에게 투여하는 방법이 제공된다. 기재된 방법에 따르면, 치료 효과는 제한 없이, 대상체에의 rAAV 벡터 생성물 또는 조성물의 투여에 후속하여 신경학적 질환 또는 장애, 예를 들어, 발작 또는 간질의 하나 이상의 증상을 억제하거나, 감소시키거나, 개선시키기 위해, 또는 하나 이상의 증상을 예방하기 위해, 충분한 수의 개재뉴런 내로 도입되는 rAAV의 양을 포함한다. 투여되는 rAAV의 양은 관련 기술분야의 통상의 실시자, 예컨대 의학적 또는 임상적 실시자에 의해 결정될 수 있으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 간질성 초점의 크기, 바이러스 제제의 역가와 같은 인자에 및 비-인간 영장류에서 획득된 데이터로부터 기반한다 (예를 들어, 문헌 [Colle, M.-A. et al., 2010, Hum. Mol. Genet., 19:147-158]). 예로서, 1010 내지 1012개의 rAAV 입자는 rAAV 벡터 또는 그의 입자를 치료상 관련된 수의 개재뉴런에 형질도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 치료를 필요로 하는 대상체를 확인하는 것은 대상체 또는 건강 관리 전문가의 판단 하일 수 있으며, 주관적 (예를 들어 의견) 또는 객관적 (예를 들어 시험 또는 진단 방법에 의해 측정가능함)일 수 있다.
치료 방법 (예방적 치료를 포함함)은 일반적으로 포유동물, 특히 인간을 포함하여 이를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 동물, 인간)에의 본원에 기재된 작용제, 예컨대 상기 언급된 작용제를 함유하는 rAAV 벡터, 바이러스 입자, 또는 조성물의 치료 유효량의 투여를 포함한다. 이러한 치료는 적합하게는 신경학적 질환 또는 장애, 예컨대 발작 및/또는 간질, 또는 DS를 앓고 있거나, 갖거나, 이에 감수성이거나, 이에 대한 위험이 있는 대상체, 특히 인간 또는 영아 인간에게 투여될 것이다. "위험이 있는" 그러한 대상체의 결정은 진단 시험 또는 대상체 또는 건강 관리 제공자의 의견 (예를 들어, 유전적 시험, 효소 또는 단백질 마커 또는 바이오마커, 가족력 등)에 의한 임의의 객관적 또는 주관적 결정에 의해 이루어질 수 있다.
기재된 바와 같은 바이러스 벡터 및 제약 조성물은 신경학적 또는 신경변성 질환 또는 장애, 예를 들어, 발작, 간질, 또는 DS를 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 치료적으로, 또는 특정 신경학적 또는 신경변성 질환 또는 장애에 대한 위험이 있는 환자에의 선행된 치료 또는 보호, 예컨대 발작, 간질, DS의 하나 이상의 증상, 또는 그의 중증도를 감소시키거나, 감소시키거나, 약화시키거나, 회피하기 위한 예방적 백신접종을 제공하기 위해 예방적으로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터의 예방 유효량은 본원에서 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 수용자의 킬로그램 체중당 약 102 TU (형질도입 단위) 내지 수용자의 킬로그램 체중당 약 1020 TU의 범위, 또는 그들 값 사이에 있는 임의의 TU일 수 있다. 발작 및 DS의 마우스 모델은 투여량 및 처방을 최적화하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 치료 벡터는 SCN1A-결핍성 개재뉴런의 흥분성을 정상화하고, 발작 및 드라베 증후군 (DS)의 발작 증상을 경감시키기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량으로 투여될 수 있다. 본원에 기재된 벡터 및 방법은 1종 이상의 발작 및/또는 DS를 경험하거나 경험할 위험이 있는 개체, 예를 들어, 인간 영아, 아동 또는 성인에 대해 치료적 가치가 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 또는 rAAV를 포함하는 조성물은 그의 개재뉴런이 투여 시, 발현을 위해 SCN1A-특이적 인핸서, 예컨대 본원에 기재된 E1-E10에 의존하는 Nav1.1 나트륨 채널을 코딩하는 SCN1A 유전자를 발현하지 않거나, 그의 기능 또는 발현의 소실을 나타내는 개체에게 투여된다. 한 실시양태에서, SCN1A-제한 인핸서 서열을 함유하는 기재된 rAAV 벡터에 의해 형질도입된 개재뉴런 세포에서의 SCN1a의 발현은 SCN1A가 결핍성이거나, 그의 비정상적 발현을 갖는 개재뉴런의 흥분성을 정상화한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터를 포함하는 조성물은 그의 개재뉴런이 더 이상 SCN1A 유전자를 발현하지 않는 개체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터를 포함하는 조성물은 적어도 1월령인 개체에게 투여된다. 실시양태에서, 개체는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18세이다.
본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터가 투여되는 대상체, 예를 들어, 포유동물 대상체, 및 인간 환자는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같은 다른 항-간질성 치료제, 및/또는 외과적 기법과 함께 사용을 포함하지만 반드시 이에 제한되지는 않는 부가적인 또는 추가적인 치료 또는 치료 화합물 또는 약물, 예컨대 항-발작 양상으로부터 유익을 얻을 수 있다. 예로서, 본원에 기재된 치료 생성물 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 항-간질성 약물 (AED)은 제한 없이, 아세타졸아미드, 브리바라세탐, 카르바마제핀, 클로바잠, 클로나제팜; 에슬리카르바제핀 아세테이트, 에토숙시미드, 가바펜틴, 라코사미드, 라모트리진, 레베티라세탐, 옥스카르바제핀, 파람파넬, 페노바르비탈, 펜니토인, 프레가발린, 프리미돈, 루피나미드, 나트륨 발프로에이트, 스티리펜톨, 티아가빈, 토피라메이트, 발프로산, (콘불렉스, 에필림 크로노, 에필림 크로노스피어로서 입수가능함), 비가바트린 및 조니사미드를 포함한다.
키트
이를 필요로 하는 대상체에서, 신경학적 또는 신경정신 질환, 상태, 또는 병리증상, 예를 들어, 발작 및/또는 간질, 뿐만 아니라 드라베 증후군 (DS)의 증상을 예방하거나 치료하기 위한 키트가 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 키트는 예를 들어, 바이러스 벡터에 함유된 SCN1A 유전자의 발현을 뇌 내의 (즉, 종뇌 내의) GABA작동성 개재뉴런 세포를 포함하여 개재뉴런 세포에, 또는 뇌 피질 내의 피라미드형 세포, 예컨대 글루타메이트성 피라미드형 세포에, 또는 VIP 세포에 제한하는 SCN1A 유전자에 대해 특이적인 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터 또는 바이러스 입자의 유효량을 함유하는 치료 또는 예방 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서는 본원에 기재된 바와 같은 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10 인간 인핸서 서열이다. 한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서는 E2 인간 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이다. 한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서는 E5 인간 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이다. 한 실시양태에서, SCN1A-특이적 인핸서는 E6 인간 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 뉴런 또는 개재뉴런 세포, 특히 PV-발현 뉴런에서 발현되는 유전자에 대해 특이적인 E11-E35 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 특히 인간 E11-E35 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터 또는 바이러스 입자의 유효량을 함유하는 치료 또는 예방 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 키트는 치료 또는 예방 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함하며; 이러한 용기는 박스, 앰풀, 보틀, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 용기는 플라스틱, 유리, 적층 페이퍼, 금속 호일, 또는 의약을 보유하기에 적합한 다른 물질로 제조될 수 있다.
적어도 본원에 기재된 바와 같은 SCN1A-특이적 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 조성물은 발작, 간질, 또는 DS를 갖거나 발달시킬 위험이 있는 대상체에게 조성물을 투여하기 위한 지시서와 함께 제공된다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 GABA작동성 개재뉴런 및 PV-발현 개재뉴런을 포함하여 개재뉴런 세포에서의, 또는 피라미드형 세포, 예컨대 글루타메이트성 피라미드형 세포에서의 발현을 위한 SCN1A 트랜스진을 포함한다. 지시서는 일반적으로 발작, 간질, 또는 DS의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 사용에 관한 정보를 포함할 것이다. 다른 실시양태에서, 지시서는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제 (SCN1A-특이적 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 등을 포함하는 rAAV)의 설명; 허혈 또는 그의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여량 스케줄 및 투여; 지침; 경고; 적응증; 반대-적응증; 과다투여량 정보; 유해 반응; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참고문헌. 지시서는 용기 상에 직접적으로 인쇄되거나 (존재하는 경우), 용기에 적용된 라벨로서, 또는 용기에 또는 그와 함께 공급되는 별개의 쉬트, 팸플릿, 카드, 또는 폴더로서일 수 있다.
추가의 실시양태 및 그의 이점
신경학적 장애를 치료하는 방법의 이해 및 개발은 관여하는 뉴런 유형의 복합성에 기인한다. 본원에 기재된 실시양태의 생성물 및 방법은 질환 유전자, 또는 질환-연관된 유전자의 세포적 작용을 디컨볼빙하기 위해 개발되었다. 따라서, SCN1A 로커스는 체계적으로 분석되었으며, 그에 의해 SCN1A 유전자의 인트론성 및 유전자간 영역에 걸쳐 분포되는 것으로 밝혀진 10가지 상이한 인핸서 요소 (인핸서 E1-E10), 특히, 인간 인핸서 요소 및 그의 서열의 확인을 발생시켰다 (도 3D). 그의 발현이 이들 인핸서의 각각에 의존한 AAV를 생성함으로써, SCN1A 유전자 발현의 전반적 패턴을 개괄한 적어도 3가지 인핸서, 예를 들어, E2 (PV-특이적 발현을 위해), E6 (VIP-특이적 발현을 위해) 및 E5 (피라미드형 층 5와 관련된 발현을 위해)가 확인되었다. 다른 7가지 요소 (예를 들어, E1, E3, E4, E7, E8, E9 및 E10)는 모두 GAD1에 대해 고도로 특이적이었고, 개재뉴런 하위집단의 모음을 표지하였으며, 하위유형의 별개의 조합을 동원할 수 있다. 특정 실시양태에서, E2 인핸서 요소는 특정 cIN 하위유형, 즉, PV-발현 급속 스파이킹 세포에 대해 선택적인 것으로 확인되었다. SCN1A의 발현의 소실은 특히 PV cIN 기능이상과 연관되기 때문에, E2 인핸서는 설치류에서 뿐만 아니라 인간을 포함하여 다양한 영장류 내에서, 이 세포 집단을 선택적으로 표적화하는데 특히 능숙한 것으로 입증되었다. 또한, E2 인핸서는 제한 없이, 연결성, 흥분성의 모니터링, 및 광유전학으로의 PV cIN 활성의 조작을 포함하여, PV cIN 기능의 측면을 조사하는데 유용한 것으로 결정되었다. 다양한 종에서의 E2 인핸서의 유용성의 입증은 이 접근법에 의해 제공되는 기본적 및 임상적 적용의 폭을 강조한다. E2 인핸서에 의해 제공되는 다른 용도는 예로서, 회로의 보다 폭넓은 탐구 (예를 들어 재조합-바이러스를 사용한 모노시냅스 추적을 위한 시작자 세포를 생성하는 것, 예컨대 광견병), 세포 유형-특이적 유전자 기능의 소실 (예를 들어 CRISPR) 및 표적화된 약물 스크리닝을 포함한다. 또한, E2 인핸서의 사용은 PV cIN의 수, 분포 또는 생리학적 특성의 종 특이적 차이를 조사하기 위한 작용제를 제공한다. 다른 세포 유형에 대해 일반화되어, 접근법은 다양한 종, 가장 특히, 영장류 및 인간 둘 다를 조사하는데 유리하다.
본원에 기재된 바와 같이, 특이적 질환 로커스, 예컨대 SCN1A 유전자 로커스에서 인핸서를 체계적으로 조사하는 전략은 이 유전자를 발현하는 세포 유형의 각각에 대한 핵심적 조절 요소를 성공적으로 확인하였으며, 따라서, 접근법의 이익을 강조한다. 이는 SCN1A 유전자의 발현을 제어하는 조절 경관을 규명할 뿐만 아니라, 이를 발현하는 세포의 별개의 하위집단의 조작을 위한 도구 키트를 제공한다.
SCN1A 로커스와 연관된 많은 SNP는 인트론 1에 맵핑된다. 특정 실시양태에서 및 본원에 기재된 바와 같이, SCN1A-발현 집단에 대해 높은 특이성을 갖는 것으로서 확인된 3가지 인핸서, 즉, E2, E5 및 E6은 이 영역 내에 위치하였다. 이론에 제한되기를 원하지는 않지만, 확인된 SNP는 SCN1A의 발현에 영향을 미치는 이들 인핸서에서의 돌연변이를 나타낼 수 있다. GTEx 데이터는 인간에서의 SCN1A 발현의 변경과 연관된 이들 인핸서 내의 다수의 eQTL을 나타냄이 보고되었다 (Auget, F. et al., 2017, Nature, 550:204-213). E2는 특히 주목되는데, 이는 전뇌 개재뉴런으로부터의 SCN1A의 조건부 제거가 마우스에서 발작 표현형을 개괄하는 것으로 나타났기 때문이다. SCN1A 발현은 대개 개재뉴런의 PV-발현 하위집단에 제한되기 때문에, E2 인핸서에서의 돌연변이는 드라베 증후군의 직접적 원인일 수 있다.
회로 성숙의 초기 역학을 조사하기 위한 큰 장애 중 하나는 트랜스제닉 동물을 사용하지 않는 특이적 세포 유형에 대한 비접근성이었다. 어린 PV cIN은 심지어 복잡한 유전적 전략으로 표적화하는데 특히 문제였다. PV-cIN의 풍부성 (이들은 모든 억제성 cIN의 40%를 나타냄), 뿐만 아니라 신경발달성 장애에서의 그들의 연루의 관점에서, PV 발현의 개시 전에 이들 세포에 접근하는 것은 관련 기술분야에서 우선사항이다. 이들 발달 단계에서의 E2 인핸서의 특이성 및 바이러스 주사의 사용은 뉴런 세포 유형, 예컨대 PV cIN의 정상적인 발달 및 신경학적 또는 신경정신 질환에서의 그들의 역할을 이해하기 위한 작용제 및 도구를 제공한다. 한 실시양태에서, E2 인핸서는 PV-cIN의 정상적인 발달 및 질환에 있어서의 그들의 역할을 연구하기 위한 작용제를 제공한다. 또한, E2 인핸서, 뿐만 아니라 본원에서 제공된 다른 인핸서 요소는 특이적 세포를 표적화하는 기능을 할 수 있으며, 드라베 증후군을 포함하여 질환, 예를 들어, 뉴런성 질환의 치료에 유리하다.
