JP2022519623A - ニューロン細胞興奮性の正常化およびドラベ症候群の処置のための介在ニューロン特異的治療剤 - Google Patents

ニューロン細胞興奮性の正常化およびドラベ症候群の処置のための介在ニューロン特異的治療剤 Download PDF

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Abstract

治療用ウイルスベクター、特に、ベクターに含まれるエフェクター遺伝子(例えば、SCN1Aコードポリヌクレオチド、Gq-DREADDコードポリヌクレオチド、またはPSAMコードポリヌクレオチド)の発現を脳内のPV発現GABA作動性介在ニューロンまたはニューロン細胞集団に特異的に制限するエンハンサー配列を含むように設計された組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを提供する。これらのrAAVベクター、その組成物および方法は、重篤な発作、認知障害、および早死に関連する乳児てんかんの一種であるドラベ症候群(DS)を含む神経病理、発作、薬理学的難治型のてんかんに苦しんでいる対象を処置するのに有用である。なぜなら、DSの原因が、SCN1A遺伝子によってコードされるナトリウムチャンネルの機能喪失を含むからである。説明されたベクターは、有利なことに、遺伝子療法(SCN1Aを用いる)または薬理遺伝学によって興奮-抑制バランスを回復させることによって疾患の根本原因に対処するように、適切な介在ニューロンまたはニューロン細胞集団で、特異性と感度を伴ってエフェクター遺伝子の発現を回復させる。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2019年2月5日に出願された米国仮出願番号62/801,483、2019年5月25日に出願された米国仮出願番号62/823,281、および2019年10月17日に出願された米国仮出願番号62/916,477に係る優先権とその恩典を主張する国際PCT出願である。これらの各仮出願の内容は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
連邦政府の支援による研究に関する記載
本発明は米国立衛生研究所によって付与された助成金番号MH111529に基づいて米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
背景
脳回路が正しく機能し、これらの回路の中で機能するニューロン細胞が活動するために慎重に維持しなければならない興奮と抑制の間には微妙なバランスが存在する。脳回路における興奮と抑制のバランスに変化、欠陥、または破壊があると多数の神経学的な、神経発生的な、または神経変性の疾患および障害が生じることが示されている。さらに、正しい皮質介在ニューロン機能の欠如は神経発生および神経学的な疾患および障害と結び付けられた。
介在ニューロン発生の経路からの逸脱(例えば、遺伝子変異による胚発生中の普通でない運命特定)または急性侵襲(例えば、脳卒中、振とう)の結果として介在ニューロンの異常な、または普通でない機能および活動が生じることがある。普通でないGABA作動性神経伝達および抑制性皮質回路の変化が、認知障害および早死に関連する薬剤抵抗(pharmaco-resistant)型乳児てんかんであるドラベ症候群(DS)などの重大な神経学的疾患および神経学的障害がある患者を苦しめる臨床上の特徴および症状、例えば、発作およびてんかんを引き起こし、誘導することがある。
特異性と感度を伴って、GABA作動性介在ニューロンまたは他の皮質ニューロンの活動を調節することができる治療用組成物および方法が不足しているために、医学界は多種多様なてんかん症例における発作、特に、焦点性発作およびDSに罹患している患者における発作を軽減する能力が著しく妨げられている。このような組成物および方法は、これらの酷い状態ならびに他の神経精神医学的疾患の重篤な症状と闘い、治療するために緊急に必要とされている。これらのニーズに応え、満たすために本明細書に記載の産物、組成物、および方法が提供される。
開示および態様の概要
ウイルスベクター、特に、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、そのウイルス粒子および組成物および方法が本明細書において注目される。このrAAVベクターは、少なくとも1つのトランスジーン(例えば、エフェクター遺伝子、例えば、hM3Dq改変ムスカリン受容体(Gq-DREADD)、薬理学的選択的アクチュエーター分子(pharmacologically selective actuator molecule)(PSAM)、または治療用遺伝子、例えば、SCN1A)と、トランスジーンの発現を介在ニューロン(IN)細胞、特に、ファストスパイキング(fast-spiking)パルブアルブミン発現GABA作動性介在ニューロン(本明細書においてPV介在ニューロン(PV INと呼ばれる))または脳皮質のニューロン細胞に制限する特異的調節ポリヌクレオチド配列を含有する(これらを含有するように分子的に操作されている)。一態様では、特異的調節ポリヌクレオチド配列は、遺伝子SCN1Aの付近にあるエンハンサー配列に由来し、rAAVによって運ばれるトランスジーンの発現を、脳内のファストスパイキングパルブアルブミン発現GABA作動性介在ニューロン集団に制限する。一態様では、治療用遺伝子はSCN1Aである。特定の態様では、前記ベクターは、介在ニューロン細胞、特に、皮質介在ニューロン細胞において、ナトリウム塩素イオンチャネルNav1.1をコードするSCN1A遺伝子の発現に欠損または欠陥がある介在ニューロン細胞に特異的に形質導入し、SCN1Aに欠損または欠陥がある介在ニューロンの興奮性を正常化し、それによって、ドラベ症候群(DS)に罹患している対象における発作および発作症状を軽減する。
一局面では、トランスジーンの発現を哺乳動物にあるGABA作動性PV発現介在ニューロン、または錐体(PYR)ニューロン、または血管作用性小腸ペプチド(VIP)発現皮質介在ニューロンに制限するために、適切なウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、または、特に、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターが用いられ、本明細書に記載のエンハンサーエレメントポリヌクレオチド(本明細書中では調節エレメントとも呼ばれる)を含む。一態様では、エンハンサーエレメントはシスで提供される。一態様では、調節エレメントは、本明細書に記載のS5E1、S5E2、S5E3、S5E4、S5E5、S5E6、S5E7、S5E8、S5E9、またはS5E10、特に、ヒトE1～E10である。一態様では、エンハンサーエレメントは、本明細書に記載のヒトE11～E35である。一態様では、エンハンサーエレメントはS5E1(E1)である。一態様では、エンハンサーエレメントはS5E2(E2)である。一態様では、エンハンサーエレメントはS5E3(E3)である。一態様では、エンハンサーエレメントはS5E4(E4)である。一態様では、エンハンサーエレメントはE5である。一態様では、エンハンサーエレメントはE6である。一態様では、エンハンサーエレメントはE11である。一態様では、エンハンサーエレメントはE14である。一態様では、エンハンサーエレメントはE22である。一態様では、エンハンサーエレメントはE29である。
一局面では、前記エンハンサーを含むウイルスベクターまたはrAAVベクターは、DSの処置および療法のために、形質導入されたPV発現介在ニューロン細胞において1コピーのSCN1Aを発現させる。他の態様では、前記エンハンサーを含むウイルスベクターまたはrAAVベクターは、焦点性てんかんおよび薬理学的に難治性のてんかんを含む全種類のてんかんを処置するために、ならびにDSを処置するために、PV介在ニューロン活動を化学遺伝学的調節するための、エフェクター遺伝子、例えば、Gq-DREADD受容体、または、例えば、薬理学的選択的アクチュエーター分子(PSAM)、直交(orthogonal)リガンド開口型イオンチャネル(およびその薬理学的選択的エフェクター分子(PSEM))を発現させる。
一局面では、トランスジーンポリヌクレオチド配列と、トランスジーンの発現を脳のパルブアルブミン(PV)発現介在ニューロン細胞に特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列とを含むウイルスベクターが提供される。
一局面では、SCN1A遺伝子発現に特異的に関連するエンハンサーポリヌクレオチド配列と、トランスジーンポリヌクレオチド配列とを含むウイルスベクターであって、エンハンサー配列がトランスジーンの発現を脳のPV発現介在ニューロン細胞に制限する、ウイルスベクターが提供される。
一局面では、トランスジーンの発現を、哺乳動物にある脳のGABA作動性の血管作用性小腸ペプチド発現皮質介在ニューロン細胞(VIP cIN)に制限するために、適切なウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、または、特に、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターが用いられ、この場合、本明細書に記載のエンハンサーエレメントはシスで提供される。一態様では、エンハンサーエレメントは、本明細書に記載のS5E6である。
一局面では、トランスジーンの発現を、哺乳動物にある脳のGABA作動性の介在ニューロンと、グルタミン酸作動性錐体ニューロンの両方に制限するために、適切なウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、または、特に、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターが用いられ、この場合、本明細書に記載のエンハンサーエレメントはシスで提供される。一態様では、錐体ニューロンは、哺乳動物にある脳の皮質層(cortical layer)5にある。一態様では、発現を錐体ニューロンに制限するエンハンサーエレメントは、本明細書に記載のS5E5である。
上記の局面のウイルスベクターの態様では、トランスジーンは、レポーター遺伝子、デザイナー薬物によって排他的に活性化されるデザイナー受容体(Designer receptor exclusively activated by designer drug)(DREADD)コード遺伝子、薬理学的選択的アクチュエーター分子(PSAM)コード遺伝子、または治療用遺伝子、例えば、SCN1Aである。一態様では、トランスジーンはSCN1A遺伝子である。一態様では、トランスジーンはDREADDコードポリヌクレオチドである。一態様では、DREADDコードポリヌクレオチドは、ケモゲン(chemogen)クロザピン-N4-オキシド(CNO)によって活性化されるGq-DREADDコード遺伝子である。一態様では、トランスジーンは薬理学的選択的アクチュエーター分子(PSAM)コード遺伝子である。一態様では、発現されたPSAMはPSEMリガンドと特異的に相互作用する。一態様では、ウイルスベクターは組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターである。
別の局面では、SCN1Aトランスジーンポリヌクレオチド配列またはその機能的部分と、SCN1Aトランスジーンの発現を脳の介在ニューロン細胞に特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列とを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターが提供される。
上記の局面のウイルスベクターまたはrAAVベクターの態様では、前記ウイルスベクターまたはrAAVベクターによる介在ニューロンまたはニューロン細胞への形質導入後に、SCN1AトランスジーンによってコードされるNav1.1ナトリウムチャンネルが介在ニューロン細胞またはニューロン細胞において機能的に発現される。上記の局面のウイルスベクターまたはrAAVベクターの態様では、前記ウイルスベクターまたはrAAVベクターによる介在ニューロンまたはニューロン細胞への形質導入後に、SCN1AトランスジーンによってコードされるNav1.1ナトリウムチャンネルがGABA作動性介在ニューロンとグルタミン酸作動性錐体ニューロンの両方において機能的に発現される。一態様では、介在ニューロン細胞はGABA作動性介在ニューロン細胞である。一態様では、介在ニューロン細胞は、脳の終脳内にあるGABA作動性介在ニューロン細胞である。一態様では、GABA作動性介在ニューロン細胞はパルブアルブミン(PV)を発現する。一態様では、ニューロン細胞は、錐体ニューロン細胞、例えば、脳皮質にあるグルタミン酸作動性錐体細胞である。上記の局面のいずれか一つの態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列は、マウスエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、またはE10(それぞれ、SEQ ID NO:5～14)のポリヌクレオチド配列、またはそのオルソログ、例えば、ヒトオルソログを含む。一態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列は、ヒトエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、またはE10(それぞれ、SEQ ID NO:15～24)のポリヌクレオチド配列を含む。一態様では、前記ウイルスベクターまたはrAAVベクターは、ヒトエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、またはE10(それぞれ、SEQ ID NO:15～24)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含むエンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。別の態様では、前記ウイルスベクターまたはrAAVベクターは、ヒトエンハンサーエレメントE2(SEQ ID NO:16)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含むエンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。別の態様では、前記ウイルスベクターまたはrAAVベクターは、ヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含むエンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。別の態様では、前記ウイルスベクターまたはrAAVベクターは、ヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID:20)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含むエンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。上記の局面の態様では、前記ウイルスベクターまたはrAAVベクターは、ヒトエンハンサーエレメントE2(SEQ ID NO:16)のポリヌクレオチド配列を含むエンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。上記の局面の他の態様では、前記ウイルスベクターまたはrAAVベクターは、ヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)のポリヌクレオチド配列を含むエンハンサーポリヌクレオチド配列、またはヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)のポリヌクレオチド配列を含むエンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。上記の局面の他の態様では、前記ウイルスベクターまたはrAAVベクターは、ヒトエンハンサーエレメントE11(SEQ ID NO:25)～E35(SEQ ID NO:49)のポリヌクレオチド配列を含むエンハンサーポリヌクレオチド配列のいずれか一つ(または1つもしくは複数)を含む。一態様では、約4.7kbを超えるポリヌクレオチド配列をパッケージングするベクターの収容能力は、相同組換えによる複数のrAAVベクターの再集合またはアクセプター部位によって媒介されるスプライシングによる複数のrAAVベクターの再集合を含む。一態様では、前記ベクターは、SCN1A遺伝子を脳内のSCN1A発現GABA作動性介在ニューロンまたはグルタミン酸作動性錐体ニューロン細胞に送達し、そこでSCN1A遺伝子は機能的に発現され、それによって、対象へのベクターの投与後に介在ニューロンおよびニューロン細胞において正常レベルのSCN1Aが回復する。一態様では、対象はヒト患者である。一態様では、ヒト患者はドラベ症候群(DS)に罹患している乳児である。
別の局面では、上記の局面のいずれかのウイルスベクターまたはrAAVベクターを含むウイルス粒子またはウイルス様粒子が提供される。
別の局面では、上記の局面のいずれかのウイルスベクターまたはrAAVベクターを含む細胞が提供される。一態様では、前記細胞は、上記で示されたウイルス粒子を含む。
別の局面では、上記の局面のいずれかのウイルスベクターまたはrAAVベクターと、薬学的に許容されるビヒクル、担体、または希釈剤とを含む薬学的組成物が提供される。
別の局面では、上記の局面のいずれかのウイルス粒子と、薬学的に許容されるビヒクル、担体、または希釈剤とを含む薬学的組成物が提供される。上記の局面の態様では、薬学的組成物は液体剤形である。
一局面では、SCN1A発現レベルに欠損または欠陥があるGABA作動性介在ニューロン細胞において正常レベルのSCN1A発現を回復させる方法であって、有効量の上記の局面のいずれかのウイルスベクターもしくはrAAVベクターまたはそのウイルス粒子もしくは薬学的組成物に細胞を接触させて、GABA作動性介在ニューロン細胞における正常レベルのSCN1A発現を回復させる工程を含む、方法が提供される。
一局面では、てんかん、発作、もしくはドラベ症候群(DS)を有するか、またはてんかん、発作、もしくはドラベ症候群(DS)を有するリスクがある乳児において乳児てんかんおよび/または発作を処置する方法であって、治療的有効量の上記の局面のいずれかのウイルスベクターまたはrAAVベクター、上記の局面のいずれかのウイルス粒子、または上記の局面のいずれかの薬学的組成物を乳児に投与して、対象における発作、てんかん、またはDSを処置する工程を含む、方法が提供される。
一局面では、ドラベ症候群(DS)を有するか、またはDSを有するリスクがある対象においてDSを処置する方法であって、治療的有効量の上記の局面のいずれかのウイルスベクターもしくはrAAVベクターまたはそのウイルス粒子もしくは薬学的組成物を対象に投与して、対象におけるDSを処置する工程を含む、方法が提供される。
一局面では、発作および/もしくはてんかんを有するか、または発作および/もしくはてんかんを有するリスクがある対象において発作および/またはてんかんを阻害または阻止する方法であって、SCN1Aトランスジーンポリヌクレオチド配列またはその機能的部分と、SCN1Aトランスジーンの発現を対象の大脳皮質の介在ニューロン細胞に特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列と、介在ニューロン細胞へのベクターの形質導入を強化するキャプシドとを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを対象に全身投与する工程を含む、方法が提供される。
上記の局面のいずれかにおける方法の一態様では、乳児または対象はヒト患者である。上記の局面のいずれかにおける方法の一態様では、ウイルスベクターまたはrAAVベクターの中にあるエンハンサーポリヌクレオチド配列は、ヒトエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、もしくはE10、またはE11～E35(それぞれ、SEQ ID NO:25～49)より選択される。一態様では、ウイルスベクターまたはrAAVベクターは、ヒトエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、またはE10(それぞれ、SEQ ID NO:15～24)またはE11～E35(それぞれ、SEQ ID NO:25～49)のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含むエンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。一態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列はヒトE2エンハンサーポリヌクレオチド配列であるか、またはエンハンサーポリヌクレオチド配列は、ヒトエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、またはE10(それぞれ、SEQ ID NO:15～24)またはE11～E35(それぞれ、SEQ ID NO:25～49)のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有する。一態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列はヒトE5エンハンサーポリヌクレオチド配列である。一態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列はヒトE6エンハンサーポリヌクレオチド配列である。ある特定の態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列は、ヒトエンハンサーエレメントE2(SEQ ID NO:16)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有する。他の態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列は、ヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)のポリヌクレオチド配列またはヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有する。
一局面では、発作および/またはてんかんの阻害または阻止を必要とする対象において発作および/またはてんかんを阻害または阻止するために、SCN1A遺伝子を発現する介在ニューロン細胞またはニューロン細胞における制限された発現のためにトランスジーンを送達する方法であって、SCN1Aトランスジーンポリヌクレオチド配列またはその機能的部分と、SCN1Aトランスジーンの発現を対象の大脳皮質の介在ニューロン細胞またはニューロン細胞に特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列とを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターに細胞を接触させ、それによって、対象における発作および/またはてんかんを阻害または阻止する工程を含む、方法が提供される。
上記の局面のいずれかにおける方法の一態様では、rAAVベクター、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、または薬学的組成物は全身投与される。上記の局面のいずれかにおける方法の一態様では、rAAVベクター、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、または薬学的組成物は非経口投与または静脈内投与される。上記の局面のいずれかにおける方法の一態様では、rAAVベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は脳内投与される。上記の局面のいずれかにおける方法の一態様では、rAAVベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は予防薬として投与される。上記の局面のいずれかにおける方法の一態様では、前記方法は、補助的抗てんかん処置を乳児または対象に施す工程をさらに含む。
別の局面では、トランスジーンポリヌクレオチド配列と、トランスジーンの発現を脳の血管作用性小腸ペプチド発現皮質介在ニューロン細胞(VIP cIN)に特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列とを含むウイルスベクターが提供される。別の局面では、SCN1A遺伝子発現に特異的に関連するエンハンサーポリヌクレオチド配列と、トランスジーンポリヌクレオチド配列とを含むウイルスベクターであって、エンハンサー配列がトランスジーンの発現を脳の血管作用性小腸ペプチド発現皮質介在ニューロン細胞(VIP cIN)に制限する、ウイルスベクターが提供される。一態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列は、ヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列はヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)である。一態様では、前記ウイルスベクターは組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターである。一態様では、トランスジーンはSCN1A遺伝子である。
別の局面では、トランスジーンポリヌクレオチド配列と、トランスジーンの発現を脳の錐体ニューロンに特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列とを含むウイルスベクターが提供される。別の局面では、SCN1A遺伝子発現に特異的に関連するエンハンサーポリヌクレオチド配列と、トランスジーンポリヌクレオチド配列とを含むウイルスベクターであって、エンハンサー配列がトランスジーンの発現を脳の錐体ニューロンに制限する、ウイルスベクターが提供される。一態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列は、ヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、エンハンサーポリヌクレオチド配列はヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)である。別の特定の態様では、エンハンサー配列はトランスジーンの発現を脳の皮質層5の錐体ニューロンに制限する。一態様では、前記ウイルスベクターは組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターである。一態様では、トランスジーンはSCN1A遺伝子である。
一局面では、SEQ ID NO:15～24より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、SCN1A発現ニューロン細胞を特異的に標的とするウイルスベクターが提供される。一態様では、ニューロン細胞は、パルブアルブミン皮質介在ニューロン(PV cIN)、錐体(PYR)ニューロン、または血管作用性小腸ペプチド皮質介在ニューロン(VIP cIN)である。
一局面では、SEQ ID NO:25～27より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Pvalb発現細胞を特異的に標的とするウイルスベクターが提供される。
一局面では、SEQ ID NO:28～31より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Acan発現細胞を特異的に標的とするウイルスベクターが提供される。
一局面では、SEQ ID NO:32～39より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Tmem132c発現細胞を特異的に標的とするウイルスベクターが提供される。
一局面では、SEQ ID NO:40またはSEQ ID NO:41より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Lrrc38発現細胞を特異的に標的とするウイルスベクターが提供される。
一局面では、SEQ ID NO:42もしくはSEQ ID NO:43より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Inpp5j発現細胞を特異的に標的とするウイルスベクターが提供される。
一局面では、SEQ ID NO:44～47より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Mef2c発現細胞を特異的に標的とするウイルスベクターが提供される。
一局面では、SEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:49より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Pthlh発現細胞を特異的に標的とするウイルスベクターが提供される。
一局面では、SEQ ID NO:15～49より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、PV発現細胞を特異的に標的とするウイルスベクターが提供される。
上記の局面のいずれかのウイルスベクターの任意の態様では、標的細胞はPV発現ニューロン細胞である。上記の局面のいずれかのウイルスベクターの態様では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたは組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターである。
一局面では、上記の局面および態様のいずれかのウイルスベクターを含む細胞が提供される。
一局面では、上記の局面および態様のいずれかのウイルスベクターを含むウイルス粒子またはウイルス様粒子が提供される。一局面では、上記の局面および態様のいずれかのウイルスベクターを含むウイルス粒子またはウイルス様粒子を含む細胞が提供される。
一局面では、上記の局面および態様のいずれかのウイルスベクターまたはウイルス粒子もしくはウイルス様粒子と、薬学的に許容されるビヒクル、担体、または希釈剤とを含む薬学的組成物が提供される。
別の局面では、トランスジーンの発現を対象のニューロン細胞に制限する方法であって、SEQ ID NO:15～49の配列を含む少なくとも1つのエンハンサーエレメントポリヌクレオチドとトランスジーンポリヌクレオチドとを含む送達ベクターを対象に投与する工程を含み、トランスジーンがニューロン細胞において特異的に発現される、方法が提供される。前記方法の一態様では、トランスジーンはSCN1Aである。一態様では、ニューロン細胞は、パルブアルブミンを発現する皮質介在ニューロン(PV cIN)である。一態様では、エンハンサーエレメントポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15～18またはSEQ ID NO:21～24に示される配列を含む。
上記の方法の別の態様では、ニューロン細胞は錐体(PYR)細胞である。一態様では、エンハンサーエレメントポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:19に示される配列を含む。
上記の方法の別の態様では、ニューロン細胞は血管作用性小腸ペプチド発現皮質介在ニューロン(VIP cIN)である。一態様では、エンハンサーエレメントポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:20に示される配列を含む。
上記の方法およびその態様の一態様では、送達ベクターはレンチウイルスベクターまたはrAAVである。前記方法の一態様では、送達ベクターは脳に投与される。前記方法の一態様では、送達ベクターは局所投与または全身投与される。一態様では、対象は哺乳動物である。一態様では、対象はヒトである。
別の局面では、SEQ ID NO:15～49より選択されるヒトエンハンサーポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターが提供される。一態様では、前記ウイルスベクターは組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターである。態様では、ウイルス粒子またはウイルス様粒子は上記のウイルスベクターを含む。別の態様では、細胞は上記のウイルスベクターを含む。一態様では、細胞は上記のウイルス粒子またはウイルス様粒子を含む。一態様では、薬学的組成物は、上記のウイルスベクターまたは上記のウイルス粒子もしくはウイルス様粒子と、薬学的に許容されるビヒクル、担体、または希釈剤とを含む。
定義
特に定義のない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は全て、説明された局面および態様が属する当業者に普通に理解される意味を有する。以下の参考文献は、説明された態様において用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用する以下の用語は、特に定めのない限り、以下で、この用語のものとされている意味を有する。
「投与する」とは、組成物、薬剤、治療用産物、例えば、トランスジーン(例えば、エフェクターもしくは治療用遺伝子)を有するウイルスベクター(rAAV)などを対象に与えること、供給すること、投薬すること、または前記組成物などを適用すること、もしくは対象と接触させることを意味する。投与する工程または投与は、例えば、非経口または全身、静脈内(IV)、(注射)、皮下、くも膜下腔内、頭蓋内、筋肉内、皮膚、皮内、吸入、直腸、膣内、局部、経口、皮下、筋肉内、または眼内などがあるが、これに限定されるわけではない多数の任意の経路によって成し遂げられ得る。態様では、投与は、全身投与、例えば、接種、注射、または静脈内注射による全身投与である。
「薬剤」とは、ペプチド、ポリペプチド、核酸分子、もしくは低分子化合物、抗体、またはその断片を意味する。
「変化」とは、標準的な、当技術分野において公知の方法、例えば、本明細書に記載の方法によって検出された時に、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性が変化(増加または減少)することを意味する。本明細書で使用された時に、変化は、発現レベルが10％変化すること、発現レベルが25％変化すること、40％変化すること、または50％以上変化することを含む。
「寛解させる」および「寛解」とは、疾患の発症または進行を減少させる、抑制する、減弱する、減らす、止める、または安定化することを意味する。
「類似体」または「誘導体」とは、同一でないが、類似する機能的特徴または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然ポリペプチドの生物学的活性を保持しているが、天然ポリペプチドと比べて類似体の機能を高める、ある特定の生化学的改変を有する。このような生化学的改変は、例えば、ポリヌクレオチド結合活性を変えることなく、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を増加することができる。別の例では、ポリヌクレオチド類似体は、対応する天然ポリヌクレオチドの生物学的活性を保持しているが、天然ポリヌクレオチドと比べて類似体の機能を高める、ある特定の改変を有する。このような改変は、DNAに対するポリヌクレオチドの親和性、半減期、および/またはヌクレアーゼ耐性を増加することができ、類似体は非天然のヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでもよい。
本明細書で使用する「リスクがある」という用語は、発作またはてんかんなどの神経学的または神経発生的な疾患、障害、または病態に適用される時には、神経学的または神経発生的な疾患、障害、または病態の家族歴または遺伝的危険因子遺伝子がある患者または個体を指す。
本明細書で使用する「担体」という用語は、組成物または薬学的組成物、例えば、ポリヌクレオチド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子を含む組成物または薬学的組成物と一緒に投与することができる、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体および薬学的に許容される担体には、無菌の液体、例えば、水、および石油、動物、野菜、または合成由来の油を含む油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが含まれる。特に、注射溶液の場合、水または食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液が担体として用いられる場合がある。担体はまた、結合剤(圧縮丸剤の場合)、流動化剤(glidant)、カプセル化薬剤、着香剤(flavorant)、および着色剤の1つまたは複数を含むが、これに限定されない固体剤形も含む場合がある。適切な薬学的担体は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」で述べられている。
本明細書で使用する、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含有する(containing)」、および「有する(having)」などは、米国特許法においてこれらの用語のものとされている意味を有することがあり、「含む(includes)」、「含む(including)」などを意味することがある。同様に、「から本質的になる(consisting essentially of)」または「本質的になる(consists essentially)」は、米国特許法においてこの用語のものとされている意味を有する。この用語はオープンエンドであり、列挙されたものの基本的な、または新規の特徴が、列挙されたものより多いが、先行技術の態様を除くものが存在することで変化しない限り、列挙されたものより多くのものが存在することを可能にする。
「DREADD」は「デザイナー薬物によって排他的に活性化されるデザイナー受容体(designer receptor exclusively activated by a designer drug)」の頭字語であり、(DREADDをコードするポリヌクレオチド配列を含有する)ウイルスベクターを用いて、または遺伝子育種(genetic breeding)によって対象またはその細胞、例えば、PV発現介在ニューロンに投与または特異的に導入され得る改変されたGタンパク質共役受容体(GPCR)である。DREADDは、ニューロンの興奮および抑制に対する正確なレベルの時間制御を可能にする、化学遺伝学的(chemical genetic)、すなわち「化学遺伝学的(chemogenetic)」分子として知られている。DREADD発現後に、静脈内注射によって投与されてもよく、経口投与されてもよい特異的リガンド(またはアゴニスト)によってDREADDは活性化され得る。DREADDおよびそのリガンドは直交になるように設計されている、すなわち、互いに特異的に結合し、交差反応しない。非限定的な例として、5つの異なるクラスのDREADDを使用することができる。hM3Dqは細胞内のカルシウムレベルを上昇させ、バースト発火を引き起こす。hM4DiはcAMPと、特定のカリウムチャンネルの活性化を低下させ、ニューロンサイレンシングを引き起こし、前シナプス神経伝達物質放出も阻害する。GsDはcAMPを上昇させ、調節信号伝達(modulation signaling)を引き起こす。Rq(R165L)は、向精神薬機構と結び付けられている特定の経路であるアレスチンシグナル伝達を上昇させる。κ-オピオイド受容体DREADDまたはKORDはニューロン興奮を低減または抑制し、前シナプス神経伝達物質放出も抑制する(例えば、Kelly Rae Chi, 2015, The Scientist;およびS.M. Sternson and B.L. Roth, 2014, Ann Rev Neuroscience, 37:387-407を参照されたい)。
直交リガンド開口型イオンチャネルは薬理学的選択的アクチュエーター分子(PSAM)および薬理学的選択的エフェクター分子(PSEM)と呼ばれ、DREADDの使用と同様に、光遺伝学的薬剤として、および光遺伝学的方法において用いられる他のタイプの化学遺伝学的分子である。それぞれのPSAMはPSEMコグネイト合成アゴニストによって排他的に活性化される。例として、3種類の特異的PSAM/PSEMツールが設計されており、それぞれが、ニューロン興奮性を制御するための異なるイオン伝導度特性を有する(例えば、Shapiro, M.G. et al., 2012、ACS Chem. Neurosci., 3(8):619-629を参照されたい)。これらには、カチオン選択的アクチベーター、PSAMQ79G,Q139G-5HT3HC/PSEM22S、アニオン選択的サイレンサー、PSAML141F,Y115F-GlyR/PSEM89S、および第3のCa2+選択的チャンネルであるPSAMQ79G,L141S-nAChR V13'T/PSEM9Sが含まれる(同書および Magnus, C.J. et al., 2011, Science, 333(6047):1292-1296を参照されたい)。DREADD と PSAM-PSEMは両方ともニューロン活動を時間的に何分から何時間まで制御することを可能にする(例えば、Kelly Rae Chi, 2015, The Scientist;およびS.M. Sternson and B.L. Roth, 2014, Ann Rev Neuroscience, 37:387-407を参照されたい)。例として、ニューロン、例えば、ニューロン中のE/Iバランスを制御するために様々なPSAMが様々なイオンチャンネルとPSEMと共に用いられてきた。このようなPSAM-PSEMペアには、リガンドPSEM89Sによって活性化され、カチオンが細胞に流入し、興奮性を増強するのを可能にするPSAML141F,Y115F-5HT3 HC;リガンドPSEM89Sによって活性化され、ニューロンがサイレンシングされるPSAML141F,Y115F-GlyR;およびリガンドPSEM9Sによって活性化され、カルシウム信号伝達が増強されるPSAMQ79G,L141S-nAChR V13が含まれるが、それに限定されるわけではない。2つの異なるPSEMリガンドがあるので、PSAM-PSEMも同じ動物(対象)において組み合わせることができる。
「検出する」とは、検出しようとする分子、化合物、または薬剤の存在、非存在、または量を特定することを指す。
「疾患」とは、細胞、組織、臓器、または身体の一部、例えば、脳の大脳皮質および脳組織を含む脳の正常機能に悪影響を及ぼす、それを損傷する、またはそれを妨害する任意の状態または障害を意味する。一態様では、疾患は発作またはてんかんである。別の態様では、疾患はドラベ症候群である。
「有効量」とは、未処置患者と比べて疾患の症状を寛解させるのに必要な量を意味する。疾患の治療的処置のために、説明された方法を実施するのに用いられる活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、および身体全体の健康に応じて変化する。最終的に、主治医、臨床家、または獣医師が適切な量および投与計画を決定する。このような量は「有効」量と呼ばれる。一態様では、有効量は、特異的エンハンサー配列(例えば、SCN1A特異的エンハンサー、例えば、本明細書に記載のE1～E10)と、神経学的な疾患または障害、例えば、発作、てんかん、ドラベ症候群(DS)の症状またはその重篤度を低減する、寛解させる、軽減する、阻害する、または安定化するのに必要な、その中に挿入される1つまたは複数のトランスジーン配列(例えば、SCN1A)を含むrAAVベクターの量である。別の態様では、有効量は、特異的エンハンサー配列(例えば、SCN1A特異的エンハンサー、例えば、本明細書に記載のE1～E10)と、介在ニューロン細胞、例えば、GABA作動性介在ニューロン細胞またはPV発現GABA作動性介在ニューロン細胞の特異的抑制活性を引き起こすのに必要な、その中に挿入される1つまたは複数のトランスジーン配列(例えば、SCN1A)を含むrAAVベクターの量である。一態様では、エンハンサーは、トランスジーン、例えば、SCN1A、またはPV介在ニューロン活動の化学遺伝学的調節の場合はGq-DREADDもしくはPSAMのようなエフェクターの発現をPV介在ニューロン細胞に制限する本明細書に記載のE2である。
本明細書で使用する「内因性」という用語は、天然で、特定の生物(例えば、ヒト)で、または生物内の特定の場所(例えば、臓器、組織、もしくは細胞、例えば、ヒト細胞)で見出される分子(例えば、ポリペプチド、ペプチド、核酸、または補因子)を表している。
本明細書で使用する「外因性」という用語は、天然で、または内因的に、特定の生物(例えば、ヒト)で、または生物内の特定の場所(例えば、臓器、組織、もしくは細胞、例えば、ヒト細胞)で見出されない分子(例えば、ポリペプチド、ペプチド核酸、または補因子)を指す。外因性材料には、外部供給源から生物に、またはそれから抽出された培養物に提供されるものが含まれる。
「調節エレメント」、「調節配列」、「エンハンサー」、「エンハンサーエレメント」、または「エンハンサー配列」は、1つまたは複数の結合タンパク質、例えば、転写因子が認識および結合する1つまたは複数の結合部位を含有する、約50～2500ヌクレオチドの核酸もしくはポリヌクレオチド配列、または核酸もしくはポリヌクレオチド配列、例えば、DNAまたはRNAの領域を指す。一般的に、結合タンパク質は、特定の標的遺伝子の転写が起こる可能性を高めるアクチベーターとして機能する。エンハンサーは、遺伝子のプロモーターを基準にして、エンハンサーの場所、距離、または方向に関係なく転写を活性化することができる。例えば、エンハンサー配列は遺伝子の上流に位置してもよく、遺伝子の下流に位置してもよく、遺伝子のコード領域内に位置してもよく、遺伝子から100万塩基対まで離れたところにあってもよい。典型的に、DNA結合タンパク質または転写因子がエンハンサーに結合するとDNAコンホメーションが変わるか、または変化し、それによって、DNAに結合した転写因子の間で、またはそれらの中で相互作用が生じる。
エンハンサーは、転写因子の組み合わせを結合することができ、次いで、メディエーター複合体またはTFIIDの成分と相互作用してRNAポリメラーゼII(RNAPII)を動員するのを助けるDNA配列のクラスターだと言われてきた。これを成し遂げるために、エンハンサーに結合した転写因子は介在配列を環状にし、遺伝子のプロモーター領域に接触し、従って、エンハンサーが距離非依存的に働くことを可能にする。さらに、真核生物遺伝子の活性化には、エンハンサーに結合した転写因子によって行われるクロマチン繊維の脱圧縮(de-compaction)が必要であり、これによって、ヒストン修飾酵素またはATP依存性クロマチンリモデリング複合体が動員されてクロマチン構造が変わり、他のタンパク質へのDNAの接近しやすさが高まる。(エンハンサー機能の総説については、例えば、Ong, C.-T. and Corces, V.G., 2011, Nat. Rev. Genetics, 12(4):283-293を参照されたい)。
本明細書に記載のように、トランスジーン、すなわちSCN1Aの発現を、そのほとんどがSCN1A遺伝子を発現するPV発現介在ニューロン細胞(PV細胞)に制限する能力があるかどうかSCN1A遺伝子の付近にある10個のエンハンサーをスクリーニングした。本明細書中でS5E1(E1)～S5E10(E10)と呼ばれる単離されたエンハンサー配列は、SCN1Aの発現をGABA作動性介在ニューロンに制限する能力を有することが発見された。例として、E2エンハンサー(S5E2)は、トランスジーンの発現を、SCN1Aを発現するPV発現介在ニューロンにターゲティングおよび制限することが証明された。SCN1Aを発現する大きな細胞画分はPV発現介在ニューロンでないと理解される。一態様では、本明細書に記載のエンハンサーを用いると、トランスジーン、例えば、SCN1Aまたは別のエフェクター遺伝子、例えば、Gq-DREADDもしくはPSAMの発現を、全てのSCN1A発現ニューロンではなくPV介在ニューロンに限定することが可能になる。さらなる例として、単離されたE5エンハンサー(S5E5)は、トランスジーンの発現を脳内のグルタミン酸作動性錐体ニューロンにターゲティングおよび制限することが証明された。態様では、このようなエンハンサーは、本明細書に記載のE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、またはE10である。一態様では、エンハンサーエレメントは天然環境から単離される。このようなエンハンサーエレメントは、細胞、組織、または身体の領域、例えば、脳に送達するために、ベクター、例えば、ウイルスベクターの中で用いられる。
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の部分を意味する。この部分は、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％を含有する。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有してもよい。
「機能的に発現された」とは、本明細書に記載のrAAVまたはrAAVベクターのポリヌクレオチドの中に含まれるか、または挿入されている遺伝子またはトランスジーンが感染細胞または形質導入された細胞において発現され、そのコードされている産物を産生し、その産物は細胞において機能する、および/または活性があることを意味する。一態様では、前記細胞は介在ニューロン細胞である。一態様では、前記細胞はGABA作動性介在ニューロン細胞である。一態様では、前記細胞は、パルブアルブミン(PV)を発現するGABA作動性介在ニューロン細胞である。一態様では、前記細胞は、ニューロン、特に、グルタミン酸作動性錐体介在ニューロン細胞である。一態様では、トランスジーンは、検出可能なレポーター遺伝子、例えば、d-Tomato、ChR2、GFP、RFPなどである。一態様では、トランスジーンは、デザイナー薬物によって排他的に活性化されるデザイナー受容体(DREADD)またはGq-DREADDである。一態様では、トランスジーンはPSAMである。一態様では、トランスジーンは、ナトリウムチャンネルNav1.1をコードするSCN1Aである。
「ハイブリダイゼーション」とは相補的核酸塩基間での水素結合を意味し、水素結合はワトソン・クリック(Watson-Crick)、フーグスティーン(Hoogsteen)、または逆フーグスティーン(reversed Hoogsteen)水素結合でもよい。例えば、アデニンとチミンは、水素結合が形成することで対形成する相補的な核酸塩基である。
「介在ニューロン」という用語は、感覚ニューロンと運動ニューロンとの間でインパルスを中継するニューロン(神経細胞)、すなわち中枢神経系(CNS)にある局所回路ニューロンを指す。一般的に、ニューロンは、主として神経インパルスの伝達において機能する専門化した細胞である。ニューロンは、樹状突起および軸索などの細胞突起を有する。樹状突起は、ニューロンの細胞体にある短い方の突起であり、他のニューロンからの入力を受け取り、信号を細胞体に伝える。軸索は長い方の、細胞体の単一の突起であり、ニューロンの先端(シナプス終末と呼ばれる)に向かって信号を中継する。3つの主なタイプのニューロンには、感覚ニューロン、(CNSの)介在ニューロン、および運動ニューロンが含まれる。ヒト脳には約1000億個の介在ニューロンがあり、感覚ニューロンからインパルスを受け取る。介在ニューロンは、他のニューロンから受け取った情報を解釈し、「統合」と呼ばれる機能における適切な応答のためにインパルスを運動ニューロンに中継する。
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、天然状態で見出されるように通常付随するか、または関連する成分を様々な程度まで含まない材料を指す。「単離する」とは、最初の供給源または周囲にあるものから、ある程度、分離することを指す。「精製する」とは、単離より大きな程度の分離を指す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質またはポリヌクレオチドは、いかなる不純物も、このタンパク質またはポリヌクレオチドの生物学的特性に物質的に影響を及ぼさず、他の有害事象を引き起こさないように十分に他の材料を含まない。すなわち、ポリヌクレオチド(核酸)、ポリペプチド、またはペプチドは、組換えDNA法によって生成された時に細胞材料もウイルス材料も培養培地も実質的に含まなければ精製されている、または化学合成された時に化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まなければ精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて求められる。「精製された」という用語は、電気泳動ゲルにおいて核酸、タンパク質、またはペプチドが本質的に1つのバンドを生じることを指すことがある。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に供することができるタンパク質の場合、異なる修飾は、異なる単離されたタンパク質を生じる場合があり、異なる単離されたタンパク質は別々に精製することができる。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、核酸分子、例えば、本明細書に記載の核酸分子の供給源である生物の天然ゲノムの中で、この遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸(例えば、DNA)を意味する。従って、この用語は、例えば、ベクター;自己複製プラスミドもしくはウイルス;または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、あるいは他の配列とは独立した別個の分子(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じたcDNAまたはゲノム断片もしくはcDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。さらに、この用語は、DNA分子から転写されたRNA分子、ならびにさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
「単離されたポリペプチド」とは、天然で付随する成分から分離されているポリペプチドを意味する。典型的に、ポリペプチドは、そのポリペプチドが天然で関連しているタンパク質および天然有機分子が無く、少なくとも60重量％である時に単離されている。好ましくは、調製物は、少なくとも75重量％、または少なくとも85重量％、または少なくとも90重量％、または少なくとも99重量％の望ましいポリペプチドである。単離されたポリペプチドは、例えば、天然供給源からの抽出によって、このようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはそのタンパク質を化学合成することによって入手されてもよい。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、またはHPLC分析によって測定することができる。
「マーカー」とは、疾患または障害と関連する発現、レベル、または活性の変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。一態様では、マーカーはSCN1AポリヌクレオチドまたはSCN1Aポリペプチドである。
本明細書で使用する「変異」という用語は、配列中にある、例えば、核酸配列中にあるヌクレオチド塩基もしくはアミノ酸配列中にあるアミノ酸残基と別の残基との置換、または配列中にある1つもしくは複数の残基の欠失もしくは挿入を指す。変異は、典型的には、本明細書中では、元々の残基に続いて、配列中の残基の位置と、新たに置換された残基の同一性(identity)を特定することによって説明される。本明細書において提供されるアミノ酸置換(変異)を加える様々な方法は当技術分野において周知であり、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって示されている。
「薬剤を入手する」にあるような、本明細書で使用する「入手する」は、薬剤を合成する、購入する、または他のやり方で取得することを含む。
「ポリヌクレオチド」とは、1つまたは複数のポリペプチドをコードする、核酸分子、例えば、二本鎖(ds)DNAポリヌクレオチド、一本鎖(ss)DNAポリヌクレオチド、dsRNAポリヌクレオチド、またはssRNAポリヌクレオチドを意味する。この用語は、転写されてRNA転写物を形成することができるプラス鎖(positive-sense)(すなわち、タンパク質をコードする)DNAポリヌクレオチドを包含し、その後にRNA転写物は翻訳されて、1つまたは複数の任意のRNAプロセシング事象(例えば、RNAスプライシングによるイントロン切除、または5’キャップもしくは3’ポリアデニルテールの連結)の後にポリペプチドを生じることができる。この用語は、直接翻訳されて、1つまたは複数の任意のRNAプロセシング事象後にポリペプチドを生じることができるプラス鎖RNAポリヌクレオチドをさらに包含する。本明細書で使用する時、ポリヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)などのウイルスベクターの中に含まれてもよい。
本明細書で使用する「核酸」および「核酸分子」という用語は、核酸塩基と酸性部分を含む化合物、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを指す。典型的に、ポリマー核酸、例えば、3個以上のヌクレオチドを含む核酸分子は直鎖分子であり、この場合、隣接しているヌクレオチドが互いにホスホジエステル結合で連結されている。一部の態様では、「核酸」は、個々の核酸残基(例えば、ヌクレオチドおよび/またはヌクレオシド)を指す。一部の態様では、「核酸」は、3個以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用する、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマー(例えば、少なくとも3個のヌクレオチドの連なり)を意味するために同義で使用することができる。一部の態様では、「核酸」はRNAならびに一本鎖DNAおよび/または二本鎖DNAを包含する。核酸は、例えば、ゲノム、転写物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然の核酸分子の状況では天然でもよい。他方で、核酸分子は、非天然分子、例えば、組換えDNAまたはRNA、人工染色体、操作されたゲノム、もしくはその断片、または合成されたDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドでもよく、非天然のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含んでもよい。さらに、「核酸」、「DNA」、「RNA」という用語、および/または類似の用語は、核酸類似体、例えば、ホスホジエステルバックボーン以外を有する類似体を含む。核酸は天然供給源から精製されてもよく、組換え発現系を用いて産生されてもよく、任意で、精製、化学合成などされてもよい。適宜、例えば、化学合成された分子の場合、核酸は、ヌクレオシド類似体、例えば、化学修飾された塩基または糖と、バックボーン修飾を有する類似体を含む場合がある。核酸配列は、特に定めのない限り、5'→3'方向で示される。一部の態様では、核酸は、天然ヌクレオシド(例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン);ヌクレオシド類似体(例えば、2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、2-アミノアデノシン、C5-ブロモウリジン、C5-フルオロウリジン、C5-ヨードウリジン、C5-プロピニル-ウリジン、C5-プロピニル-シチジン、C5-メチルシチジン、2-アミノアデノシン、7-デアザアデノシン、7-デアザグアノシン、8-オキソアデノシン、8-オキソグアノシン、O(6)-メチルグアニン、および2-チオシチジン);化学修飾された塩基;生物学的に修飾された塩基(例えば、メチル化塩基);インターカレートされた(intercalated)塩基;修飾された糖(2'-e.g.,フルオロリボース、リボース、2'-デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース);ならびに/もしくは修飾されたリン酸基(例えば、ホスホロチオエートおよび5'-N-ホスホルアミダイト結合)であるか、またはこれを含む。
本明細書で使用する「薬学的に許容される」という用語は、生理学的に許容され、かつ患者(例えば、ヒト患者)に投与された時に、典型的に、アレルギー反応または他の有害反応、例えば、胃の不調、めまいなどを生じない分子的実体、生物学的製品、および組成物を指す。
本明細書で使用する「予防する(prevent)」、「予防する(preventing)」、「予防」、「予防的処置」などという用語は、障害または状態がないが、障害もしくは状態を発症するリスクがあるか、障害もしくは状態になりやすいか、または障害もしくは状態の素因がある対象において障害または状態が発症する可能性を小さくすることを指す。
本明細書で使用する「シュードタイプ化された(pseudotyped)」という用語は、1つまたは複数の外来ウイルス構造タンパク質、例えば、エンベロープ糖タンパク質を含有するウイルスベクターを指す。シュードタイプ化ウイルスは、エンベロープのあるウイルスのエンベロープ糖タンパク質またはエンベロープのないウイルスのキャプシドタンパク質が、元々のウイルスゲノムおよびゲノム複製装置の供給源とは異なるウイルスに由来するものであり得る(D.A. Sanders, 2002, Curr. Opin. Biotechnol., 13:437-442)。シュードタイプ化ウイルスの外来ウイルスエンベロープタンパク質を利用して宿主親和性を変えるか、またはウイルス粒子の安定性を増加もしくは減少することができる。シュードタイプ化ウイルスベクターの例には、野生型ウイルスの外側に天然に生じない1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質を含有するウイルスが含まれる。シュードタイプ化ウイルスベクターは細胞に感染し、ウイルスベクターの中に含まれるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質または分子、例えば、レポーターまたはエフェクタータンパク質または分子、例えば、SCN1A遺伝子によってコードされるナトリウムチャンネルNav1.1を発現および産生することができる。
本明細書で使用する「組換え」という用語は、タンパク質または核酸の文脈では、天然では(または天然のタンパク質配列中もしくは核酸配列中では)生じないが、生体工学の産物、多くの場合、または典型的には、当業者によって実施される分子生物学的または分子遺伝学的なツールおよび技法を利用した産物であるタンパク質または核酸を指す。例えば、一部の態様では、組換えタンパク質または核酸分子は、任意の天然配列と比較して、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、少なくとも6つの、少なくとも7つの、または少なくとも8つの変異を含むアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含む。
「低減する」とは、少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、または100％負に変化することを意味する。
「参照」とは標準または対照の条件を意味する。「参照配列」とは、配列比較の基準として用いられる規定された配列である。参照配列は、指定された配列の一部でもよく全体でもよく、例えば、完全長cDNAもしくは遺伝子配列、または完全cDNAもしくは遺伝子配列の一部でもよい。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも約16アミノ酸、少なくとも約20アミノ酸、少なくとも約25アミノ酸、または約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。核酸の場合、参照核酸配列の長さは、一般的に、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、少なくとも約75ヌクレオチド、もしくは約100ヌクレオチド、もしくは約300ヌクレオチド、またはそれに近いか、もしくはその間にある任意の整数である。
「特異的に結合する」とは、所定のポリペプチドおよび/または核酸分子を認識および結合するが、試料、例えば、生物学的試料中にある他の分子を実質的に認識および結合しない、核酸分子、ポリペプチド、もしくはその複合体(例えば、結合タンパク質、例えば、転写因子およびそのコグネイト核酸結合領域)、または化合物、または分子を意味する。
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、例えば、マーモセット、または非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコ哺乳動物、もしくはヒツジ、ヤギ、ラマ、ラクダ、もしくはげっ歯類(ラット、マウス)、フェレット、スナネズミ、ハムスター、もしくはキンカチョウ(zebrafinch)を含むが、これに限定されない哺乳動物を意味する。対象は、典型的には、本明細書に記載の特定の疾患または状態(例えば、神経精神医学的、神経学的、または神経発生的な疾患、障害、または病態、例えば、発作、てんかん、またはDS)に対する処置を受ける患者、例えば、ヒト患者である。対象および患者の例には、このような疾患もしくは状態に対する処置を受けているか、またはこのような疾患もしくは状態を有するリスクがある哺乳動物、例えば、ヒトが含まれる。
本明細書において示される範囲は、この範囲内にある全ての値の省略表現だと理解される。例えば、1～50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を、最初の値と最後の値を含めて含むと理解される。
本明細書で使用する「治療的有効量」という用語は、処置を必要とする患者に投与された時に、疾患、障害、および/または状態の1つまたは複数の症状の発症を処置する、軽減する、低減する、診断する、阻止する、および/または遅延するのに十分な治療剤の量を指す。場合によっては、治療的有効量はまた、疾患またはその症状、例えば、神経学的な、神経変性の、または神経発生的な疾患または障害を発症するリスクがある対象に、予防的に(例えば、最も悪化した疾患の発症に先立って)投与される治療剤の量を指す場合がある。一態様では、障害はドラベ症候群(DS)である。
本明細書で使用する「処置する(treat)」、「処置する(treating)」、「処置」などという用語とは、障害および/またはこれに関連する症状を低減する、または寛解させることを指す。除外されてはいないが、障害または状態の処置は、障害、状態、またはこれらに関連する症状が完全に無くなることを必要としないと理解される。「処置する」または「処置」とは、その目的が、望ましくない生理学的変化または障害を阻止する、または減速する(和らげる、または低減する)ことである治療的処置を指す場合がある。有益な、または望ましい臨床結果には、検出できても検出できなくても、症状の緩和、疾患の程度の低下、疾患の状態の安定化(すなわち、悪化なし)、疾患進行の遅延もしくは緩徐化、疾患状態の寛解もしくは一時的緩和、および(部分的か完全かに関係なく)軽快が含まれるが、これに限定されない。処置を必要とする対象には、状態もしくは障害が既にある対象、ならびに状態もしくは障害にかかりやすい対象、または状態もしくは障害を阻止することになっている対象が含まれる。
本明細書で使用する「予防する(prevent)」、「予防する(preventing)」、「予防」、「予防的処置」などという用語は、対象において疾患状態または疾患の完全発症を阻害またはブロックすること、あるいは疾患、障害、もしくは状態がないが、疾患、障害、もしくは状態を発症するリスクがあるか、または疾患、障害、もしくは状態を発症しやすい対象において疾患、障害、もしくは状態が発症する可能性を小さくすることを指す。
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、核酸(例えば、DNAベクター、例えば、プラスミド)、RNAベクター、ウイルス、または他の適切なレプリコン(例えば、ウイルスベクター)を指す。「ベクター」とは、さらに、ベクターが宿主細胞において発現する能力、宿主細胞において複製する能力、および/または宿主細胞に組み込まれる能力を破壊することなく、外来核酸を挿入することができる核酸(ポリヌクレオチド)分子を指す。外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に送達するために様々なベクターが開発されている。ベクターは、関心対象の遺伝子(例えば、トランスジーン、例えば、治療用遺伝子、レポーター遺伝子、または、さらに具体的には、Nav1.1ナトリウムチャンネルをコードするSCN1A遺伝子)を含むポリヌクレオチド配列、ならびに、例えば、これらのポリヌクレオチド配列の転写、翻訳、および/または細胞ゲノムへの組込みを調整することができる、さらなる配列エレメントを含有し得る。ベクターは、調節配列、例えば、プロモーター、例えば、サブゲノムプロモーター、遺伝子転写を誘導する領域およびエンハンサー領域を含有し得る。ベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を速くするか、または遺伝子転写に起因するmRNAの安定性もしくは核外輸送を改善するポリヌクレオチド配列(エンハンサー配列)を含有し得る。これらの配列エレメントは、発現ベクターに載せて運ばれる遺伝子の効率的な転写を誘導するために、例えば、5’非翻訳領域および3’非翻訳領域、配列内リボソーム進入部位(IRES)、ならびに/またはポリアデニル化シグナル部位を含んでもよい。ベクター、例えば、本明細書に記載のウイルスベクターまたはrAAVベクターも発現ベクターと呼ばれることがある。
「形質導入」とは、ウイルスまたはウイルスベクターの中に含まれるDNAまたはポリヌクレオチド、例えば、1つまたは複数のトランスジーンが、そのウイルスまたはウイルスベクターによって細胞に導入または移入され、そのDNAまたはポリヌクレオチドが発現されるプロセスを指す。一態様では、ウイルスベクター、例えば、本明細書に記載のrAAVベクターによって細胞に形質導入されたDNAまたはポリヌクレオチドは細胞において安定発現される。場合によっては、ウイルスまたはウイルスベクターは細胞に感染すると言われる。
本明細書で使用する「ビヒクル」という用語は、薬学的組成物の溶媒、希釈剤、または担体成分を指す。
「ウイルス粒子」(ビリオンとも呼ばれる)とは、コアウイルスゲノムまたは遺伝物質(RNAまたはDNA)と、遺伝物質を取り囲み、保護する、キャプシドと呼ばれるタンパク質コートと、場合によっては、キャプシドを取り囲む脂質エンベロープを含む独立した粒子として存在するウイルス(感染因子)を意味する。ウイルス粒子とは、細胞に感染し、細胞内に取り込まれる前のウイルスの形態を意味してもよく、細胞に感染したウイルスの形態を意味してもよい。
「ウイルス様粒子(VLP)」とは、1種類または複数種の(one of more)ウイルス構造タンパク質で構成されるが、ウイルスゲノムを欠くウイルス粒子を意味する。VLPにはウイルスゲノムが無いので、非感染性であり、より安全な、かつ潜在的により経済的なワクチンおよびワクチン製品を生じる。さらに、VLPは、多くの場合、異種発現によって産生することができ、簡単に精製することができる。ほとんどのVLPは、少なくとも、宿主細胞からの粒子の出芽と放出を推進するウイルスコアタンパク質を含む。
「実質的に同一の」とは、参照アミノ酸配列(例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか一つ)または核酸配列(例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか一つ)と少なくとも50％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、比較に用いられた配列と、例えば、指定された比較ウィンドウにわたってアミノ酸レベルまたは核酸において少なくとも60％同一であり、好ましくは少なくとも70％同一であり、より好ましくは80％または85％同一であり、最も好ましくは90％、95％、さらには99％同一である。最適アラインメントは、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムを用いて実行され得る。2つのペプチド配列またはポリペプチド配列が実質的に同一であるということは、あるペプチドまたはポリペプチドが、もう一つのペプチドまたはポリペプチドに対して作られた特異的抗体と免疫学的に反応することを示しているが、このような交差反応性は、2つのポリペプチドが実質的に同一であるとみなされることに必要とされない。従って、例えば、2つのペプチドまたはポリペプチドが保存的置換の点だけ異なる場合、あるペプチドまたはポリペプチドは、もう一つのペプチドまたはポリペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似する」ペプチドまたはポリペプチドは、同一でない残基位置が保存的アミノ酸変化の点だけ異なる場合があることを以外は、上記のように配列を共有する。保存的置換には、典型的には、以下のグループ内での置換:グリシンおよびアラニン;バリン、イソロイシン、およびロイシン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;アスパラギンおよびグルタミン;セリンおよびスレオニン;リジンおよびアルギニン;およびフェニルアラニンおよびチロシン、ならびに当業者に公知の他のものが含まれるが、これに限定されない。
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム)を用いて測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および/または他の修飾との相同性の程度を割り当てることによって同一の配列または類似する配列を付き合わせる。保存的置換は、典型的には、以下のグループ:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リジン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシンの中での置換を含む。同一性の程度を求める例示的なアプローチでは、密接に関係する配列を示すe-3～e-100の確率スコア(probability score)を用いてBLASTプログラムが用いられることがある。