다른 실시양태에서, 본원에서 확인되고 기재된 인핸서는 별개의 임상적 관련성을 갖는 특정 세포 집단에 대한 접근을 제공한다. 예로서, 이들 인핸서는 예를 들어, 유전자 요법을 통해 또는 뉴런 활성의 조정을 통해, 예를 들어, 광유전적 또는 화학유전적 접근법을 통해 드라베 증후군의 약화시키는 측면을 경감시키는데 사용된다. (예를 들어, 문헌 [Walker, M.C. et al., 2019, Neuropharmacology, 107751. doi: 10.1016/j.neuropharm.2019.107751. Review. PMID: 31494141] 참조). 본원에 기재되고 입증된 바와 같이, 국소 및 전신 주사는 뇌에의 효과적인 바이러스 전달에 사용될 수 있으며, 따라서 임상적 개입을 위한 전달 및 투여 방법을 제공한다. 예로서, 국소 주사 (예를 들어, 인핸서 요소 및 표적 폴리뉴클레오티드를 운반하는 재조합 바이러스의)는 초점성 간질, 전두전엽 피질 기능이상 또는 해마 기억 장애를 경감시키기 위해 채용될 수 있다. 바이러스의 전신 투여 또는 전달은 예를 들어, 전반적 개입이 전신성 발작을 교정하는데 또는 정신 및 신경변성 장애에 필요한 맥락에서 채용될 수 있다. 본원에 기재되고 예시된 실시양태에 의해 제공된 바와 같이, 조절 요소의 철저한 확인은 특이적 세포 유형에 접근하는 것을 허용한다. 이러한 요소는 실험 및 치료 절차 및 방법 둘 다에 사용하기에 유리하다.
기재된 실시양태의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 통상의 기술자의 범위 내인 분자 생물학 (재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 채용한다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)]; ["Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)]; ["Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)]; ["Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)]; ["Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]에 충분히 설명되어 있다. 이들 기법은 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 및 바이러스 입자의 생산에 적용가능하며, 따라서, 본원에 기재된 실시양태를 생성하고 실시하는데 있어서 고려될 수 있다. 특정 실시양태에 대해 특히 유용한 기법은 이어지는 섹션에서 논의될 것이다.
하기 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 어떻게 본원에 기재된 바와 같은 생성물, 조성물 및 치료 방법을 제조하고 사용하는지의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본원에 기재되고 예시된 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1 - 리포터 및 이펙터 유전자의 발현을 PV-발현 피질 개재뉴런 세포 집단에 제한하는 시스-조절 서열 (PV-개재뉴런-특이적 인핸서 서열)의 확인
Nav1.1 나트륨 채널을 코딩하는 유전자인 SCN1A는 피질 내의 다수의 별개의 뉴런 집단에서 발현된다. 이들은 3가지 비-중첩하는 뉴런 집단을 포함한다: 파르브알부민을 발현하는 급속-스파이킹 피질 개재뉴런 (PV cIN), 혈관활성-장 펩티드를 발현하는 탈-억제성 피질 개재뉴런 (VIP cIN) 및 층 5 피라미드형 뉴런. 특정 실시양태에서, SCN1A는 PV-발현 피질 개재뉴런에서 발현된다. SCN1A는 특히 흥미로운데, 이는 그의 기능의 소실이 발작의 초기 발병을 특징으로 하는 간질성 뇌병증의 초기-발병 및 난치성 형태인 드라베 증후군과 연관되기 때문이다. 보다 구체적으로, SCN1A의 반가불충분성 또는 병원성 변이체는 드라베 증후군을 유발한다.
SCN1A 로커스 내의 후보 인핸서를 체계적으로 확인하는 통합적 방법을 이 유전자를 발현하는 별개의 피질 집단을 표적화하는 유전적 전략으로서 개발하고 창안하였다. 조절 서열을 하기 3가지 기준에 기반하여 선택하였다. 첫째, 유전자의 전사 시작 부위 (TSS)에 대한 인핸서의 근접성은 발현의 수준에 정비례하는 것으로 상정되었기 때문에, 그의 TSS에 가장 가까운 SCN1A의 유전자간 및 인트론성 영역을 조사하여 트랜스진의 기능적 수준을 유도할 수 있는 인핸서를 확인하였다. 둘째, 주어진 세포 유형 내의 활성 인핸서의 위치는 염색질 접근성과 상관되기 때문에, 시각 피질로부터의 개재뉴런을 Dlx6acre;Sun1-eGFP 트랜스제닉 마우스를 사용하여 수집하여 SCN1A를 발현하는 세포 집단의 염색질 경관을 평가하였다. 주어진 세포 유형 내의 활성 인핸서의 위치는 염색질 접근성 및 DNA 저메틸화와 상관된다.
핵을 단리한 후, 단일-세포 ATAC-seq 프로파일링 (예를 들어, 문헌 [Buenrostro, J.D. et al., Nature, 523:486-90 (2015)] 및 [Cusanovich, D.A. et al., Science, 348: 910-4 (2015)] 참조)을 SnapATAC 분석 파이프라인 (하기 방법에 기재됨)을 사용하여 수행하여 가장 높은 수준의 SCN1A를 발현하는 PV cIN, VIP cIN 및 피라미드형 뉴런을 포함하여 피질 개재뉴런의 4가지 주요한 부류의 각각에서 차등적으로 접근가능한 염색질 영역을 확인하였다. (도 3A-3C 및 도 12). 셋째, 조절 요소는 양성 선택 압력으로 처리되기 때문에, 인간을 포함하여 포유동물 종에 걸쳐 가장 높은 보존을 나타내는 서열을 확인하였다. 따라서, 치료 잠재성을 갖는 인핸서를 결정하고 단리하기 위해, 진화를 통해 고도로 보존된 SCN1A의 TSS 부근의 10개의 선택적으로 접근가능한 인트론성 및 유전자간 영역, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 E1-E10을 평가하였다. (도 3D 및 도 15A-1, 15A-2, 16A-1 및 16A-2).
SCN1A를 발현하는 뉴런 집단을 표적화하는 후보 인핸서의 능력을 조사하기 위해, 각각의 인핸서 서열을 적색 형광 리포터 (rAAV-E[x]-d토마토)의 상류에 최소 프로모터를 함유하는 rAAV-백본 내로 삽입하였다. 이들 구축물로부터, rAAV를 그 후 PHPeB 캡시드로 생산하고 (Chan, K.Y. et al., Nat. Neurosci., 20:1172-1179 (2017)), 성체 마우스 내로 전신적으로 주사하였다. 3주 후, 모든 바이러스는 피질 내에서, 뿐만 아니라 다수의 뇌 영역에 걸쳐 강하고 희박한 발현을 나타내었다. E5를 제외하고, 대다수의 바이러스-표지된 세포가 범-개재뉴런 마커 Gad1을 발현하였다. 그러나, 피질 뉴런 내의 PV에 대한 공동-국재화의 정도는 다양하였고, E2에 대해 90% 초과 내지 E6에 대해 5% 미만의 범위였으며, 모든 나머지 인핸서는 중간 수준의 PV 특이성을 나타내었다 (도 3E 및 도 7). 그 후, E2, E5 및 E6 인핸서에 의해 포획된 뉴런 집단의 아이덴티티 및 층 분포를 추가로 조사하였다. 그들의 층 분포와 일치하게, 다양한 마커로의 공동-국재화 분석은 E2 조절 요소가 바이러스 리포터의 발현을 PV cIN에 제한한 반면, E6은 VIP 개재뉴런에 대해 선택적이었음을 밝혀내었다. 대조적으로, E5 조절 요소는, 모든 층에 걸쳐 개재뉴런을 희박하게 표지하면서, 층 5 내의 피라미드형 뉴런에 대한 주목할 만한 풍부화를 가졌다 (도 3F). 따라서, SCN1A의 피질 발현 프로파일의 상당한 부분은 3가지 인핸서의 집합적 발현에 의해 반영되었다. 따라서, 이들 조절 요소는 별개의 기능 및 발달 기원을 갖는 개재뉴런 및 뉴런의 집단에서 크게 비-중첩하는 발현을 해명한다. 본원에 기재된 바와 같이 개발된 바이러스 도구는 뉴런 하위유형을 분석하기 위한 수단을 제공하며, 그들의 정상적인 기능, 뿐만 아니라 질환에 걸린 피질에서의 비정상을 연구하는데 유리하게 사용될 수 있다.
특정 측면에서, S5E2 (E2) 인핸서 요소 서열을 최소 기저 프로모터 및 리포터 트랜스진 (예를 들어, d-토마토) 또는 이펙터 유전자 (예를 들어 Gq-DREADD)를 포함한 재조합 AAV (rAAV) 벡터 내로 혼입하여, pAAV-S5-E2-d토마토로 지칭되는 rAAV 벡터를 생성하였다. 리포터 유전자 (트랜스진)의 발현을 뇌 내의 PV-발현 개재뉴런에 제한하는 E2 인핸서의 능력을 E2 인핸서-함유 rAAV 벡터를 동물 (마우스) 내로 전신적으로 주사하고, 피질을 포함하여 뇌 구조에 걸쳐 발현된 리포터 사이의 공동-국재화를 분석함으로써 평가하였다. 벡터에 의해 형질도입된 특이적 세포의 검출을 허용하는, 동물 (마우스) 내로의 pAAV-S5-E2-d토마토 벡터의 전신 생체내 주사 후의 뇌 섹션에서의 d토마토 리포터에 대한 면역조직화학적 (IHC) 염색 분석의 결과를 나타내는 화상은 도 2A (도면의 상부 부분에서 시상 섹션; 도면의 하부 부분에서 두정 섹션)에 나타내어진다. PV를 발현하는 특이적 세포의 검출을 허용하는, 동물 (마우스) 내로의 pAAV-S5-E2-d토마토 벡터의 전신 생체내 주사 후의 뇌 섹션에서 발현된 d토마토 리포터에 대한 면역조직화학적 (IHC) 염색 분석의 결과를 나타내는 화상은 도 2B에 나타내어진다. pAAV-S5-E2-d토마토 벡터로부터의 리포터 유전자 발현은 뇌 섹션에서 가시화된다 (도 2B, 좌측 패널, 적색). pAAV-S5-E2-Gq-DREADD-d토마토로부터의 리포터 유전자 발현은 Gq-DREADD (녹색)에 대해 및 d토마토 (적색)에 대해 가시화된다 (도 2B, 우측 패널). 벡터에 의해 형질도입된 특이적 PV-발현 세포의 검출은 또한 가시화된다 (도 2B, 좌측 패널, 녹색; 도 2B, 우측 패널, 청색).
후보 인핸서의 확인
상기 인핸서 서열 선택 접근법을 사용하여, SCN1A 유전자 전사 시작 부위에 근위인 10가지 후보 인핸서 서열을 마우스 게놈에서 발견하였다. 본원에서 S5E1 (E1), S5E2 (E2), S5E3 (E3), S5E4 (E4), S5E5 (E5), S5E6 (E6), S5E7 (E7), S5E8 (E8), S5E9 (E9) 및 S5E10 (E10)으로 지칭되는 이들 인핸서 서열은 SCN1A 유전자의 부근에서 확인되었다 (도 1A-1). E1-E10 인핸서 서열에 상응하는 인간 폴리뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 15-24), 뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 추가적인 인간 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 E11-E35 (서열식별번호: 25-49)가 또한 본원에서 제공되고 기재된다. (도 1A-2 및 1A-3).
E1-E10 인핸서에 대한 인간 (인간 오르토로그) 서열을 100 kb 상류 및 하류 둘 다를 포함하여, SCN1A의 인간 게놈 서열에 대한 마우스 서열의 정렬에 기반하여 결정하였으며, 이는 2가지 종 사이에 고도로 보존된 인간 오르토로그 서열의 확인을 초래하였다 (도 1A-1 내지 1A-3, 16A-1, 16A-2). 통상의 실시자에 의해 인식될 것인 바와 같이, 인핸서 조절 요소는 종에 걸쳐 상대적으로 잘 보존되지만, 종에 걸쳐 인접하게 보존되지 않은 스페이서 서열이 사이에 들어간 일련의 전사 결합 부위를 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, SCN1A 인핸서 요소는 본원에 기재된 바와 같은 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) 인핸서 서열, 즉, E1-E10과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 100 bp 초과의 임의의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 구성할 수 있다. 한 실시양태에서, SCN1A 인핸서 요소는 인간 E2 (S5E2) 폴리뉴클레오티드 (DNA) 인핸서 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 100 bp 초과의 임의의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 이러한 인핸서 서열에 대해, 핵산 서열의 크기는, 서열이 본원에 기재된 바와 같은 인간 폴리뉴클레오티드 (DNA) E1-E10 또는 E11-E35 인핸서 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 100 bp 초과의 임의의 영역을 함유하는 한, 제한적이지 않다. 본원에 기재된 확인된 인핸서 서열 (35가지 인핸서 서열)의 각각과 관련된 데이터는 도 1A-1 내지 1A-3, 15A-1, 15A-2, 16A-1 및 16A-2에 나타내어진 표에 제공된다.
마우스 뇌의 피질층 내의 PV-발현 개재뉴런에서의 E1-E10 인핸서 요소-제한된 리포터 유전자 발현은 도 1B-1 및 1B-2에 나타내어지며, 이는 동물 (마우스) 내로의 pAAV-S5-E2-d토마토 벡터의 전신 생체내 주사 후의 뇌 섹션에서의 d토마토에 대한 면역조직화학적 (IHC) 염색 분석을 제시한다. 피질 내의 PV-발현 개재뉴런에서의 리포터 유전자의 발현의 특이성 (도 1C) 및 민감성 (도 1D)의 정도의 정량화는 그래프적으로 입증된다. 리포터 유전자의 발현은 rAAV 벡터에 함유된 E1-E10 인핸서 요소에 의해 제어된다. 특이성은 동물 (마우스) 내로의 pAAV-S5-E2-d토마토 벡터의 전신 생체내 주사 후의 뇌 섹션 상의 면역조직화학에 의해 평가된 PV-개재뉴런 마커 PV를 공동-발현하는 바이러스 리포터 d토마토를 발현하는 세포의 비율로서 정량화되었다. 민감성은 동물 (마우스) 내로의 pAAV-S5-E2-d토마토 벡터의 전신 생체내 주사 후의 뇌 섹션 상의 면역조직화학에 의해 평가된 바와 같은 바이러스 리포터 d토마토에서 공동-발현된 PV-개재뉴런 마커 PV를 발현하는 세포의 비율로서 정량화되었다. 막대 그래프는 평균 +/- 평균의 표준 오차를 나타낸다.
실시예 2 - 마우스에서의 PV 피질 개재뉴런 (PV cIn)의 바이러스 표적화
PV cIN에 대한 E2 조절 요소의 90% 특이성은 집합적으로 모든 피질 (GABA작동성) 개재뉴런의 40%를 구성하는 급속-스파이킹 뉴런 (예를 들어, 바스켓 및 샹들리에 세포)을 표적화하기 위한 수단을 제공한다. 이들 뉴런은 국소 네트워크에 비해 강한 수준의 억제를 발휘하며, 그들의 기능이상은 드라베 증후군, 초점성 간질, 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD) 및 조현병을 포함하여 신경학적 및 신경정신 장애에 직접적으로 연루되었다. 따라서, 그들의 활성에 대한 제어를 얻는 것은 근본적 연구 및 임상적 적용 둘 다를 위해 특히 흥미롭다. 따라서, E2 조절 요소를 예를 들어, 바이러스 도구 또는 치료제로서 폭넓은 유용성을 갖는 작용제를 개발하기 위해 조사하고 특징규명하였다.
rAAV-E2-d토마토로 전신적으로-주사된 성체 마우스는 1주 후에 바이러스 리포터의 검출가능한 발현을 나타내었으며, 3주 후에 높고 안정한 수준의 발현에 도달하였다. 면역조직화학 및 계내 혼성화를 수행하였으며, 일치하게 바이러스 표지된 세포의 ~90%가 피질 내의 PV IN (즉, PV-발현 피질 개재뉴런)이었음을 나타내었다. 반대로, 평균적으로, PV cIN의 75%는 바이러스 리포터를 발현하였으며, 최소 민감성은 93%에 도달하였다 (도 4A 및 4B). 이는 층 또는 하위유형에 대한 편향 없이 모든 PV cIN을 표적화하는 E2의 능력을 지시한다. PV cIN에 대한 특이성과 일치하게, 마우스로부터의 슬라이스 기록은 바이러스 리포터를 발현하는 뉴런이 1차 체성감각 피질 (S1) 및 전두전엽 피질 (PFC) 둘 다 내에서 급속-스파이킹 PV cIN의 특징적인 전기생리학적 특성을 나타내었음을 나타내었다 (도 4C 및 도 8A 및 8B).
바이러스 리포터는 뇌 피질에 우세하게 국한되었지만, 일부 양성 세포는 SCN1A 발현의 영역에 가깝게 상응하는 다른 뇌 영역에서 관찰되었다. E2는 1차 시각 피질 (V1) 및 대상 피질, 구상회, 해마 CA1, 흑질 망상부 내의 PV-발현 뉴런에 대해 높은 특이성을 유지하였다 (도 8C). 특히, 간에서 (임의의 AAV의 전신 전달 시 예상됨) 및 폐에서 (SCN1A이 낮은 수준에서 발현됨) 관찰된 소수의 세포를 제외하고는, 뇌의 외부에서는 사실상 바이러스 리포터 발현이 관찰되지 않았다 (도 8D). 이들 결과는, 전신 전달에도 불구하고, E2를 함유하는 벡터가 중추 신경계의 외부에서 비유의한 오프-타겟 발현을 가지면서, 다양한 뇌 영역에서 PV-발현 뉴런을 선택적으로 표적화하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
많은 실험적 패러다임 및 임상적 적용은 전신 주사라기 보다는 국소 주사를 요구할 수 있다. 이들 맥락에서 유용하기 위해, 바이러스 발현은 PV cIN에 대한 높은 수준의 특이성을 보유해야 한다. 정위적으로 가이드된 주사는 전형적으로 오프-타겟 발현을 발생시킬 수 있는 전신 전달에 비해 세포당 보다 많은 수의 바이러스 입자를 초래한다. 바이러스 로드를 증가시키는 것이 특이성을 변경시켰는지 여부를 시험하기 위해, 동일한 부피의 rAAV-E2-d토마토를 다양한 역가에서 성체 마우스의 피질 내로 국소적으로 주사하고, 리포터 발현을 1주 후에 PV cIN 내에서 평가하였다 (도 4D). 결과는 보다 높은 역가가 리포터 발현의 수준을 증가시켰지만, 특이성의 유의한 변경은 관찰되지 않았음을 나타내었다.
성숙한 피질 내의 PV-발현 개재뉴런의 우세에도 불구하고, 초기 출생후 단계에서 이들 PV cIN을 표적화하는 것은 파르브알부민의 상대적으로 늦은 발현 (출생 후 대략 15일, 즉, P15) 및 이 집단에 대한 다른 초기 마커의 결여에 의해 저해되었다. 발달 장애에서의 PV cIN의 관여는 피질 회로 어셈블리 동안 이 세포 집단을 표적화하고 조작할 필요를 강조한다. 복잡한 유전적 전략은 마우스에서 이를 달성하기 위한 단지 부분적 해결책을 제공하지만 (즉, Lhx6-Cre, Sst-Flp 및 Cre 및 Flp-의존성 리포터); 이들 전략은 출생후 제2주 전에 이들 뉴런을 용이하게 조작하는 수단을 제공하지 않는다.
E2 인핸서가 파르브알부민의 발현의 개시 전에 급속-스파이킹 cIN을 표적화하였는지 여부를 시험하기 위해, 그의 활성을 다양한 출생후 단계에서 조사하였다. 이를 위하여, rAAV-E2-d토마토의 일련의 정위적으로-가이드된 주사를 통해, 초기 출생후 기간에 걸쳐 분석을 타일링하였다 (도 4E). 리포터의 선택성을 P15에서 파르브알부민 발현의 개시 시 평가하였다. 이 평가는 50% 초과의 선택성이 P1에서의 주사 시 PV cIN에 대해 얻어졌으며, P7 주사에 의해 67%로 증가하고, P10 주사 후 80% 초과로 증가하였음을 밝혀내었다. 이 접근법을 추가로 사용하여 P15 전에 PV cIN을 표지화하였다. 이 맥락에서 급속 스파이킹 cIN을 확인하기 위해, GFP가 중앙 신경절 융기 (MGE)-유래된 개재뉴런 (PV cIN 및 SST cIN 둘 다)에서 발현되는 Lhx6-Cre/무손상 트랜스제닉 마우스를 사용하였다. SST에 대해 공동-염색함으로써, PV cIN은 GFP-양성/SST-음성으로서 구별될 수 있었다. 72% 및 78% 특이성이 각각 P4-P7 또는 P7-P10 시간 과정으로 PV에 대해 얻어졌다. 따라서, 이 접근법은 단일 바이러스 주사를 사용하여 회로 성숙 동안 이러한 뉴런을 연구하는 수단을 제공한다.
실시예 3 - 마우스에서의 바이러스 모니터링 및 PV 피질 개재뉴런의 조작
실시예 2에 기재된 바와 같이 상이한 주사의 방식으로 및 발달 단계에 걸쳐 PV cIN에 대한 E2 발현의 정확도를 입증하였으므로, 이 벡터의 유용성을 연결성 (시냅스전 리포터를 사용하여) 및 활성 (유전적으로 코딩된 칼슘-리포터와 결합된 화상화를 사용하여)을 연구하기 위해 평가하였다. E2를 사용하여 시냅토피신-td토마토 융합 유전자를 유도한 경우 (예를 들어, 문헌 [Madisen, L. et al., 2012, Nat Neurosci, 15(5):793-802] 참조), 리포터 발현은 피라미드형 뉴런 상으로 세포체주변으로 위치한 말단을 갖는 PV cIN에 시냅스전으로 제한되었다 (도 5A). 이 벡터를 사용하여 GCaMP6f 발현을 유도한 경우 (Chen, T.W. et al., Nature, 499: 295-300 (2013)), 휘스커 자극 시 PV cIN이 동원되었음이 입증되었다 (도 5B 및 도 9A). 함께 이들 결과는 E2가 PV cIN 생물학의 다양한 측면을 모니터링하는 효과적인 수단을 제공함을 입증하였다.
E2가 활성의 기능적 변화를 유발하는데 충분한지 여부를 조사하기 위한 추가의 연구를 화학- 또는 광유전적 접근법을 사용하여 수행하였다. E2를 사용하여 성체 동물에서 화학유전적 수용체 PSAM4-5HT3-LC의 발현을 지정하였다 (Magnus, C.J. et al., 2019, Science, 364(6436). 이들 동물로부터 수집된 뇌 섹션에서의 PV cIN은, 작동자 바레니클린에 노출되는 경우, 전류가 역치 미만으로 클랭핑되었을 때 발화하도록 유도될 수 있음이 관찰되었다 (도 5C). 화학유전적 수용체 Gq-DREADD를 사용하여 유사한 결과가 얻어졌다 (Armbruster, B.N. et al., PNAS USA, 104:5163-5168 (2007), (도 9C). 마지막으로, 뇌 슬라이스에서 적색-이동된 옵신 C1V1을 발현하는 PV cIN의 일정하고도 높은 주파수 레이저 자극은 자극에 대해 시한이 있는 발화를 발생시켰다 (도 5D 및 5E 및 도 9A 및 9B). 이들 뉴런의 결속이 수반 국소 억제를 발생시켰음을 입증하였으므로, 바이러스 표지된 PV cIN의 부근의 피라미드형 뉴런 활성은 레이저 자극에 의해 일관되게 중단되었다. 특히, 이 효과는 피크로톡신으로의 처리에 의해 없어졌다 (도 5D 및 도 9B). 생체외에서 방법의 효능을 입증하였으므로, PV cIN을 광-유전적으로 자극함으로써 생체내에서 흥분성 네트워크를 변경시키는 능력을 조사하였다. 성체 동물의 1차 시각 피질 내로의 AAV-E2-C1V1의 국소 주사 후 3주에, 감염된 영역 내의 단일 단위 기록을 기준선에서 및 레이저 자극 시 둘 다에 수행하였다. 기록된 뉴런의 아이덴티티를 그들의 스파이크 폭 및 최대 발화 주파수에 기반하여 구별하였다. 신뢰성 있게, 억제성 개재뉴런 발화율은 레이저 자극에 의해 증가된 반면, 흥분성 뉴런 발화는 침묵되었다 (도 5E). 함께, 이들 결과는 생체외에서 및 생체내에서 둘 다 화학- 또는 광유전학 접근법을 사용하여 E2가 PV cIN을 기능적으로 결속하고, 네트워크 억제를 유발할 수 있음을 입증하였다.
실시예 4 - 인간을 포함하여 영장류에서의 바이러스 모니터링 및 PV 피질 개재뉴런의 조작
E2 인핸서의 서열은 인간을 포함하여 포유동물 종에 걸쳐 고도로 보존되며, 따라서 이는 유전자 조절에서의 보존된 역할을 시사한다. E2 조절 요소가 포유동물 종에 걸쳐 PV cIN을 표적화하는데 사용될 수 있는지 여부를 확립하기 위한 연구를 수행하였다. E2를 함유하는 바이러스 벡터 (E2 바이러스)의 전신 주사 (마모셋에서) 또는 초점성 주사 (래트 및 마카크에서)를 사용하여, PV cIN이 대략 90% 특이성으로 표적화되었음이 입증되었다 (도 6A). 외과적 절제 동안 얻어진 인간 뇌 조직은 연장된 기간 동안 배양될 수 있음이 보고되었다 (Eugene, E. et al., 2014, J. Neurosci Methods, 235:234-244). 생체외에서 건강하게 잔류하는 인간 뇌의 회복력을 이용하여, 새롭게 절제된 구상회 또는 중앙 측두 피질을 E2 바이러스에 노출시켰다. 2-주 배양 기간에 걸쳐, 형광 표지된 세포의 점진적 외관을 관찰하였다. PV 염색이 이들 세포의 예상된 분포를 반영한 영역에서, 바이러스 표지된 세포는 PV-양성이었다 (도 6B (i); 상세사항에 대해서는 방법 참조). 또한, 피질 및 구상회 둘 다 내의 대다수의 세포는 형태학, 직접적 탈분극을 통해 유발된 경우 최대 발화율, 또는 광유전적 광 자극을 포함하여, 다수의 기준에 의해 지시된 바와 같이 PV IN의 특징적 특성을 나타내었다 (도 6B (ii-iv) 및 도 10A 및 10B).
특히, 인간 E2 인핸서는 마우스에서의 주사 시 PV cIN에 대한 동일한 정도의 특이성을 나타내었으며, 이는 높은 정도의 서열 보존을 특징으로 하는 게놈의 비-코딩 영역이 종에 걸쳐 그들의 기능적 특성을 보유할 가능성이 있음을 추가로 입증한다. 마지막으로, 인간 E2 인핸서의 5' 및 3' 말단 둘 다의 말단절단은 특이성의 급격한 감소를 발생시켰으며, 이는 E2 인핸서의 기능적 경계가 최적으로 확인되었음을 시사한다 (도 14). 함께, 이들 결과는 E2 벡터가 인간을 포함하여 포유동물 종에 걸쳐 PV cIN을 표적화하고 조작하기 위한 효과적인 도구를 제공함을 지시한다.