「実質的に同一の」とは、一般的に、参照アミノ酸配列(例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか一つ)または核酸配列(例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか一つ)に対して少なくとも50％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。態様では、このような配列は、比較に用いられる配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸において少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくはそれより大きく同一であるか、または少なくとも99％同一である。
本明細書に記載の方法および組成物において有用なポリヌクレオチドまたはウイルス核酸分子には、ポリペプチドもしくはその断片をコードするか、または本明細書に記載のウイルスベクターの成分をコードする任意の核酸分子が含まれる。前記ポリヌクレオチドまたはウイルス核酸分子は、前記ウイルスベクター、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)などに含まれるポリペプチド産物、ならびにそのペプチドまたは断片をコードしてもよい。このような核酸分子は、内因性配列またはウイルスベクター核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示す。内因性配列またはウイルスベクター配列に対して実質的な同一性を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1本の鎖と、またはウイルスベクター核酸分子とハイブリダイズすることができる。説明された方法において有用な核酸分子には、本明細書に記載のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシー条件下で対形成すること、すなわち、相補的なポリヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載の遺伝子もしくは核酸配列)またはその一部の間で核酸分子が二本鎖分子を形成することを意味する(例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい)。
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、普通、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウムより低く、好ましくは、約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウムより低く、より好ましくは、約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウムより低い。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得ることができるのに対して、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、普通、少なくとも約30℃、より好ましくは、少なくとも約37℃、最も好ましくは、少なくとも約42℃の温度を含む。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の濃度、および担体DNAの採用または不採用などの様々なさらなるパラメータが当業者に周知である。様々なストリンジェンシーレベルが、必要に応じて、これらの様々な条件を組み合わせることによって成し遂げられる。一態様では、ハイブリダイゼーションは、30℃で、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1％SDSの中で行われる。さらに好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは、37℃で、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミド、および100μg/ml変成サケ精子DNA(ssDNA)の中で行われる。別の態様では、ハイブリダイゼーションは、42℃で、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミド、および200μg/ml ssDNAの中で行われる。これらの条件の有用なバリエーションは当業者に容易に明らかである。
ほとんどの用途について、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もストリンジェンシーが変化する。洗浄ストリンジェンシー条件は塩濃度と温度によって規定することができる。前記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を下げることによって、または温度を上げることによって高めることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウムより低く、最も好ましくは、約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウムより低い。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、普通、少なくとも約25℃、より好ましくは、少なくとも約42℃、さらにより好ましくは、少なくとも約68℃の温度を含む。一態様では、洗浄工程は、25℃で、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSの中で行われる。別の態様では、洗浄工程は、42℃で、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSの中で行われる。さらに別の態様では、洗浄工程は、68℃で、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSの中で行われる。これらの条件のさらなるバリエーションは当業者に容易に明らかである。ハイブリダイゼーション技法は当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York);およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号によって許される最大コドン縮重を用いて1コピーの核酸が作り出される時に発生する。このような場合、核酸は、典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の非限定的な例は、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSの緩衝液中、37Cでのハイブリダイゼーションと、45Cで1xSSCでの洗浄を含む。ポジティブハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、別のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用して同様のストリンジェンシー条件を得ることができることを容易に認める。
「オルソログ」とは、別の生物に由来する参照タンパク質または核酸配列と高度に関連する、ある生物の任意のポリペプチドまたは核酸分子を意味する。関連性の程度は、参照タンパク質が、例えば、blast検索において配列を特定する可能性で表されることがある。参照配列がランダム配列をオルソログとして特定する可能性は極めて低く、e-10、e-20、e-30、e-40、e-50、e-75、e-100より小さい。当業者は、オルソログが参照タンパク質または核酸配列と機能上関連する可能性が高いことを理解する。言い換えると、オルソログとその参照分子、例えば、マウスオルソログとヒトオルソログは、それぞれの生物において、同等でないにしても類似する機能的役割を果たすと予想される。
オルソログは参照配列とアライメントされた時に参照配列に対して特定の程度のアミノ酸配列同一性を有することが必要とされない。タンパク質オルソログは、タンパク質の全長にわたって、かなりのアミノ酸配列同一性を共有してもよく、例えば、または代わりに、タンパク質のたった1つの機能的に重要なドメインにわたって、かなりのアミノ酸配列同一性を共有してもよい。このような機能的に重要なドメインは遺伝子変異によって規定されてもよく、構造機能アッセイによって規定されてもよい。オルソログは、当技術分野において実施される方法を用いて特定することができる。オルソログの機能的役割は、当業者に周知の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、機能は、生化学的アッセイ、免疫学的アッセイ、もしくは酵素アッセイ;または形質転換レスキュー(transformation rescue)を用いてインビボまたはインビトロでアッセイされる場合がある。または、バイオアッセイは組織培養物中で行われる場合がある。機能はまた、遺伝子不活性化によって(例えば、RNAi、siRNA、もしくは遺伝子ノックアウトによって)アッセイされてもよく、遺伝子過剰発現によってアッセイされてもよく、ならびに他の方法によってアッセイされてもよい。
本明細書において示される範囲は、この範囲内にある全ての値の省略表現だと理解される。例えば、1～50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を、最初の値と最後の値を含めて含むと理解される。
SCN1Aとは、SCN1A、ヒトアイソフォーム1、OmniProt識別番号P35498-1(長さ2,009アミノ酸;質量(Da):228,972); RefSeq番号NP_001159435.1; NP_001189364.1; NP_001340877)の古典的アミノ酸配列のアミノ酸配列に対して少なくとも約85％もしくは85％または少なくとも約90％、約95％、約98％、約99％もしくは90％、95％、98％、99％、あるいはそれより大きなアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(ナトリウムチャンネルNav1.1)またはその断片を意味する。ヒトSCN1Aのポリペプチド(タンパク質)配列は以下の通りである:
Figure 2022519623000001
Figure 2022519623000002
Nav1.1ナトリウムチャンネルは、以下に示したように、アクセッション番号NCBI CCDS 54413.1(RefSeq番号NM_001165963.2; NM_001202435.2; NM_001353948.1)のSCN1Aポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約85％もしくは85％、または少なくとも約90％、約95％、約98％、約99％もしくは90％、95％、98％、99％、あるいはそれより大きな配列同一性を有するヒトSCN1Aポリヌクレオチド配列またはその断片によってコードされる(Genome Reference Consortium GRCh38.p12からのゲノム情報。GenBank assembly accession: GCA_000001405.27(最新); RefSeq assembly accession: GCF_000001405.38(最新))。
SCN1Aヌクレオチド配列(6030nt):
Figure 2022519623000003
Figure 2022519623000004
SCN1A遺伝子によってコードされるナトリウムチャンネルNav1.1は皮質にある複数の別個のニューロン集団において発現している。これらには、3つの重複しないニューロン集団:パルブアルブミンを発現するファストスパイキング皮質介在ニューロン(PV cIN)、血管作用性小腸ペプチドを発現する脱抑制性(dis-inhibitory)皮質介在ニューロン(VIP cIN)、および層5錐体ニューロンが含まれる。
非改変ヒトムスカリン性アセチルコリン受容体M3のアミノ酸配列は、以下に示したようにNCBI参照配列NP_000731.1で提供される。本明細書中では、以下のアミノ酸配列:
Figure 2022519623000005
に対して少なくとも約85％もしくは85％、または少なくとも約90％、約95％、約98％、約99％もしくは90％、95％、98％、99％、あるいはそれより大きな配列同一性を有するポリペプチドもしくはタンパク質またはその機能的断片も包含される。
ヒトGq-DREADD(hM3Dq)興奮性受容体のアミノ酸配列は、上記で示した非改変ヒトムスカリン性アセチルコリン受容体M3のアミノ酸配列に由来する。以下:
Figure 2022519623000006
に示されるように、Gq-DREADD(hM3Dq)受容体アミノ酸配列(590aa)において位置149にあるチロシンはシステインによって交換され、位置239にあるアルギニンはグリシンによって交換されている(米国特許出願公開第2018/0078658号)。
具体的に述べられていない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する「または」という用語は包括的(inclusive)であると理解される。具体的に述べられていない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という用語は単数または複数であると理解される。
本明細書で使用する「約(about)」または「約(approximately)」という用語は、説明された値のタイプ、およびその値を測定するのに用いられる方法の許容可能な誤差範囲内にあることを意味する。例えば、これらの用語は、所定の値または範囲の20％以内、より好ましくは、10％以内、最も好ましくは、さらに5％以内にあることを示すことができる。さらに具体的には、「約(about)」とは、述べられた値または範囲の20％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.1％以内、0.05％以内、または0.01％以内にあると理解することができる。または、特に生物系では、「約(about)」という用語は、所定の値の1log単位(すなわち、1桁)以内、好ましくは、2分の1の範囲内にあることを意味する。具体的に述べられていない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する「約(about)」という用語は、当技術分野において正常な許容誤差の範囲内にある、例えば、平均の2標準偏差内にあると理解される。文脈から明らかでない限り、本明細書において提供される数値は全て約という用語によって修飾される。
本明細書における変数の任意の定義における化学グループまたは成分グループの一覧の説明は、任意の1つのグループとして、または列挙されたグループの組み合わせとして、その変数を定義することを含む。本明細書における変数または局面についての態様の説明は、本開示に記載のように任意の1つの態様として、または他の任意の態様もしくはその一部と組み合わせて、その態様を含む。
本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供される他の任意の組成物および方法のいずれか1つまたは複数と組み合わせることができる。
図1A-1、1A-2、1A-3、1B-1、1B-2、1C、および1Dは、本明細書中で「E1～E35」と呼ばれる特異的エンハンサー(調節)配列の発見および特定に関連する表形式データおよび情報を示す。PV発現介在ニューロンなどのGABA作動性介在ニューロンにおける、SCN1A制限遺伝子発現に特異的なエンハンサー、例えばE1～E10、ならびに表に示された他の遺伝子を標的とするエンハンサーを示した。図1A-1は、マウスゲノム中にある、E1～E35と呼ばれる35(35)のエンハンサーエレメントの遺伝子、標的(例えば、ニューロン細胞タイプ)、特異性、位置(例えば、遺伝子間またはイントロン)、染色体場所ならびにゲノム配列の開始部位および停止部位の特徴を示した表形式データを示す。同様に、図1A-2および1A-3は、ヒトゲノム中にある、これらの35(35)のE1～E35エンハンサーエレメントの遺伝子、標的(例えば、ニューロン細胞タイプ)、特異性、位置(例えば、遺伝子間またはイントロン)、染色体場所ならびにゲノム配列の開始部位および停止部位の特徴を示した表形式データを示す。例として、エンハンサー(調節)エレメントE1～E10(本明細書中ではS5E1～S5E10とも呼ばれる)が、マウスゲノム(図1A-1)ならびにヒトゲノム(図1A-2および1A-3)においてヒトSCN1A遺伝子の付近で特定された。図1A-1～1A-3では、本明細書に記載のマウスエンハンサーエレメントおよびヒトエンハンサーエレメントのポリヌクレオチド配列は、表(ならびに図15A-1、15A-2、16A-1、および16A-2の表)に示したようにマウスゲノムおよびヒトゲノムに開始部位および停止部位を有する。マウスエンハンサー配列およびヒトエンハンサー配列は、図1A-1～1A-3の表に列挙したウェブアクセス可能なゲノム情報を介して提供される。図1B-1および1B-2は、脳の皮質層にあるPV発現介在ニューロンにおける、E1～E10エンハンサーエレメントによって制限されたレポーター遺伝子発現を示した画像を示す。画像は、ベクターによって形質導入された特異的細胞の検出を可能にする、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターを動物(マウス)に全身インビボ注射した後の脳切片におけるdTomatoに対する免疫組織化学的(IHC)染色分析の結果を示す。図1Cおよび1Dは、皮質中のPV発現介在ニューロンにあるレポーター遺伝子発現の特異性(図1C)および感度(図1D)の程度の定量を示したグラフを示す。レポーター遺伝子の発現は、rAAVベクターに含まれるE1～E10エンハンサーエレメントによって制御される。特異性は、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターを動物(マウス)に全身インビボ注射した後の脳切片上の免疫組織化学によって評価された時の、PV介在ニューロンマーカーPVを同時発現する、ウイルスレポーターdTomatoを発現する細胞の割合として定量された。感度は、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターを動物(マウス)に全身インビボ注射した後の脳切片上の免疫組織化学によって評価された時の、ウイルスレポーターdTomatoを同時発現する、PV介在ニューロンマーカーPVを発現する細胞の割合として定量された。棒グラフは平均+/-平均の標準誤差(s.e.m.)を表す。 図1A-1-1の説明を参照のこと。 図1A-1-1の説明を参照のこと。 図1A-1-1の説明を参照のこと。 図1A-1-1の説明を参照のこと。 図1A-1-1の説明を参照のこと。 図1A-1-1の説明を参照のこと。 図1A-1-1の説明を参照のこと。 図1A-1-1の説明を参照のこと。 図1A-1-1の説明を参照のこと。 図2Aおよび2Bは、皮質を含む脳構造全体にわたる、E2エンハンサーエレメント配列と、レポータートランスジーン(例えば、d-Tomato)またはエフェクター遺伝子(例えば、Gq-DREADD)を含有するrAAVベクターを用いたレポーター遺伝子発現の局在を示した画像を示す。図2Aは、ベクターによって形質導入された特異的細胞の検出を可能にする、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターを動物(マウス)に全身インビボ注射した後の脳切片(図の上部にある矢状切片;図の下部にある冠状切片)における、dTomatoレポーターに対する免疫組織化学的(IHC)染色分析の結果を示した画像を示す。図2Bは、特異的なPV発現細胞の検出を可能にする、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターを動物(マウス)に全身インビボ注射した後の脳切片における、発現されたdTomatoレポーターに対する免疫組織化学的(IHC)染色分析の結果を示した画像を示す。脳切片における、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターからのレポーター遺伝子発現を(図2Bの左パネルに赤色で)視覚化した。pAAV-S5-E2-Gq-DREADD-dTomatoからのレポーター遺伝子発現を、図2Bの右パネルにGq-DREADDの場合は緑色で、dTomatoの場合は赤色で視覚化した。前記ベクターによって形質導入された特異的なPV発現細胞の検出を(図2Bの左パネルおよび図2Bの右パネルに)視覚化した。 図2Aの説明を参照のこと。 図3A～3Fは、SCN1Aエンハンサーの特定に関連する模式図、プロット、グラフ、および共焦点顕微鏡画像を示す。図3Aは、scATAC-seqパイプラインの模式図を示す。介在ニューロンを成獣Dlx6aCre::Sun1-eGFPマウスの視覚皮質から収集した。図3Bは、UMAP空間における3500個の核のプロットを示す。SnapATACパイプラインから得られたクラスターを4つの主要なクラスの介在ニューロンにまとめた。図3Cは、4つの介在ニューロン集団、PV、SST、VIP、およびID2全体にわたるユニークなピークおよび共通のピークの数を示したベン図を示す。図3Dは、本明細書中の方法(実施例8)に記載のような、SCN1A遺伝子座でのエンハンサー選択方法の模式図を示す。図3Eおよび3Fは、成獣マウスに、説明されたようにエンハンサーエレメントを含有する示されたrAAV-E[x]-dTomatoベクターを全身注射した後に得られた結果と、注射して3週間後の分析を示す。S1皮質におけるレポーターと、示されたマーカーに対する免疫組織化学的(IHC)評価を用いてレポーターの発現強度(図3E、上パネル)と、示されたマーカーに対するウイルスレポーター発現の特異性(他の全てのパネル)を評価した。体性感覚皮質における、示されたウイルスレポーターの代表的な蛍光画像(図3F、左パネル)。破線は解剖学的構造の限界を表す。スケールバーは100μmを表す。グラフ上にある点は個々の測定値を示し、線は平均+/-s.e.mを表す。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図4A～4Eは、マウスにおけるPV皮質介在ニューロン(PV cIN)のウイルスターゲティングに関連する画像、グラフ、および記録トレースを示す。成獣マウスに、E2調節エレメントの制御下でレポーターdTomatoを発現するrAAV-E2-dTomatoを全身注射(図4A～4B画像)または局所注射(図4D)し、注射して3週間後に、レポーターおよびPVマーカーの両方に対する免疫組織化学(IHC)またはISHによって分析した。図4Cは、ウイルスにより標識されたニューロンの内在(intrinsic)特性のスライス記録を示す。図4D(右パネル)は、レポーターの発現強度と比べた、PVを同時発現するレポーター発現細胞の割合として示された発現の特異性を図示したグラフを示す。図4Eは、E2調節エレメントの制御下でレポーターdTomatoを発現するrAAV-E2-dTomatoをマウスに局所注射し、レポーターと、示されたマーカーについて、示された発育段階で分析した実験に起因する画像を示す。スケールバーは250μm(図4A)および50μm(図4B、4D、4E)を表す。グラフにある点は個々の測定値を示し、線は平均+/-s.e.mを表す。 図5A～5Eは、マウスにおけるウイルスモニタリングおよびPV皮質介在ニューロン(PCc IN)の操作に関連する画像、電流固定記録トレース、およびグラフを示す。マウスの体性感覚(S1)皮質にrAAVを局所注射(図5A-rAAV-E2-SYP-dTomatoを用いたP10注射;図5B-rAAV-E2-GCaMP6fを用いたP14注射;図5Dおよび5E-rAAV-E2-C1V1-eYFPを用いた成獣注射)または全身注射した(図5C-rAAV-E2-PSAM4-5HT3-LC-GFPを用いた成獣注射)。図5Aは、注射して1週間後のSYP-dTomatoレポーターとシナプスマーカーSyt2との共局在の代表的な画像と、対応する定量を示す。図5Bは、注射して2～3週間後に行った洞毛刺激時のCa2+イメージングの結果を示す。右パネルでは、成功率を、洞毛刺激に応答して閾値を上回ったΔF/Fピークの割合として計算した。図5Cは、注射して4週間後に脳切片上で行った電流固定記録の結果を示す。トレースは、ベースライン時とバレニクリンのバス適用後の示された電流での代表的な細胞応答を示す。図5Dは、注射して1週間後の脳切片上で行った電流固定記録の結果を示す。ウイルスレポーター発現細胞を2秒間の一定のレーザー刺激(550nm)に曝露している間に、電圧を3秒間にわたって記録した。レーザー刺激中に、ウイルスレポーターを発現しない、隣接している錐体細胞も記録した。図5Eは、ニューロン活動のインビボシングルユニット分析を図示し、レーザー刺激時のウイルス感染ニューロンのラスタープロットと、対応する集団定量データを示す。左パネルはファストスパイキング細胞を示し、右パネルは、通常のスパイキング興奮細胞を示す。注目すべきことに、局所ウイルス注射のモザイク性のために、個々の細胞応答は二峰性であった。これは、特定の細胞が感染しているか、感染していないかを反映している可能性が高い。スケールバーは5μmを表す。「トライアル(Trial)」対「時間(Time)」グラフの上にある中央のバーはレーザー刺激を表している。グラフにある点は個々の測定値を示し、線は平均+/-s.e.mを表す。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図6Aおよび6Bは、ヒトを含む霊長類におけるウイルスターゲティングおよびPV皮質介在ニューロン(PV cIN)の操作に関連した図、グラフ、画像、および記録トレースを示す。図6A:示された種に由来する動物にrAAV-E2-C1V1-eYFP(マカク)またはrAAV-E2-dTomato(ラットおよびマーモセット)を局所注射(ラットおよびマカク)または全身注射し(マーモセット)、注射して2～8週間後に分析した。発現の特異性は、PVを同時発現する、ウイルスにより標識された細胞の割合として示された。図6B:外科的切除から得られたヒト脳組織をrAAV-E2-dTomato(i～iii)またはrAAV-E2-C1V1-eYFP(iv)に曝露し、培養状態で7～14日間維持した。右上パネルは、内在特性の電気生理学的記録によって評価された時の、ウイルスにより標識された細胞中のファストスパイキングニューロンの割合を示す。(iv)レーザー刺激時のウイルスにより標識された細胞の電気生理学電流固定記録。スケールバーは25μmを表す。「直接的光活性化(PV)」トレースの上にあるバーはレーザー刺激を表し、矢じりは、PVとウイルスレポーターを同時発現するニューロンを示す。グラフ上にある点は個々の測定値を示し、線は平均+/-s.e.mを表す。 図6Aの説明を参照のこと。 示されたrAAV-E[x]-dTomウイルスレポーターベクターを全身注射し、ウイルスレポーターに対するIHCを用いて注射して3週間後に分析した成獣マウスに由来する矢状切片の蛍光画像を図示する。スケールバーは500μmを表す。 図8A～8Dは、成獣マウスにrAAV-E2-dTomatoを全身注射した後の結果の画像およびグラフを示す。図8Aは、ウイルスにより標識されたニューロンの内在特性のスライス記録に関する。左パネルは、ウイルスレポーターを発現する代表的な細胞を示す。真ん中の上部にある三角形のトレースは記録用ピペットを表している。定量は、示されたパラメータを示す。「同一性(Identity)」グラフにある灰色が濃い方の点は、典型的なファストスパイキング(FS)特性を有する細胞を表している。図8Bは、ポジティブ(positive)およびネガティブ(negative)ファストスパイキング細胞(それぞれ、FSおよびnFS)の代表的なスライス記録トレースを示す。スケールバーは20μmを表す。グラフ上にある点は個々の測定値を示し、線は平均+/-s.e.mを表す。図8Cおよび8Dは、成獣マウスにrAAV-E2-dTomatoを全身注射した後の結果と、注射して3週間後の分析を示す。図8C:冠状切片および矢状切片を、ウイルスレポーターおよびPVに対するIHCで分析し、脳領域全体にわたるPVに対する特異性を報告した。図8D:示された臓器からのネイティブウイルス発現を分析した。スケールバーは100μm(図8C)および250μm(図8D)を表す。グラフ上にある点は個々の測定値を示し、線は平均+/-s.e.mを表す。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図9A～9Cは、画像、記録トレースデータ、およびグラフを示す。マウスに全身注射(図9A:rAAV-E2-GCaMP6fを用いたP14注射)および体性感覚皮質への局所注射(図9B:rAAV-E2-C1V1-eYFP;図9C:rAAV-E2-GqDREADD)を行った。図9A:注射して1週間後にマウスを分析した。左パネルは、中央のパネルにあるパウンド(pound)徴候によって示される2つの代表的なピークの広視野画像を示す。右パネルは、GCaMP記録後に撮影した蛍光画像を示す。図9B:注射して1週間後にスライス電気生理学電流固定記録を行った。ウイルスレポーター発現細胞を10Hzまたは40Hzレーザー刺激(550nm)でターゲティングしている間に、電圧を3秒間にわたって記録した。図9C:注射して1週間後にスライス電気生理学電流固定記録を行った。CNOバス適用の前後に電圧を記録した。スケールバーは500μmを表す。「+CNO」バーはレーザー刺激を表す。グラフ上にある点は個々の測定値を示す。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図10Aおよび10Bは、外科的切除から得られたヒト脳組織をAAV-E2-dTomatoに曝露し、培養状態で7～14日間維持した研究に関連した染色画像およびデータプロットを示す。図10A:記録作業中にビオシチンで満たした、ウイルスにより標識された細胞の樹状突起の代表的な画像。図10B:ウイルスにより標識されたニューロンの内在特性のスライス記録。定量は、示されたパラメータを示す。「同一性(Identity)」グラフにある濃い方の右端の点は、典型的なファストスパイキング(FS)特性を有する細胞を表している。スケールバーは100μmを表す。グラフにある点は個々の測定値を示し、線は平均+/-s.e.mを表す。 図11は、マーカー/レポーター発現細胞の定量を示した表を示す。実施例7に記載のように、定量は、最低2個の独立したバイオロジカルレプリケートを用いて行った。表には、それぞれの個々の定量について特定の数の細胞と条件を示した。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 示された古典的な介在ニューロンマーカーのプロモーターアクセシビリティを反映している、4匹のDlx6aCre::Sun1-GFPマウスから収集した3500個のニューロン核のUMAPプロットを示す。 図13Aおよび13Bは、領域特異性があるウイルスエンハンサーの特定に関連したスライス、画像、およびグラフを示す。図13A:成獣マウスに、エンハンサーエレメントポリヌクレオチド配列と、検出可能なレポーターまたはマーカー(例えば、GFP)ポリヌクレオチド、すなわち、rAAV-E[x]-eGFPを含有する示されたrAAVベクターを全身注射し、注射して3週間後に分析した。S1皮質におけるレポーターと、示されたマーカーに対する免疫組織化学(IHC)を用いて、ウイルスレポーターを発現するニューロン細胞体の密度(左パネル)と、示されたマーカーに対するウイルスレポーター発現の特異性(右パネル)を評価した。E29ウイルスの場合、視床網様核(TRN)を除いて視床には細胞体が観察されなかった。図13B:成獣マカクのV1にrAAV-E22-eGFPを注射し、レポーターと、示されたマーカーに対するIHCを用いて注射して8週間後に分析した。スケールバーは100μm(a)、50μm(b、左)、および10μm(b、右)を表す。グラフ上にある点は個々の測定値を示し、線は平均+/-s.e.mを表す。 図13A-1の説明を参照のこと。 図13A-1の説明を参照のこと。 成獣マウスに、示された改変rAAV-E2-dTomato構築物を注射し、ウイルスレポーターと、PVに対するIHCを用いて注射して3週間後に分析した研究に関連した画像およびグラフを示す。対応する特異性をグラフの右側に示した。スケールバーは2μmを表す。グラフ上にある点は個々の測定値を示し、線は平均+/-s.e.mを表す。 図15A-1および15A-2は、関連する遺伝子、標的集団、標的集団に対する特異性、場所、ATACピークの存在、およびヒト配列との保存を含む、試験した全てのエンハンサーの仕様を含む表を示す。 図15A-1の説明を参照のこと。 図16A-1および16A-2は、エンハンサー名(E1～E35)、遺伝子、標的、％特異性、マウス染色体場所(マウス_mm10_Chr)、マウスゲノム中のエンハンサー配列開始部位(マウス_mm10_開始)、マウスゲノム中のエンハンサー配列停止部位(マウス_mm10_停止)、サイズ(塩基対(bp))、ヒト染色体場所(ヒト_hg38_Chr)、ヒトゲノム中のエンハンサー配列開始部位(ヒト_hg38_開始)、ヒトゲノム中のエンハンサー配列停止部位(ヒト_hg38_停止)、およびマウスエンハンサー配列とヒトエンハンサー配列との間の保存パーセントを含む、試験したエンハンサーのそれぞれに関連した様々なパラメータを編集した表を示す。図15A-1および15A-2、ならびに図16-A1および16-A2、ならびに図1A1～1A3に示した表には、列挙したエンハンサーE1～E35のそれぞれのポリヌクレオチド配列について示した塩基対(bp)の総数は、当業者により理解されるように、配列中で数えられた最初の塩基対(bp)の数値がゼロ(0)であることを反映している。それにもかかわらず、各エンハンサー(E1～E35)のポリヌクレオチド配列を含むbpの総数は、本明細書に記載の図に示した表にされたデータに基づいて、単に配列中の全bpの数を数えることによって入手することができる。 図16A-1の説明を参照のこと。
本態様の詳細な説明
本明細書において特徴付けおよび説明される態様は、ウイルスベクター、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターと共に使用するための、例えば、機能的に異なるニューロンサブタイプ、特に、大脳皮質内にあるニューロンサブタイプをターゲティングするためにウイルスベクター、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターと共に使用するための、複数の新たなエンハンサー(E1～E35)を特定するために開発された戦略、方法、および産物に関する。疾患遺伝子SCN1Aの調節特性を調べることで、非限定的な例として、パルブアルブミン(PV)皮質介在ニューロンおよび血管作動性腸管ポリペプチド(VIP)皮質介在ニューロンに選択的な2種類のエンハンサーを含む、疾患遺伝子SCN1Aの発現の範囲(breadth)をターゲティングするエンハンサーが特定された。これらの調節エレメントの機能的有用性が証明され、PV特異的エンハンサーが、マウスからヒトまで種を越えて、これらのニューロンの選択的ターゲティングおよび操作を可能にすることが見出された。さらに、本明細書に記載の選択方法は、他の遺伝子、ならびに別個の脳領域に対する高度の特異性を有する、特徴付けられた、ある特定のPV特異的エンハンサー、例えば、E11、E14、E22、およびE29に一般化することができる。このエンハンサー配列を有する組換えウイルスベクター、例えば、rAAVベクターは、細胞タイプ特異的な回路操作において使用するための、ならびに神経病理学的または神経精神医学的な疾患、状態、および病態を処置する、および寛解させるための治療介入において使用するためのウイルスツールを提供する。
神経学的、神経発達的、神経発生的、または神経精神医学的な疾患、障害、および病態を処置する、または寛解させるための具体的なウイルスベースの治療用産物、組成物、方法、およびアプローチが本明細書において説明される。説明されたように、遺伝子送達用のウイルスベクターおよびビヒクルが、特異的エンハンサー配列(エンハンサー)と、関心対象の遺伝子、例えば、エフェクター遺伝子(例えば、トランスジーンまたはレポーター遺伝子)のポリヌクレオチド配列を含有するように設計および産生され、これらは、前記ウイルスベクターまたはビヒクルによる介在ニューロンまたはニューロン細胞への形質導入後に特定の介在ニューロンまたはニューロン細胞集団において特異的および機能的に発現される。一態様では、特異的エンハンサー配列(エンハンサー)のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターまたはビヒクルであって、前記ウイルスベクターまたはビヒクルによる介在ニューロンまたはニューロン細胞への形質導入後に、特定の介在ニューロンまたはニューロン細胞集団において特異的および機能的に発現されるウイルスベクターまたはビヒクルが提供される。一態様では、前記ウイルスが有するエンハンサーは、トランスジーンの発現を、ある特定の介在ニューロン細胞またはニューロン細胞に限定することができる。態様では、トランスジーンの発現は、その遺伝子に欠損がある細胞において発現するように制限される。一態様では、トランスジーンの発現は介在ニューロンまたは他のニューロン細胞において特異的に調節される。他の態様では、トランスジーンはエフェクター遺伝子または治療用遺伝子である。態様では、エンハンサーエレメントは、遺伝子の発現を、ファストスパイキング皮質介在ニューロンであるパルブアルブミン(PV)発現皮質介在ニューロン細胞(PV-cIN細胞);血管作用性小腸ペプチド(VIP)を発現する脱抑制性皮質介在ニューロン細胞(VIP cIN細胞);および錐体(PYR)ニューロン、特に、脳の皮質層5の錐体ニューロンを含む1つまたは複数のニューロン細胞タイプに制限する。