실시예 5 - 영역 특이성을 갖는 바이러스 인핸서의 확인
본원에 기재된 인핸서 선택 방법이 일반화가능하였음을 입증하기 위해, 25가지 추가적인 인핸서/조절 요소 후보 (본원에서 E11-E35)를 그의 발현이 종에 걸쳐 PV cIN에 풍부화된 7가지 유전자의 부근에서 확인하였다 (도 1A-1 내지 1A-3; 도 15A-1 및 15A-2; 도 16A-1 및 16A-2). (하기 방법 참조). 이들 서열을 함유하는 AAV의 전신 주사는 이들 중 4가지가 PV cIN에 대한 90% 초과의 선택성을 나타내었음을 밝혀내었다. 특히, 이들 인핸서 중에서, PV를 발현하지 않은 상대적으로 소수의 바이러스-표지된 뉴런은 범-개재뉴런 마커 Gad1에 대해 양성이었다. 도 1A-1 내지 1A-3에서, Pvalb (유니프롯(UniProt)KB - P20472)는 칼슘-결합 파르브알부민 알파 단백질을 코딩하는 유전자를 지칭하고; ACAN (NCBI 유전자 ID: 176; 유니프롯 P16112)은 질환 척추골단골간단 이형성증에 관여할 수 있는 아그레칸 코어 단백질 (연골-특이적 프로테오글리칸 코어 단백질로도 지칭됨)을 코딩하는 유전자를 지칭하고; Tmem132c (NCBI 유전자 ID: 92293)는 세포 또는 소기관의 생물학적 막에 걸치는 단백질의 유형인 막횡단 단백질 132c를 코딩하는 유전자를 지칭하고; Lrrc38 (유니프롯KB - Q5VT99)은 부신 및 전립선 조직에서 상대적으로 높은 발현을 나타내는 38 유전자를 함유하는 류신 풍부 반복부를 지칭하고; Inpp5j (유니프롯KB - Q15735)는 막 주름에서 이노시톨 및 포스파티딜이노시톨 포스페이트 결합 단백질의 기능의 조정에 관여할 수 있는 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트 5-포스파타제 A를 코딩하는 유전자를 지칭하고; Mef2c (유니프롯KB - Q06413)는 심장 형태형성 및 근육발생 및 혈관 발달에, 뿐만 아니라 신경발생에 및 피질 구조의 발달에 관여하는 Mef2 패밀리에서의 전사 인자인 근육세포-특이적 인핸서 인자 2C를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 인간에서, Mef2c 유전자에서의 돌연변이는 중증 정신운동 손상, 주기적 진전 뿐만 아니라 비정상적 EEG 및 간질을 특징으로 하는 상염색체 우성 정신 지체 20 (MRD20)을 발생시킨다. Pth1h (NCBI 유전자 ID: 5744)는 신장 및 뼈에서 유형 1 PTH/PTHrP 수용체를 활성화시킴으로써 악성종양의 호르몬성 고칼슘혈증을 유발하는, 암 세포, 예를 들어, 유방암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 간암, 또는 결장직장암 세포에 의해 분비되는 부갑상선 호르몬-유사 펩티드를 코딩하는 유전자를 지칭한다. SCN1A와 유사하게, 상기 언급된 유전자는 뇌 내의 모든 다른 세포에 비해 PV-개재뉴런에 고도로 풍부화된다. 따라서, 이들 유전자는 인핸서 요소에 의한 표적화를 위한 후보로서 선택되었으며, 기재된 바와 같은 인핸서는 이들 유전자의 코딩 서열의 부근에서 확인되고 위치하였다.
특히, 4가지 PV-특이적 조절 요소, 즉, E11 (서열식별번호: 25, 인간), E14 (서열식별번호: 28, 인간), E22 (서열식별번호: 36, 인간) 및 E29 (서열식별번호: 43, 인간)는 특이적 뇌 영역 내에서 고도로 선택적인 발현을 갖는 것으로 확인되었다. (도 13A 및 13B). 이들 4가지 인핸서의 각각은 PV-발현 뉴런의 별개이지만 중첩하는 하위세트에 대해 특이적이었다. 구체적으로, E11 및 E14는 피질의 상부 층에서 PV cIN을 표적화하기 위한 편향을 나타낸 반면, E22 인핸서는 피질에 거의 배타적으로 제한된 발현을 나타내었으며, 단지 소수의 뉴런은 다른 곳에서 낮은 수준의 발현을 나타내었다. 대조적으로, E29 인핸서는, 그것이 중추 신경계 전반에 걸쳐 PV-발현 뉴런의 전체 집단을 표적화하였기 때문에, 가장 전반적인 발현을 나타내었다. 이들 인핸서 모두는 높은 정도의 서열 보존을 나타내며, 그의 발현 프로파일이 종에 걸쳐 유사한 유전자로부터 선택되었다. 인핸서 중에서의 교차-종 유사성이 종에 걸쳐 유사한 기능성을 발생시키는지를 직접적으로 시험하기 위해, AAV-E22-d토마토를 마카크의 V1에서 국소적으로 주사하였다. 이는, 마우스의 그것과 유사한 방식으로, 바이러스 리포터의 발현이 PV cIN에 제한되었음을 나타내었다. 영역 선택성 및 종에 걸친 발현의 보존의 조합은 상이한 포유동물 종에서의 비정상적 뇌 기능을 교정하기 위한 표적화된 요법에서 이들 바이러스 작용제에 대한 유용성을 제공한다.
실시예 6 - SCN1A 발현은 DS의 마우스 모델에서 SCN1A -발현 집단 내의 SCN1A 유전자의 기능적 카피를 전달함으로써 정상 수준으로 복원된다.
예를 들어, DS의 마우스 모델에서 SCN1A 유전자의 기능적 카피를 SCN1A-발현 개재뉴런 세포 집단에 전달함으로써 SCN1A 유전자 발현을 정상 수준으로 복원하기 위해, '제한된 핵산 (DNA) 탑재량' (즉, rAAV 벡터 내에 함유되거나 운반되는 외인성 핵산 (DNA), 예를 들어, 트랜스진 및 연관된 핵산 서열의 크기)은 SCN1A 유전자의 크기를 수용할 수 있는 rAAV 벡터를 발생시키는 하나 이상의 접근법을 사용하여 증가된다. 상기 언급된 바와 같이, AAV DNA는 4.7-5 kb 정도인 반면, rAAV 벡터 내의 삽입 및 벡터에 의한 전달에 바람직한 유전자는 종종 그 크기의 2배 이상이다. rAAV를 사용한 보다 큰 유전자의 전달은 상동성 재조합에 의해 또는 수용자-부위에 의해 매개되는 스플라이싱에 의해 재-어셈블리하는 다수의 벡터를 사용한 다른 맥락에서 입증되었다. (예를 들어, 문헌 [Hirsch, M.L. et al., 2016, Methods Mol Biol, 1382:21-39] 참조). 이들 접근법 둘 다는 rAAV의 패키징 한계를 극복하는데 이용가능하다.
DS 동물 모델 및 인간 환자 둘 다가 입증된 바와 같이, SCN1A에 대한 요구는 용량-의존적이다. 따라서, rAAV-유도된 SCN1A의 발현의 수준은 SCN1A 발현의 정상 내인성 수준에 매칭되거나, 가능한 한 가깝게 매칭되는 것으로 관련 기술분야에 공지되고 실시되는 바와 같이 적절하게 적정된다. 몇몇 방법은 SCN1A 유전자 발현의 수준을 정확하게 조정하는데 사용될 수 있다. 다양한 전략은 치료의 유효성의 직접적 판독으로서의 발작의 개선을 사용하여, SCN1A 발현의 수준을 조정하는데 사용된다.
실시예 7 - DS의 마우스 모델에서의 SCN1A -결핍성 뉴런 집단의 흥분성을 선택적으로 정상화하기 위한 약물유전적 접근법
개재뉴런 세포에서의 전달 및 제한된 발현을 위한 특이적 인핸서 및 유전자 핵산 서열을 함유하는 rAAV 벡터를 사용한 직접적 유전자 요법에 대한 대안으로서, 약물유전적 방법은 SCN1A 뉴런 집단 내의 뉴런 활성을 직접적으로 교정하기 위해 채용될 수 있다. 이를 위하여, '디자이너 수용체'를 포함하는 화학유전적 접근법은 개재뉴런 활성을 조정하는데 사용될 수 있다. 디자이너 약물에 의해 배타적으로 활성화된 디자이너 수용체 (DREADD)는 변형된 인간 무스카린성 수용체이다. 또한, PSAM-PSEM 화학유전적 작용제는 사용하기에 적합하다.
Gq-DREADD, 즉, 약리학상 불활성 및 경구 생체이용성 약물인 클로자핀-N4-옥시드 (CNO)에 의해 배타적으로 활성화된 수용체를 사용하여, 흥분성/억제성 균형 (E/I 균형)은 DS의 마우스 모델 (DS 마우스)에서 교정될 수 있다. 간략하게, Gq-DREADD 수용체는 SCN1A-특이적 인핸서, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 E1-E10 및 SCN1A 유전자를 함유하는 rAAV 벡터를 사용하여 SCN1A-결핍성 개재뉴런 세포에서 발현된다. Gq-DREADD를 사용한 다른 연구에 기반하여, 수용체는 기능적이며, 형질도입된/감염된 세포의 막에 위치할 것으로 예상된다. 또한, SCN1a-특이적 조절 요소, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 E1-E10을 함유하는 rAAV 벡터는 개재뉴런, 예컨대 GABA작동성 개재뉴런 및 PV-발현, GABA작동성 개재뉴런 내에서 G1-DREADD 수용체의 발현을 배타적으로 유도해야 한다. 감염된 세포 내의 Gq-DREADD의 기능성이 평가될 수 있다. CNO의 조 적용 시, Gq-DREADD를 발현하는 모든 개재뉴런은 기능적 수용체의 발현과 일치하게, 1분 미만 내에 막 전위 탈분극을 나타낼 것으로 예상된다. 더욱이, Gq-DREADD를 발현하는 개재뉴런의 부근의 피라미드형 세포의 전압 클램프 기록은 클로자핀-N-옥시드 (CNO)의 적용 시 억제성 시냅스후 전류 (IPSC)의 증가를 나타낼 것으로 예상된다. 이러한 실험은 SCN1a-특이적 E1-E10 인핸서 서열 및 Gq-DREADD-코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV가 Gq-DREADD의 특이적, 기능적 및 제한된 발현을 허용하고, CNO-처리가 개재뉴런의 활성을 효과적으로 및 선택적으로 증가시키며, 그에 의해 이웃하는 흥분성 뉴런 내의 개재뉴런에 의한 억제 활성의 국소화되고 현저한 증가를 제공함을 입증한다.
SCN1A의 결여 (SCN1A의 기능의 소실)가 세포의 흥분성을 증가시키는 DREADD의 능력을 손상시켜야 하는 경우, DREADD는 문헌 [Dimidschstein, J. et al. (2016, Nature Neuroscience, 19(12):1743-1749)]에 의해 기재된 바와 같이, 범-개재뉴런 인핸서, 예컨대, 예를 들어, 별개의 및 상이한 Dlx 인핸서를 사용함으로써 모든 개재뉴런에 전달되어, SCN1A의 기능의 소실에 의해 영향을 받지 않은 다른 유형의 개재뉴런의 활성을 증가시킴으로써 손상을 피할 수 있다.
실시예 8 - 상기 기재된 실시예의 물질 및 방법
scATAC -seq 라이브러리 제조 및 시퀀싱. 수컷 반접합성 Dlx6a-Cre 마우스 (잭스(Jax) 스톡 #008199)를 암컷 동형접합성 INTACT 마우스 (flox-Sun1-eGFP, 잭스 스톡 #021039)와 교배시켜 scATAC-seq 실험을 위한 Dlx6a-Cre::INTACT 자손을 생성하였다. P28 Dlx6aCre::INTACT 마우스로부터의 뇌를 수확하고, 마우스 뇌 슬라이서 (지빅 인스트루먼츠(Zivic Instruments)) 상에서 두정적으로 섹션화하고, 관심의 영역을 빙냉 인공 뇌척수액 (ACSF)에서 해부하였다. 그 후, 조직을 용해 완충액 (10 mM 트리스(Tris)-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.01% 트윈(Tween)-20, 및 0.01% IGEPAL CA-630, 0.001% 디기토닌(Digitonin))을 함유하는 다운스 균질화기에 옮겼다. 조직을 막자 A의 10 스트로크, 막자 B의 10 스트로크로 균질화하고, 5분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 후, 30 μm 필터를 통해 여과하고, 500xg에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 펠릿을 소니(Sony) SH800S 세포 분류기 상에서 GFP+ 핵에 대해 분류하기 위해 1% BSA에 재현탁시켰다. 핵을 희석된 핵 완충액 (10X 게노믹스(Genomics)) 내로 분류하였다. 단일-세포 ATAC-seq 라이브러리를 크로뮴 단일 세포 ATAC 용액 (10X 게노믹스)을 사용하여 제조하였다. 라이브러리를 노바(Nova)-Seq S2 100 사이클 키트 (일루미나(Illumina))를 사용하여 시퀀싱하였다. (도 3A-3C)
scATAC 분석. 원 시퀀싱 데이터를 셀 레인저(Cell Ranger) ATAC 파이프라인 (10X 게노믹스)를 통해 통과시켰다. 그 후, 단편 파일을 사용하여 snapATAC 패키지 (https://doi.org/10.1101/615179)를 사용한 분석을 위한 스냅 파일을 생성하였다. 세포를 그래프-기반 클러스터링 (k=15, 24개의 주요 성분)을 사용하여 클러스터링하였다. 유전자 활성 점수를 snapATAC 패키지에 기재된 바와 같이 생성하고, 이를 사용하여 개재뉴런 중요 부류에 상응하는 클러스터를 결정하였다. 각각의 중요 부류에 대해, 빅윅(bigwig) 파일을 생성하고, 피크를 통합 게놈 브라우저 내로의 입력을 위한 macs2 및 인핸서 선택을 사용하여 콜링하였다. 중요 부류에 걸친 피크를 베드툴 자카드(Jaccard)를 사용하여 비교하였다.
인핸서 선택. 본원에서 제시된 모든 인핸서 (S5E1-E10 및 E11-E35)를 ATACseq 데이터의 공동-존재 (DNA 접근성을 위해) 및 종에 걸친 보존 (UCSC 게놈 브라우저 척추동물 보존 트랙을 사용하여)에 기반하여 선택하였다. 마우스 및 그들의 인간 오르토로그에 대한 게놈 좌표는 도 1A-1 내지 1A-3에 제시된다.
선택을 위해, 후보 조절 요소를 "콘텍스트" 영역 (SCN1A 유전자간 영역 + 인트론1)을 "ATAseq 피크 유니온" 파일 및 "파스트콘스(Phastcons) 60-웨이" 파일 둘 다로 교차시킴으로써 생성된 요소의 목록으로부터 수동으로 큐레이팅하였다 - 하기 참조. 접근성. ATAC-seq 데이터 (Mo et al., 2015, Neuron, 86:1369-1384)를 GEO 저장소 상에 다운로드하고, 디폴트 파라미터를 갖는 MACS2 랜 (https://github.com/taoliu/MACS)을 사용하여 피크로서 구분하였다. 커스텀 R 스크립트를 사용하여, 데이터세트에 걸쳐 모든 피크의 유니온을 함유하는 파일을 생성하고, 하기 기재된 바와 같이 인핸서 선택에 사용하였다. 최종 선택은 모든 피크의 유니온이라기 보다는 개별적인 세포-유형에 대한 피크의 점검에 의존하였다. 메틸화. 마우스에 대한 전체 게놈에 걸친 비-중첩하는 100kb 빈에 대한 마우스 mCH 수준 (Luo et al., 2018, Nat Commun, 9(1):3824)을 브레이놈(Brainome) 포털 (http://brainome.org)로부터 다운로드하였다. 이들 데이터를 상기 기재된 ATAC-seq 데이터세트를 사용하여 선택된 후보의 위치화를 위한 확인으로서 사용하였다. 보존. "파스콘스 60-웨이" 트랙을 UCSC 포털 (https://genome.ucsc.edu)로부터 BED 파일 형식으로 다운로드하고, 커스텀 R 스크립트를 사용하여 필터링하여 10bp 미만의 임의의 요소를 제거하고, 베트툴스 / 인터섹트(Bedtools / Interesct)를 사용하여 50bp 미만만큼 분리된 임의의 요소를 융합하였다.
rAAV 클로닝 및 바이러스 생산. 모든 바이러스 구축물을 분자 생물학에서의 표준 클로닝 방법 및 프로토콜을 사용하여 생성하였다. 플라스미드 pAAV-mDlx-GFP (애드진(Addgene)#83900; 애드진, 미국 매사추세츠주 워터타운) (Dimidschstein, J. et al., 2016, Nat. Neuroscience, 19(12):1743-1749)를 사용하여 AAV의 생산에 필요한 요소 (내부 말단 반복부, 최소 프로모터, 마멋 전사후 반응 요소)를 함유하는 표준 백본을 생성하였다.
인핸서 서열 (특이적 유형의 뉴런에 발현을 제한하는데 필요한)을 진위즈(Genewiz) (미국 매사추세츠주 캠브리지)에 의해 데 노보 합성하고, 리포터 및 이펙터를 PCR에 의해 증폭시켰다. 특히, 인핸서 서열을 하기 프라이머를 사용하여 마우스 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다: E1: caaagtggacagaggggagg (서열식별번호: 50) 및 gtgctgttgggagtggtgga (1280 bp), (서열식별번호: 51); E2: aatctaacatggctgctata (서열식별번호: 52) 및 caattgctcagagttatttt (618 bp), (서열식별번호: 53); E3: ataaaattttattttcctaa (서열식별번호: 54) 및 gaggaaatcagctacggggc (832 bp), (서열식별번호: 55); E4: tctgacagagcaagtcttga (서열식별번호: 56) 및 tatcaaaattgtatattcag (261 bp), (서열식별번호: 57); E5: aatgttttgatatttaggag (서열식별번호: 58) 및 ttgactcttaaaatttaata (663 bp), (서열식별번호: 59); E6: ttgtcactttgttactctac (서열식별번호: 60) 및 ttaaatcttaaaattttcct (606 bp), (서열식별번호: 61); E7: gatactgtataattaattag (서열식별번호: 62) 및 cttccttctggttccttttt (2430 bp), (서열식별번호: 63); E8: attgatctccaactttttaa (서열식별번호: 64) 및 gttcatccaagtaataagag (1644 bp), (서열식별번호: 65); E9: atctcaagtgtatgtaacat (서열식별번호: 66) 및 gtctttttgttttttttttt (521 bp), (서열식별번호: 67); E10: tattgcaaaaggaaggaatg (서열식별번호: 68) 및 tcatggaaaaagaaaaaatc (547 bp), (서열식별번호: 69). 인핸서, 리포터 및 이펙터를 깁슨 클로닝 어셈블리 키트(Gibson Cloning Assembly Kit) (NEB-E5510S)를 사용하여 표준 절차에 따라 클로닝하였다. 구체적으로, AAV-E1:10-d토마토에 대해, d토마토 코딩 서열을 플라스미드 애드진 # 83897로부터 증폭시키고; AAV-E2-SYP-d토마토에 대해, 시냅토피신-td토마토 코딩 서열을 플라스미드 애드진 # 34881로부터 증폭시키고; AAV-E2-GCaMP6f에 대해, GCaMP6f 코딩 서열을 플라스미드 애드진 # 83899로부터 증폭시키고; AAV-E2-C1V1-eYFP에 대해, C1V1-eYFP 코딩 서열을 플라스미드 애드진 # 35499로부터 증폭시켰다.
최종 플라스미드를 깁슨 어셈블리® 클로닝 키트 (NEB-E5510S) (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs), 미국 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 제조업자의 지시서 및 표준 프로토콜에 따라 어셈블리하였다. rAAV를 표준 생산 방법을 사용하여 생산하였다. 폴리에틸렌이민 (PEI)을 형질감염에 사용하고 (예를 들어, 문헌 [Longo, P.A. et al., 2013, Methods Enzymol., 529:227-240] 참조), 옵티프렙(OptiPrep)™ 밀도 구배 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스)를 바이러스 입자 정제 및 단리에 사용하였다. 혈청형 1을 사용하여 마우스 및 래트에서의 국소 주사를 위한 AAV를 생산하였다. 혈청형 9를 마모셋에서의 전신 주사에 사용하고, 혈청형 PHPeB를 마카크에서의 국소 주사 및 마우스에서의 전신 주사 둘 다에 사용하였다. 바이러스 역가를 모든 구축물에 공통인 WPRE 서열을 통한 프라이머 어닐링으로 qPCR에 의해 추정하였다. 생산된 모든 배치는 ml당 1010 내지 1012개의 바이러스 게놈의 범위였다. 특히, 마멋 간염 바이러스 (WHP) 전사후 조절 요소 (WPRE)는 전사되는 경우, 발현을 향상시키는 3차 구조를 생성하는 DNA 서열이다. 감마, 알파, 및 베타 성분을 갖는 3부분 조절 요소인 WPRE는 바이러스 벡터, 예를 들어, rAAV-d토마토에 의해 전달된 유전자의 발현을 증가시키기 위해 분자 생물학에서 통상적으로 사용된다. (예를 들어, 문헌 [Choi, J.-H. et al., 2014, Mol. Brain, 7:17] 참조). 생산된 모든 rAAV 배치는 ml당 1010 내지 1012개의 바이러스 게놈의 범위였다.
동물. 마우스: 암컷 C57BL/6J 마우스 (무스 무스쿨루스(Mus musculus); 10주령)를 잭슨 랩스(Jackson Labs) (미국 메인주 바 하버 - 스톡# 000664)로부터 얻었다. 래트. 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트 (성체 150-- 250 gm)를 미국 뉴욕주 킹스턴의 찰스 리버 랩스(Charles River labs)로부터 얻었다. 마모셋. 1마리의 암컷 코먼 마모셋 (칼리트릭스 자크후스(Callithrix jacchus), 6.0년령)을 매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지(Massachusetts Institute of Technology)의 콜로니로부터 얻었다. 마카크. 1마리의 수컷 마카크 (마카카 물라타(Macaca mulatta); 15.0년령)를 데이비스의 유니버시트 오브 캘리포니아(University of California)의 캘리포니아 국립 영장류 연구 센터(California National Primate Research Center)로부터 얻었다. 모든 동물을 마우스에 대해 케이지당 최대 5마리의 동물 및 래트에 대해 케이지당 1마리의 동물을 갖는 12 명/12 암 주기에서 유지하였다. 마모셋 및 마카크를 사회적으로 수용하였다. 모든 동물 유지 및 실험 절차를 브로드 인스티튜트 오브 엠아이티 앤드 하버드(Broad Institute of MIT and Harvard)의 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee) (마우스), 엠아이티의 맥거번 리서치 인스티튜트(McGovern research institute) (래트 및 마모셋) 및 소크 인스티튜트 포 바이올로지컬 스터디즈(Salk Institute for Biological studies) (마카크)에 의해 확립되고, 미국 국립 보건원의 표준을 지킨 지침에 따라 수행하였다.
국소 및 전신 바이러스 주사. 마우스 국소 S1. 성체 마우스에서의 국소 주사를 하기 좌표로 체성감각 피질에서 정위적으로 가이드된 주사에 의해 수행하였다: 150nL의 바이러스로 브레그마에 대해 1.0 mm 후방, 2.9 mm 측방, 0.7/0.45 mm 복측. 마우스 전신. 성체 마우스에서의 전신 주사를 위해, 대략 1011개의 바이러스 입자를 동물당 안구뒤 굴에서 주사하였다. 수술후 모니터링을 주사 후 5일 동안 수행하였다. V1에서의 래트 국소. 성체 래트에서의 국소 주사를 하기 좌표로 1차 시각 피질에서 정위적으로 가이드된 주사에 의해 수행하였다: 670 nL의 바이러스로 브레그마에 대해 5.4 mm 후방, 4.2 mm 측방, 2.0 mm 복측. 마모셋 전신 주사. 성체 마모셋에서의 전신 주사를 위해, ~ 0.7 ml의 멸균 PBS 중 대략 1012개의 바이러스 입자를 복재 정맥 내로 주사하고, 이어서 ~ 0.5 ml의 염수로 또 다른 주입을 하였다. 최종 주입 후, 항상성을 보장하기 위해 압력을 주사 부위에 적용하였다. 동물을 그의 홈 케이지로 복귀시키고, 마취 후 정상 거동에 대해 면밀하게 모니터링하였다. 동물을 바이러스 주사 후 51일에 안락사시켰다. V1에서의 마카크 국소. 성체 마카크에서의 국소 주사를 하기 좌표로 좌측 1차 시각 피질에서 정위적으로 가이드된 주사에 의해 수행하였다: 양귀간 선의 중심에 대해 13 mm 후방, 19 mm 측방, 23 mm 상방 (동물의 MRI에 기반하여). 총 333 nL의 부피를 4개의 깊이 (즉, 피질 표면으로부터 1.8, 1.3, 0.8 및 0.3 mm)에서 주사하였다.
수술. 정위적으로 가이드된 바이러스 주사를 위해, 동물을 이소플루란 (산소 중 1-3%) 하에서 마취시키고, 온도-제어된 가열 패드 상의 정위적 헤드 프레임에 정치하였다. 개두술 및 경막침습술을 관심의 뇌 영역 위에서 수행하였다. 동물을 50-500 nl의 지시된 바이러스 (rAAV)로 10-25 nl/분의 속도로 샤프한 유리 피펫 (25-35 mm의 직경)을 사용하여 주사하고, 이를 역류를 최소화하기 위해 주사 후 5-15분 동안 제자리에 두었다. 개두술 부위를 멸균 뼈 왁스로 덮고, 외과적 개방부를 베트본드(Vetbond)로 닫고, 동물을 적어도 1주 동안 그들의 홈 케이지로 복귀시켰다. 주사 부위는 하기 좌표에 의해 정의되었다: 체성감각 피질 S1: 브레그마에 대해 1.0 mm 후방, 3.0 mm 측방, 0.7 / 0.4 mm 복측; 해마 CA1: 브레그마에 대해 1.6 mm 후방, 1.8 mm 측방, 1.2 mm 복측; 선조체: 브레그마에 대해 0.5 mm 후방, 2.0 mm 측방, 3.2 mm 복측.
안구뒤 정맥 주사를 위해, 동물을 이소플루란 (산소 중 1-3%) 하에서 마취시키고, 온도-제어된 가열 패드 상에 정치하였다. 정맥내 (IV) 주사를 안구뒤 얼기에서 수행하였다. 보다 구체적으로, 동물 (마우스)을 비-재호흡 장치 (서지베트(Surgivet), 미국 오하이오주 더블린)에 연결된 깔때기-형상 노즈 콘에 정치하고, 바늘을 비스듬한 면을 아래로, 내안각에서, 안구뒤 굴 내로 주사하였다. 복제-결함성 rAAV 벡터를 함유하는 최대 150 μL의 상청액을 꼬리 정맥 또는 안구뒤 얼기 내로 주사하였다. 주사 후, 항상성을 보장하기 위해 눈을 최소 30초 동안 감긴 채로 유지하였다.
마우스에서의 전기생리학적 기록:
2 내지 6주령 마우스에 대한 슬라이스 제조. 바이러스 주사된 마우스를 이소플루란으로 마취시켰다. 반사의 소실 시, 마우스를 하기 (mM로)를 함유하는 빙냉 산소화된 ACSF로 경심적으로 관류하였다: 87 NaCl, 75 수크로스, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 글루코스, 1 CaCl2 및 2 MgCl2. 그 후, 마우스를 참수시키고, 300-μm 두께 두정 슬라이스를 라이카(Leica) VT-1200-S 비브라톰을 사용하여 섹션화하고, 홀딩 챔버에서 32-35℃에서 15-30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 실온 20-23.5℃ (68-74℉)에서 적어도 45-60분 동안 계속 인큐베이션한 후, 생리학적 기록을 행하였다. 주사 부위를 함유하는 슬라이스를 하기 (mM로)를 함유하는 산소화된 ACSF로 침지된 기록 챔버에서 옮겼다: 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 글루코스, 2 CaCl2 및 1 MgCl2 (pH = 7.4, 95% O2 및 5% CO2로 버블링됨). 6주령 및 그 초과의 마우스에 대한 슬라이스 제조. 급성 두정 뇌 슬라이스를 하기와 같이 제조하였다: 마우스를 아베르틴(Avertin) 용액 (20 mg/ml, 0.5 mg/g 체중)으로 마취시키고, 하기를 함유하는 15 내지 20 ml의 빙냉 탄소화된 (95% O2, 5% CO2) 커팅 용액으로 경심적으로 관류시켰다: 194 mM 수크로스, 30 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 0.2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 및 10 mM D-(+)-글루코스 (340-350 mOsm의 오스몰농도로). 그 후, 뇌를 급속하게 제거하고, 슬라이스 제조를 위해 빙냉 커팅 용액에 정치하였다. 두정 슬라이스 (300 μm)를 제조하고, 그 후 32℃에서 탄소화된 인공 뇌척수액 (aCSF)과 함께 10 내지 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 슬라이스를 실온에서 적어도 1시간 동안 하기를 함유한 CSF에서 인큐베이션하였다: 실온에서 적어도 1시간 동안 119 mM NaCl, 2.3 mM KCl, 1.0 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 11 mM 글루코스, 1.3 mM MgSO4, 및 2.5 mM CaCl2 (pH 7.4, 295-305 mOsm의 오스몰농도로). 전류 클램프. 개재뉴런 기록을 위해, 10 μM CNQX, 25 μM AP-5 및 10 μM SR-95531을 첨가하여 각각 AMPA, NMDA 및 GABAA 수용체를 차단하여 광유전적 및 화학유전적 자극의 세포-내재적 효과를 측정하였다. 전체-세포 전류-클램프 기록을 하기 (mM로)를 함유하는 보로실리케이트 피펫 (3-5 MΩ)을 사용하여 바이러스 리포터를 발현하는 가시적으로-확인된 세포로부터 얻었다: 130 K-글루코네이트, 6.3 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 0.3 Na-GTP 및 0.3% 비오시틴 (KOH로 7.3으로 pH 조정됨). 개입 시, 직렬 저항 (전형적으로 15-25 MΩ)이 보상되고, 단지 안정한 기록 (<20% 변화)이 포함되었다. 데이터를 멀티클램프(MultiClamp) 700B 증폭기 (몰리큘라 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 획득하고, 20 kHz에서 샘플링하고, 10 kHz에서 필터링하였다. 모든 세포를 DC 전류로 -60 mV에서 유지하고, 전류-단계 프로토콜을 적용하여 발화 패턴을 얻고, 기본 역치아래 및 역치위 전기생리학적 특성을 추출하였다. 전압 클램프. 바이러스 리포터를 발현하지 않는 세포를 IR-DIC 가시화 하에서 그들의 피라미드형-세포-형상 소마에 따라 선택하고, 하기 (mM로)를 함유하는 피펫으로 기록하였다: 130 Cs-글루코네이트, 0.5 EGTA, 7 KCl, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 0.3 Na-GTP, 5 포스포크레아틴, 5 QX-314 및 0.3% 비오시틴 (CsOH로 7.3으로 pH 조정됨). 세포를 기준선 및 광유전적 또는 화학유전적 자극을 위해 0 mV에서 계속적으로 유지하였다. 전류 및 전압 클램프 기록 둘 다를 위해, 적어도 2분의 기준선을 자극 전에 기록하였다. 작은 펄스 (-20 pA 또는 -5 mV, 0.2 Hz 또는 0.5 Hz에서 100 ms)를 기준선 및 CNO 적용 전반에 걸쳐 인가하여 직렬 저항 변화를 모니터링하였다. 데이터를 클램프핏(Clampfit) 10.2 소프트웨어 (몰리큘라 디바이시즈)를 사용하여 오프라인에서 분석하였다.