一態様では、前記ウイルスベクターは、特異的エンハンサー配列と、神経学的、神経発達的、または神経発生的な疾患、障害、または状態と関連するトランスジーン(エフェクター遺伝子)を含有し、エンハンサーは、トランスジーンの発現を、その遺伝子が機能喪失しているか、その遺伝子に欠損があるか、または神経学的もしくは神経発生的な疾患、障害、および病態と関連する、その遺伝子の変異体、変種、もしくは欠陥型を発現する介在ニューロン細胞集団に限定することができる。特定の態様では、ウイルスベクターポリヌクレオチドに挿入されるエンハンサー配列は、Nav1.1ナトリウムチャンネルをコードするSCN1A遺伝子の発現を調節し、発現をSCN1A発現細胞、特に、GABA作動性介在ニューロン細胞に限定する特異性があるものとして特定される。SCN1A遺伝子の機能喪失は、認知障害および早死に関連する薬剤抵抗型の乳児てんかんである衰弱性疾患ドラベ症候群(DS)の最も一般的な症例である。ある特定の態様では、介在ニューロンにおけるトランスジーン(エフェクター遺伝子)の特異的発現は、GABA GAD67、またはPV介在ニューロン細胞マーカーなどがあるが、それに限定されるわけではない、介在ニューロン細胞に特異的なマーカーの検出によって確かめられ得る。一態様では、前記ウイルスベクターまたはビヒクルはアデノ随伴ウイルス(AAV)または組換えAAV(rAAV)である。「AAV」および「rAAV」という用語は本明細書において同義で用いられる。
「トランスジーン」という用語は、本明細書に記載のrAAVベクターまたはビヒクルに含まれる関心対象の遺伝子(エフェクター遺伝子)を指すために本明細書中で用いられ、特に、遺伝子の発現を、規定された細胞集団、例えば、PV発現介在ニューロンもしくはSCN1A発現介在ニューロンまたはそのサブタイプに制限する、これもrAAVベクターに含まれるエンハンサー配列によって、本明細書に記載のように、ある特異的細胞タイプまたは集団において特異的に発現され、機能する。場合によっては、関心対象の遺伝子(エフェクター遺伝子)は、rAAVによって形質導入される細胞タイプにおいて発現しており、コードされている産物が、細胞、例えば、トランスジーンと同じ遺伝子の機能喪失がある細胞において正常な産物または正常に機能する産物を提供するように機能する正常型の遺伝子である。場合によっては、トランスジーンまたはエフェクター遺伝子は、rAAVベクターによる細胞の形質導入後に検出可能なシグナルを提供するレポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)または赤色蛍光タンパク質(RFP)でもよい。場合によっては、トランスジーンまたはエフェクター遺伝子は、レポーターと、発現および活性があると正常な細胞機能をもたらす産物をコードする遺伝子の両方でもよい。後者のタイプの遺伝子は治療用遺伝子だとみなされる場合がある。特定の態様では、rAAVは、SCN1A特異的エンハンサー配列とSCN1Aトランスジーンを含有する。
本明細書に記載のrAAVベクターおよび方法は、少なくとも部分的には、特異的エンハンサーが、前記ウイルスベクターによって運ばれるトランスジーン、例えば、神経学的な疾患、障害、もしくは病態と関連する遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を、その遺伝子が発現しており、コードされている遺伝子(トランスジーン)産物が機能している、脳内にある介在ニューロン細胞(「介在ニューロン」)に制限できるという発見と証明に基づいている。一態様では、このような発現された機能的な遺伝子は、介在ニューロン細胞の正常機能に関与する産物をコードする遺伝子の異常な機能、普通でない機能、または機能の欠如を相殺するか、それを取り替えるか、またはそれに取って代わる。
一態様では、哺乳動物においてトランスジーンの発現をGABA作動性PV発現介在ニューロンに制限するために、適切なウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、または、特に、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターが用いられ、この場合、本明細書に記載のエンハンサーエレメントはシスで提供される。態様では、エンハンサーエレメントは、S5E1(E1)、S5E2(E2)、S5E3(E3)、S5E4(E4)、S5E6(E6)、S5E7(E7)、S5E8(E8)、S5E9(E9)、S5E10(E10)のうちの1つである。態様では、エンハンサーエレメントは、本明細書に記載のような、ウイルスレポーターの発現をパルブアルブミン(PV)発現皮質介在ニューロン(PV cIN)に限定することができるE2、VIP介在ニューロンに選択的なE6、または全皮質層にわたって介在ニューロン集団を標識するが、脳皮質の層5にある錐体ニューロン、特に、グルタミン酸作動性錐体ニューロンに特に選択的であるE5である。特定の態様では、エンハンサーエレメントはE2である。別の特定の態様では、エンハンサーエレメントはE5である。さらに別の特定の態様では、エンハンサーエレメントはE6である。
一態様では、前記エンハンサーを含むウイルスベクターまたはrAAVベクターは、発作、全形態のてんかん、またはDSの処置および療法のために、形質導入されたPV発現介在ニューロン細胞において1コピーのSCN1Aを発現させる。他の態様では、前記エンハンサーを含むベクターまたはrAAVベクターは、全形態の発作、焦点性てんかんおよび薬理学的に難治性のてんかんを含むてんかんを処置するために、ならびにDSおよびその症状を処置するためにも、PV介在ニューロン活動の化学遺伝学的調節のためのGq-DREADDまたはPSAMのようなエフェクターを発現させる。
一般的に、ウイルスベクターまたはrAAVベクターは、本明細書に記載のS5E1～S5E10より選択されるエンハンサー配列を含むポリヌクレオチドと、トランスジーン配列、例えば、SCN1A遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、hM3Dq改変ムスカリン受容体(Gq-DREADD)受容体をコードするポリヌクレオチド配列、またはPSAMをコードするポリヌクレオチド配列を含む。一態様では、前記ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のE2、E5、またはE6より選択されるエンハンサー配列を含む。ある特定の態様では、発作およびてんかん、さらに具体的にはドラベ症候群に対する治療的処置および予防的処置のための方法が、それを必要とする個体(例えば、ヒト患者)において提供される。
一態様では、必要とする個体または対象、例えば、発作、てんかん、またはDSに苦しんでいる患者に、SCN1A、Gq-DREADD、またはPSAMが個体または対象の介在ニューロン、特に、PV発現介在ニューロンにおいて発現されるように、本明細書に記載のエンハンサー配列、例えば、E2、E5、またはE6と、例えば、SCN1Aコードポリヌクレオチド配列、hM3Dq改変ムスカリン受容体(Gq-DREADD)コードポリヌクレオチド配列、またはPSAMコードポリヌクレオチド配列をコードするトランスジーンポリヌクレオチド配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターなどのウイルスベクターが投与される方法が提供される。従って、SCN1A、Gq-DREADD、またはPSAMを発現しない、必要とする個体または対象にある介在ニューロン、特に、PV発現介在ニューロンを、それぞれ、SCN1A、Gq-DREADD、またはPSAMを発現する介在ニューロンに変換する方法が提供される。従って、遺伝子およびコードされるタンパク質の発現は、これもrAAVベクターゲノムの成分として提供される本明細書に記載のエンハンサーエレメント(E1～E10)の存在と結び付けられている。一態様では、エンハンサーエレメントはE2、E5、またはE6である。一態様では、必要とする個体または対象、例えば、発作、てんかん、またはDSに苦しんでいる患者には、本明細書に記載のエンハンサー配列、例えばE2と、SCN1Aをコードするトランスジーンポリヌクレオチド配列とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターなどのウイルスベクターが投与される。
一態様では、個体または対象が経験した発作、てんかん、もしくはDS症状の重篤度が低減するか、または発作、てんかん、もしくはDS症状が処置もしくは予防されるように、本明細書に記載のエンハンサー配列(E1～E10)とSCN1Aコードポリヌクレオチド配列をコードする配列とを含むウイルスベクターまたはrAAVベクターを、必要とする個体または対象に導入する工程を含む、発作、てんかん、またはDSの予防および/または療法のための予防的処置方法または治療的処置方法が提供される。一態様では、エンハンサーエレメントはE2、E5、またはE6である。一態様では、必要とする個体または対象は前記ベクターの投与時に発作(例えば、てんかん発作)またはDS症状を経験している。個体または対象へのベクター投与後に、発作、てんかん、もしくはDS症状の重篤度は低減するか、または発作、てんかん、もしくはDS症状は処置もしくは予防される。
一態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列(E1～E10)と、hM3Dq改変ムスカリン受容体(Gq-DREADD)コードポリヌクレオチド配列をコードする配列とを含むウイルスベクターまたはrAAVベクターを個体に導入し、その後に、発作、てんかん、もしくはDS症状の重篤度が低減するように、または発作、てんかん、もしくはDS症状が処置もしくは予防されるように有効量のGq-DREADDアゴニストを個体に投与する工程を含む、発作、てんかん、またはDSに対する予防および/または療法のための予防的処置方法または治療的処置方法が提供される。一態様では、エンハンサーエレメントはE2、E5、またはE6である。一態様では、必要とする個体または対象はGq-DREADD受容体アゴニストの投与時に発作(例えば、てんかん発作)を経験している。アゴニスト投与後に、発作の重篤度は低減する。態様では、Gq-DREADD受容体アゴニストはクロザピン-N4-オキシド(CNO)または当技術分野において公知であり、使用されている別の適切なGq-DREADD受容体アゴニストである。
本明細書に記載の治療方法および予防方法の局面では、個体または対象は、部分発作もしくは全般発作を経験しているか、または部分発作もしくは全般発作を発症するリスクがある。他の態様では、個体または対象は、薬剤抵抗性てんかんを含むが、それに限定されるわけではない任意の形態のてんかんを有するか、それを有すると疑われるか、またはそれがあると診断されたことがある。説明された方法によれば、発作、てんかん、またはDS症状は阻害されるか、ブロックされるか、低減されるか、軽減されるか、または阻止される。
一態様では、ウイルスベクターまたはrAAVベクターを含む組成物は、それを必要とする対象に投与される。一態様では、本明細書に記載のエンハンサーエレメント、例えば、E1～E10と、SCN1Aをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む組成物(またはベクターそのもの)を投与すると、脳における、SCN1Aを発現しない個体または対象の介在ニューロンまたはPV発現介在ニューロンから、SCN1Aを発現する介在ニューロンまたはPV発現介在ニューロンへの変換が容易になる。別の態様では、本明細書に記載のエンハンサーエレメント、例えば、E1～E10と、Gq-DREADD受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む組成物(またはベクターそのもの)を投与すると、脳における、Gq-DREADD受容体を発現しない個体または対象の介在ニューロンまたはPV発現介在ニューロンから、Gq-DREADD受容体を発現する介在ニューロンまたはPV発現介在ニューロンへの変換が容易になり、それによって、Gq-DREADDアゴニストに対して応答性の介在ニューロンまたはPV発現介在ニューロンが生じる。別の態様では、本明細書に記載のエンハンサーエレメント、例えば、E1～E10と、PSAMをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む組成物(またはベクターそのもの)を投与すると、脳における、PSAMを発現しない個体または対象の介在ニューロンまたはPV発現介在ニューロンから、PSAMを発現する介在ニューロンまたはPV発現介在ニューロンへの変換が容易になる。一態様では、本明細書に記載のベクター、組成物、および方法は部分発作および/または全般発作の予防的処置または治療的処置において用いられる。一態様では、エンハンサーエレメントはE2、E5、またはE6である。
一態様では、本明細書に記載のベクター、組成物、および方法は、薬剤抵抗性てんかんを含むが、それに限定されるわけではない様々な種類のてんかんの予防的処置もしくは治療的処置において用いられる、および/または薬理学的処置の代替を構成し得る。態様では、本明細書に記載のベクター、組成物、および方法は、局在関連てんかん、全般てんかん、全般発作および/または局所発作を伴うてんかんなどを含む、てんかん、レノックス・ガストー(Lennox-Gastaut)症候群と関連する発作、疾患または状態の合併症としての発作(例えば、脳症、フェニルケトン尿症、若年性ゴーシェ病、ウンフェルリヒト・ルンドボルグ進行性ミオクローヌスてんかん(Unvericht-Lundborg's progressive myoclonic epilepsy)、脳卒中、頭部外傷、ストレス、ホルモン変化、薬物使用または断薬、アルコール使用または禁酒、断眠、発熱、感染、脳がんなど、または化学誘導性発作障害と関連する発作)を含むが、これに限定されない1つまたは複数の発作障害の予防的処置または治療的処置において用いられる。
一態様では、本明細書に記載のベクターまたはrAAVベクター、組成物および方法は、必要とする個体または対象、例えば、発作を経験したことがある、および/または発作を経験するリスクがある、従って、任意の発作障害と診断される可能性がある、もしくは任意の発作障害を有すると疑われる可能性がある個体または対象の予防的処置または治療的処置において用いられる。一態様では、本明細書に記載のエンハンサーエレメントおよびトランスジーンを含むウイルスベクターまたはrAAVベクターの投与は、発作、例えば、てんかん発作、またはDS症状が発症する前に、例えば、投与の数日前に、数週間前に、数ヶ月前に、または数年前に行われてもよい。例として、当業者は、rAAVによって動かされる発現は非ヒト霊長類モデルにおいて少なくとも6年間継続できることを証明した(Rivera, V.M. et al., 2005, Blood, 105:1424-1430)。
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列を含むrAAVベクターはまた、キャプシドタンパク質も含み、キャプシドタンパク質は、ウイルスベクターのターゲティング能力を強化し、介在ニューロン細胞、例えばGABA作動性介在ニューロン細胞および/または特に脳の大脳皮質にあるGABA作動性介在ニューロン細胞の特定の亜集団にベクターが特異的に形質導入するのを可能にする。GABA作動性介在ニューロンに形質導入するrAAVベクター、および、GABA作動性介在ニューロン、特にPV発現介在ニューロンと呼ばれる(PV発現皮質介在ニューロンとも呼ばれる)パルブアルブミン(PV)も発現するGABA作動性介在ニューロンの亜集団にウイルスが特異的に形質導入する可能性を高めるキャプシドタンパク質を含むrAAVベクターは、本明細書に記載の組成物および方法における使用に非常に適している。別の態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列、例えばE5を含有するrAAVベクターはまた、ウイルスベクターのターゲティング能力を高め、ベクターが錐体ニューロン、例えば脳皮質のグルタミン酸作動性錐体ニューロン細胞に特異的に形質導入するのを可能にするキャプシドタンパク質も含む。
一態様では、前記ウイルスベクターに挿入されるトランスジーン(エフェクター遺伝子)は、発作またはてんかんの有害な症状を特徴とする神経学的疾患、例えば、乳児熱性てんかん、またはドラベ症候群(DS)と因果関係があると見出されている機能(または機能喪失)をもつものである。前記ベクター内にあるエンハンサー配列は、トランスジーンの発現を介在ニューロンもしくはそのサブタイプ、またはニューロン、例えば、錐体ニューロンに制限し、介在ニューロン細胞における、この遺伝子の正常な機能的バージョンの発現を特異的に調節する、例えば、増加させる、または強化する。一態様では、介在ニューロンはGABA作動性介在ニューロン細胞である。一態様では、介在ニューロンGABA作動性細胞はPV発現介在ニューロン細胞である。一態様では、前記ニューロン細胞は錐体ニューロン細胞である。一態様では、錐体ニューロン細胞はグルタミン酸作動性錐体ニューロンである。
特定の態様では、本明細書において提供されるAAVベクター、ベクターベースの組成物、ならびに送達および処置方法は、ドラベ症候群(DS)およびその重大な症状、例えば、てんかんおよび付随的な発作に苦しんでいる患者を処置するのに有用である。一態様では、患者は、ヒト患者、特に、DSに苦しんでいる乳児または幼児である。下記でさらに説明されるように、ドラベ症候群(DS)は、認知障害および命にかかわる発作を含む多くの重大な症状と関連する乳児てんかんの一種である。SCN1A遺伝子によってコードされるナトリウムチャンネルNav1.1の機能喪失がDSの最も一般的な原因である。DSマウスモデルを用いた以前の研究から、原因は、この症候群における最も有害な症状である発作の根底をなす一次欠陥である、GABA作動性介在ニューロンにおけるSCN1A遺伝子機能の喪失であることが示唆されている。現在、DS患者において発作を無くすか、または低減する信頼性の高い処置法はない。従って、本明細書に記載のウイルス産物、組成物、および方法は、DSに苦しんでいる患者に、かなり必要とされていた、かつ極めて有益な処置法を提供する。
従って、特定の態様では、AAVベクターまたはビヒクルに含まれるトランスジーンまたはエフェクター遺伝子はSCN1Aであり、エンハンサーは、SCN1A遺伝子の発現をSCN1A発現介在ニューロンに制限し、かつ介在ニューロン細胞、例えば、GABA作動性介在ニューロンまたはPV発現GABA作動性介在ニューロンにおいてSCN1A遺伝子の発現を調節するのに特異的である核酸配列(例えば、AAVベクター内にあるシス作用制御エレメント)である。別の特定の態様では、AAVベクターまたはビヒクルに含まれるトランスジーンまたはエフェクター遺伝子はSCN1Aであり、エンハンサーは、SCN1A遺伝子の発現をSCN1A発現錐体ニューロンに制限し、かつ脳皮質、例えば、脳の皮質層5にある錐体ニューロン細胞、例えば、グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいてSCN1A遺伝子の発現を調節するのに特異的である核酸配列(例えば、AAVベクター内にあるシス作用制御エレメント)である。
Nav1.1ナトリウムチャンネルをコードする正常なSCN1Aエフェクター遺伝子の発現を介在ニューロン細胞に制限する特異的エンハンサーを有するように設計され、分子的に操作されているAAVベクターを利用した方法は、特に、対象にある介在ニューロン細胞に、SCN1A特異的エンハンサー配列とSCN1A遺伝子を有するベクターを形質導入し、介在ニューロンにおいて前記遺伝子を発現させ、投与後に対象の介在ニューロン細胞において機能的応答、例えば、機能的Nav1.1ナトリウムチャンネルの提供またはナトリウムチャンネル機能の増加をもたらすために、治療的有効量のウイルスベクター、ウイルス粒子、または前記ウイルスベクターもしくは粒子を含む薬学的組成物を対象(例えば、DSを有するヒト乳児)に投与する工程を含む。形質導入された介在ニューロン細胞におけるSCN1Aの機能的発現は、SCN1Aに欠損がある介在ニューロン細胞集団、例えば、GABA作動性介在ニューロンおよびPV発現GABA作動性介在ニューロンの興奮性を正常化する。このような結果は脳領域における微妙なE/Iバランスを回復させる。
DSに対する療法の一形態としてAAVに含まれる遺伝子を首尾よく、かつ特異的に発現させる目的で、SCN1A遺伝子に欠損があるニューロン細胞集団に発現を特異的に限定することができるエンハンサーポリヌクレオチド配列を特定するために、このエフェクター遺伝子の調節特性を探索するアプローチを開発した(図3A～3D)。一態様では、前記エンハンサー配列は、特に、介在ニューロン細胞、例えば、GABA作動性介在ニューロン細胞またはPV発現GABA作動性介在ニューロン細胞において、特に、SCN1A遺伝子の機能喪失がある介在ニューロンにおいてSCN1A遺伝子の発現を調節する、例えば、増加させる、強化する、増大させる、または他のやり方で改善するシス作用エレメントである。一態様では、前記エンハンサー配列は、特に、錐体ニューロン、例えば、グルタミン酸作動性錐体ニューロン細胞においてSCN1A遺伝子の発現を調節する、例えば、増加させる、強化する、増大させる、または他のやり方で改善するシス作用エレメントである。「エンハンサー」および「エンハンサーエレメント」という用語は本明細書中で同義で用いられる。本明細書中では、場合によっては、「エンハンサーエレメント」という用語は「調節エレメント」と呼ばれる。
一態様では、介在ニューロン細胞におけるSCN1A遺伝子の発現を特異的に調整するエンハンサーポリヌクレオチド配列は、長さが約25～50、50～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～350、350～400、400～450、450～500、500～550、550～600、600～650、650～700、700～750、750～800、800～850、850～900、900～950、950～1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1650、1800、1850、1900、1950、2000、2050、もしくは2500ヌクレオチド(塩基対(bp))であるか、またはそれより長く、例えば、2500ヌクレオチド(bp)より長く、これらの上記のbp長の中にある全ての大きな値と小さな値を含む。一部の態様では、使用に適したPV特異的エンハンサー配列は、261bp、521bp、547bp、606bp、618bp、663bp、832bp、1280bp、1644bp、または2430bpである。他の態様では、使用に適したPV特異的エンハンサー配列は、267bp、586bp、636bp、665bp、844bp、849bp、894bp、1636bp、1766bp、または5124bpである。介在ニューロン細胞におけるSCN1A遺伝子の発現を調節(例えば、強化)するための特異性を有するエンハンサー配列は、ゲノムポリヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNAのイントロン配列または遺伝子間配列に由来してもよい(図1A-1～1A-3)。
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、図1A-1に示した2番染色体の開始/停止位置66256056/66257335に位置する、「S5E1」とも呼ばれる以下のマウスポリヌクレオチド(DNA)配列(E1)に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列、またはそのヒトオルソログを含む。
Figure 2022519623000007
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、図1A-1に示した2番染色体の開始/停止位置66364036/66364653に位置する、「S5E2」とも呼ばれる以下のマウスポリヌクレオチド(DNA)配列(E2)に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列、またはそのヒトオルソログを含む。
Figure 2022519623000008
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、図1A-1に示した2番染色体の開始/停止位置66383190/66384021に位置する、「S5E3」とも呼ばれる以下のマウスポリヌクレオチド(DNA)配列(E3)に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列、またはそのヒトオルソログを含む。
Figure 2022519623000009
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、図1A-1に示した2番染色体の開始/停止位置66387764/66388024に位置する、「S5E4」とも呼ばれる以下のマウスポリヌクレオチド(DNA)配列(E4)に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列、またはそのヒトオルソログを含む。
Figure 2022519623000010
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、図1A-1に示した2番染色体の開始/停止位置66392447/66393109に位置する、「S5E5」とも呼ばれる以下のマウスポリヌクレオチド(DNA)配列(E5)に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列、またはそのヒトオルソログを含む。
Figure 2022519623000011
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、図1A-1に示した2番染色体の開始/停止位置66401767/66402372に位置する、「S5E6」とも呼ばれる以下のマウスポリヌクレオチド(DNA)配列(E6)に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列、またはそのヒトオルソログを含む。
Figure 2022519623000012
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、図1A-1に示した2番染色体の開始/停止位置66407834/66410263に位置する、「S5E7」とも呼ばれる以下のマウスポリヌクレオチド(DNA)配列(E7)に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列、またはそのヒトオルソログを含む。
Figure 2022519623000013
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、図1A-1に示した2番染色体の開始/停止位置66439814/66441457に位置する、「S5E8」とも呼ばれる以下のマウスポリヌクレオチド(DNA)配列(E8)に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列、またはそのヒトオルソログを含む。
Figure 2022519623000014
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、図1A-1に示した2番染色体の開始/停止位置66441748/66442268に位置する、「S5E9」とも呼ばれる以下のマウスポリヌクレオチド(DNA)配列(E9)に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列、またはそのヒトオルソログを含む。
Figure 2022519623000015
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、図1A-1に示した2番染色体の開始/停止位置66450594/66451140に位置する、「S5E10」とも呼ばれる以下のマウスポリヌクレオチド(DNA)配列(E10)に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列、またはそのヒトオルソログを含む。
Figure 2022519623000016
一局面では、前記の10個のマウスエンハンサー配列のヒト配列(ヒトオルソログ配列)は、100kb上流および100kb下流を含めて、SCN1Aのマウス配列とヒトゲノム配列とのアラインメントに基づいて決定された。従って、マウス配列とヒト配列との間で高度に保存されているヒトオルソログ配列が特定された。
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始165953030/ヒト_hg38 停止165954796(図1A-2および1A-3)に位置する、本明細書中でE1またはS5E1と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000017
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始166084035/ヒト_hg38 停止166084884(図1A-2および1A-3)に位置する、本明細書中でE2またはS5E2と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000018
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始166090876/ヒト_hg38 停止166091720(図1A-2および1A-3)に位置する、本明細書中でE3またはS5E3と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000019
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始166094366/ヒト_hg38 停止166094633(図1A-2および1A-3)に位置する、本明細書中でE4またはS5E4と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000020
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始166103693/ヒト_hg38 停止166104587(図1A-2および1A-3)に位置する、本明細書中でE5またはS5E5と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000021
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始166118214/ヒト_hg38 停止166118879(図1A-2および1A-3)に位置する、本明細書中でE6またはS5E6と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000022
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始165892760/ヒト_hg38 停止165897884(図1A-2および1A-3)に位置する、本明細書中でE7またはS5E7と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000023
Figure 2022519623000024
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始166148156/ヒト_hg38 停止166149792(図1A-2および1A-3)に位置する、本明細書中でE8またはS5E8と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000025
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始166150066/ヒト_hg38 停止166150702(図1A-2および1A-3)に位置する、本明細書中でE9またはS5E9と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000026
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始166160023/ヒト_hg38 停止166160609(図1A-2および1A-3)に位置する、本明細書中でE10またはS5E10と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、もしくは少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、もしくは100bp以上の1つもしくは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000027
一態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、前記のE1(S5E1)～E10(S5E10)エンハンサーエレメント配列(例えば、SEQ ID NO:15～24)のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。別の態様では、SCN1A特異的エンハンサー配列は、前記のE2(S5E2)エンハンサーエレメント配列(例えば、SEQ ID NO:16)のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始36816984/ヒト_hg38 停止36817612に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE11と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000028
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始36817484/ヒト_hg38 停止36817720に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE12と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000029
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始36818134/ヒト_hg38 停止36818727に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE13と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000030
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始88802240/ヒト_hg38 停止88802877に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE14と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000031
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始88803290/ヒト_hg38 停止88803678に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE15と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000032
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始88807290/ヒト_hg38 停止88807962に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE16と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000033
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始88833390/ヒト_hg38 停止88833984に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE17と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000034
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始128377753/ヒト_hg38 停止128378783に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE18と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000035