생체내 칼슘 화상화. 대략 100 nL의 AAV-E2-GCaMP6 바이러스를 출생후 제10일에 동물의 통모양 피질 내로 주사하였다. P27-P34에서, 개두술을 주사 부위 위로 삽입하고, 광시야 칼슘 화상화를 개두술 절차로부터의 회복 후에 수행하였다. 간략하게, 특정 간격 (5-20s)에서의 공기 퍼프 (100-200ms 지속기간, 피코스피리처(Picospritzer) III)를 반대측 휘스커에 지향시키면서, 마취된 (1.5% 이소플루란) 마우스를 4x 배율로 3-4Hz에서 화상화하였다 (토르랩스(Thorlabs) CCD 카메라 - 1501M-USB, 토르랩스 LED 자극 - DC4104). 다수의 기록을 수행하고, 그 후, 마우스를 조직학적 분석을 위해 관류시켰다. 기록을 이미지J(ImageJ)에서 각각의 기록에 대한 F/F (형광의 변화/평균 형광)를 계산함으로써 분석하고, 휘스커 자극을 동기화하였다. (5%) F/F의 역치를 자극된 및 자발적 칼슘 신호 반응 둘 다에 대해 설정하였다.
인간에서의 전기생리학적 기록.
조직 제조, 배양 프로토콜 및 바이러스의 접종. 4명의 참가자 (2명의 남성/2명의 여성; 연령 범위 22-57세)는 뇌 조직 (측두엽 및 해마)이 약물 저항성 간질의 치료를 위해 절제된 외과적 절차를 겪었다. 모든 경우, 각각의 참가자는 발작 발병의 위치를 확인하기 위한 두개내 모니터링을 위해 경막하 및/또는 깊이 전극의 정치를 위한 초기 수술을 이전에 겪었다. NINDS 기관 감사 위원회(Institutional Review Board) (IRB)는 연구 프로토콜을 승인하였으며 (ClinicalTrials.gov 식별자 NCT01273129), 절제된 조직의 실험적 사용을 위해 참가자로부터 사전 동의가 얻어졌다. 해마 및 측두엽 둘 다로부터의 300 um 슬라이스를 신경외과적 절제 후 30분 내에 빙냉 산소화된 수크로스 기반 커팅 용액 (100mM 수크로스, 80mM NaCl, 3.5mM KCl, 24mM NaHCO3, 1.25mM NaH2PO4, 4.5mM MgCl2, 0.5mM CaCl2, 및 10mM 글루코스, 95% O2 및 5% CO2로 포화됨)에서 얻었다 (라이카 1200S 비브라톰; 라이카 마이크로시스템스(Leica Microsystems), 미국 일리노이주 반녹번). 그 후, 슬라이스를 수크로스 커팅 용액에서 33℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 15-30분 동안 실온으로 냉각시켰다. 슬라이스를 배양 배지에 옮기고 (Eugene et al., 2014), 35℃에서 평형의 15분 동안 인큐베이터 (5% CO2)에 정치하였다. 그 후, 각각의 개별적인 슬라이스를 계면 배양을 위해 30 mm 밀리셀 세포 배양 삽입물(Millicell Cell Culture Insert) (밀리포어(Millipore); 카탈로그 번호 PICM0RG50) 상으로 옮기고, 상기와 같이 인큐베이션하였다. 12시간 후, 배양 배지를 교환하고, pAAV_S5E2_C1V1-eYFP를 갖는 또는 갖지 않는 1-2 μl의 pAAV_S5E2-d토마토를 각각의 슬라이스 상으로 직접적으로 피펫팅하고, 인큐베이터 내로 다시 정치하였다. 해마 슬라이스에 대해, 바이러스를 구상회 부분체에 표적화하였다. 배양 배지를 전기생리학적 분석까지 2-3일마다 통상적으로 교환하였다. 전기생리학적 기록. 배양된 인간 슬라이스로부터의 전기생리학적 기록을 바이러스 접종 후 7 내지 14일에 수행하였다. 배양된 인간 슬라이스를 33℃에서 3 - 4 ml/min의 속도로 세포외 용액 (95% O2/5% CO2로 포화된 130 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 24 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4-H2O, 10 mM 글루코스, 2.5 mM CaCl2 및 1.5 mM MgCl2 (pH 7.4; 300-310 mOsm)으로 관류된 기록 챔버에 옮겼다. pAAV_S5E2-d토마토 또는 pAAV_S5E2_C1V1-eYFP 감염된 뉴런으로부터의 전체 세포 패치 클램프 기록을 하기 조성의 세포내 용액으로 수행하였다: 130 mM K-글루코네이트, 10 mM HEPES, 0.6 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 2 mM Na2ATP, 0.3 mM NaGTP 및 0.5% 비오시틴 (7.4로 pH 조정됨; 285-300 mOsm으로 오스몰농도 조정됨). 일부 기록에서, 130mM K-글루코네이트를 90 mM K-글루코네이트/40 KCl에 의해 대체하였다. 내재적 막 및 발화 특성을 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 검정하였다 (Tricoire, L. et al., 2011, J. Neurosci, 31(30):10948-70). C1V1의 550nm 광 자극된 광유전적 활성화를 CoolLED pE-4000 조명 시스템 (앤도버(Andover), 영국)을 사용하여 40X 수침 대물렌즈를 통해 슬라이스에 전달하였다. 비오시틴 재구축 및 면역세포화학. 전기생리학적 기록 후, 슬라이스를 0.1M PB 중 4% 파라포름알데히드에서 밤새 드롭-고정시켰다. 슬라이스를 0.1M PB에서 세척하고 (3 X 15분), 실온에서 적어도 2시간 동안 0.1M PB 중 0.5% 트리톤(Triton) X-100/10% 염소 혈청에서 투과화/차단하였다. 조합된 비오시틴 회수 및 면역세포화학을 위해, 1:1000으로 희석된 1차 항체에서의 초기 인큐베이션 (40시간 동안 4℃)을 수행하였다 (토끼 항-PV, 앱캠(Abcam) 카탈로그 번호: ab11427; 기니아-피그 항-RFP, SYSY, 카탈로그 번호: 390005). 슬라이스를 0.1M PB에서 실온에서 4 x 30분 세척하고, 4℃에서 밤새 2차 항체 (염소 항 기니아-피그 알렉사-플루오르 555에 대해 1:1000, 써모피셔(Thermofisher) 카탈로그 번호 A21435; 염소 항-토끼 알렉사-플루오르 647에 대해 1:500, 써모피셔 카탈로그 번호 A32733 및 1:1000 스트렙타비딘 알렉사 플루오르TM 488; 써모피셔 S1123)에서 인큐베이션하였다. 최종 세척 절차 (4 x 30분) 후, 슬라이스를 후속 공초점 현미경검사 분석을 위해 프롤롱 골드(Prolong Gold) 안티페이드 (써모피셔; 카탈로그 번호 P36930)를 갖는 현미경 슬라이드 상에 실장하였다.
면역조직화학 (IHC). 바이러스로 주사된 동물을 유타솔(Euthasol) (버박(Virbac), 미국)로 안락사시키고, 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 경심적으로 관류시켰다. 뇌를 4% PFA에 밤새 정치하고, 그 후 라이카 VTS1000 비브로섹터를 사용하여 50-60 μm (특히, 50 μm)에서 섹션화하였다. 부유하는 뇌 섹션을 0.1% 트리톤 X-100 및 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 30분 동안 투과화하고, PBS로 3회 세척하고, 차단 완충액 (PBS 중 5% 정상 당나귀 혈청)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 섹션을 4℃에서 하기 1차 항체의 지시된 조합과 함께 차단 완충액에서 밤새 인큐베이션하였다: 1:1,000에서 닭 항-GFP (앱캠 USA ab13970); 1:1000에서 토끼 항-DsRed (클론테크(Clontech) USA 632496); 1:1,000에서 염소 항-PV (스완트(Swant) USA, PVG-213); 1:1,000에서 기니아-피그 항-PV (스완트 USA, GP-72); 1:2000에서 토끼 항-SST (페닌슐라(Peninsula) USA, T-4103.0050); 1:250에서 마우스 항-시냅토타그민-2 (ZFIN USA, #ZDB-ATB-081002-25). 그 후, 섹션을 PBS로 3회 세척하고, 1:1000에서 알렉사 플루오르-접합된 2차 항체 (인비트로젠(Invitrogen), USA)와 함께 인큐베이션하고, DAPI (시그마(Sigma), USA)로 반대염색하고, 플루오로마운트(Fluoromount)-G (시그마, USA)를 사용하여 유리 슬라이드 상에 실장하였다. 뇌 영역의 화상을 자이스(Zeiss) LSM800 공초점 현미경 또는 자이스 액시오이미저(Axioimager) A1 에피형광 현미경을 사용하여 획득하였다. 인간 뇌 조직 내의 PV IHC의 염색은 고도로 가변적이었으며; 따라서, 바이러스 특이성의 추정을 염색 밀도가 이들 세포의 공지된 분포 및 밀도를 반영한 피질 및 구상회의 영역 내에서 수행하였다. 인간 뇌 조직에 대한 가변성의 관점에서, 정확한 정량화는 이 방법에 의해 얻어지지 않았다.
계내 혼성화. 본원에 기재된 연구에 사용된 계내 혼성화 프로브 (Gad1; 제품 #400951, Pvalb; 제품 #421931, VIP; 제품 #415961)는 어드밴스드 셀 디아그노스틱스(Advanced Cell Diagnostics) (미국 캘리포니아주 뉴어크)에 의해 디자인되었다. RNA스코프® 멀티플렉스 형광 시약 키트 v2 (제품 # 323100) 중의 시약, RNA스코프® 프로브 희석제 (제품 #300041), HYBEZ™ 오븐 (제품 #321710/321720), 습도 제어 트레이 (제품 # 310012), 및 HYBEZ 가습지 (제품 #310025)는 또한 어드밴스드 셀 디아그노스틱스로부터의 것이었다. 퍼킨엘머(PerkinElmer)로부터의 TSA 플러스 플루오레세인, TSA 플러스 시아닌 3, 및 TSA 플러스 시아닌 5 (#NEL741, #NEL744, 및 #NEL745). 뇌 조직을 상기 면역조직화학 섹션에 언급된 바와 같이 프로세싱하였다. 뇌 섹션을 PBS에서 1회 세척하고, 이어서 0.1% 트리톤 X-100 및 PBS에서 3회 세척하고, 슈퍼프로스트 플러스(Superfrost Plus) 유리 슬라이드 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 12-550-15) 상에 실장하고, 60℃에서 HYBEZ 오븐에서 25분 동안 베이킹하였다. 그 후, 슬라이드를 4% PFA에 30분 동안 침지한 후, H2O에서 3회 세척하였다. RNA스코프 H2O2를 실온에서 5분 동안 각각의 섹션에 적용하였다. 그 후, 슬라이드를 H2O에서 3회 세척한 후, 미리-가온된 90℃ H2O에 15초 동안, 이어서 미리-가온된 90℃ RNA스코프 타겟 리트리벌(Target Retrieval)에 15분 동안 침지하였다. 슬라이드를 H2O에서 3회 세척한 후, RNA스코프 프로테아제 III을 각각의 섹션 상으로 적용하고, 그 후 HYBEZ 오븐에서 40℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 H2O에서 3회 세척하고, 그 후 프로브 희석제로 1:50으로 희석된 프로브 용액과 함께 HYBEZ 오븐에서 40℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 섹션을 RNA스코프 세척 완충액에서 3회 세척하고, 이어서 형광 증폭시켰다. 주목할 만하게, 리포터의 RNA에 대한 프로브는 바이러스 DNA에 기인하였을 가능성이 있는 비-특이적 염색을 밝혀내었다. 바이러스 리포터를 밝혀내기 위해, RNA스코프 프로토콜을 d토마토의 IHC 증폭으로 수행하였다. 섹션을 차단 용액 (PBS 중 0.3% 트리톤 X-100 플러스 5% 정상 말 혈청)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 섹션을 1:250에서의 토끼 항-DsRed (클론테크 USA 632496)와 함께 항체 용액 (PBS 중 0.1% 트리톤 X-100 플러스 5% 정상 말 혈청)에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 섹션을 PBS로 3회 세척하고, 1:500에서의 알렉사 플루오르-접합된 2차 항체 (인비트로젠, USA)와 함께 인큐베이션하고, DAPI (시그마, USA)로 반대염색하고, 플루오로마운트-G (시그마, USA)를 사용하여 유리 슬라이드 상에 실장하였다.