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始128289803/ヒト_hg38 停止128290279に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE19と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000036
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始128323153/ヒト_hg38 停止128323718に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE20と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000037
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始128332503/ヒト_hg38 停止128332974に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE21と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000038
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始128336003/ヒト_hg38 停止128336491に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE22と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000039
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始128365603/ヒト_hg38 停止1283366181に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE23と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000040
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始128375853/ヒト_hg38 停止128376606に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE24と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000041
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始128408553/ヒト_hg38 停止128408930に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE25と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000042
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始13388723/ヒト_hg38 停止13390212に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE26と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000043
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始13469123/ヒト_hg38 停止13470861に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE27と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000044
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始31124894/ヒト_hg38 停止31125629に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE28と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000045
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始31132544/ヒト_hg38 停止31133831に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE29と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000046
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始88655733/ヒト_hg38 停止88657379に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE30と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000047
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始88872683/ヒト_hg38 停止88872997に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE31と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000048
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始88745133/ヒト_hg38 停止88745535に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE32と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000049
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始88799783/ヒト_hg38 停止88801354に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE33と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000050
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始27969472/ヒト_hg38 停止27969690に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE34と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000051
別の態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、ヒトゲノム配列のヒト_hg38 開始27973822/ヒト_hg38 停止27974489に位置する(図1A-2および1A-3)、本明細書中でE35と呼ばれる以下のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、少なくとも80％以上、少なくとも85％以上、少なくとも90％以上、または少なくとも95％以上の配列同一性を有する50～500bp以上、50～250bp以上、100～200bp以上、または100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022519623000052
一態様では、本明細書に記載のエンハンサー配列は、前記のE11～E35エンハンサーエレメント配列(例えば、SEQ ID NO:25～49)のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。別の態様では、エンハンサー配列は、例えば、前記のE1(SEQ ID NO:15)、E2(SEQ ID NO:16)、E5(SEQ ID NO:19)、E6(SEQ ID NO:20)、E11(SEQ ID NO:25)、E14(SEQ ID NO:28)、E22(SEQ ID NO:36)、またはE29(SEQ ID NO:43)エンハンサーエレメント配列のヒトポリヌクレオチド(DNA)配列に対して少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む。
熱性けいれんを伴う遺伝性てんかんプラス(Genetic Epilepsy with Febrile Seizures plus)(GEFS+)およびドラベ症候群
熱性けいれんを伴う遺伝性てんかんプラス(GEFS+)は、重篤度が多様にある発作性障害スペクトルを構成する、まれな状態である。GEFS+は、通常、発熱によって誘発される熱性けいれんと、発熱に関連しない発作(無熱性けいれん)を含む他のタイプの再発性発作(てんかん)の組み合わせをもつ一員がいる家系内で診断される。全般発作と呼ばれる、さらなる発作タイプは、通常、脳の両側が関与する。しかしながら、一部の罹患した個体では、脳の片側しか関与しない発作(部分発作)が発生する。GEFS+個体における最もよくあるタイプの発作には、不随意筋攣縮を引き起こすミオクローヌス発作、弱い筋緊張の突然の発症を伴う弛緩性発作、および凝視発作(staring spell)として現れる短期間の意識消失を引き起こす欠神発作が含まれる。通常、GEFS+は家系内で診断されるが、家系内にこの状態の病歴がない個体で発生することもある。
GEFS+スペクトルの最もよくある、かつ最も穏やかな特徴は、乳児期に始まり、典型的に5歳までになくなる単純熱性けいれんである。熱性けいれんが5歳を過ぎて続く時、または他のタイプの発作が発症する時には、この状態は熱性けいれんプラス(FS+)と呼ばれ、典型的には前期思春期になくなる。
ドラベ症候群(DS)は乳児重症ミオクローヌスてんかん(SMEI)または早期乳児てんかん性脳症-6(EIEE6)とも知られ、GEFS+スペクトルの一部であるとよくみなされる状態であり、この障害群で最も重篤な障害である。全ての罹患した個体がミオクローヌスてんかんを示すとは限らないので、ドラベ症候群という用語が好んで用いられる。罹患した乳児は典型的には数分間続く長期発作を有し(てんかん重積持続状態)、発熱によって誘発される。無熱性発作を含む他のタイプの発作は幼児期に始まる。これらの発作タイプはミオクローヌス発作または欠神発作を含むことがある。ドラベ症候群では、これらの発作は薬物療法で管理することが難しく、時が経つにつれ悪化することがある。脳機能の低下もドラベ症候群ではよくある。通常、ドラベ症候群に罹患した小児は普通は生後1年以内に発症するが、その後に発症は失速する。罹患した小児の中には、以前に獲得した能力を失い、発育が退行するものもいる。ドラベ症候群に苦しんでいる多くの小児は運動を調整することが難しく(運動失調)、知的障害を有する。
GEFS+の原因
特定されていない変異も含めて、いくつかの遺伝子にある変異がGEFS+の原因となり得る。最もよく関連付けられている遺伝子はSCN1aである。この遺伝子の変化によってドラベ症候群症例の80％超と他のGEFS+症例の約10％が引き起こされる。他の遺伝子の変異は少数の罹患した個体または家族にしか発見されていない。SCN1A遺伝子およびGEFS+と関連する他の遺伝子は、正に荷電しているイオンを細胞内に輸送するイオンチャンネルのサブユニットをコードする。これらのイオンの輸送は電気信号を発生し、ニューロン(神経細胞)間で伝達するのを助ける。SCN1A遺伝子の変異はナトリウムチャンネルに対して様々な影響を及ぼす。ドラベ症候群の原因となる、またはドラベ症候群と関連する多くの遺伝子変異が各細胞にある機能的チャンネルの数を減らす。軽度のGEFS+障害の原因となる変異があるとチャンネル構造が変化する可能性が高い。これらの遺伝子変化は全て、チャンネルがナトリウムイオンをニューロンに輸送する能力に影響を及ぼす。有害な変異の中にはチャンネル活性を低減すると考えられているものもあれば、増加させる可能性があるものもある。GABA作動性受容体サブユニット遺伝子が変化するとチャンネル機能が損なわれ、ニューロン間の制御されていない信号伝達が生じ、これが発作につながる可能性が高い。理論に拘束されたくもないし、そのつもりもないが、いくかの研究では、ある特定のSCN1A遺伝子変異がニューロン間で絶え間ない信号伝達刺激の原因となることが報告されている。このように脳にある、ある特定のニューロンが過剰刺激されると、発作と関連する異常な脳活動が誘発される。
全てのSCN1A遺伝子変異が同じ影響を及ぼすかどうか知られていないが、ゲノムワイド関連解析から、SCN1A遺伝子によってコードされる電位開口型ナトリウムチャンネルNav1.1の機能喪失がドラベ症候群の最も一般的な原因であると証明されている。ドラベ症候群のマウスモデルを用いた以前の研究から、これは、この症候群の最も有害な症状である発作の根底をなす主要な欠陥である、GABA作動性介在ニューロンにおけるSCN1A遺伝子機能の喪失であると示唆される。
動物試験において、SCN1A-/-マウスは重篤な運動失調と発作を発症し、出生後15日目に死亡することが発見された。SCN1A+/-マウスには、遺伝的背景への注目すべき依存をともなって、自然発症発作と、出生後21日目の後に始まる突発性の死亡があった。SCN1Aが喪失しても、海馬ニューロンにあるナトリウムチャンネルの電圧依存的活性化も電圧依存的不活性化も変化しない。しかしながら、SCN1A-/-および+/-マウスの抑制性介在ニューロンにおいてナトリウム電流密度が大幅に低下した(Yu, F.H. et al., 2006, Nat Neurosci, 9(9):1142-1149; Yu et al., 2007, Nat Neurosci, 10(1):134)。上記の研究から、ヘテロ接合性SCN1A変異に起因するGABA作動性抑制性介在ニューロンにおけるナトリウム電流の低下はSMEI患者における、てんかんにつながる過剰興奮性の原因となり得ることが示唆された。
GABA作動性皮質介在ニューロン
GABA作動性介在ニューロンは神経伝達物質γ-アミノ酪酸(GABA)を放出し、中枢神経の抑制性ニューロンであり、神経回路と活動の調節と維持に不可欠である。(Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19)。哺乳動物大脳皮質のGABA作動性介在ニューロンは、発現したタンパク質マーカーによって大別および分類され得る、いくつかの異なる皮質介在ニューロンサブタイプを含む。
介在ニューロンは、無脊椎生物と脊椎動物生物両方の発達中の神経系の配線(wiring)と神経回路において重要な役割を果たしている。一般的に、介在ニューロンは、主な役割が他のタイプのニューロンとの接続を形成することである専門化したタイプのニューロン(神経細胞)である。介在ニューロンは運動ニューロンでも感覚ニューロンでもなく、投射ニューロンが脳または脊髄などの離れた場所に信号を送る点で投射ニューロンと異なる。重要なことに、介在ニューロンは神経回路と回路活動を調節するように機能する。中枢神経系の大多数の介在ニューロンは抑制タイプの介在ニューロンである。興奮性ニューロンとは対照的に、抑制性皮質介在ニューロンは、典型的には、神経伝達物質γ-アミノ酪酸(GABA)とグリシンを放出する。皮質介在ニューロンは、脳にある大脳と小脳構造を覆うように機能する一枚の外側神経組織と定義される大脳皮質に局在する。(同上)
GABA作動性介在ニューロンには、発現する表面マーカーによって大別され得る非常に多くの介在ニューロンサブタイプが含まれる。4つの主要な皮質介在ニューロンサブタイプは、パルブアルブミン(PV)発現介在ニューロン、ソマトスタチン(SST)発現介在ニューロン(不均一な集団を構成する)、およびイオンチャネル型セロトニン受容体5HT3a(5HT3aR)発現介在ニューロンである。これらの3つのサブタイプは一緒になって、マウスにおける新皮質GABA作動性介在ニューロン集団の約100％を占めている。これらの介在ニューロンは大脳皮質のそれぞれの層に本拠を構えるが、様々な外套下(subpallial)場所で発生し、その後に大脳皮質に移動する。
皮質回路機能は興奮性入力と抑制性入力の間のバランスによって維持される。神経回路のバランスの破壊は、てんかん、自閉症スペクトラム障害、および知的障害などがあるが、それに限定されるわけではない神経学的、神経発達的、または神経精神医学的な障害の発生に寄与する可能性が高い。
GABA作動性皮質介在ニューロンの役割
GABA作動性ニューロンは抑制的な役割を果たし、標的ニューロンの発火頻度を調整するために神経伝達物質GABAをシナプスに放出する。神経伝達物質の放出は、典型的には、ニューロン信号伝達経路を誘発するために後シナプスGABAAイオンチャネル型受容体を介して働く。介在ニューロンの役割/機能は、典型的には、3つの成分:(1)求心性の入力、(2)介在ニューロンの内在特性、および(3)介在ニューロンの標的に大別される。一般的に、介在ニューロンは錐体細胞ならびに他の皮質領域および皮質下領域に由来する細胞を含む様々な発生源から入力を受け取る。(Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19)。出力に関して、皮質介在ニューロンはフィードフォワードおよびフィードバック阻害に関与する。出力形式に関係なく、皮質介在ニューロンネットワークは、たった1つの皮質介在ニューロンが興奮性ニューロン標的と複数の接続を結ぶことができるという事実によりさらに複雑にされる。
皮質介在ニューロンサブタイプ
大脳皮質には20を超える異なるGABA作動性介在ニューロンサブタイプがあると見積もられている。サブタイプはまた、これらが発現する、マーカーとして働くカルシウム結合タンパク質に基づいて互いに区別される。マウスとラット脳組織の両方で行われた研究に基づいて、カルシウム結合タンパク質であるパルブアルブミン(PV)と、ニューロペプチドであるソマトスタチン(SST)が、大脳皮質内で最も優勢な介在ニューロンサブタイプを規定するために発見された重要なマーカーである。特に注目すべきことに、これらのマーカーの発現が重複しないので、PV発現介在ニューロン集団はSST発現集団から独立している。合わせると全GABA作動性皮質介在ニューロン集団の約70％を構成する、PV陽性GABA作動性介在ニューロンおよびSST陽性GABA作動性介在ニューロンに加えて、5HT3aRを発現する別の介在ニューロンサブグループが全介在ニューロンの約30％を構成すると発見された。これらの3つの介在ニューロン亜集団が全GABA作動性皮質介在ニューロンのほぼ100％または100％を占めている。だが、これらの集団のそれぞれ、特に、5HT3aR発現集団は不均一であり、これらの特徴付けに寄与する他のタンパク質またはニューロペプチドを発現する。(Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19)。
パルブアルブミン(PV)発現介在ニューロン
PV発現介在ニューロンはGABA作動性皮質介在ニューロン集団の約40％を占めている。この介在ニューロン集団は、ファストスパイキングパターンと短時間活動電位の発火持続性高周波数の連なり(fire sustained high-frequency trains of brief action potential)を有する。これらの介在ニューロンはまた全ての介在ニューロンの中で最も小さな入力抵抗と最も速い膜時定数も有する。
2つのタイプのPV介在ニューロン:バスケット細胞(basket cell)とシャンデリア細胞(chandelier cell)がPV介在ニューロングループを構成する。バスケット細胞は、標的ニューロンの細胞体および近位樹状突起においてシナプスを作り、通常、多極形態を有する介在ニューロンである。いくつかの研究から、ファストスパイキングバスケットニューロンは新皮質における主要な抑制系であることが分かっており、新皮質において、数ある機能の中でも標的ニューロンの迅速な抑制を媒介する。このようなファストスパイキングバスケットニューロンは、大脳皮質における興奮性入力と抑制性入力との間の微妙なバランスを調節するのに大きな役割を果たしている可能性が高い。バスケットニューロンと異なり、PV発現介在ニューロンのシャンデリア細胞サブグループは錐体ニューロンの軸索起始部を標的とする。バスケット細胞とシャンデリア細胞は両方ともファストスパイキングであるが電気生理学的特性の点で異なる。他の介在ニューロンとは対照的に、シャンデリア細胞は、膜電位に対して脱分極作用があるため抑制性ではなく興奮性であるかもしれない。(Kelsom,C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19)。
新皮質、例えば、マウス神経皮質(neurocortex)においてシャンデリアニューロンおよびバスケットニューロンから独立している別のPV発現細胞グループは多極性バースト細胞(multipolar bursting cell)と呼ばれ、電気生理学および結合性の点でシャンデリア細胞およびバスケット細胞とは異なる。多極性バーストニューロンは、ペアドパルスファシリテーション(paired-pulse facilitation)を示す錐体細胞(または他の多極性バースト細胞)とのシナプスを有する。対照的に、通常、シャンデリア細胞およびバスケット細胞は強く抑圧的である。(Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19)。
ソマトスタチン(SST)発現介在ニューロン
SST発現介在ニューロンはマウス新皮質において2番目に大きな介在ニューロングループを構成し、全皮質介在ニューロン集団の約30％を占めている。SST GABA作動性介在ニューロンは皮質介在ニューロンの不均一な集団である。SST陽性介在ニューロンはマルティノッティ細胞と呼ばれ、大脳皮質の第I層に分岐している上行性の軸索を有し、錐体ニューロンの樹状ふさ状分岐(dendritic tuft)の上にシナプスを確立する。マルティノッティ細胞はまた皮質第II～VI層でも見出されるが、第V層が最も豊富である。PV陽性介在ニューロンとは対照的に、マルティノッティ細胞への興奮性入力は強く促進するものである。SST発現皮質介在ニューロンのさらなる亜集団は発火特性、分子マーカーの発現、およびこの集団内にある様々なニューロンの結合性の点で違いを示す。(Kelsom, C. and Lu, W., 2013, Cell Biosci., 3:19)。
5HT3aR発現介在ニューロン
GABA作動性皮質介在ニューロンの第3の集団は5HT3aR介在ニューロングループと呼ばれ、GABA作動性皮質介在ニューロン集団の約30％を占めている。マウス研究に基づいて、皮質にある、このGABA作動性介在ニューロン集団は5HTa3受容体を発現するが、PVもSSTも発現しない。
5HT3aR介在ニューロンは不均一な集団である。5HT3aR介在ニューロングループの中には、血管作動性腸管ポリペプチド(VIP)を含む他のタンパク質またはニューロペプチドマーカーも発現する、いくつかの介在ニューロンサブセットがある。VIP発現介在ニューロンは皮質第II層および第III層に局在する。VIP発現介在ニューロンはPVもSSTも発現しないが、5HTa3受容体を発現し、5HT3aR集団の約40％を占めている。VIP介在ニューロンは一般的に樹状突起の中にシナプスを作り、一部は他の介在ニューロンを標的とすることが観察されている。他の皮質介在ニューロンと比較して、VIP介在ニューロンは非常に高い入力抵抗を有し、介在ニューロンの最も興奮性の高いものの中に含まれている。
5HT3aR発現集団にある皮質介在ニューロンの60％はVIPを発現しない。このVIP陰性5HT3aRグループのうち、ほぼ80％が介在ニューロンマーカーであるリーリン(reelin)を発現する。この後者の皮質介在ニューロンカテゴリーでは、スパイダーウェブ(spiderweb)細胞と呼ばれるニューログリアフォーム(neurogliaform)細胞集団がニューロペプチドY(NPY)を発現し、円形の細胞体から放射状に広がる複数の樹状突起を示す。相同なニューロン上でしかシナプスを作ることができない他のタイプの介在ニューロンとは対照的に、ニューログリアフォーム介在ニューロンは互いに、ならびに他の介在ニューロンタイプとシナプス接続を形成することができる。従って、ニューログリアフォーム細胞は、錐体ニューロンおよび他の介在ニューロン上で、長続きする抑制性後シナプス電位を誘発するために、ゆっくりしたGABAAおよびGABAB受容体を活性化することによって神経回路と機能を調節するのに重要な役割を果たしている。
錐体ニューロン
錐体ニューロンは錐体細胞とも知られ、直径が20～120μmに及ぶピラミッド形の細胞体(cell body)(細胞体(soma))と、2つの別個の樹状突起樹を有するニューロンである。基底樹状突起は基底から生じ、尖端樹状突起は錐体細胞体の尖端から生じる。ほとんどのニューロンと同様に、錐体ニューロンは複数の樹状突起と1本の軸索を有するが、樹状突起と軸索は両方とも広範に枝分かれしている。錐体ニューロンの樹状突起は、通常、入力構造とみなされ、他のニューロンからのシナプス結合を受け取るのに対して、軸索は他のニューロンへの出力として役立つ。錐体ニューロン樹状突起はまた逆行性の信号伝達分子(例えば、エンドカンナビノイド)を放出することもでき、そのため、伝達はいくらか双方性がある。樹状突起と軸索の広範な枝分かれがあるので、1つのニューロンがネットワーク中にある何千もの他のニューロンと伝達することができる。(Spruston, N., 2009, Scholarpedia, 4(5):6130)。
錐体ニューロンは、哺乳動物ならびに鳥類、魚類、およびハ虫類の大脳皮質、海馬、および扁桃体などの前脳構造において見出されるが、嗅球、線条体、中脳、後脳、または脊髄では見出されない。錐体ニューロンは、脳皮質構造などの興奮性ニューロンファミリーが存在する脳領域において、興奮性ニューロンファミリーの中で最も数が多いメンバー、例えば、神経伝達物質グルタミン酸を放出するニューロンである。錐体ニューロンが豊富にあることから、神経系の機能ならびに認知処理において重要な役割を果たしていることが示唆される。錐体ニューロンは哺乳動物大脳皮質における全ニューロンの約2/3を構成し、ここで、シナプス入力を、パターンがある活動電位出力に変えるように機能する。錐体ニューロンは何万もの興奮性シナプスと数千もの抑制性シナプスからシナプス入力を受け取る。興奮性入力のほとんど、例えば、グルタミン酸作動性錐体ニューロンは神経伝達物質としてグルタミン酸を使用するのに対して、抑制性入力はGABAを使用する。
刺激がどういったものであるかということで、錐体ニューロンが生じる出力タイプ(例えば、シングルスパイク(single spike)対バースト(burst))が決まるが、内在ニューロン興奮性は、どのようにニューロンが入力に応答するかの別の重要な決定要因である。典型的に、ニューロンは、どのように電流注入に応答するかに従って分類され、これは錐体ニューロンタイプによって異なる場合がある。ほとんどの錐体ニューロンは、スパイク周波数適応(spike-frequency adaptation)(順応)を示すスパイクの連なりを伴って、連続した脱分極性の電流注入に応答する。多くの錐体ニューロンは1つまたは複数の活動電位バーストをともなって応答する。この応答がどういったものであるかは、主として、ニューロンで発現する電位開口型イオンチャンネルのタイプによって決まるが、樹状突起樹の構造も重要である(Mainen, Z.F. et al., 1996, Nature, 382:363-366; Spruston, N., 2008, Nature Reviews Neuroscience, 9:206-221; Spruston, 2009, Scholarpedia, 4(5):6130)。
アデノ随伴ウイルス(AAV)
AAVは、ウイルスキャプシドにパッケージングされた線状の一本鎖DNAゲノムを含有する小さな(25nm)無エンベロープウイルスである。AAVはパルボウイルス科(Parvoviridae)に属し、AAVによる増殖性感染がアデノウイルスまたはヘルペスウイルスのヘルパーウイルスの存在下でしか生じないのでディペンドウイルス属(Dependovirus)のウイルスである。ヘルパーウイルスの非存在下では、AAV(血清型2)は細胞に形質導入された後に、染色体19q13.4への特異的であるが、まれな組込みによって潜伏期を確立することがある。従って、AAVは、部位特異的組込みが可能なことが知られている唯一の哺乳動物DNAウイルスである。(Daya, S. and Berns, K.I., 2008, Clin. Microbiol. Rev., 21(4):583-593)。
感染が成功した後にAAV生活環に向かう2つの段階:溶解段階(lytic stage)および溶原段階(lysogenic stage)がある。アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのヘルパーウイルスの存在下では溶解段階が持続する。この期間の間に、AAVは、ゲノム複製、ウイルス遺伝子発現、およびビリオン産生を特徴とする増殖性感染を受ける。AAV遺伝子発現のためのヘルパー機能を提供するアデノウイルス遺伝子には、E1a、E1b、E2a、E4、およびVA RNAが含まれる。アデノウイルスおよびヘルペスウイルスはヘルパー機能のための異なる遺伝子セットを提供するが、両方とも細胞遺伝子発現を調節し、増殖性AAV感染のための許容的な細胞内環境をもたらす。ヘルペスウイルスは、ウイルスDNAポリメラーゼおよびヘリカーゼ、ならびにHSV転写に必要な初期機能を提供することでAAV遺伝子発現を助ける。
アデノウイルスまたはヘルペスウイルスの非存在下ではAAV複製は限定され、ウイルス遺伝子発現は抑制され、AAVゲノムは、AAVS1と呼ばれる、19番染色体上の4kb領域(q13.4)の中に組み込むことで潜伏期を確立することがある。AAVS1遺伝子座は、いくつかの筋肉特異的遺伝子、TNNT1およびTNNI3の近くにある。AAVS1領域そのものは、その産物がアクチン組織化に関与することが示されている遺伝子MBS85の上流部分である。組織培養実験からAAVS1遺伝子座は安全な組込み部位だと示唆されている。
遺伝子送達および治療的処置のためのベクターとしての組換えAAV(rAAV)
AAVは、遺伝子発現およびノックダウン、遺伝子編集、回路調節、インビボイメージング、疾患モデル開発、ならびに神経学的疾患を処置するための治療候補の評価を可能にするので、神経系に遺伝子導入するためのベクターおよびビヒクルとして使用するのによく適している。AAVは神経系において安全な長期発現をもたらす。前述の用途のほとんどは、血液脳関門(BBB)を迂回するために、ならびにトランスジーン発現を時間的および空間的に制限するために成人脳への局所AAV注射に頼る。
AAVベクターは、標的細胞に取り付き、進入する能力、核への首尾良い移入、持続的な期間にわたって核で発現する能力、ならびに病原性および毒性の全体的な欠如などの、送達ビヒクルに望ましい特徴の全てを満たすことに大成功を収めてきた。組換えAAV(rAAV)は、局所注射可能であり、長い期間をかけて安定した発現を示し、非病原性であり、形質導入された細胞のゲノムに組み込まれないので、送達ベクターとして、特に、脳組織にある介在ニューロンに送達するのに有利である。12のヒトAAV血清型(AAV血清型1(AAV-1)～AAV-12)と、非ヒト霊長類に由来する100を超える血清型が現在まで報告されている。(Daya, S.and Berns, K.I., 2008, Clin. Microbiol. Rev., 21(4):583-593)。さらに、rAAVは、いくつかの異なるヒト臨床試験のための少なくとも38プロトコールにおいてベクターとしての使用するのにFDAによって承認されている。AAVの病原性の欠如、持続性、およびその多くの利用可能な血清型が、説明された組成物および方法に従う遺伝子療法用途のための送達ビヒクルとしてのウイルスの潜在能力を高めてきた。
複製(Rep)タンパク質をコードせず、頻繁な部位特異的組込みに必要とされる、cis活性がある38塩基対の組込み効率エレメント(IEE)を欠く組換えAAV(rAAV)ベクターが構築されている。逆位末端配列(ITR)は、パッケージングに必要なcisシグナルであるので保持されている。従って、現行の組換えAAV(rAAV)ベクターは主として染色体外エレメントとして存続する。
遺伝子療法用の組換えAAV(rAAV)ベクターは主にAAV-2血清型をベースとしてきた。AAV-2ベースのrAAVベクターは筋肉、肝臓、脳、網膜、および肺に形質導入することができ、最適に発現するために数週間を必要とする。rAAV形質導入の効率は、それぞれのAAV感染段階、すなわち、ウイルス結合、侵入、輸送、核侵入、アンコーティング、および第2鎖合成での効率に依存している。
AAVのゲノム収容能力を増やすために、または遺伝子発現を強化するために、いくつかの新規のAAVベクター技術が開発されている。トランススプライシングAAVベクターは、ITRにおける組換えを介してAAVがヘッドトゥテール(head-to-tail)コンカテマーを形成する能力を利用することによって、異種ポリヌクレオチドを収容するためのベクターの収容能力を増やす目的で用いられてきた。このアプローチでは、トランスジーンカセットは、適切に配置されたスプライスドナー部位とアクセプター部位を含有する2つのrAAVベクターに分割される。組換えされたAAV分子からの転写と、それに続く、mRNA転写物の正しいスプライシングによって機能的な遺伝子産物が生じる。rAAVベクターより若干非効率的であるが、トランススプライシングAAVベクターはサイズが9kbまでの治療用遺伝子の送達を可能にし、網膜、肺、および筋肉における遺伝子発現に首尾よく用いられてきた。
本明細書に記載のrAAVをコードするポリヌクレオチドはSCN1Aエンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。エンハンサーとしての性質があるために、エンハンサーポリヌクレオチド配列の方向、すなわち、5'-3'または3'-5'は、その機能にとって重要でない。従って、エンハンサー配列(例えば、本明細書に記載のE1～E10、例えば、E2、PV特異的エンハンサー配列、またはE5もしくはE6)は逆方向で用いられてもよく、逆相補的配列として用いられてもよい。「PV特異的エンハンサー」は、本明細書に記載のようにトランスジーンの発現をPV発現皮質介在ニューロン(PV-cIN)にターゲティングおよび制限する本明細書に記載のエンハンサー配列を指す。
さらに、前記エンハンサーは、SCN1Aコード配列などの他の配列に対して特定の間隔をおいて配置される必要はない。さらに、rAAVポリヌクレオチドは、さらなるエレメント、例えば、レポーターもしくは検出可能なマーカー、例えば、蛍光タンパク質、またはRNA安定性およびタンパク質収率を高める可能性があるエレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Woodchuck Hepatitis Virus Posttrascriptional Regulatory Element)(WPRE)を含んでもよい。rAAVポリヌクレオチドはまた、逆位末端配列(ITR)間に挿入される1つまたは複数のポリヌクレオチド(遺伝子)を転写するためにプロモーターも含んでよい。ポリアデニル化シグナル、例えば、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルおよび/またはSV40ポリオーマウイルスシミアンウイルス40ポリアデニル化シグナルがrAAVポリヌクレオチドにエレメントとして含まれる場合がある。rAAVポリヌクレオチドは、最小プロモーター、例えば、ヒトβグロビン最小プロモーター(phβg)およびキメライントロン配列を含むことができる(Hermeming et al., 2004, J Virol Methods, 122(1):73-77)。理論に拘束されたくはないが、一本鎖のAAVベクターDNAが宿主細胞DNAポリメラーゼ複合体によって二本鎖(ds)DNAに変換された後に、ITRは核内でのコンカタマー(concatamer)形成を助ける可能性がある。従って、説明されたrAAVの投与は、形質導入された介在ニューロン細胞の核内でエピソームコンカテマーを形成する可能性がある。成人介在ニューロンなどの非分裂細胞では、コンカテマーは介在ニューロンの生涯にわたって、これらの細胞の中でそのまま残っている可能性がある。有利なことに、宿主染色体へのrAAVポリヌクレオチドの組込みはごくわずかであるか、または存在しない可能性が高く、他のどのヒト遺伝子の発現も調節も変えず、それに影響を及ぼさない。
組換えAAVベクターは、当技術分野において標準的な、かつ実施された技法を用いて、および市販の試薬を用いて作製することができる。いくつかの臨床試験において用いられたrAAVベクターが有望な結果を出していると当業者により理解される。例として、Kotterman, M.A. et al., 2014, Nat. Rev. Genet., 15:445-451により報告されたように、rAAVベースの療法は2012年に欧州連合により販売承認を受けた。一部の態様では、プラスミドベクターは周知の複製(rep)、キャプシド(cap)、およびアデノヘルパー成分の全てまたは一部をコードし得る。rep成分は、AAV生活環に必要なRepタンパク質(例えば、Rep78、Rep68、Rep52、およびRep40)をコードする、4つの重複する遺伝子を含む。cap成分は、一緒になって相互作用して正二十面体対称のキャプシドを形成する、キャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3の重複するヌクレオチド配列を含む。ヘルパー成分をコードし、AAVベクターにヘルパー機能をもたらす第2のプラスミドもコトランスフェクションによって細胞に導入され得る。ヘルパー成分は、ウイルス複製のためのアデノウイルス遺伝子E2A、E4orf6、およびVA RNAを含む。