정량화 및 통계. 발현의 강도를 위해, 형광 화상을 표준화된 배율 및 노출 시간에서 취하였다. 바이러스 리포터를 발현하는 각각의 세포의 세포체의 평균 화소 강도를 기록하고, 인핸서당 모든 세포에 비한 평균으로서 보고하였다. 공동-국재화의 정량화를 위해, 지시된 리포터를 발현하는 세포를 단지 상응하는 컬러 채널을 사용하여 카운팅하고, 그 후, 이들 세포 중에서, 관심의 마커를 공동-발현하는 세포의 수를 카운팅하였다. 세포는 상응하는 신호가 배경 형광 초과인 경우, 주어진 마커에 대해 양성인 것으로 간주되었다. 그 후, 단지 리포터만을 발현하는 세포의 총 수에 비해 둘 다의 마커를 공동-발현하는 세포의 비를 계산하고, 본원에서 평균 ± s.e.m (예를 들어, 본원의 도면에서 막대 플롯으로서 나타내어짐)으로서 보고하였다. 정량화를 최소 2회의 독립적인 생물학적 반복실험을 사용하여 수행하였다 (세포의 구체적인 수, 동물 및 조건은 도 11에 제시된 표에서 각각의 개별적인 정령화에 대해 지시되고/거나, 도면 범례에 기재됨). 동일한 동물로부터의 몇몇 섹션을 지시된 경우 사용하였다. 데이터 수집 및 분석은 실험의 조건에 맹검으로 수행되지 않았지만, 상이한 연구 그룹으로부터의 실험자는 정량화를 수행하였다. 통계적 방법은 샘플 크기를 미리 결정하는데 사용되지 않았지만, 기재된 샘플 크기는 이전의 간행물에서 보고된 것들과 유사하였다.
실시예 9 - 마우스로부터 인간까지 기능적으로 별개의 뉴런의 바이러스 조작
특이적 뉴런 세포 집단 및 하위유형을 표적화하고 조작함으로써 뉴런 및 신경정신 질환을 이해하고 치료하기 위한 방법 및 접근법이 본원에 기재된다. 비-인간 영장류 및 인간에서의 이들 세포 집단에 대한 접근을 얻는 것은 중요하게 되었다. AAV는 신경계에서 유전자 전달에 유용할 수 있지만, 이들은 제한된 게놈 탑재량을 가지며, 특정 뉴런 집단에 대해 내재적으로 선택적이지 않다. 폭넓은 뉴런 부류에 바이러스 발현을 제한할 수 있는 조절 요소의 확인이 본원에 기재된다. 본원에 기재된 바와 같은 인핸서의 선택에 초점을 맞추기 위해, 별개의 뉴런 집단에서 발현되고, 그의 붕괴가 중증 간질과 연관된 유전자인 SCN1A의 조절 경관을 구체적으로 조사하였다.
종에 걸친 서열 보존을 갖는 단일-세포 ATAC-seq 데이터를 조합하여, 10가지 후보 조절 서열을 SCN1A 유전자의 부근에서 확인하였다. 이들 요소의 각각을 바이러스 발현을 지정하는 그의 능력에 대해 조사함으로써, SCN1A를 발현하는 뉴런 집단의 폭을 집합적으로 표적화한 3가지 인핸서 (E2, E5, E6)를 확인하였다. 이들 중에서, 특정 짧은 조절 서열 (본원에서 E2)은 바이러스 발현을 파르브알부민-발현 피질 개재뉴런 (PV cIN)에 제한할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 리포터 발현 너머 이 요소의 유용성을 충분히 평가하기 위해, 인핸서 요소를 생체외에서 및 생체내에서 둘 다의 시냅스 태그부착, 칼슘 화상화, 뿐만 아니라 광- 및 화학-유전적 접근법을 포함하여 다양한 맥락에서 입증하였다. 더욱이, 이 인핸서 요소는 발달 동안 및 설치류, 비-인간 영장류 및 인간을 포함하여 종에 걸쳐 둘 다 PV cIN의 선택적 표적화를 허용하였다. 이 접근법이 인핸서 발견을 위한 일반화가능한 전략을 제공하였음을 입증하여, 25가지 추가적인 조절 요소를 PV IN이 풍부화된 7가지 유전자의 부근에서 선택하였다 (도 15A-1, 15A-2, 16A-1 및 16A-2). 이들로부터, 추가적인 4가지 PV-특이적 조절 요소 (E11, E14, E22 및 E29)를 확인하였으며, 이들의 각각은 특이적 뇌 영역 내에서 현저하게 선택적인 발현을 가졌다. 함께, 동물 모델에 걸쳐 이용될 수 있는 다양한 기능적으로-시험된 도구의 유용성이 입증되었다. 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 인핸서 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 1종 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 전달 벡터를 포함하는 이러한 "바이러스 시약"은 어떻게 기능적으로 별개의 뉴런 세포-유형이 비-인간 영장류에서 신경학적, 신경발달성 및 신경변성 질환의 맥락에서 영향을 받는지를 조사하기 위해 채용될 수 있다. 궁극적으로, 인핸서-함유 바이러스 벡터는 특이적 뉴런 세포 집단에서 병리학적 뉴런 활성 또는 유전자 발현을 치료적으로 정상화하는 작용제로서 기능할 수 있다.
본원에서 확인되고 기재된 인핸서는 특정 임상적 관련성으로 뉴런 집단에 대한 접근을 제공한다. 이들 인핸서는 예를 들어, 유전자 요법의 사용에 의해 또는 뉴런 활성의 조정에 의해, 드라베 증후군의 약화시키는 측면을 경감시키는데 활용될 수 있다. 상기 실시예에 기재된 바와 같이, 국소 및 전신 주사는 뇌에의 효과적인 바이러스 벡터 전달에 이용되었다. 국소 주사로, 신경학적 상태 및 병리증상, 예컨대 초점성 간질, 전두전엽 피질 기능이상 또는 해마 기억 장애는 치료되거나 개선될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 벡터의 전신 도입은 예를 들어, 전신성 발작을 교정하기 위해, 또는 정신 및 신경변성 장애를 위해 전반적 개입이 필요한 맥락에서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조절 요소는 치료 맥락을 위해 특이적 세포 유형에 특이적으로 접근하는 것을 제공한다.
사실, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서 선택을 위한 방법 및 접근법은 그것이 다른 유전자에 일반화가능하기 때문에 유리하다. 제한적인 것을 의도하지는 않지만, 7가지 대표적인 인핸서 (예를 들어, 본원에서 E1, E5, E6, E11, E14, E22, E29)의 하위세트가 확인되었으며, 별개의 뉴런 집단 및 중추 신경계의 영역 둘 다에 대해 고유한 특이성을 갖는 것으로 입증되었다. 심지어 엄격한 기준 (표적 집단에 대해 >90% 선택성)의 적용으로, 기재된 인핸서 선택 방법은 높은 (>20%) 성공률을 갖는다. 더욱이, 높은 정도의 서열 보존에 의해 예측되는 바와 같이, 인핸서의 대표적인 하위세트는 인간을 포함하여 종에 걸쳐 동등하게 선택적이고 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, 기재된 방법은 종에 걸쳐 기능적인 세포-유형 특이적 인핸서를 체계적으로 확인하는 신뢰성 있는 수단을 제공한다.
다른 실시양태
상기 설명으로부터, 본원에 기재된 실시양태에 대해 그들을 다양한 용법 및 조건으로 채택하기 위해 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 실시양태는 또한 하기 청구범위의 범위 내에 있다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 요소의 목록의 나열은 열거된 요소의 임의의 단일 요소 또는 조합 (또는 하위조합)으로서 그 변수의 정의를 포함한다. 본원에서 실시양태의 나열은 임의의 단일 실시양태로서 또는 예컨대 본원에서 하나 이상의 섹션에 기재된 임의의 다른 실시양태 또는 그의 부분과 조합으로 그 실시양태를 포함한다. 본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 각각의 독립적인 특허 및 간행물이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 지시된 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE BROAD INSTITUTE, INC. PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE NEW YORK UNIVERSITY <120> INTERNEURON-SPECIFIC THERAPEUTICS FOR NORMALIZING NEURONAL CELL EXCITABILITY AND TREATING DRAVET SYNDROME <130> 167741.019503/PCT <140> PCT/US2020/015183 <141> 2020-01-27 <150> 62/916,477 <151> 2019-10-17 <150> 62/823,281 <151> 2019-03-25 <150> 62/801,483 <151> 2019-02-05 <160> 69 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2009 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Gln Thr Val Leu Val Pro Pro Gly Pro Asp Ser Phe Asn Phe 1 5 10 15 Phe Thr Arg Glu Ser Leu Ala Ala Ile Glu Arg Arg Ile Ala Glu Glu 20 25 30 Lys Ala Lys Asn Pro Lys Pro Asp Lys Lys Asp Asp Asp Glu Asn Gly 35 40 45 Pro Lys Pro Asn Ser Asp Leu Glu Ala Gly Lys Asn Leu Pro Phe Ile 50 55 60 Tyr Gly Asp Ile Pro Pro Glu Met Val Ser Glu Pro Leu Glu Asp Leu 65 70 75 80 Asp Pro Tyr Tyr Ile Asn Lys Lys Thr Phe Ile Val Leu Asn Lys Gly 85 90 95 Lys Ala Ile Phe Arg Phe Ser Ala Thr Ser Ala Leu Tyr Ile Leu Thr 100 105 110 Pro Phe Asn Pro Leu Arg Lys Ile Ala Ile Lys Ile 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Ala Leu Leu Cys 325 330 335 Gly Asn Ser Ser Asp Ala Gly Gln Cys Pro Glu Gly Tyr Met Cys Val 340 345 350 Lys Ala Gly Arg Asn Pro Asn Tyr Gly Tyr Thr Ser Phe Asp Thr Phe 355 360 365 Ser Trp Ala Phe Leu Ser Leu Phe Arg Leu Met Thr Gln Asp Phe Trp 370 375 380 Glu Asn Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Arg Ala Ala Gly Lys Thr Tyr Met 385 390 395 400 Ile Phe Phe Val Leu Val Ile Phe Leu Gly Ser Phe Tyr Leu Ile Asn 405 410 415 Leu Ile Leu Ala Val Val Ala Met Ala Tyr Glu Glu Gln Asn Gln Ala 420 425 430 Thr Leu Glu Glu Ala Glu Gln Lys Glu Ala Glu Phe Gln Gln Met Ile 435 440 445 Glu Gln Leu Lys Lys Gln Gln Glu Ala Ala Gln Gln Ala Ala Thr Ala 450 455 460 Thr Ala Ser Glu His Ser Arg Glu Pro Ser Ala Ala Gly Arg Leu Ser 465 470 475 480 Asp Ser Ser Ser Glu Ala Ser Lys Leu Ser Ser Lys Ser Ala Lys Glu 485 490 495 Arg Arg Asn Arg Arg Lys Lys Arg Lys Gln Lys Glu Gln Ser Gly Gly 500 505 510 Glu Glu Lys Asp Glu Asp Glu Phe Gln Lys Ser Glu Ser Glu Asp Ser 515 520 525 Ile Arg Arg Lys Gly Phe Arg Phe Ser Ile Glu Gly Asn 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ataaacattg actttttccc catgccaata 1740 ggttatgtaa ggacagtctt 1760 <210> 16 <211> 850 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 agtgtgggcc tcccagggct gtttagctag caatgagaga ggcactgcct atatccaagt 60 tgtatatggc aggttttgca caaagtggat tactcgaaga gaaagcctaa tggccagtct 120 attcatcttc ccctttctcg atgttcatct tttctctccc agctctcctt tattctcaat 180 tttctttttt tttttttttt tgctcagcct ccatctcact tccgttgctg tcctctcccc 240 accccttccc actctggact gtgcctctcc tttgtagaca cttcaagtcc attctatttc 300 attcaaaaac catggtctag aagtaactta atgtaaaccc acaaagatgg agacagaatg 360 aatgccattc ttcttgctgc tctctcagac aatgcaggtc atttttgcct atggtgctgg 420 taaagccagg agttatgtag ctataagtag cagccagagg aaatagtgcc tgagtcagca 480 attgtctttt tattgctgtg gggcaataat gggagaaaaa atcaggcttg gtacaattcc 540 ctttgaagga aaaagatgcc aacactagca ttttaacaca aaatgctggt tgggggttgg 600 gaggaaggat gcttacattc cttctttgga aatatctact ttgataacca ttttggtaaa 660 ataatgcagt gttttcagtg tgcaaatcct ttcaggactc atggttgtat ggcagacgca 720 cctgacagca ataatttaag ggtaccctga 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ttaaactggg catacaaact gaatgagaaa gagtttgcct ccacagagct gagcgtccta 120 gagagatgtg cccagatgtt gcaatcataa tgcaatgaga aatgtaatgt tggtacaggc 180 tactatgtaa gcacaggaaa gaggtgcata acttgtctgt tagagtcagg aaaggctttt 240 ctcaaatggc tgaactgaat tctgtgggat gacaaagagt gctcaatagc atgaagcaga 300 agaaggaaag gcatgctagg attgcatagg taagagtaag cggccgtgac attgccaagt 360 ggcggcacag tgtagcaatt aagagcacac actgaggccg ggt 403 <210> 47 <211> 1572 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 ataaaatatc aggtaaatat aatctctcat ctctcatctt ctctccatct ccctatgtcc 60 ctttccttct ctctctctct ctctctctca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 120 cacacacaca cagagagaga gacacacatg ttcttcctct aaaaagaaaa accaataatc 180 ctctactgag acagttgtga atcaaaggtt tcttctgcag gagttacatc catctctgaa 240 tttcctagag agcagcaaag ggccttgtgt tttattcccc ttccacactt aatcactgga 300 ctgtgggccc agactgaatg agtagctcat tagaatcact gagttcactg aggggatgag 360 agattccttc ctggctgggt gctaagtgat actcccataa ggattttgtg gttacaaaac 420 gtgctggata tggaggtaac ctgtctggga gtcctgtcac tccaaggatc acttggaatg 480 ctctggaaaa acacatgacc tggctgaatg agttctgttg aattgtttag cctacacctt 540 catttcagca gcttatactg cattaatgag gttattgttc ctttgccgtc caattgttcc 600 caagctgatt ttttgcatat atgttttaca tccttaacaa gaatgcctgt ctcctgctgt 660 ttcagagtct cttccacagt gctgagcatg agtggagctt gctaaatcat tgctaaatga 720 agcaatgggc tgtaagcatg tcctgtggga tctgcatctt cagatcatcc tgaagtactc 780 aacaaccaca tcttcttcca ggaacagagc ccaacataaa ctggtagggt ttgctgtctt 840 agacagctaa gagaacgagg agtggagcta gtgaacaagc agtgaagggg gcagttcctt 900 aatgccatcc gaactgaatt tcaacagtct gacaagctag cgttttgggt aaatatccca 960 gtatacttgt cacagagtta agtaaaatgg acttccttca aaggaagtgc ttttaataca 1020 ataactgttt ttgttttttt aaccaatgga ttaaaaattt aacacattta ctaaatctgg 1080 catatttata tattgtatct aaacagatat tcaagctgca ttataatata atcataaaaa 1140 aactgatctc agtctgtctg ttaagccttt gtgagtcttt gtgccattgt tggagtagtg 1200 ctaattatca agcaaagaca tgataattac gcagagcttt tttgctaaaa gaaggaatct 1260 ttttcaacac ccacgcactg cacaatttcc tatgaccctg tagcactact ctggtatggc 1320 ccagaaattt gtatttctgt gtaaaggctg gaaattatat tatttctatc tctcccgata 1380 ccttttcttc ttgtgagtaa actgttttta gagggttaag gaagaggggt aatggtccaa 1440 atgggaaata taaaactaat gacccttcat gaaacatatt atgctcctca ttaaacttat 1500 tcagttaaat gtattccatt aaattaaaat aaataggatt taaaatttta cccaggagca 1560 gtaaacaatc tt 1572 <210> 48 <211> 219 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 tgctgaacca gtctccgctg catcgtctcc gctcgcgctc gggacctgca acagaaggga 60 atgggacccg agtgtcagtc tggactctcc atctccccgc actactccgc tccccctttt 120 tagcccgctc tcaaaaagcc tcttcaacat caagggcatc tcccaagttg aaaagaaaaa 180 aaatttctct ggagcctctc agcacttact tatttagca 219 <210> 49 <211> 668 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 caagctgatg ggatcctccc atgggaaaag tgggcctcac acccttcctc acccttccct 60 acttcctggg caatgttctg cttcccccaa actgaagcag gaggcccaga gaggaggcgg 120 tttcctggga ggaacccaaa ccaatgtgag atgagaaggt ctttaggaaa tgggggtctc 180 tgagaaccgg ttcttaaagg tcaagcactt gagcacctcg caaactcctg acaattgaaa 240 catatctgaa gagtcttctt cagatatgtc 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 caattgctca gagttatttt 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 ataaaatttt attttcctaa 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 gaggaaatca gctacggggc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 tctgacagag caagtcttga 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 tatcaaaatt gtatattcag 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 aatgttttga tatttaggag 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 ttgactctta 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 atctcaagtg tatgtaacat 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 gtctttttgt tttttttttt 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 tattgcaaaa ggaaggaatg 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 tcatggaaaa agaaaaaatc 20

Claims (99)

  1. 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열 및 뇌의 파르브알부민 (PV)-발현 개재뉴런 세포에서의 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  2. SCN1A 유전자 발현과 특이적으로 연관된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 및 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 인핸서 서열이 뇌의 PV-발현 개재뉴런 세포에서의 트랜스진의 발현을 제한하는 것인 바이러스 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트랜스진이 리포터 유전자, 디자이너 약물에 의해 배타적으로 활성화된 디자이너 수용체 (DREADD)-코딩 유전자, 약리학상 선택적 작동자 분자 (PSAM)-코딩 치료 유전자, 또는 치료 유전자인 바이러스 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 SCN1A 유전자인 바이러스 벡터.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 DREADD-코딩 유전자인 바이러스 벡터.