一態様では、本明細書に記載の産物、組成物、および使用のためにrAAVを作製する方法は、説明されたようなrAAVポリヌクレオチド発現ベクターを含む細胞を培養する工程;ポリヌクレオチドを発現できるように前記細胞を培養して、前記細胞内でrAAVを産生する工程、ならびにrAAVを細胞培養中の細胞および/または細胞培養培地から分離または単離する工程を含む。このような方法は当業者に公知であり、当業者により実施される。rAAVは、従来の技法を用いて細胞および細胞培養培地から任意の望ましい純度まで精製することができる。
一態様では、rAAVベクターは、SCN1A制限エンハンサーポリヌクレオチド配列と、化学遺伝学的DREADD(「デザイナー薬物によって排他的に活性化されるデザイナー受容体」)をコードする配列、例えば、Gq-DREADD受容体(Hu, J. et al., 2016, J Biol Chem, 291:7809-7820)、またはaを含有する。Gq-DREADD受容体のアミノ酸配列は、Armbruster et al. (2007, Proc Natl Acad Sci USA, 104:5163-5168)によって報告されている。Gq-DREADD受容体のアミノ酸配列は、ヒトムスカリン性アセチルコリン受容体、M3のアミノ酸配列の誘導体であり、ここでは、位置149にあるチロシンがシステインによって交換されており、位置239にあるアルギニンがグリシンによって交換されている。非改変ヒト配列はNCBIアクセッション番号NP000731.1で提供される。一態様では、rAAVベクター中でGq-DREADD受容体をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、ヒト介在ニューロンにおけるGq-DREADD受容体の発現のために最適化されたコドンを含めることで改変することができる。
一態様では、rAAVベクターは、SCN1A制限エンハンサーポリヌクレオチド配列と化学遺伝学的PSAMをコードする配列を含有する。
組換えAAVベクターは、小さなサイズ(約5kb)のゲノムを有し、もっと大きなゲノム(トランスジーン)、例えば、4.7kbより大きなゲノムをパッケージングし、含有するように操作することができる。例として、多量の遺伝物質(遺伝子、ポリヌクレオチド、核酸)をパッケージングするように開発された2つのアプローチには、スプリットAAVベクター(split AAV vector)および断片AAV(fAAV)ゲノムアセンブリ(fragment AAV (fAAV) genome reassembly)が含まれる(Hirsch, M.L. et al., 2010, Mol Ther 18(1):6-8; Hirsch, M.L. et al., 2016, Methods Mol Biol, 1382:21-39)。スプリットrAAVベクター用途は、rAAVゲノムが天然では形質導入後に細胞内でコンカテマー化し、強化された相同組換え(HR)の基質だという事実を利用するために開発された(Hirsch, M.L. et al., 2016, Methods Mol Biol, 1382:21-39)。このアプローチは、大きなトランスジーンを2つの別々のベクターに「分割(splitting)」することを含み、同時形質導入されると、ベクターゲノムコンカテマー化を介した細胞内の大きな遺伝子の再構築がHRまたは非相同末端結合(NHEJ)を介して行われる。一般的に、スプリットrAAVアプローチには、3つの戦略:オーバーラッピング(overlapping)、トランススプライシング(trans-splicing)、およびハイブリッドトランススプライシング(hybrid trans-splicing)が存在する。
AAVを介した大きな遺伝子送達のためのアプローチとしての断片AAV(fAAV)は、AAVキャプシドのパッケージング収容能力を超えるトランスジェニックカセットの試行されたキャプシド形成が、両極性の不均一な1本鎖ゲノム断片(<5kb)のパッケージングをもたらすという報告に基づいて開発された。複数のfAAV粒子が形質導入された後にゲノム断片は反対鎖アニーリングを受け、それに続いて、宿主を介したDNA合成を経て目的の大型のゲノムが細胞内で再構築されることがある。(Hirsch, M.L. et al., 2016, Methods Mol Biol, 1382:21-39)。
本明細書に記載のベクター、組成物、および方法の利点および利益は、遺伝子発現を、規定された細胞集団、例えば、介在ニューロン細胞に特異的に制限することができる十分に小さなエンハンサーエレメント(シス作用エレメント)の特定および使用である。一態様では、エンハンサーエレメントは、SCN1A特異的であり、かつ遺伝子発現、例えば、SCN1A遺伝子を介在ニューロン細胞、例えば、GABA作動性介在ニューロンおよびPV発現GABA作動性介在ニューロン、または錐体ニューロン、例えば、グルタミン酸作動性錐体ニューロンに制限する、本明細書に記載のE1～E10エンハンサー配列の少なくとも1つである。本明細書に記載のrAAVベクターによって送達された遺伝子(トランスジーン)は特定の細胞において活性があり、機能し、ここで発現される、すなわち、遺伝子(トランスジーン)がコードする産物が産生され、この細胞によって機能的に発現される。具体例として、トランスジーン、例えば、レポーター遺伝子またはSCN1Aの発現をGABA作動性介在ニューロン細胞またはGABA作動性PV発現皮質介在ニューロン細胞に特異的に制限するエンハンサー配列を含有するように操作された本明細書に記載のrAAVベクターは、これらの特定の細胞タイプに形質導入し、特定の細胞タイプにおいて、コードされているレポータータンパク質、またはSCN1Aの場合はNav1.1ナトリウムチャンネルが機能的に発現される。別の具体例として、本明細書に記載のrAAVベクターは、トランスジーン、例えば、レポーター遺伝子またはSCN1Aの発現を、脳皮質にある錐体細胞、例えば、グルタミン酸作動性錐体細胞に特異的に制限するエンハンサー配列を含有するように操作されている。
別の利点として、説明されたSCN1A特異的エンハンサー制御エレメントE1～E10は、他のエフェクターエレメントポリヌクレオチド配列、例えば、レポーターポリヌクレオチド、DREADD、トランスジーンと一緒にrAAVベクターに挿入することができるサイズ/長さ(kb)、例えば、約2kb未満である。例として、欠くことのできない最小サイズのレポーターエレメント(例えば、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、オレンジ蛍光タンパク質(dTomato))が単独で、またはエフェクターまたはレポーターエレメント(例えば、チャネルロドプシン(ChR2)、DREADD)と組み合わされて、それぞれ、平均して約700bp～2kbだと仮定すると、エンハンサー配列などのシス作用DNA制御エレメントがrAAVベクターに挿入されるために最大約2kbのパッケージング収容能力が残っている。本明細書中で特定および説明されたSCN1A限定エンハンサー配列は、発現を、規定された細胞集団、例えば、介在ニューロンまたはGABA作動性介在ニューロン、または錐体ニューロン細胞に限定することができ、さらなる核酸配列、レポーターエレメント、およびトランスジーンもAAVベクターにクローニングできるほど十分に小さなエレメントである。
細胞特異的AAVキャプシド
選択的組織/臓器ターゲティングを示すAAVベクターの合理的設計は、遺伝子療法用のベクター/ビヒクルとしてのAAVの適用を広げてきた。AAVベクターの細胞ターゲティング特異性および再ターゲティングを強化するために直接的および間接的両方のターゲティングアプローチが用いられてきた。例として、直接的ターゲティングでは、ある特定の細胞タイプへのAAVベクターターゲティングは、ウイルスキャプシド配列に直接挿入されている小さなペプチドまたはリガンドによって媒介される。このアプローチは、内皮細胞をターゲティングするために首尾よく用いられてきた。直接的ターゲティングでは、キャプシド表面に露出される部位にペプチドまたはリガンドが配置されるようにキャプシド構造の詳しい知識が必要とされる。挿入はキャプシド構造および集合に大きな影響を及ぼさず、特定の細胞タイプへのターゲティングを最大化するために天然の親和性は除去される。間接的ターゲティングでは、AAVベクターターゲティングは、ウイルス表面と特定の細胞表面受容体の両方と相互作用する結合分子によって媒介される。AAVベクター用の、このような結合分子には二重特異性抗体およびビオチンが含まれ得る。間接的ターゲティングの利点は、キャプシド構造を大きく変えることなく、様々なアダプターをキャプシドに結合することができ、天然の親和性を簡単に除去できることである。ターゲティングのためにアダプターを使用する欠点は、インビボでのキャプシド-アダプター複合体の安定性が低下する可能性を含む。
さらに、細胞形質導入ならびに脈管構造を介した中枢神経系および脳への遺伝子導入を高めるキャプシドを含むAAVベクターが産生され得る。(Chan, K.Y. et al., 2017, Nat. Neurosci., 20(8):1172-1179)。このようなベクターは、介在ニューロンを含むニューロン細胞の堅固な形質導入を容易にする。エンハンサーおよび細胞タイプ特異的プロモーターと共に用いられた時に、このようなAAVは神経系のニューロン細胞において標的遺伝子発現をもたらす。
1個の細胞当たりの高い発現レベルを必要としない用途の場合、使用されるウイルスの量、すなわち、ウイルス用量を少なくすることができる。全身遺伝子送達に用いられるウイルス負荷(viral load)を少なくすると、コストと製造負担が低下し、ウイルス成分に対する有害反応の潜在的なリスクが最小になる。
組換えアデノ随伴ウイルスベクターの送達および処置アプローチ
一般的に、遺伝子レベルで、例えば、遺伝子発現を改変または修正することによって、例えば、遺伝子療法によって神経学的疾患を処置するためのエフェクター遺伝子の送達は、適切かつ有効なベクター、例えば、ウイルスまたはウイルスベクター、例えば、AAVまたはrAAVを用いて成し遂げられ得る。rAAVベクターの使用は、治療用遺伝子を、その遺伝子が発現される細胞に効率的に送達する。遺伝子を細胞に送達するための他の方法およびアプローチは、例えば、金粒子に付着したDNAまたは脂質-DNA複合体を用いるショットガンアプローチである水力学的圧力下での精製DNAの使用を伴うが、このような方法およびアプローチは往々にして遺伝子を効率的に送達せず、治療効力に必要とされるものよりも少ない遺伝子発現をもたらす。さらに、このような方法はヒト使用に適用できない。他方で、ウイルスは、インビボで宿主細胞において外因性遺伝子を送達および発現するための天然の運び屋である。
ウイルスベクターとしてのrAAVの使用に関連する利点は、動物モデルで証明されているようにrAAVトランスジーン発現が典型的には数年または生涯にわたって持続することである。これは、トランスジーン発現が初期に爆発することが多く、通常、比較的短い時間、例えば、数週間後に消失する非rAAVウイルスベクターと対照をなす。
強化された療法または処置を成し遂げるために、治療応答に必要なrAAVベクターの用量は、例えば、ある特定のrAAV血清型を用いることで少なくなることがある。または、上記のように標的組織および標的細胞に取り付くためにrAAVベクターキャプシドの表面が特定のリガンドを含むように変えられることがある。別のアプローチでは、細胞質内小胞(endocytoplasmic vesicle)から核へのウイルス粒子の輸送を考慮する(Zhao, W. et al., 2007, Gene Ther., 14:545-550; Daya, S. and Berns, K.I., 2008, Clin. Microbiol. Rev., 21(4):583-593)。典型的に、rAAVベクター調製物のウイルス粒子対感染性の比は10:1～100:1である。この高い比は、不完全な、または空のベクター粒子、ならびに細胞質内小胞からの核への輸送を反映している。輸送中に、ベクター粒子はユビキチン結合し、トランスジーンが発現され得る核ではなく分解のためにプロテアソームに向けられることがある。ユビキチン結合と、プロテアソームへの方向付けには、rAAVベクターキャプシド表面にあるチロシン残基のリン酸化が必要なことが発見された。AAV-2キャプシド表面にある7個のチロシン残基がフェニルアラニン残基と交換された時に、トランスジーン発現の検出に必要とされる感染多重度(MOI)は細胞培養物中で、および肝臓と眼にある細胞の形質導入のいくつかのマウスモデルにおいて大幅に低下した。従って、疾患の処置においてトランスジーン発現を治療レベルまで高める能力が強化される可能性がある。
発作を管理下に置くための1つまたは複数の処置アプローチが、最先端の遺伝子療法または薬理遺伝学的アプローチが関与する本明細書に記載の治療用産物、組成物、および方法に含まれる。このようなアプローチは、DSの発作症状を軽減するための臨床的に関連する療法の開発につながる可能性が高い。
脳に直接送達する場合、rAAVベクターは、血液脳関門を迂回するために、トランスジーン発現を時間的および空間的に制限するために、ならびに特定の脳領域、例えば、介在ニューロン細胞およびこれらの細胞を含む脳組織をターゲティングするために切開(open)神経外科手技によって投与されてもよく、局所注射によって投与されてもよい。
(静脈内注射による)全身rAAV送達は、神経系への幅広い遺伝子送達のための非侵襲的代案を提供する。しかしながら、必要とされる高いウイルス負荷と、比較的低い形質導入効率が、この方法の幅広い採用を制限してきた。いくつかのグループが、静脈内送達後にCNSならびにある特定の組織および細胞集団への遺伝子導入を強化するrAAVキャプシドを開発している。例として、AAV-ASキャプシド18では、特に、線条体へのニューロン形質導入を高めるために、AAV9.4719VP2キャプシドタンパク質へのポリアラニンN末端延長を利用している。AAV2をベースとするAV-BR1キャプシド20は脳内皮細胞への効率的かつ選択的な形質導入に有用な可能性がある。別のAAVキャプシドであるAAV-PHP.Bは、静脈内注射後に、成獣マウス脳および脊髄の多くの領域にわたるニューロンおよび星状細胞の大多数に形質導入するキャプシドを含む。一態様では、rAAVは、大脳皮質(脳)にあるPV介在ニューロンを含む介在ニューロンに特異的に形質導入したキャプシドを含む。
他のrAAVベクター投与方法は、脂質を介したベクター送達、水力学的送達、および遺伝子銃を含む場合がある。特定の態様では、rAAVベクターは、介在ニューロン細胞、例えば、GABA作動性介在ニューロン細胞およびGABA作動性PV発現介在ニューロン細胞、または錐体細胞、例えば、グルタミン酸作動性錐体細胞、およびこれらの細胞を含む脳組織に直接感染または形質導入する可能性を高めるキャプシドを含む。
本明細書に記載のウイルスベクターおよびその組成物は、神経学的、神経発達的、および神経変性の疾患および障害の処置において、特に、てんかんおよびその付随する症状、多くの場合、重篤な発作症状を含むDSの処置に使用される場合がある。発作のカテゴリーを区別する特徴は、発作活動が部分的(例えば、局所性)か全般性かどうかである。一態様では、本明細書に記載のウイルスベクターおよびその組成物は部分発作および/または全般発作を処置するのに用いられる。部分発作は、典型的には、発作活動が別々の大脳皮質領域に制限されるものだとみなされる。当業者により理解されるように、発作は、発作中に意識が完全に保たれていれば単純部分発作として特徴付けられる。意識障害があれば、発作は複雑部分発作として特徴付けられる。複雑部分発作はまた、部分発作として始まり、その後に皮質中に広がるものも含む。従って、これらのタイプの発作は、二次性全般化を伴う部分発作（partial seizure with secondary generalization)だとみなされる。
全般発作は脳の離れた領域を同時に左右相称に取り囲み、例えば、欠神発作または小発作の場合、姿勢制御を失わずに急な短時間の意識消失を伴うことがある。非定型欠神発作は、通常、さらに長い意識消失と、もっとゆるやかな発生と終了を伴う。全身性強直・間代発作(generalized tonic-clonic seizure)または大発作(grand mal seizure)は全般発作の主なタイプとみなされており、典型的には、前兆なく突然発生する。発作の初期段階は、通常、緊張性筋収縮と、呼吸障害と、心拍、血圧、および瞳孔サイズの拡大につながる交感神経緊張の著しい亢進を伴う。約10～20秒後、発作の緊張段階は、典型的には、緊張性筋収縮に重ね合わされる筋弛緩期間によって生じるクローヌス段階に発展する。弛緩期間は、通常、1分以下続く発作段階が終了するまで進行的に増加する。発作後段階は、不反応性、筋弛緩状態、ならびに喘鳴音のある呼吸と部分的な気道閉塞の原因となり得る過剰な唾液分泌を特徴とする。
弛緩性発作は、約1～2秒続く突然の姿勢筋緊張の消失を特徴とする。短時間の意識障害の間に、通常、発作後錯乱はない。ミオクローヌス発作は、身体の一部または全身を伴うことがある、突然の、かつ短時間の筋収縮を特徴とする。非限定的に、本明細書に記載のrAAV産物、その組成物および使用方法は、DSがある人を苦しめる発作を含む、前記発作の予防的処置および/または治療的処置を包含する。一態様では、本明細書に記載のrAAV産物、その組成物および使用方法は、SCN1A遺伝子によってコードされるナトリウムチャンネルNav1.1の機能喪失または機能障害と関連するてんかんの予防的処置および/または治療的処置に用いられる。特定の態様では、本明細書に記載のrAAV産物、その組成物および使用方法はドラベ症候群(DS)の予防的処置および/または治療的処置に用いられる。別の態様では、本明細書に記載のrAAV産物、その組成物および使用方法は薬剤抵抗性てんかんの予防的処置および/または治療的処置に用いられる。薬剤抵抗性てんかんとは、このタイプのてんかんの処置に適しており、かつ最大耐用量(MTD)で投与された2種類以上の薬物の使用にもかかわらず、管理されていない、てんかん状態を指す。態様では、薬剤抵抗性てんかんは、以前の抗てんかん薬処置または処置の組み合わせによって発作が無くならなかった状態を包含する。
遺伝薬理学的アプローチ
本明細書に記載のウイルスベクター、rAAVベクター、その組成物、および方法と使用するための遺伝薬理学的アプローチが検討されている。このようなアプローチは、本明細書に記載のエンハンサーエレメント(例えば、E1～E10)とGq-DREADD受容体またはPSAMをコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスベクター、例えばrAAVベクターを用いて、Gq-DREADD受容体またはPSAMをPV介在ニューロンに特異的に送達する。標的とされたPVニューロンは、処置される病態のタイプによって決定されるように局所注射の時には特定の領域において、または全身注射の時には皮質全体に、受容体(Gq-DREADDまたはPSAM)を安定発現する。その後に、個体(患者)には、受容体を活性化する薬物(例えば、それぞれ、CNOまたはPSEM)が投与される。このアプローチは、この受容体を発現するPV介在ニューロンの興奮性の制御された変化をもたらし、ニューロン(介在ニューロンおよびPV発現介在ニューロン)における興奮/抑制(E/I)バランスを用量依存的かつ時間依存的に調節し、その結果として脳の活動を正常化する。
薬学的組成物
DSなどの神経学的または神経発生的な疾患、障害、もしくは病態に苦しんでいるか、またはそれを発症するリスクがある対象を処置するための薬学的組成物または製剤も提供される。一態様では、薬学的組成物は、(活性薬剤として)AAVベクターまたはウイルス粒子、例えば、本明細書に記載のSCN1A特異的エンハンサー配列を含有するAAVベクターまたはウイルス粒子と、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む。薬学的組成物の中に処方された時に、治療用化合物または産物としてのrAAVベクターは、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することができる。
治療剤は任意の適切な担体物質に任意の適切な量で含めることができ、一般的に、組成物の総重量に対して1～95重量％の量で存在する。前記組成物は、本明細書に記載のウイルスベクターなどの薬剤が全身送達されるように、非経口(例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内)投与経路に適した剤形で提供されてもよい。一態様では、特に、レポーター産物もベクターによってコードされている時に、本明細書に記載のrAAVベクターの全身注射は脳領域全体にわたる発現特異性の特徴付けを可能にする。薬学的組成物は従来の薬務に従って処方され得る(例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照されたい)。
薬学的組成物は、おおむね投与されたらすぐに、または任意の予め決められた時間で、または投与後に活性薬剤を放出するように処方され得る。後者のタイプの組成物は一般的に制御放出(controlled release)製剤として知られ、これは、(i)長期間にわたって体内に実質的に一定の薬剤濃度を作り出す製剤、(ii)予め決められたラグタイムの後に、長期間にわたって体内に実質的に一定の薬物濃度を作り出す製剤、(iii)体内に比較的一定の有効なレベルを維持し、それに付随して、活性物質の血漿レベルの変動(鋸歯状のキネティックパターン)に関連する望ましくない副作用を最小限にすることによって、予め決められた期間の間に作用を持続する製剤、(iv)例えば、標的部位もしくは標的場所に隣接した、または標的部位もしくは標的場所と接触する制御放出組成物の空間配置によって、作用を、例えば、組織または臓器の領域に局在化させる製剤、(v)用量が、例えば、1週間、2週間、または数週間に1回投与されるように便利な投薬を可能にする製剤、および(vi)治療剤を、例えば、介在ニューロン、またはPV発現GABA作動性介在ニューロン、または錐体ニューロン、例えば、グルタミン酸作動性錐体ニューロンに送達するように担体、化学的誘導体、または特別に設計されたベクター(例えば、ある特定のキャプシド組成物を含む)を用いて特定の組織または細胞タイプをターゲティングする製剤を含む。一部の用途については、制御放出製剤は、投与された薬剤の血漿レベルを治療レベルに維持するために日中に頻繁に投薬する必要をなくす。
放出速度が、問題となっている薬剤の代謝速度より勝る制御放出を得るための方法は、限定するものであると意図されない。例として、制御放出は、例えば、様々なタイプの制御放出組成物およびコーティングを含む様々な製剤パラメータおよび成分を適切に選択することによって得られる。従って、治療剤は、適切な賦形剤を用いて、投与されると薬剤を制御放出する薬学的組成物になるように処方される。例には、単一単位または複数単位の錠剤またはカプセル組成物、油溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロカプセル、マイクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームが含まれる。
DSなどの神経学的疾患または神経学的障害を処置するための薬剤の組み合わせを含む組成物の投与は、他の成分と組み合わされた時に、対象において発作を寛解させる、軽減する、低減する、減少させる、または安定化するのに有効な治療剤濃度をもたらす任意の適切な手段によるものでよい。前記組成物は、例えば、生理食塩水などの薬学的に許容される緩衝液に溶解して処方されて全身投与されてもよい。一態様では、特にレポーター産物もベクターによってコードされている時に、本明細書に記載のrAAVベクターを全身注射すると脳領域全体にわたって発現特異性を特徴付けることが可能になる。
投与経路には、例えば、患者において連続した持続したレベルの薬剤を最適に提供する、例えば、注射による、頭蓋内投与、非経口投与、皮下(s.c.)投与、静脈内(i.v.)投与、腹腔内(i.p.)投与、筋肉内(i.m.)投与、または皮内投与が含まれる。投与される治療剤の量は、投与方法、患者の年齢、身体状態、および体重、ならびにDSなどの神経学的疾患または神経学的障害の臨床症状に応じて変化する。一般的に、量は、神経学的疾患または神経学的障害の処置において、特に、脳において用いられる他のウイルスベクターベース薬剤に用いられる量の範囲であるが、場合によっては、この薬剤が高い特異性を示すのであれば、もっと少ない量が必要とされる。組成物は、治療効果、例えば、当業者に公知の方法によって確かめられた時に、患者において発作を寛解させる、軽減する、低減する、減少させる、または安定化する効果を示す投与量で投与される。
薬学的組成物は、剤形、製剤の形で、または従来の無毒の薬学的に許容される担体およびアジュバントを含有する適切な送達装置もしくは移植片を介して、注射、注入、または移植(皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、頭蓋内など)によって非経口投与されてもよい。このような組成物の製剤および調製物は薬学的製剤の当業者に周知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 前記において見られる。特定の態様では、投与は、例えば、注射または静脈内送達による全身投与および非経口投与である。
非経口送達用および非経口投与用の組成物は単位剤形で(例えば、単一用量アンプルに入れて)提供されてもよく、いくつかの用量を含有し、適切な防腐剤が添加され得るバイアルに入れて提供されてもよい(以下を参照されたい)。前記組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、注入装置、または移植用の送達装置の形をとってもよく、使用前に水または別の適切なビヒクルを用いて再構成される乾燥粉末として提示されてもよい。活性薬剤(例えば、本明細書に記載のように、エンハンサー配列と、エフェクター遺伝子および関連する調節配列をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスベクターまたは粒子)の他に、前記組成物は、適切な非経口的に許容される担体および/または賦形剤を含んでもよい。活性治療剤は、制御放出のためにマイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込まれてもよい。さらに、前記組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、pH調整剤、張性調整薬剤、および/または分散剤を含んでもよい。
一部の態様では、活性治療剤(すなわち、本明細書に記載のウイルスベクターまたは粒子)を含む組成物は静脈内送達用に処方される。上記のように、説明された態様に従う薬学的組成物は無菌注射に適した形をとってもよい。このような組成物を調製するために、適切な治療剤は、非経口的に容認できる液体ビヒクルに溶解または懸濁される。使用され得る容認できるビヒクルおよび溶媒には、水、適量の塩酸、水酸化ナトリウム、または適切な緩衝液を添加することで適切なpHに調整した水、1,3-ブタンジオール、リンガー溶液、等張性の塩化ナトリウム溶液、およびデキストロース溶液が含まれる。水性製剤は1種類または複数種の防腐剤(例えば、メチル、エチル、またはn-プロピルp-ヒドロキシベンゾエート)も含有してよい。薬剤のうちの1つが水に控えめに、またはわずかにしか溶けない場合、溶解を強化する薬剤または可溶化剤が添加されてもよく、溶媒が10～60％w/wのプロピレングリコールなどを含んでもよい。
投与および送達の方法
DSを有する対象、例えば、患者または乳児患者への、本明細書に記載のウイルスベクターまたは薬学的組成物の投与。態様では、前記ウイルスベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物は、このベクターまたはウイルス粒子に含まれる配列を発現するように機能するか、または活性があるような任意のやり方で細胞(標的細胞、例えば、介在ニューロンまたは介在ニューロンを含む脳の層)に送達され得る。例示的に、SCN1A特異的エンハンサーとエフェクター遺伝子(例えば、SCN1A)ポリヌクレオチド配列を含むrAAVは、介在ニューロンにおいてSCN1Aを標的発現するために介在ニューロン細胞または介在ニューロン細胞を含む組織に送達され得る。従って、ウイルスベクターまたはウイルス粒子は、ウイルスベクターまたはウイルス粒子を含む組成物と細胞を接触させ、ウイルスベクターまたはウイルス粒子が有するポリヌクレオチドを細胞において異種発現させることによって細胞に送達される。治療的に有効なレベルのコードされている産物が産生されるように、rAAVベクターが有するポリヌクレオチドは取り込まれる形で対象の細胞に送達しなければならない。
形質導入用rAAVベクターは、細胞への望ましいタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする遺伝子の送達および発現のために、特に、感染効率が高く、組込みと発現が安定しているという理由で用いられる(例えば、Cayouette et al., Human Gene Therapy, 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research, 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology, 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science, 272:263-267, 1996;およびMiyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:10319, 1997を参照されたい)。例として、rAAVは、遺伝子発現を特定の介在ニューロン細胞タイプにおいて優先的に誘導する、本明細書に記載のSCN1A特異的エンハンサー核酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むように操作され、遺伝子、例えば、SCN1Aの発現をGABA作動性介在ニューロン標的細胞または錐体標的細胞、例えば、グルタミン酸作動性錐体細胞に誘導および制限するために用いられる。一態様では、遺伝子は、標的細胞に特異的なプロモーターなどの任意の適切なプロモーターから発現することができる。一態様では、rAAVベクターは全身投与される。一態様では、特に、例えば、レポーター産物もベクターによってコードされている時に、本明細書に記載のrAAVベクターの全身注射を用いると脳領域全体にわたる発現特異性の特徴付けが可能になる。
遺伝子導入はまたインビトロトランスフェクション法を用いて成し遂げることもできる。このような方法には、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、およびプロトプラスト融合の使用が含まれる。DNAを細胞に送達するのにリポソームも潜在的に有益な場合がある。
処置方法およびプロトコール
治療剤を必要とする対象、例えば、神経学的疾患または神経学的障害、さらに具体的には、発作、てんかん、またはDSを有する、経験している、経験したことがある、および/または経験するリスクがある対象に、ならびに発作障害と診断される可能性があるか、または発作障害を有すると疑われるか、もしくは発作障害の症状を有すると疑われる対象にも、あるいはこのような処置が必要であると特定された対象に治療剤を投与する方法が提供され、ここでは、治療効果を生じるように、有効量の本明細書に記載のウイルスベクターもしくはウイルス粒子または本明細書に記載の組成物が対象に投与される。説明された方法によれば、治療効果には、rAAVベクター産物または組成物を対象に投与した後に、神経学的疾患もしくは神経学的障害の1つもしくは複数の症状、例えば、発作もしくはてんかんを阻害する、低減する、もしくは寛解させるように、または1つもしくは複数の症状を予防するように十分な数の介在ニューロンに導入されるrAAVの量が含まれるが、それに限定されるわけではない。投与されるrAAVの量は、当業者、例えば、医療従事者または臨床従事者によって決定することができ、当業者によって理解されているように、てんかん病巣のサイズ、ウイルス調製物の力価、および非ヒト霊長類で得られたデータなどの要因に基づいている(例えば、Colle, M.-A. et al., 2010, Hum. Mol. Genet., 19:147-158)。例として、rAAVベクターまたはその粒子を治療的に関連する数の介在ニューロンに形質導入するために1010～1012個のrAAV粒子が用いられる場合がある。このような処置を必要とする対象の特定は対象または保健医療専門家の判断で行われてもよく、主観的(例えば、見解)でもよく、客観的(例えば、検査または診断方法によって測定可能)でもよい。
治療的方法(予防的処置を含む)は、一般的に、治療的有効量の本明細書に記載の薬剤、例えば、rAAVベクター、ウイルス粒子、または上記の薬剤を含有する組成物を、それを必要とする、哺乳動物、特に、ヒトを含む対象(例えば、動物、ヒト)に投与することを含む。このような処置は、神経学的疾患または神経学的障害、例えば、発作および/もしくはてんかん、またはDSに罹患しているか、それを有するか、それにかかりやすいか、またはそのリスクがある対象、特に、ヒトまたは乳児ヒトに適切に投与される。「リスクがある」対象の決定は、診断検査または対象もしくは医療提供者の見解による任意の客観的決定または主観的決定(例えば、遺伝子検査、酵素またはタンパク質マーカーまたはバイオマーカー、家族歴など)によって行うことができる。
説明されたようなウイルスベクターおよび薬学的組成物は、神経学的なまたは神経変性の疾患または障害、例えば、発作、てんかん、またはDSに罹患している患者を処置するために治療的に使用されてもよく、ある特定の神経学的なまたは神経変性の疾患または障害のリスクがある患者に高度な処置または保護、例えば、発作、てんかん、DSの1つもしくは複数の症状またはその重篤度を低減する、減少させる、軽減する、または回避するための予防的ワクチン接種を提供するために予防的に使用されてもよい。本明細書に記載のrAAVベクターの予防的有効量は、本明細書において限定するものであると意図されず、レシピエントの体重1キログラムにつき約102TU(形質導入単位(transducing unit))～レシピエントの体重1キログラムにつき約1020TUまたはこれらの値の間の任意のTUでもよい。投与量およびレジメンを最適化するために発作およびDSのマウスモデルを使用することができる。
本明細書に記載の治療用ベクターは、それを必要とする対象に、SCN1Aに欠損がある介在ニューロンの興奮性を正常化するのに、ならびにドラベ症候群(DS)の発作および発作症状を軽減するのに有効な量で投与され得る。本明細書に記載のベクターおよび方法は、1つもしくは複数の発作および/もしくはDSを経験した、またはそれを経験するリスクがある個体、例えば、ヒト乳児、小児、または成人にとって治療的価値がある場合がある。一態様では、本明細書に記載のrAAVまたはrAAVを含む組成物は、投与時に、Nav1.1ナトリウムチャンネルをコードするSCN1A遺伝子を発現しないか、またはその機能もしくは発現の喪失を示す介在ニューロンを有する個体に投与され、このSCN1A遺伝子は、発現するために、本明細書に記載のE1～E10などのSCN1A特異的エンハンサーに依存する。一態様では、SCN1A限定エンハンサー配列を含有する説明されたrAAVベクターによって形質導入された介在ニューロン細胞においてSCN1aが発現すると、SCN1Aが欠損しているか、またはSCN1Aの異常発現を有する介在ニューロンの興奮性が正常化する。一態様では、本明細書に記載のrAAVベクターを含む組成物は、SCN1A遺伝子をもはや発現していない介在ニューロンを有する個体に投与される。一態様では、本明細書に記載のrAAVベクターを含む組成物は、少なくとも1ヶ月齢の個体に投与される。態様では、個体は、少なくとも1歳、2歳、3歳、4歳、5歳、6歳、7歳、8歳、9歳、10歳、11歳、12歳、13歳、14歳、15歳、16歳、17歳、または18歳である。
本明細書に記載のrAAVベクターが投与される対象、例えば、哺乳動物対象およびヒト患者は、補助的な、または追加の処置または治療用の化合物もしくは薬物、例えば、当業者に周知の他の抗てんかん治療剤および/または外科的技法との使用を含むが、必ずしもこれに限定されるわけではない、抗発作モダリティからも利益を得る場合がある。例として、本明細書に記載の治療用産物および組成物と共に使用され得る抗てんかん薬物(AED)には、アセタゾラミド、ブリバラセタム、カルバマゼピン、クロバザム、クロナゼパム;エスリカルバゼピン酢酸エステル、エトサクシミド、ガバペンチン、ラコサミド、ラモトリギン、レベチラセタム、オクスカルバゼピン、ペランパネル、フェノバルビタール、フェニトイン、プレガバリン、プリミドン、ルフィナミド、バルプロ酸ナトリウム、スチリペントール、チアガビン、トピラマート、バルプロ酸、(Convulex、EpilimChrono、Epilim Chronosphereとして入手可能)、ビガバトリン、およびゾニサミドが含まれるが、それに限定されるわけではない。
キット
神経学的または神経精神医学的な疾患、状態、または病態、例えば、発作および/またはてんかん、ならびにドラベ症候群(DS)の症状の予防または処置を必要とする対象において、神経学的または神経精神医学的な疾患、状態、または病態、例えば、発作および/またはてんかん、ならびにドラベ症候群(DS)の症状を予防または処置するためのキットも提供される。一態様では、キットは、有効量の本明細書に記載のrAAVベクターまたはウイルス粒子を含有する治療用組成物または予防用組成物であって、本明細書に記載のrAAVベクターまたはウイルス粒子が、SCN1A遺伝子、例えば、前記ウイルスベクターに含まれるSCN1A遺伝子の発現を、脳(すなわち、終脳)にあるGABA作動性介在ニューロン細胞を含む介在ニューロン細胞、または脳皮質にある錐体細胞、例えば、グルタミン酸作動性錐体細胞、またはVIP細胞に制限する、SCN1A遺伝子に特異的なエンハンサーポリヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。一態様では、SCN1A特異的エンハンサーは、本明細書に記載のE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、またはE10ヒトエンハンサー配列である。一態様では、SCN1A特異的エンハンサーはE2ヒトエンハンサーポリヌクレオチド配列である。一態様では、SCN1A特異的エンハンサーはE5ヒトエンハンサーポリヌクレオチド配列である。一態様では、SCN1A特異的エンハンサーはE6ヒトエンハンサーポリヌクレオチド配列である。
別の態様では、キットは、有効量の本明細書に記載のrAAVベクターまたはウイルス粒子を含有する治療用組成物または予防用組成物であって、本明細書に記載のrAAVベクターまたはウイルス粒子が、ニューロンまたは介在ニューロン細胞、特に、PV発現ニューロンにおいて発現する遺伝子に特異的な、E11～E35エンハンサーポリヌクレオチド配列、特に、ヒトE11～E35配列を含む、組成物を提供する。
一部の態様では、キットは、治療用組成物または予防用組成物を含む滅菌した容器を含む。このような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バック、パウチ、ブリスター包装、または当技術分野において公知の他の適切な容器形態でもよい。容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙(laminated paper)、金属箔、または医用薬剤を保持するのに適した他の材料から作られてもよい。
少なくとも、本明細書に記載のSCN1A特異的エンハンサーポリヌクレオチド配列を含むrAAVベクターを含む組成物は、発作、てんかん、もしくはDSを有するか、または発作、てんかん、もしくはDSを発症するリスクがある対象に組成物を投与するための説明書と一緒に提供される。一態様では、rAAVベクターは、GABA作動性介在ニューロンおよびPV発現介在ニューロンを含む介在ニューロン細胞、またはグルタミン酸作動性錐体細胞などの錐体細胞において発現させるためのSCN1Aトランスジーンを含む。説明書は、一般的に、発作、てんかん、またはDSを処置または予防するための組成物の使用についての情報を含む。他の態様では、説明書は、以下:治療剤(SCN1A特異的エンハンサーポリヌクレオチド配列などを含むrAAV)の説明;虚血またはその症状を処置または予防するための投与計画および投与;用法注意;警告;適応症;使用禁忌;過量情報;有害反応;動物薬理学;臨床研究;ならびに/または参考文献の少なくとも1つを含む。説明書は、容器(存在する場合)に直接印刷されてもよく、容器に貼り付けられたラベルとして、または容器の中に、もしくは容器と一緒に提供される独立したシート、パンフレット、カード、フォルダとして印刷されてもよい。
さらなる態様およびその利点
神経学的障害を処置する方法の理解と開発は、関与するニューロンタイプの複雑さから来ている。本明細書に記載の態様の産物および方法は、疾患遺伝子または疾患関連遺伝子の細胞活動を解析するために開発された。従って、SCN1A遺伝子座は系統立って分析され、それによって、10個の異なるエンハンサーエレメント(エンハンサーE1～E10)、特に、ヒトエンハンサーエレメントとその配列が特定され、SCN1A遺伝子のイントロン領域および遺伝子間領域にわたって分布していることが見出された(図3D)。発現が、これらのエンハンサーのそれぞれに依存しているAAVを作り出すことによって、SCN1A遺伝子発現の全体パターンを再現する少なくとも3つのエンハンサー、例えば、E2(PV特異的発現の場合)、E6(VIP特異的発現の場合)、およびE5(錐体の第5層に関連した発現の場合)が特定された。他の7つのエレメント(例えば、E1、E3、E4、E7、E8、E9、およびE10)は全てGAD1に高度に特異的であり、介在ニューロン亜集団の集まりを標識し、サブタイプの別個の組み合わせを動員し得る。特定の態様では、E2エンハンサーエレメントは、ある特定のcINサブタイプ、すなわち、PV発現ファストスパイキング細胞に選択的であることが突き止められた。SCN1Aの発現消失は特にPV cIN機能不全と関連し、E2エンハンサーは、げっ歯類だけでなく、ヒトを含む様々な霊長類でも、この細胞集団を選択的にターゲティングすることに特に長けていることが分かった。さらに、E2エンハンサーは、結合性、興奮性のモニタリング、および光遺伝学を用いたPV cIN活動の操作を含むが、それに限定されるわけではないPV cIN機能の側面を調べることにも有用なことが確かめられた。広範な種においてE2エンハンサーの有用性が証明されたことは、このアプローチによって提供される基礎用途および臨床用途の広さに光を当てる。E2エンハンサーによって提供される他の使用には、例として、もっと広範な回路探索(例えば、狂犬病などの組換えウイルスを用いた単シナプス追跡(monosynaptic tracing)のためのスターター細胞の作製)、細胞タイプ特異的な遺伝子機能喪失(例えば、クリスパー)、および標的薬物スクリーニングが含まれる。さらに、E2エンハンサーを使用すると、PV cINの数、分布、または生理学的特性の点で種特異的な差異を調べるための薬剤が得られる。他の細胞タイプに一般化されると、このアプローチは、広範な種、最も注目すべきは霊長類とヒトを調べるのに有利である。
本明細書に記載のように、SCN1A遺伝子座などの特定の疾患遺伝子座にあるエンハンサーを系統立って調べる戦略によって、この遺伝子を発現する細胞タイプのそれぞれについて重要な調節エレメントが首尾よく特定され、従って、このアプローチの利点が強調される。このアプローチは、SCN1A遺伝子の発現を制御する調節的特性を明らかにし、SCN1A遺伝子を発現する別個の細胞亜集団を操作するためのツールキットを提供する。
SCN1A遺伝子座と関連するSNPの多くはイントロン1に位置する。特定の態様では、および本明細書に記載のように、SCN1A発現集団に対して高い特異性を有すると突き止められた3つのエンハンサー、すなわち、E2、E5、およびE6は、この領域内に位置していた。理論に拘束されたくはないが、特定されたSNPは、これらのエンハンサーにある、SCN1Aの発現に影響を及ぼす変異であるかもしれない。GTExデータは、これらのエンハンサーの中に、ヒトにおけるSCN1A発現の変化と関連する複数のeQTLを示すと報告されている(Auget, F. et al., 2017, Nature, 550:204-213)。前脳介在ニューロンからSCN1Aが条件付きで除去されるとマウスにおいて発作表現型が再現されることが示されているので、E2は特に注目されている。SCN1A発現は主として介在ニューロンのPV発現亜集団に制限されるので、E2エンハンサーの変異がドラベ症候群の直接的な原因であるかもしれない。
回路成熟の初期ダイナミクスを調べる上で最大の障害の1つは、トランスジェニック動物を使用しなければ特定の細胞タイプを利用しにくいことであった。若いPV cINは、複雑な遺伝子戦略を用いてもターゲティングに特に問題を抱えていた。(全ての抑制的性cINの40％に相当する)PV-cINが豊富なことと、神経発達的障害に関与していることを考慮すると、これらの細胞をPV発現開始の前に評価することは、この分野において優先すべき事項である。これらの発生段階でのE2エンハンサーの特異性とウイルス注射の使用は、PV cINなどのニューロン細胞タイプの正常発達と、神経学的疾患または神経精神医学的疾患におけるその役割を理解するための薬剤およびツールを提供する。一態様では、E2エンハンサーは、PV-cINの正常発達と、疾患におけるその役割を研究するための薬剤を提供する。さらに、E2エンハンサーならびに本明細書中で提供される他のエンハンサーエレメントは特定の細胞をターゲティングするのに役立つ可能性があり、疾患、例えば、ラベ症候群を含むニューロン疾患を処置するのに有利である。
他の態様では、本明細書中で特定および説明されたエンハンサーは、別個の臨床関連性をもつ特定の細胞集団へのアクセスを提供する。例として、これらのエンハンサーは、例えば、遺伝子療法によって、またはニューロン活動の調節を介して、例えば、光遺伝学的または化学遺伝学的アプローチを介して、ドラベ症候群の衰弱性の側面を軽減するために用いられる(例えば、Walker, M.C. et al., 2019, Neuropharmacology, 107751. doi: 10.1016/j.neuropharm.2019.107751. Review. PMID: 31494141を参照されたい)。本明細書中で説明および証明されるように、脳への有効なウイルス送達のために局所注射および全身注射を使用することができ、従って、臨床介入のための送達および投与方法が提供される。例として、局所注射(例えば、エンハンサーエレメントと標的ポリヌクレオチドを運ぶ組換えウイルスの局所注射)は焦点性てんかん、前頭前皮質機能不全、または海馬記憶障害を軽減するために用いられる場合がある。ウイルスの全身投与または送達は、例えば、全般発作または精神医学的障害および神経変性障害を補正するために全体的な介入が必要な状況で用いられる場合がある。本明細書中で説明および例示される態様によって提供されるように、調節エレメントを厳密に特定すると、特定の細胞タイプを評価することが可能になる。このようなエレメントは、実験および治療の手順および方法の両方において使用するのに有利である。
説明された態様の実施では、特に定めのない限り、分子生物学(組換え法を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技法を使用し、これらは十分に当業者の範囲内である。このような技法は、文献では、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第2版 (Sambrook, 1989); 「Oligonucleotide Synthesis」 (Gait, 1984); 「Animal Cell Culture」 (Freshney, 1987); 「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」 (Weir, 1996); 「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」 (Miller and Calos, 1987); 「Current Protocols in Molecular Biology」 (Ausubel, 1987); 「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis, 1994); 「Current Protocols in Immunology」 (Coligan, 1991)において十分に説明されている。これらの技法は、ポリヌクレオチド 、ウイルスベクター、およびウイルス粒子の産生に適用することができ、従って、本明細書に記載の態様の作製および実施において考慮され得る。特定の態様に特に有用な技法が以下のセクションにおいて議論される。
以下の実施例は、当業者に、本明細書に記載の産物、組成物、および治療方法を作製および使用するやり方を完璧に開示および説明するために示され、本明細書中で説明および例示されるものの範囲を限定することを目的としない。
実施例1-レポーターおよびエフェクター遺伝子の発現をPV発現皮質介在ニューロン細胞集団に制限するcis調節配列(PV介在ニューロン特異的エンハンサー配列)の特定
SCN1Aは、 Nav1.1 ナトリウムチャンネルをコードする遺伝子であり、皮質にある複数の別個のニューロン集団において発現している。これらには、3つの重複しないニューロン集団:パルブアルブミンを発現するファストスパイキング皮質介在ニューロン(PV cIN)、血管作用性小腸ペプチドを発現する脱抑制性皮質介在ニューロン(VIP cIN)、および第5層錐体ニューロンが含まれる。特定の態様では、SCN1AはPV発現皮質介在ニューロンにおいて発現している。SCN1Aは、その機能喪失が、発作の早期発症を特徴とする早期発症型および難治型のてんかん性脳症であるドラベ症候群と関連付けられているので特に関心が高い。さらに具体的には、SCN1Aのハプロ不全変種または病原性変種がドラベ症候群を引き起こす。
SCN1A遺伝子座内にある候補エンハンサーを系統立って特定するための統合的な方法が、この遺伝子を発現する別個の皮質集団をターゲティングするための遺伝子戦略として開発および考案された。調節配列を以下3つの判断基準に基づいて選択した。第1に、遺伝子の転写開始部位(TSS)に対するエンハンサーの近接は発現レベルに正比例することが断定されているので、機能的なレベルのトランスジーンを動かすことができるエンハンサーを特定するために、TSSに最も近いSCN1Aの遺伝子間領域およびイントロン領域を調べた。第2に、所定の細胞タイプの中で活性があるエンハンサーの場所はクロマチンアクセシビリティと相関関係があるので、SCN1Aを発現する細胞集団のクロマチン特性を評価するために、Dlx6acre;Sun1-eGFPトランスジェニックマウスを用いて視覚皮質から介在ニューロンを収集した。所定の細胞タイプの中で活性があるエンハンサーの場所はクロマチンアクセシビリティおよびDNA低メチル化と相関関係がある。
核を単離した後に、最高レベルのSCN1Aを発現する、PV cIN、VIP cIN、および錐体ニューロンを含む主要な4つのクラスの皮質介在ニューロンのそれぞれにおいて異なってアクセスできるクロマチン領域を特定するために、SnapATAC分析パイプライン(下記の方法に記載)を用いて、シングル細胞ATAC-seqプロファイリング(例えば、Buenrostro, J.D. et al., Nature, 523:486-90 (2015)およびCusanovich, D.A. et al., Science, 348: 910-4 (2015)を参照されたい)を行った(図3A-3Cおよび図12)。第3に、調節エレメントは正の選択圧を受けやすいので、ヒトを含む哺乳動物種間で最高の保存を示す配列を特定した。従って、治療可能性があるエンハンサーを決定および分離するために、進化を通じて高度に保存された、SCN1AのTSSの近くにある10個の選択的にアクセス可能なイントロン領域および遺伝子間領域、例えば、本明細書に記載のE1～E10を評価した(図3Dおよび図15A-1、15A-2、16A-1、および16A-2)。
候補エンハンサーが、SCN1Aを発現するニューロン集団をターゲティングする能力を調べるために、それぞれのエンハンサー配列を、赤色蛍光レポーターの上流に最小プロモーターを含有するrAAVバックボーン(rAAV-E[x]-dTomato)に挿入した。次いで、これらの構築物から、PHPeBキャプシドがあるrAAVを産生し(Chan, K.Y. et al., Nat. Neurosci., 20:1172-1179 (2017))、成獣マウスに全身注射した。3週間後に、全ウイルスが皮質内に、ならびに複数の脳領域にわたって強力かつまばらな発現を示した。E5を除いて、ウイルスによって標識された細胞の大多数が全介在ニューロン(pan-interneuron)マーカーGad1を発現した。しかしながら、皮質ニューロン内にあるPVに対する共局在の程度は多様であり、E2の90％超からE6の5％未満まで及び、残りの全てのエンハンサーは中間レベルのPV特異性を示した(図3Eおよび図7)。その後、E2、E5、およびE6エンハンサーによって捕らえられたニューロン集団の同一性および層分布をさらに調べた。層分布と一致して、様々なマーカーを用いた共局在分析から、E2調節エレメントはウイルスレポーターの発現をPV cINに制限するのに対して、E6はVIP介在ニューロンに選択的であることが明らかになった。対照的に、E5調節エレメントは、全ての層にわたって介在ニューロンをまばらに標識するが、第5層にある錐体ニューロンに特に豊富にあった(図3F)。従って、SCN1Aの皮質発現プロファイルのかなりの割合は3種類のエンハンサーの集合的な発現によって反映された。従って、これらの調節エレメントが介在ニューロンならびに別個の機能と発生起源があるニューロンの集団における、おおむね重複しない発現を説明する。本明細書に記載のように開発されたウイルスツールは、ニューロンサブタイプを分析するための手段を提供し、ニューロンサブタイプの正常機能ならびに罹患した皮質における異常を研究するのに有利に使用することができる。
特定の局面では、pAAV-S5-E2-dTomatoと呼ばれるrAAVベクターを作製するために、最小基本プロモーターとレポータートランスジーン(例えば、d-Tomato)またはエフェクター遺伝子(例えば、Gq-DREADD)を含む組換えAAV(rAAV)ベクターにS5E2(E2)エンハンサーエレメント配列を組み込んだ。E2エンハンサーがレポーター遺伝子(トランスジーン)の発現を脳のPV発現介在ニューロンに制限する能力は、E2エンハンサーを含有するrAAVベクターを動物(マウス)に全身注射し、皮質を含む脳構造全体にわたる発現されたレポーター間の共局在を分析することによって評価した。ベクターによって形質導入された特異的細胞の検出を可能にする、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターを動物(マウス)に全身インビボ注射した後の脳切片における、dTomatoレポーターに対する免疫組織化学的(IHC)染色分析の結果を示した画像を図2Aに示した(図の上部にある矢状切片;図の下部にある冠状切片)。特異的なPV発現細胞の検出を可能にする、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターを動物(マウス)に全身インビボ注射した後の脳切片における、発現されたdTomatoレポーターに対する免疫組織化学的(IHC)染色分析の結果を示した画像を図2Bに示した。pAAV-S5-E2-dTomatoベクターからのレポーター遺伝子発現を脳切片において視覚化した(図2B、左パネル、赤色)。pAAV-S5-E2-Gq-DREADD-dTomatoからのレポーター遺伝子発現をGq-DREADD(緑色)およびdTomato(赤色)について視覚化した(図2B、右パネル)。ベクターによって形質導入された特異的なPV発現細胞の検出も視覚化した(図2B、左パネル、緑色;図2B、右パネル、青色)。
候補エンハンサーの特定
上記のエンハンサー配列選択アプローチを用いて、SCN1A遺伝子転写開始部位に近い10個の候補エンハンサー配列がマウスゲノムにおいて観察された。これらのエンハンサー配列は、本明細書ではS5E1(E1)、S5E2(E2)、S5E3(E3)、S5E4(E4)、S5E5(E5)、S5E6(E6)、S5E7(E7)、S5E8(E8)、S5E9(E9)、およびS5E10(E10)と呼ばれ、SCN1A遺伝子の付近で特定された(図1A-1)。E1～E10エンハンサー配列に対応するヒトポリヌクレオチド配列(SEQ ID NO:15～24)も本明細書において提供および説明され、さらなるヒトエンハンサーポリヌクレオチド配列E11-E35(SEQ ID NO:25～49)も本明細書において説明される(図1A-2および1A-3)。
E1～E10エンハンサーのヒト(ヒトオルソログ)配列は、100kb上流および100kb下流を含めて、SCN1Aのマウス配列とヒトゲノム配列のアラインメントに基づいて決定された。これによって、2つの種間で高度に保存されたヒトオルソログ配列が特定された(図1A-1～1A-3、16A-1、16A-2)。当業者により理解されるように、エンハンサー調節エレメントは、種間で比較的よく保存されているが、種間で連続して保存されていないスペーサー配列が点在している一連の転写結合部位を含む。従って、一態様では、SCN1Aエンハンサーエレメントは、本明細書に記載のヒトポリヌクレオチド(DNA)エンハンサー配列、すなわち、E1～E10と少なくとも75％以上の配列同一性を有する100bp超の任意の領域を含有するヌクレオチド配列を構成してもよい。一態様では、SCN1Aエンハンサーエレメントは、ヒトE2(S5E2)ポリヌクレオチド(DNA)エンハンサー配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する100bp超の任意の領域を含有するヌクレオチド配列を構成する。このようなエンハンサー配列について、この配列が、本明細書に記載のヒトポリヌクレオチド(DNA)E1～E10またはE11～E35エンハンサー配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する100bp超の任意の領域を含有する限り、核酸配列のサイズは限定するものではない。本明細書に記載の特定されたエンハンサー配列(35のエンハンサー配列)のそれぞれに関連したデータは、図1A-1～1A-3、15A-1、15A-2、16A-1、および16A-2に示した表に提供される。
マウス脳の皮質層にあるPV発現介在ニューロンにおける、E1～E10エンハンサーエレメントによって制限されたレポーター遺伝子発現を図1B-1およびIB-2に示した。これらの図は、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターを動物(マウス)に全身インビボ注射した後の脳切片におけるdTomatoに対する免疫組織化学的(IHC)染色分析を示す。皮質中のPV発現介在ニューロンにおけるレポーター遺伝子の発現の特異性(図1C)および感度(図1D)の程度の定量を図表で証明する。レポーター遺伝子の発現は、rAAVベクターに含まれるE1～E10エンハンサーエレメントによって制御される。特異性は、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターを動物(マウス)に全身インビボ注射した後の脳切片上の免疫組織化学によって評価された、PV介在ニューロンマーカーPVを同時発現する、ウイルスレポーターdTomatoを発現する細胞の割合として定量した。感度は、pAAV-S5-E2-dTomatoベクターを動物(マウス)に全身インビボ注射した後の脳切片上の免疫組織化学によって評価された時の、ウイルスレポーターdTomatoを同時発現した、PV介在ニューロンマーカーPVを発現する細胞の割合として定量した。棒グラフは平均+/-平均の標準誤差を表す。
実施例2-マウスにおけるPV皮質介在ニューロン(PV cIn)のウイルスターゲティング
PV cINに対するE2調節エレメントの90％の特異性は、まとめると全ての皮質(GABA作動性)介在ニューロンの40％を構成するファストスパイキングニューロン(例えば、バスケット細胞およびシャンデリア細胞)をターゲティングするための手段を提供する。これらのニューロンは局所ネットワーク(local network)にわたって強いレベルの抑制を発揮し、これらの機能不全は、ドラベ症候群、焦点性てんかん、自閉症スペクトラム障害(ASD)、および統合失調症を含む神経学的障害および神経精神医学的障害に直接関係づけられてきた。従って、これらの活動を管理下に置くことは基礎研究と臨床応用の両方で特に関心が高い。従って、例えば、ウイルスツールまたは治療剤として幅広い有用性がある薬剤を開発するためにE2調節エレメントを調べ、特徴付けた。
rAAV-E2-dTomatoを全身注射した成獣マウスは、1週間後に、検出可能なウイルスレポーター発現を示し、3週間後に高く、かつ安定したレベルの発現に達した。免疫組織化学およびインサイチューハイブリダイゼーションを行った。これらから、ウイルスにより標識された細胞の約90％が皮質にあるPV IN(すなわち、PV発現皮質介在ニューロン)であることが首尾一貫して示された。逆に、平均してPV cINの75％がウイルスレポーターを発現し、最大感度は93％に達した(図4Aおよび4B)。このことは、層またはサブタイプの偏りがなく、E2が全てのPV cINをターゲティングできることを示している。PV cINに対する特異性と一致して、マウスからのスライス記録から、ウイルスレポーターを発現するニューロンは、一次体性感覚皮質(S1)と前頭前皮質(PFC)の中にあるファストスパイキングPV cINに特有の電気生理学的特性を示すことが分かった(図4Cならびに図8Aおよび8B)。
ウイルスレポーターは主に脳皮質に限定されたが、陽性細胞の中には、SCN1A発現領域に密接に対応する他の脳領域で観察されるものもあった。E2は、一次視覚皮質(V1)および帯状回皮質、鉤状回、海馬CA1、黒質網様部の中にあるPV発現ニューロンに対して高い特異性を維持した(図8C)。注目すべきことに、肝臓(あらゆるAAVの全身送達時に予想された)および肺(SCN1Aが低レベルで発現している)で観察されたいくつかの細胞を除いて、脳の外側ではウイルスレポーター発現は実質的に観察されなかった(図8D)。これらの結果から、全身送達にもかかわらず、E2を含有するベクターを用いると、中枢神経系の外側にわずかな非特異的発現があるが、様々な脳領域においてPV発現ニューロンを選択的にターゲティングできることが分かる。
多くの実験パラダイムと臨床用途では全身注射ではなく局所注射が必要とされる場合がある。これらの状況で役に立つために、ウイルス発現はPV cINに対して高レベルの特異性を保持しなければならない。定位ガイド下注射を用いると、典型的には、1個の細胞当たりのウイルス粒子数が、非特異的発現の原因となる可能性がある全身送達と比較して多くなった。ウイルス負荷の増加が特異性を変えるかどうか試験するために、等量のrAAV-E2-dTomatoを様々な力価で成獣マウスの皮質に局所注射し、1週間後にPV cIN内でのレポーター発現を評価した(図4D)。結果から、力価が高くなるとレポーター発現レベルが増加し、特異性の大きな変化は観察されないことが分かった。
成熟皮質ではPV発現介在ニューロンが優勢であるのにもかかわらず、これらのPV cINを出生後早期でターゲティングすることはパルブアルブミンの比較的遅い発現(生後約15日目、すなわち、P15)と、この集団の他の初期マーカーの欠如によって妨げられてきた。PV cINが発達障害に関与することは、皮質回路構築中に、この細胞集団をターゲティングおよび操作する必要性に光を当てる。複雑な遺伝子戦略は、マウスにおいて、これを実現する部分的な解だけ提供する(すなわち、Lhx6-Cre、Sst-FlpおよびCreおよびFlp依存的レポーター)。しかしながら、これらの戦略は、出生後2週目の前に、これらのニューロンを簡単に操作する手段を提供しない。
パルブアルブミン発現が開始する前に、E2エンハンサーがファストスパイキングcINをターゲティングするかどうか試験するために、出生後の様々な段階で、その活性を調べた。この目標に向かって、rAAV-E2-dTomatoの一連の定位ガイド下注射によって、出生後早期にわたって分析を極秘にした(tile)(図4E)。P15のパルブアルブミン発現の発生時にレポーターの選択性を評価した。この評価から、P1注射時のPV cINについて50％を超える選択性が得られ、P7注射までに67％まで増加し、P10注射後に80％超になることが明らかになった。このアプローチをさらに使用して、P15前にPV cINを標識した。この状況においてファストスパイキングcINを特定するために、GFPが内側基底核隆起(medial ganglionic eminence)(MGE)由来介在ニューロン(PV cINとSST cINの両方)において発現しているLhx6-Cre/インタクトトランスジェニックマウスを使用した。SSTに対して共染色することによって、PV cINはGFP陽性/SST陰性だと識別することができた。P4-P7またはP7-P10時間経過ではPVについて、それぞれ、72％および78％の特異性が得られた。従って、このアプローチは、回路の成熟中に、単回ウイルス注射を用いて、このようなニューロンを研究する手段を提供する。
実施例3-マウスにおけるウイルスモニタリングおよびPV皮質介在ニューロンの操作
実施例2に記載のように異なる注射方法を用いて、および発達段階全体にわたってPV cINのE2発現の正確さが証明されたので、結合性(前シナプスレポーターを用いる)と活動(遺伝的にコードされているカルシウムレポーターと一緒にイメージングを用いる)を研究するために、このベクターの有用性を評価した。E2を用いてシナプトフィジン-tdTomato融合遺伝子(例えば、Madisen, L. et al., 2012, Nat Neurosci, 15(5):793-802を参照されたい)を動かした時には、レポーター発現は前シナプスにPV cINに制限され、末端は錐体ニューロン上の細胞体周囲(peri-somatically)に位置していた(図5A)。このベクターを用いてGCaMP6f発現を動かした時に(Chen, T.W. et al., Nature, 499: 295-300 (2013))、洞毛刺激時にPV cINが動員されることが証明された(図5Bおよび図9A)。合わせると、これらの結果から、E2は、PV cIN生物学の様々な側面をモニタリングするための効果的な手段を提供することが証明された。
化学遺伝学的または光遺伝学的アプローチを用いて、E2が活動の機能的変化を誘発するのに十分かどうか調べるために、さらなる研究を行った。E2を用いて、成獣動物において化学遺伝学的受容体PSAM4-5HT3-LCを発現した(Magnus, C.J. et al., 2019, Science, 364(6436)。これらの動物から収集した脳切片中のPV cINはアクチュエーターバレニクリンに曝露されると、閾値未満に電流が固定された時に発火するように誘導できることが観察された(図5C)。化学遺伝学的受容体Gq-DREADDを用いて同様の結果が観察された(Armbruster, B.N. et al., PNAS USA, 104:5163-5168 (2007)(図9C)。最後に、脳スライスにおいてレッドシフトしたオプシンC1V1を発現するPV cINの一定の、かつ高周波数レーザー刺激によって、刺激に対して時限錠がかけられた(time-locked)発火が生じた(図5Dおよび5Eならびに図9Aおよび9B)。これらのニューロンの関与が、同時に生ずる局所抑制をもたらすことが証明されたので、ウイルスにより標識されたPV cINの付近にある錐体ニューロン活動はレーザー刺激によって首尾一貫して妨げられた。注目すべきことに、この効果はピクロトキシン処理によって消失した(図5Dおよび図9B)。エクスビボで上記の方法の効力が証明されたので、PV cINを光遺伝的に刺激することによってインビボで興奮性ネットワークを変えることができるか調べた。AAV-E2-C1V1を成獣動物の一次視覚皮質に局所注射して3週間後に、感染領域内でのシングルユニット記録をベースラインで、およびレーザー刺激時に行った。記録されたニューロンの身元はスパイクの幅と最大発火頻度に基づいて区別された。信頼性をもって、抑制性介在ニューロン発火頻度はレーザー刺激によって増加し、これに対して、興奮性ニューロン発火は静かになった(図5E)。合わせると、これらの結果から、E2はPV cINに機能的に関与し、エクスビボとインビボの両方で化学遺伝学的または光遺伝学的アプローチを用いてネットワーク抑制を誘発できることが証明された。
実施例4-ヒトを含む霊長類におけるウイルスモニタリングおよびPV皮質介在ニューロンの操作
E2エンハンサーの配列はヒトを含む哺乳動物種間で高度に保存されており、従って、遺伝子調節において保存された役割があることが示唆される。E2調節エレメントを用いて哺乳動物種全体にわたってPV cINをターゲティングできるかどうか明らかにするために研究を行った。E2を有するウイルスベクター(E2ウイルス)の全身注射(マーモセット)または局所注射(ラットおよびマカク)を用いて、約90％の特異性でPV cINがターゲティングされることが証明された(図6A)。外科的切除中に得られたヒト脳組織は長期間培養できると報告されている(Eugene, E. et al., 2014, J. Neurosci Methods, 235:234-244)。ヒト脳がエクスビボで健康なままであるレジリエンスを利用して、新鮮に切除された鉤状回または内側側頭皮質をE2ウイルスに曝露した。2週間の培養期間にわたって、徐々に進行する蛍光標識細胞の出現が観察された。これらの細胞の予想された分布をPV染色が反映した領域では、ウイルスにより標識された細胞はPV陽性であった(図6B(i);詳細については方法を参照されたい)。さらに、皮質と鉤状回の両方にある細胞の大多数は、形態、直接的な脱分極または光遺伝学的光刺激によって誘発された時の最大発火頻度を含む複数の判断基準によって示された時にPV INの独特の特徴を示した(図6B(ii-iv)ならびに図10Aおよび10B)。
注目すべきことに、ヒトE2エンハンサーは、マウスに注射された時にPV cINに対して同程度の特異性を示した。このことから、高度の配列保存を特徴とするゲノムの非コード領域は種間で機能的特性を保持している可能性が高いことがさらに証明された。最後に、ヒトE2エンハンサーの5'末端と3'末端を両方とも切断すると特異性が激減した。このことから、E2エンハンサーの機能的境界が最適に特定されたことが示唆される(図14)。合わせると、これらの結果から、E2ベクターは、ヒトを含む哺乳動物全体にわたってPV cINをターゲティングおよび操作するための有効なツールとなることが分かる。
実施例5-領域特異性を有するウイルスエンハンサーの特定
本明細書に記載のエンハンサー選択方法が一般化できることを証明するために、種全体にわたってPV cINに発現が豊富にある7つの遺伝子の付近に、25個のさらなるエンハンサー/調節エレメント候補(本明細書中ではE11～E35)が特定された(図1A-1～1A-3;図15A-1および15A-2;図16A-1および16A-2)(下記の方法を参照されたい)。これらの配列を含有するAAVの全身注射から、これらのうち4つがPV cINに対して90％超の選択性を示すことが明らかになった。注目すべきことに、これらのエンハンサーの中で、PVを発現しない比較的少ないウイルス標識ニューロンが全介在ニューロンマーカーGad1に対して陽性であった。図1A-1～1A-3において、Pvalb(UniProtKB-P20472)は、カルシウム結合パルブアルブミンαタンパク質をコードする遺伝子を指す。ACAN(NCBI Gene ID: 176; UniProt P16112)は、脊椎骨端骨幹端異形成(spondyloepimetaphyseal dysplasia)という疾患に関与し得るアグリカンコアタンパク質(軟骨特異的プロテオグリカンコアタンパク質とも呼ばれる)をコードする遺伝子を指す。Tmem132c(NCBI Gene ID:92293)は、細胞または細胞小器官の生体膜を貫通するタンパク質の一種である膜貫通タンパク質132cをコードする遺伝子を指す。Lrrc38(UniProtKB-Q5VT99)は、副腎および前立腺組織において比較的高い発現を示す、leucine rich repeat containing 38遺伝子を指す。Inpp5j(UniProtKB-Q15735)は、膜ラッフル(membrane ruffle)におけるイノシトールおよびホスファチジルイノシトールリン酸結合タンパク質の機能調節に関与し得るホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸5-ホスファターゼAをコードする遺伝子を指す。Mef2c(UniProtKB-Q06413)は、心臓形態形成および筋形成および血管発達ならびに神経形成に関与する、ならびに皮質構造の発達に関与する、Mef2ファミリーの転写因子であるmyocyte-specific enhancer factor 2Cをコードする遺伝子を指す。ヒトにおいて、Mef2c遺伝子の変異は、重篤な精神運動障害、周期的な振戦、ならびに異常なEEGおよびてんかんを特徴とする、autosomal dominant mental retardation 20(MRD20)の原因となる。Pth1h(NCBI Gene ID:5744)は、腎臓および骨にある1型PTH/PTHrP受容体を活性化することによって悪性体液性高カルシウム血症(humoral hypercalcmia of malignancy)の原因となる、がん細胞、例えば、乳がん細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞、膵臓がん細胞、前立腺がん細胞、肝臓がん細胞、または結腸直腸がん細胞によって分泌される副甲状腺ホルモン様ペプチドをコードする遺伝子を指す。SCN1Aと同様に、上記の遺伝子は、脳にある他の全ての細胞と比較してPV介在ニューロンに極めて豊富にある。従って、エンハンサーエレメントによるターゲティングの候補として、これらの遺伝子を選択し、説明されたエンハンサーを特定し、これらの遺伝子のコード配列の付近に位置を突き止めた。