  6. 제5항에 있어서, DREADD-코딩 유전자가 케모겐 클로자핀-N4-옥시드 (CNO)에 의해 활성화된 Gq-DREADD-코딩 유전자인 바이러스 벡터.
  7. 제3항에 있어서, 트랜스진이 약리학상 선택적 작동자 분자 (PSAM)-코딩 치료 유전자인 바이러스 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터인 바이러스 벡터.
  9. SCN1A 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분, 및 뇌의 개재뉴런 또는 뉴런 세포에서의 SCN1A 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터.
  10. 제4항 또는 제9항에 있어서, SCN1A 트랜스진에 의해 코딩되는 Nav1.1 나트륨 채널이 rAAV 벡터에 의한 개재뉴런 세포의 형질도입 후 개재뉴런 세포에서 기능적으로 발현되는 것인 rAAV 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 개재뉴런 세포가 GABA작동성 개재뉴런 세포인 바이러스 또는 rAAV 벡터.
  12. 제9항에 있어서, 개재뉴런 세포가 뇌 종뇌 내의 GABA작동성 개재뉴런 세포인 rAAV 벡터.
  13. 제11항에 있어서, GABA작동성 개재뉴런 세포가 파르브알부민 (PV)을 발현하는 것인 rAAV 벡터.
  14. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, GABA작동성 개재뉴런 세포가 혈관활성-장 펩티드 (VIP)를 발현하는 것인 rAAV 벡터.
  15. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴런 세포가 뇌 피질의 피라미드형 (PYR) 뉴런인 rAAV 벡터.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E7, E8, E9, 또는 E10 (각각 서열식별번호: 15-18 또는 21-24)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 바이러스 또는 rAAV 벡터.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E7, E8, E9, 또는 E10 (각각 서열식별번호: 15-18 또는 21-24)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 바이러스 또는 rAAV 벡터.
  18. 제13항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E2 (서열식별번호: 16)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 바이러스 또는 rAAV 벡터.
  19. 제14항 또는 제15항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20) 또는 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 rAAV 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20)의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 rAAV 벡터.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4.7 kb 초과의 폴리뉴클레오티드 서열을 패키징하는 벡터의 용량이 상동성 재조합에 의한 또는 억셉터 부위에 의해 매개되는 스플라이싱에 의한 다수의 rAAV 벡터의 재어셈블리를 포함하는 것인 바이러스 또는 rAAV 벡터.
  22. 제4항 및 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 뇌 내의 SCN1A-발현 GABA작동성 개재뉴런 세포에 SCN1A 유전자를 전달하고, SCN1A 유전자가 기능적으로 발현되며, 그에 의해 대상체에의 벡터의 투여 후 개재뉴런 세포에서의 SCN1A의 정상 수준을 복원하는 것인 바이러스 또는 rAAV 벡터.
  23. 제22항에 있어서, 대상체가 인간 환자인 바이러스 또는 rAAV 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 인간 환자가 드라베 증후군 (DS)을 앓고 있는 영아인 바이러스 또는 rAAV 벡터.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 rAAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 rAAV 벡터를 포함하는 세포.
  27. 제25항의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 세포.
  28. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 rAAV 벡터, 및 제약상 허용되는 비히클, 담체, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
  29. 제25항의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자, 및 제약상 허용되는 비히클, 담체, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 제약 조성물이 액체 투여 형태인 제약 조성물.
  31. SCN1A 발현 수준이 결핍성 또는 결함성인 GABA작동성 개재뉴런 세포 또는 뉴런 세포에서의 SCN1A 발현의 정상 수준을 복원하는 방법으로서, 세포를 제4항 및 제9항 내지 제22항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 rAAV 벡터, 바이러스 입자, 또는 그의 제약 조성물의 유효량과 접촉시켜, GABA작동성 개재뉴런 세포 또는 뉴런 세포에서의 SCN1A 발현의 정상 수준을 복원하는 것을 포함하는 방법.
  32. 간질, 발작, 또는 드라베 증후군 (DS)을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 영아에서 영아 간질 및/또는 발작을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 rAAV 벡터, 제25항의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자, 또는 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 치료 유효량을 영아에게 투여하여 대상체에서 발작, 간질, 또는 DS를 치료하는 것을 포함하는 방법.
  33. 드라베 증후군 (DS)을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 대상체에서 DS를 치료하는 방법으로서, 제4항 및 제9항 내지 제22항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 rAAV 벡터, 바이러스 입자 또는 그의 제약 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하여, 대상체에서 DS를 치료하는 것을 포함하는 방법.
  34. 발작 및/또는 간질을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 대상체에서 발작 및/또는 간질을 억제하거나 또는 예방하는 방법으로서, SCN1A 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분, 대상체의 대뇌 피질의 개재뉴런 세포 또는 뉴런 세포에서의 SCN1A 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 및 개재뉴런 세포 내로의 벡터의 형질도입을 향상시키는 캡시드를 포함하는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터를 대상체에게 전신적으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 영아 또는 대상체가 인간 환자인 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터에서의 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10 (각각 서열식별번호: 15-24)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, rAAV 벡터에서의 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E2 (서열식별번호: 16)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 16의 인간 인핸서 요소 E2 폴리뉴클레오티드 서열인 방법.
  39. 제36항에 있어서, rAAV 벡터에서의 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20)의 폴리뉴클레오티드 서열과 또는 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 20의 인간 인핸서 요소 E6 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19의 인간 인핸서 요소 E5 폴리뉴클레오티드 서열인 방법.
  41. SCN1A 유전자를 발현하는 개재뉴런 세포 또는 뉴런 세포에서의 제한된 발현을 위한 트랜스진을 전달하여 발작 및/또는 간질의 억제 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 발작 및/또는 간질을 억제하거나 또는 예방하는 방법으로서, 세포를 SCN1A 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분, 및 대상체의 대뇌 피질의 개재뉴런 세포 또는 뉴런 세포에서의 SCN1A 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터와 접촉시키며, 그에 의해 대상체에서 발작 및/또는 간질을 억제하거나 또는 예방하는 것을 포함하는 방법.
  42. 제31항 및 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 개재뉴런 세포가 PV-발현 피질 개재뉴런 (PV-cIN), 혈관활성-장 펩티드를 발현하는 탈-억제성 피질 개재뉴런 (VIP cIN), 또는 피라미드형 뉴런으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, rAAV 벡터에서의 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10 (각각 서열식별번호: 15-24)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 포함하는 것인 방법.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서, rAAV 벡터에서의 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E2 (서열식별번호: 16)의 폴리뉴클레오티드 서열과, 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20)의 폴리뉴클레오티드 서열과, 또는 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 포함하는 것인 방법.
  45. 제41항 또는 제42항에 있어서, rAAV 벡터에서의 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, 또는 E10 (각각 서열식별번호: 15-24)으로부터 선택되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 16의 인간 인핸서 요소 E2 폴리뉴클레오티드 서열, 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20), 또는 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)인 방법.
  47. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 또는 제약 조성물이 전신적으로 투여되는 것인 방법.
  48. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터, 바이러스 입자, 또는 제약 조성물이 비경구로 투여되는 것인 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, rAAV 벡터, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 또는 제약 조성물이 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  50. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 또는 제약 조성물 뇌내로 투여되는 것인 방법.
  51. 제32항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 또는 제약 조성물이 예방제로서 투여되는 것인 방법.
  52. 제32항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적 항-간질 치료를 영아 또는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열 및 뇌의 혈관활성-장 펩티드-발현 피질 개재뉴런 세포 (VIP cIN)에서의 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  54. SCN1A 유전자 발현과 특이적으로 연관된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 및 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 인핸서 서열이 뇌의 혈관활성-장 펩티드-발현 피질 개재뉴런 세포 (VIP cIN)에서의 트랜스진의 발현을 제한하는 것인 바이러스 벡터.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E6 (서열식별번호: 20)인 바이러스 벡터.
  57. 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열 및 뇌의 피라미드형 뉴런에서의 트랜스진의 발현을 특이적으로 제한하는 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  58. SCN1A 유전자 발현과 특이적으로 연관된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열 및 트랜스진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 인핸서 서열이 뇌의 피라미드형 뉴런에서의 트랜스진의 발현을 제한하는 것인 바이러스 벡터.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 100 bp 이상의 1개 이상의 영역을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 인핸서 요소 E5 (서열식별번호: 19)인 바이러스 벡터.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서 서열이 뇌의 글루타메이트성 피라미드형 뉴런에서의 트랜스진의 발현을 제한하는 것인 바이러스 벡터.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서 서열이 뇌의 피질층 5 내의 피라미드형 뉴런에서의 트랜스진의 발현을 제한하는 것인 바이러스 벡터.
  63. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터인 바이러스 벡터.
  64. 제53항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 SCN1A 유전자인 바이러스 벡터.
  65. 서열식별번호: 15-24로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 SCN1A를 발현하는 뉴런 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터.
  66. 제65항에 있어서, 뉴런 세포가 파르브알부민 피질 개재뉴런 (PV cIN), 피라미드형 (PYR) 뉴런, 또는 혈관활성-장 펩티드 피질 개재뉴런 (VIP cIN)인 바이러스 벡터.
  67. 서열식별번호: 25-27로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Pvalb를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터.
  68. 서열식별번호: 28-31로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Acan을 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터.
  69. 서열식별번호: 32-39로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Tmem132c를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터.
  70. 서열식별번호: 40 또는 서열식별번호: 41로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Lrrc38을 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터.
  71. 서열식별번호: 42 또는 서열식별번호: 43으로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Inpp5j를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터.
  72. 서열식별번호: 44-47로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Mef2c를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터.
  73. 서열식별번호: 48 또는 서열식별번호: 49로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 Pthlh를 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터.
  74. 서열식별번호: 15-49로부터 선택된 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 부분을 포함하며, 여기서 벡터가 세포 PV-발현 세포를 특이적으로 표적화하는 것인 바이러스 벡터.
  75. 제65항 및 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 PV-발현 뉴런 세포인 바이러스 벡터.
  76. 제65항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터인 바이러스 벡터.
  77. 제65항 내지 제76항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자.
  78. 제65항 내지 제76항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터를 포함하는 세포.
  79. 제77항의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 세포.
  80. 제65항 내지 제76항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터, 또는 제77항의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자, 및 제약상 허용되는 비히클, 담체, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
  81. 대상체의 뉴런 세포에서의 트랜스진의 발현을 제한하는 방법으로서, 서열식별번호: 15-49의 서열을 포함하는 적어도 1종의 인핸서 요소 폴리뉴클레오티드 및 트랜스진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전달 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 트랜스진이 뉴런 세포에서 특이적으로 발현되는 것인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 트랜스진이 SCN1A인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 뉴런 세포가 파르브알부민을 발현하는 피질 개재뉴런 (PV cIN)인 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 인핸서 요소 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 15-18 또는 서열식별번호: 21-24에 제시된 서열을 포함하는 것인 방법.
  85. 제82항에 있어서, 뉴런 세포가 피라미드형 (PYR) 세포인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 인핸서 요소 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 19에 제시된 서열을 포함하는 것인 방법.
  87. 제82항에 있어서, 뉴런 세포가 혈관활성-장 펩티드를 발현하는 피질 개재뉴런 (VIP cIN)인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 인핸서 요소 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 20에 제시된 서열을 포함하는 것인 방법.
  89. 제81항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 rAAV인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 전달 벡터가 뇌에 투여되는 것인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 전달 벡터가 국소적으로 또는 전신적으로 투여되는 것인 방법.
  92. 제81항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  94. 서열식별번호: 15-49로부터 선택된 인간 인핸서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  95. 제94항에 있어서, 재조합 아데노-연관된 바이러스 (rAAV) 벡터인 바이러스 벡터.
  96. 제94항 또는 제95항의 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자.
  97. 제94항 또는 제95항의 바이러스 벡터를 포함하는 세포.
  98. 제96항의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 세포.
  99. 제94항 또는 제95항의 바이러스 벡터, 또는 제96항의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자, 및 제약상 허용되는 비히클, 담체, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
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