特に、4つのPV特異的調節エレメント、すなわち、E11(SEQ ID NO:25、ヒト)、E14(SEQ ID NO:28、ヒト)、E22(SEQ ID NO:36、ヒト)、およびE29(SEQ ID NO:43、ヒト)が特定の脳領域内で高度に選択的な発現を有すると突き止められた(図13Aおよび13B)。これらの4つのエンハンサーはそれぞれ、別個であるが、重複するPV発現ニューロンサブセットに特異的である。詳細に述べると、E11およびE14は、皮質の上層にあるPV cINをターゲティングする偏りを示したのに対して、E22エンハンサーは、皮質にほぼ排他的に制限された発現を示し、ほんのわずかなニューロンが他の場所で低レベルの発現を示した。対照的に、E29エンハンサーは中枢神経系全体にわたってPV発現ニューロン集団全体をターゲティングしたので、最も全体的な発現を示した。これらのエンハンサーは全て高度の配列保存を示し、発現プロファイルが種間で類似する遺伝子から選択された。エンハンサー間の異種間類似性が種間で類似する機能をもたらすことを直接試験するために、AAV-E22-dTomatoをマカクのV1に局所注射した。これから、マウスに似たやり方で、ウイルスレポーター発現がPV cINに制限されることが分かった。領域選択性と、種間の発現保存の組み合わせは、異なる哺乳動物種において異常な脳機能を補正する標的療法において、これらのウイルス薬剤に有用性を提供する。
実施例6-機能的なSCN1A遺伝子コピーをDSマウスモデルのSCN1A発現集団内に送達することによってSCN1A発現は正常レベルまで回復する
機能的なSCN1A遺伝子コピーをSCN1A発現介在ニューロン細胞集団に、例えば、DSマウスモデルにあるSCN1A発現介在ニューロン細胞集団に送達することによってSCN1A遺伝子発現を正常レベルまで回復させるために、SCN1A遺伝子のサイズを収容できるrAAVベクターをもたらす1つまたは複数のアプローチを用いて、「制限された核酸(DNA)ペイロード」(すなわち、rAAVベクターの中に含まれる、または運ばれる、外因性核酸(DNA)、例えば、トランスジーンおよび関連する核酸配列のサイズ)を増やす。前記のように、AAV DNAはほぼ4.7～5kbであるのに対して、rAAVベクター内への挿入およびベクターによる送達に望ましい遺伝子は、そのサイズの2倍またはそれより大きくなることが多い。相同組換えによって、またはアクセプター部位によって媒介されるスプライシングによって再集合する複数のベクターを用いる他の状況では、rAAVを用いた、もっと大きな遺伝子の送達が証明されている(例えば、Hirsch, M.L. et al., 2016, Methods Mol Biol, 1382:21-39を参照されたい)。これらのアプローチは両方とも、rAAVのパッケージング限界を克服するのに利用することができる。
DS動物モデルとヒト患者が両方とも証明されたので、SCN1Aに必要な条件は用量依存的である。従って、rAAVによって動かされるSCN1Aの発現レベルは、正常な内因性のSCN1A発現レベルに一致するように、または可能な限り近くに一致するように、当技術分野において公知であり、かつ実施されるように適切に滴定される。SCN1A遺伝子発現レベルを正確に調節するために、いくつかの方法を使用することができる。処置の有効性の直接的な読み取りとして発作の寛解を用いて、SCN1A発現レベルを調節するために様々な戦略が用いられる。
実施例7-DSマウスモデルにおけるSCN1A欠損ニューロン集団の興奮性を選択的に正常化するための遺伝薬理学的アプローチ
介在ニューロン細胞における送達と制限された発現のために、特異的エンハンサーと遺伝子核酸配列を有するrAAVベクターを用いる直接的な遺伝子療法に代わるものとして、SCN1Aニューロン集団内のニューロン活動を直接補正するために遺伝薬理学的方法が使用され得る。この目標に向かって、介在ニューロン活動を調節するために「デザイナー受容体」が関与する化学遺伝学的アプローチが使用され得る。デザイナー薬物によって排他的に活性化されるデザイナー受容体(DREADD)は、改変されたヒトムスカリン受容体である。さらに、PSAM-PSEM化学遺伝学的薬剤が使用するのに適している。
薬理学的に不活性な、かつ経口的に生物利用可能な薬物であるクロザピン-N4-オキシド(CNO)によって排他的に活性化される受容体であるGq-DREADDを用いると、興奮性/抑制性のバランス(E/Iバランス)がDSマウスモデル(DSマウス)において補正される可能性がある。手短に述べると、Gq-DREADD受容体は、前記のようなSCN1A特異的エンハンサー、例えば、E1～E10とSCN1A遺伝子を有するrAAVベクターを用いて、SCN1Aに欠損がある介在ニューロン細胞において発現される。Gq-DREADDを用いた他の研究に基づいて、前記受容体は、形質導入された/感染した細胞の膜において機能し、かつ位置すると予想される。さらに、本明細書に記載のSCN1a特異的調節エレメント、例えば、E1～E10を含有するrAAVベクターは、G1-DREADD受容体を、介在ニューロン、例えば、GABA作動性介在ニューロンおよびPV発現GABA作動性介在ニューロンの中で排他的に発現するはずである。感染細胞内でのGq-DREADDの機能は評価することができる。CNOバスを適用すると、Gq-DREADDを発現する介在ニューロンは全て、機能的受容体の発現と一致する1分未満での膜電位脱分極を示すと予想される。さらに、クロザピン-N-オキシド(CNO)を適用すると、Gq-DREADDを発現する介在ニューロンの付近にある錐体細胞の電圧固定記録は抑制性後シナプス電流(inhibitory post-synaptic current)(IPSC)の増加を示すと予想される。このような実験から、SCN1a特異的E1～E10エンハンサー配列と、Gq-DREADDをコードするポリヌクレオチドを含むrAAVは、特異的で、機能的で、かつ制限されたGq-DREADD発現を可能にし、CNO処理すると介在ニューロン活動が効果的かつ選択的に増加し、それによって、隣接している興奮性ニューロンの中にある介在ニューロンによる抑制活性が局在して、かつ著しく増加することが証明される。
SCN1Aの欠如が(SCN1Aの機能喪失)が、細胞の興奮性を増加させるDREADDの能力を損なうのであれば、全介在ニューロンエンハンサー、例えば、Dimidschstein, J. et al. (2016, Nature Neuroscience, 19(12):1743-1749)に記載のような別個の、かつ異なるDlxエンハンサーを用いて、SCN1Aの機能喪失に影響を受けない他のタイプの介在ニューロンの活動を増やすことで損傷を回避することによってDREADDを全介在ニューロンに送達することができる。
実施例8-前記の実施例の材料および方法
scATAC-seqライブラリー調製および配列決定
雄ヘミ接合性Dlx6a-Creマウス(Jax stock #008199)を雌ホモ接合性インタクトマウス(flox-Sun1-eGFP, Jax stock #021039)と交配させて、scATAC-seq実験用のDlx6a-Cre::インタクト子孫を得た。P28 Dlx6aCre::インタクトマウスからの脳を採取し、マウス脳スライサー(mouse brain slicer)(Zivic Instruments)で冠状切片を作製し、関心対象の領域を氷冷人工脳脊髄液(ACSF)中で解剖した。次いで、組織を、溶解緩衝液(10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.01％Tween-20、および0.01％IGEPAL CA-630、0.001％ジギトニン)を含むダンス型(dounce)ホモジナイザーに移した。ペッスル(pestle)Aを10回、ペッスルBを10回用いて組織をホモジナイズし、氷上で5分間インキュベートした後に、30μmフィルターで濾過し、500xg、4℃で10分間遠心分離した。Sony SH800SセルソーターでGFP+核を選別するためにペレットを1％BSAに再懸濁した。核を選別してDiluted Nuclei Buffer(10X Genomics)に入れた。シングル細胞ATAC-seqライブラリーを、Chromium Single Cell ATAC Solution(10X Genomics)を用いて調製した。ライブラリーを、Nova-Seq S2 100 cycle kit(Illumina)を用いて配列決定した。(図3A～3C)
scATAC分析
配列決定用生データをCell Ranger ATAC pipeline(10X Genomics)に通した。次いで、断片ファイルを用いて、分析のためにsnapATACパッケージ(https://doi.org/10.1101/615179)を用いてsnapファイルを作成した。グラフベースのクラスタリング(k=15, 24の主成分)を用いて細胞をクラスター化した。snapATACパッケージに記載のように遺伝子活性スコアを作成し、介在ニューロンの主要クラスに対応するクラスターを決定するのに使用した。それぞれの主要クラスについて、bigwigファイルを作成し、Integrated Genome Browserへの入力とエンハンサー選択のためにmacs2を用いてピークを呼び出した。ベッドツールズ(bedtools)Jaccardを用いて主要クラス間のピークを比較した。
エンハンサー選択
本明細書中で示した全エンハンサー(S5E1～E10およびE11～E35)は、ATACseqデータの共存(DNAアクセシビリティ(DNA accessibility)用)と(UCSCゲノムブラウザの脊椎動物保存トラック(vertebrate conservation track)を用いた)種間の保存に基づいて選択された。マウスおよびそのヒトオルソログのゲノム座標を図1A-1～1A-3に示した。
選択のために「コンテキスト(context)」領域(SCN1A遺伝子間領域+イントロン1)を「ATAseqピークユニオン(peak union)」ファイルおよび「Phastcons 60-way」ファイルとインターセクト(intersect)することによって作成したエレメントリストから、候補調節エレメントを手作業で精選した-下記を参照されたい。アクセシビリティ。ATAC-seqデータ(Mo et al., 2015, Neuron, 86:1369-1384)をGEOリポジトリでダウンロードし、デフォルトパラメータを用いて実行したMACS2を用いてピークとして離散化した(https://github.com/taoliu/MACS)。カスタムRスクリプトを用いて、データセット全体にわたって全ピークの和集合(union)を含むファイルを作成し、以下で説明するようにエンハンサー選択に使用した。最終選択は、全ピークの和集合ではなく個々の細胞タイプのピークの検証に頼った。メチル化。マウスの全ゲノムにわたる非重複100kbビン(bin)のマウスmCHレベル(Luo et al., 2018, Nat Commun, 9(1):3824)をBrainomeポータル(http://brainome.org)からダウンロードした。これらのデータを、上記のATAC-seqデータセットを用いて選択した候補の位置決めを裏付けるものとして使用した。保存。「phascons 60-way」トラック(track)をUCSCポータル(https://genome.ucsc.edu)からBEDファイルフォーマットでダウンロードし、10bpより小さなエレメントを除去し、カスタムRスクリプトを用いてフィルタリングして、Bedtools/Interesctを用いて50bp未満だけ隔てられている、あらゆるエレメントを融合した。
rAAVクローニングおよびウイルス産生
全ウイルス構築物を、分子生物学における標準的なクローニング方法およびプロトコールを用いて作製した。プラスミドpAAV-mDlx-GFP(Addgene#83900; Addgene, Watertown, MA)(Dimidschstein, J. et al., 2016, Nat. Neuroscience, 19(12):1743-1749)を用いて、AAV産生に必要なエレメント(内部末端反復(internal terminal repeat)、最小プロモーター、ウッドチャック転写後応答エレメント)を含む標準的なバックボーンを作り出した。
エンハンサー配列(発現を特定のタイプのニューロンに限定するのに必要である)はGenewiz(Cambridge, MA)によって新規に合成され、レポーターおよびエフェクターはPCR増幅した。特に、エンハンサー配列を、以下のプライマーE1:
Figure 2022519623000053
を用いてマウスゲノムDNAからPCR増幅した。エンハンサー、レポーター、およびエフェクターを、標準的な手順に従ってGibson Cloning Assembly Kit(NEB-E5510S)を用いてクローニングした。詳細に述べると、AAV-E1:10-dTomatoについては、dTomatoコード配列をプラスミドAddgene#83897から増幅し、AAV-E2-SYP-dTomatoについては、シナプトフィジン-tdTomatoコード配列をプラスミドAddgene#34881から増幅し、AAV-E2-GCaMP6fについては、GCaMP6fコード配列をプラスミドAddgene#83899から増幅し、AAV-E2-C1V1-eYFPについては、C1V1-eYFPコード配列をプラスミドAddgene#35499から増幅した。
最終プラスミドは、Gibson Assembly(登録商標)Cloning Kit(NEB-E5510S)(New England BioLabs, Ipswich, MA)を用いて製造業者の説明書と標準的なプロトコールに従って組み立てた。標準的な産生方法を用いてrAAVを産生した。トランスフェクションにはポリエチレンイミン(PEI)を使用し(例えば、Longo, P.A. et al., 2013, Methods Enzymol., 529:227-240を参照されたい)、ウイルス粒子精製および単離にはOptiPrep(商標)密度勾配(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を使用した。血清型1を使用してマウスおよびラットにおける局所注射用のAAVを産生した。血清型9をマーモセットにおける全身注射に使用し、血清型PHPeBを、マカクにおける局所注射とマウスにおける全身注射に使用した。qPCRと、全構築物に共通するWPRE配列を介したプライマーアニーリングによってウイルス力価を評価した。産生されたバッチは全て1010～1012ウイルスゲノム/mlの範囲であった。特に、ウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)は、転写されると、発現を強化する三次構造を作り出すDNA配列である。γ、α、およびβ成分とのトリパータイト調節エレメントであるWPREは、ウイルスベクターによって送達される遺伝子、例えば、rAAV-dTomatoの発現を増加させるために分子生物学においてよく用いられる。(例えば、Choi, J.-H. et al., 2014, Mol. Brain, 7:17を参照されたい)。産生されたrAAVバッチは全て1010～1012ウイルスゲノム/mlの範囲であった。
動物
マウス:
雌C57BL/6Jマウス(ハツカネズミ(Mus musculus); 10週齢)をJackson Labs(Bar Harbor, ME - stock#000664)から入手した。ラット。スプラーグドーリーラット(成獣150～250gm)をCharles River labs, Kingston, NYから入手した。マーモセット。1匹の雌コモンマーモセット(マーモセット(Callithrix jacchus), 6.0歳)をMassachusetts Institute of Technologyのコロニーから入手した。マカク。1匹の雄マカク(アカゲザル(Macaca mulatta); 15.0歳)を、カリフォルニア大学デービス校にあるCalifornia National Primate Research Centerから入手した。全動物を12明/12暗サイクルで維持し、マウスの場合は1ケージに最大5匹の動物、ラットの場合は1ケージに1匹の動物を入れた。マーモセットおよびマカクを社会的に収容した。全動物の維持および実験手順は、Broad Institute of MIT and Harvard (マウス)、MITにあるMcGovern research institute(ラットおよびマーモセット)、ならびにSalk Institute for Biological studies(マカク)の動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)によって規定され、米国立衛生研究所の基準に遵守するガイドラインに従って行った。
局所ウイルス注射および全身ウイルス注射
マウス局所S1。成獣マウスにおける局所注射は、体性感覚皮質への定位ガイド下注射によって、以下の座標:ブレグマに対して1.0mm後方、2.9mm外側、0.7/0.45mm腹側と150nLのウイルスを用いて行った。マウス全身。成獣マウスにおける全身注射の場合、1匹の動物につき約1011個のウイルス粒子を後眼窩洞に注射した。注射して5日後に術後モニタリングを行った。V1におけるラット局所。成獣ラットへの局所注射を、670nLのウイルスを用いて、以下の座標:ブレグマに対して5.4mm後側、4.2mm外側、2.0mm腹側の一次視覚皮質に定位ガイド下注射によって行った。マーモセット全身注射。成獣マーモセットにおける全身注射の場合、約0.7mlの無菌PBSに溶解した約1012個のウイルス粒子を伏在静脈に注射した後に、約0.5mlの食塩水をもう1回注入した。最後の注入後に、止血を確実なものにするために圧力を注射部位に加えた。動物をホームケージに戻し、麻酔後の通常行動についてしっかりとモニタリングした。ウイルス注射の51日後に動物を安楽死させた。V1におけるマカク局所。成獣マカクにおける局所注射を、以下の座標:両耳間の線(inter-aural line)の中心に対して13mm後側、19mm外側、23mm上方(動物のMRIに基づく)の左一次視覚皮質に定位ガイド下注射によって行った。合計333nLの体積を4種類の深さ(すなわち、皮質表面から1.8mm、1.3mm、0.8mm、および0.3mm)で注射した。
外科手術
定位ガイド下ウイルス注射のために、動物をイソフルラン(酸素中に1～3％)で麻酔し、温度管理したヒーティングパッド(heating pad)の上にある定位頭部フレームに入れた。関心対象の脳領域の上で開頭と硬膜切開を行った。動物に、50～500nlの示されたウイルス(rAAV)を鋭いガラスピペット(直径25～35mm)を用いて10～25nl/分の速度で注射し、逆流を最小限にするために注射後5～15分間留置した。開頭部位を無菌ボーンワックス(bonewax)で覆い、外科的開口部をVetbondで閉じ、動物をホームケージに少なくとも1週間戻した。注射部位は、以下の座標:体性感覚皮質S1:ブレグマに対して1.0mm後側、3.0mm外側、0.7/0.4mm腹側;海馬CA1:ブレグマに対して1.6mm後側、1.8mm外側、1.2mm腹側;線条体:ブレグマに対して0.5mm後側、2.0mm外側、3.2mm腹側によって規定された。
後眼窩静脈注射のために、動物をイソフルラン(酸素中に1～3％)で麻酔し、温度管理したヒーティングパッドの上に置いた。後眼窩神経叢(retro-orbital plexus)に静脈内(IV)注射を行った。さらに具体的には、動物(マウス)を、非再呼吸式装置(Surgivet, Dublin, OH)に接続した漏斗形ノーズコーン(nose cone)に入れ、内眼角(medial canthus)で斜角をつけて針を後眼窩洞(retroorbital sinus)に挿入した。複製に欠陥があるrAAVベクターを含有する、150μLまでの上清を尾静脈または後眼窩神経叢に注射した。注射後に、ホメオスタシスを確かなものにするために、眼を最低30秒間閉じたままにした。
マウスにおける電気生理学的記録:
2～6週齢マウスのスライス調製。ウイルスを注射したマウスをイソフルオラン(isofluorane)で麻酔した。反射が消失したらすぐに、マウスに、以下(mM):87 NaCl、75スクロース、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、10グルコース、1 CaCl2、および2 MgCl2を含有する氷冷酸素添加ACSFを経心腔的灌流した。次いで、マウスを断頭し、300μm厚の冠状スライスをLeica VT-1200-Sビブラトームを用いて切片化し、保持チャンバー(holding chamber)に入れて32～35℃で15～30分間インキュベートした後に、室温20～23.5℃(68～74°F)で少なくとも45～60分間、継続してインキュベートした後に、生理学的記録を行った。注射部位を含むスライスを、以下(mM):125 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、10 グルコース、2 CaCl2、および 1 MgCl2(pH=7.4、95％O2および5％CO2で泡立たせた)を含有する酸素添加ACSFに浸漬した記録用チャンバーに移した。6週齢以上のマウスのスライス調製。急性冠状脳スライスを以下のように調製した。マウスをAvertin溶液(20mg/ml, 0.5mg/g体重)で麻酔し、以下:194mM スクロース、30mM NaCl、4.5mM KCl、1.2mM NaH2PO4、0.2mM CaCl2、2mM MgCl2、26mM NaHCO3、および10mM D-(+)-グルコース(340～350mOsmの容量オスモル濃度(osmolarity))を含有する氷冷炭酸化(carbogenated)(95％O2、5％CO2)切断用溶液15～20mlを経心腔的灌流した。次いで、脳を素早く取り出し、スライス調製のために氷冷切断用溶液に入れた。冠状スライス(300μm)を調製し、次いで、炭酸化人工脳脊髄液(aCSF)と32℃で10～15分間インキュベートした。次いで、スライスを、室温で少なくとも1時間、以下:119mM NaCl、2.3mM KCl、1.0mM NaH2PO4、26mM NaHCO3、11mMグルコース、1.3mM MgSO4、および2.5mM CaCl2(pH7.4、295～305mOsmの容量オスモル濃度)を含有するCSFに入れて室温で少なくとも1時間インキュベートした。電流固定。介在ニューロン記録のために、10μM CNQX、25μM AP-5、および10μM SR-95531も、それぞれ、AMPA、NMDA、およびGABAA受容体をブロックするために添加して、光遺伝学的刺激および化学遺伝学的刺激の細胞固有の効果を測定した。ホールセル電流固定記録は、130 K-グルコン酸塩、6.3 KCl、0.5 EGTA、10 HEPES、4 Mg-ATP、0.3 Na-GTP、および 0.3％ビオシチン(pHをKOHで7.3に調整した)(mM)を含有する、ホウケイ酸ピペット(3～5MΩ)を用いて、視覚的に特定されたウイルスレポーター発現細胞から入手した。ブレークイン(break-in)したらすぐに、直列抵抗(series resistance)(典型的に15～25MΩ)を補償し、安定した記録(<20％の変化)だけを含めた。MultiClamp 700B増幅器(Molecular Devices)を用いてデータを取得し、20kHzでサンプリングし、10kHzでフィルタリングした。全細胞をDC電流で-60mVに保ち、発火パターンを入手し、基本的な閾値下および閾値上の電気生理学的特性を抽出するために電流ステップ(current-step)プロトコールを適用した。電圧固定。ウイルスレポーターを発現しない細胞を、IR-DIC視覚化の下で錐体細胞形の細胞体によって選択し、130 Cs-グルコン酸塩、0.5 EGTA、7 KCl、10 HEPES、4 Mg-ATP、0.3 Na-GTP、5 ホスホクレアチン、5 QX-314、および0.3％ビオシチン(pHをCsOHで7.3に調整した)(mM)を含有するピペットで記録した。ベースラインおよび光遺伝学的刺激または化学遺伝学的刺激のために細胞を連続して0mVに保った。電流固定記録および電圧固定記録の両方について、刺激前に少なくとも2分間のベースラインを記録した。直列抵抗の変化をモニタリングするために、小さなパルス(-20pAまたは-5mV、0.2Hzまたは0.5Hzで100ms)をベースラインとCNO適用の間ずっと加えた。Clampfit 10.2ソフトウェア(Molecular Devices)を用いてデータをオフラインで分析した。
インビボカルシウムイメージング
出生後10日目の動物の樽構造(barrel)皮質に約100nLのAAV-E2-GCaMP6ウイルスを注射した。P27～P34で、注射部位上に開頭術(craniotomy)を移植し、開頭処置からの回復後に広視野カルシウムイメージングを行った。短時間で、ある決まった間隔(5～20s)のエアパフ(100～200msの期間、Picospritzer III)を反対側の洞毛に向けている間に、麻酔した(1.5％イソフルラン)マウスを3～4Hzで4x倍率(Thorlabs CCDカメラ-1501M-USB, Thorlabs LED stimulation-DC4104)を用いて画像化した。複数の記録を行い、その後、組織学的分析のためにマウスに灌流させた。ImageJで、各記録および同時進行した洞毛刺激についてF/F(蛍光の変化/平均蛍光)を計算することによって記録を分析した。刺激カルシウム信号反応および自発的カルシウム信号反応の両方について(5％)F/Fの閾値を設定した。
ヒトにおける電気生理学的記録
組織調製、培養プロトコール、およびウイルス接種。4人の参加者(2人の男性/2人の女性;年齢22～57歳)が、薬剤抵抗性てんかんを処置するために脳組織(側頭葉および海馬)を切除する外科的処置を受けた。全ての場合において、各参加者は、発作発症の場所を特定する頭蓋内モニタリングのために硬膜下電極および/または深部電極を配置する目的で初回外科手術を以前に受けたことがある。NINDS施設内審査委員会(Institutional Review Board)(IRB)が研究プロトコール(ClinicalTrials.gov Identifier NCT01273129)を承認し、切除された組織の実験使用について参加者からインフォームドコンセントを得た。神経外科的切除後30分以内に海馬と側頭葉の両方から300umスライスを入手して(Leica 1200S Vibratome; Leica Microsystems, Bannockburn, IL)、氷冷酸素添加スクロースベース切断用溶液(100mMスクロース、80mM NaCl、3.5mM KCl、24mM NaHCO3、1.25mM NaH2PO4、4.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2、および10mMグルコース。95％O2および5％CO2で飽和させた)の中に入れた。次いで、スライスをスクロース切断用溶液中で33℃で30分間インキュベートし、室温まで15～30分間冷却した。スライスを培養培地(Eugene et al., 2014)に移し、15分間の平衡化のために35℃のインキュベーター(5％CO2)に入れた。次いで、界面培養(interface culture)のために各スライスをそれぞれ30 mm Millicell Cell Culture Insert(Millipore; Cat No. PICM0RG50)に移し、上記のようにインキュベートした。12時間後、培養培地を交換し、1～2μlのpAAV_S5E2-dTomatoをpAAV_S5E2_C1V1-eYFPと共に、または伴わずに、各スライスに直接、ピペットで移し、インキュベーターに戻した。海馬スライスの場合、ウイルスは鉤状回亜領域にターゲティングされた。電気生理学的分析まで培養培地を2～3日ごとに日常的に交換した。電気生理学的記録。ウイルス接種して7～14日後に培養ヒトスライスからの電気生理学的記録を行った。細胞外溶液(95％O2/5％CO2で飽和させた、130mM NaCl、3.5mM KCl、24mM NaHCO3、1.25mM NaH2PO4-H2O、10mMグルコース、2.5mM CaCl2、および1.5mM MgCl2 (pH7.4; 300～310mOsm)を33℃で3～4ml/minの速度で灌流させた記録用チャンバーに培養ヒトスライスを移した。pAAV_S5E2-dTomatoまたはpAAV_S5E2_C1V1-eYFPに感染させたニューロンからのホールセルパッチクランプ記録を、以下の組成:130mM K-グルコン酸塩、10mM HEPES、0.6mM EGTA、2mM MgCl2、2mM Na2ATP、0.3mM NaGTP、および0.5％ビオシチン(pHを7.4に調整した; 容量オスモル濃度を285～300mOsmに調整した)の細胞内溶液を用いて行った。一部の記録では、130mM K-グルコン酸塩を90mM K-グルコン酸塩/40 KClによって交換した。本質的に以前に説明されたように(Tricoire, L. et al., 2011, J. Neurosci, 31(30):10948-70)、固有の膜特性および発火特性をアッセイした。550nm光で刺激したC1V1光遺伝学的活性化を、CoolLED pE-4000 Illumination system(Andover, UK)を用いて40X水浸対物レンズを介してスライスに届けた。ビオシチン再構築および免疫細胞化学。電気生理学的記録後に、スライスを、0.1M PBに溶解した4％パラホルムアルデヒドで一晩、滴下固定(drop-fix)した。スライスを0.1M PB(3X15分)で洗浄し、0.1M PBに溶解した0.5％Triton X-100/10％ヤギ血清で室温で少なくとも2時間、透過処理/ブロックした。ビオシチン回復と免疫細胞化学の組み合わせのために、1:1000に希釈した一次抗体中での初回インキュベーション(4℃で40時間)を行った(ウサギ抗PV, Abcam カタログ番号: ab11427; モルモット抗RFP, SYSY, カタログ番号:390005)。スライスを0.1M PBで室温で4x30分間洗浄し、二次抗体(ヤギ抗モルモットAlex-flour 555, Thermofisherカタログ番号A21435については1:1000; ヤギ抗ウサギAlexa-flour 647, Thermofisherカタログ番号A32733については1:500、およびストレプトアビジンAlexa FluorTM 488; Thermofisher S1123については1:1000)の中で4℃で一晩インキュベートした。最終洗浄手順の後に(4x30分)、後の共焦点顕微鏡観察分析のために、スライスをProlong Gold antifade(Thermofisher; カタログ番号P36930)で顕微鏡スライドにマウントした。
免疫組織化学(IHC)
ウイルスを注射した動物をEuthasol (Virbac, USA)で安楽死させ、4％パラホルムアルデヒド (PFA)を経心腔的灌流した。脳を4％PFAに一晩入れ、次いで、Leica VTS1000ビブロセクター(vibrosector)を用いて50～60μm(特に、50μm)に切片化した。浮かんでいる脳切片を0.1％Triton X-100およびリン酸緩衝食塩水(PBS)で30分間透過処理し、PBSで3回洗浄し、ブロッキング緩衝液(PBSに溶解した5％正常ロバ血清)中で30分間インキュベートした。次いで、切片を、ブロッキング緩衝液中で、以下の一次抗体:1:1,000のニワトリ抗GFP(Abcam USA, ab13970); 1:1000のウサギ抗DsRed(Clontech USA 632496);1:1,000のヤギ抗PV(Swant USA, PVG-213);1:1,000のモルモット抗PV(Swant USA, GP-72);1:2000のウサギ抗SST(Peninsula USA, T-4103.0050); 1:250のマウス抗シナプトタグミン-2(ZFIN USA, #ZDB-ATB-081002-25)の示された組み合わせと4℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をPBSで3回洗浄し、1:1000のAlexa Fluor結合二次抗体(Invitrogen, USA)とインキュベートし、DAPI(Sigma, USA)で対比染色し、Fluoromount-G(Sigma, USA)を用いてガラススライドにマウントした。脳領域の画像を、Zeiss LSM800共焦点顕微鏡またはZeiss Axioimager A1落射蛍光顕微鏡を用いて取得した。ヒト脳組織内にあるPV IHCの染色は極めて変化に富んでいた。従って、ウイルス特異性の評価は、染色密度が、これらの細胞の既知の分布および密度を反映する皮質および鉤状回の領域内で行った。ヒト脳組織のばらつきを考慮して、この方法で正確な定量は得られなかった。
インサイチューハイブリダイゼーション
本明細書に記載の研究で使用したインサイチューハイブリダイゼーションプローブ(Gad1; 製品番号400951, Pvalb; 製品番号421931, VIP; 製品番号415961)はAdvanced Cell Diagnostics(Newark, CA, USA)によって設計された。RNAscope(登録商標)Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2(製品番号323100)の中の試薬、RNAscope(登録商標)Probe Diluent (製品番号300041)、HYBEZ(商標)オーブン(製品番号321710/321720)、湿度管理トレー(humidity control tray)(製品番号310012)、およびHYBEZ Humidifying Paper(製品番号310025)もAdvanced Cell Diagnosticsから入手した。TSA Plus Fluorescein、TSA Plus Cyanine 3、およびTSA Plus Cyanine 5はPerkinElmer(#NEL741、#NEL744、および#NEL745)から入手した。前記の免疫組織化学セクションで述べたように脳組織を処理した。脳切片をPBSで1回洗浄した後に、0.1％Triton X-100およびPBSで3回洗浄し、Superfrost Plusガラススライド(Fisher Scientific, 12-550-15)にマウントし、HYBEZオーブンに入れて60℃で25分間焼いた。次いで、スライドを4％PFAに30分間浸漬し、次いで、H2Oで3回洗浄した。RNAscope H2O2を各切片に室温で5分間適用した。次いで、スライドをH2Oで3回洗浄した後に、予め温めた90℃のH2Oに15秒間浸漬した後に、予め温めた90℃のRNAscope Target Retrievalに15分間浸漬した。スライドをH2Oで3回洗浄した後に、RNAscopeプロテアーゼIIIを各切片に適用し、次いで、HYBEZオーブンで40℃で15分間インキュベートした。スライドをH2Oで3回洗浄し、次いで、HYBEZオーブンに入れて、プローブ希釈剤で1:50に希釈したプローブ溶液と40℃で2時間インキュベートした。次に、切片をRNAscope洗浄緩衝液で3回洗浄した後に、蛍光増幅を行った。注目すべきことに、レポーターのRNAに対するプローブは、ウイルスDNAに起因する可能性が高い非特異的染色を明らかにした。ウイルスレポーターを明らかにするために、RNAscopeプロトコールをdTomatoのIHC増幅と共に行った。切片をブロッキング溶液(PBSに溶解した0.3％TritonX-100+5％正常ウマ血清)の中で30分間インキュベートした。この後、切片を、1:250のウサギ抗DsRed(Clontech USA 632496)を含む抗体溶液(PBSに溶解した0.1％Triton X-100+5％正常ウマ血清)の中で4℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をPBSで3回洗浄し、1:500のAlexa Fluor結合二次抗体(Invitrogen, USA)とインキュベートし、DAPI(Sigma, USA)で対比染色し、Fluoromount-G(Sigma, USA)を用いてガラススライドにマウントした。
定量および統計
発現強度については、蛍光画像を、標準化された倍率と露出時間で撮影した。ウイルスレポーターを発現する各細胞の細胞体の平均画素強度を記録し、エンハンサーごとの全細胞の平均として報告した。共局在の定量については、示されたレポーターを発現する細胞を、対応するカラーチャンネルだけを用いて計数し、次いで、これらの細胞の中で、関心対象のマーカーを同時発現している細胞の数を計数した。対応するシグナルがバックグラウンド蛍光を上回れば、細胞は所定のマーカーが陽性だとみなされた。次いで、レポーターだけを発現している細胞の総数に対する、両マーカーを同時発現している細胞の比を計算し、本明細書中で平均±s.e.m(例えば、本明細書中にある図の棒グラフで表した)として報告した。定量は、最低2個の独立したバイオロジカルレプリケートを用いて行った(個々の定量について、特定の数の細胞、動物、および条件を、図11に示した表に示し、および/または図の説明に記載する)。示された時には、同じ動物に由来する数枚の切片を使用した。実験の条件を知らせずにデータ収集および分析を行わなかったが、異なる研究グループの実験者が定量を行った。試料サイズを予め決定するために統計手法を使用しなかったが、説明された試料サイズは、以前の刊行物において報告したものと同様であった。
実施例9-マウスからヒトまでの、機能的に異なるニューロンのウイルス操作
特定のニューロン細胞集団およびサブタイプをターゲティングおよび操作することによってニューロン疾患および神経精神医学的疾患を理解および処置するための方法およびアプローチが本明細書において説明される。非ヒト霊長類およびヒトにおいて、これらの細胞集団にアクセスすることは最優先事項になっている。AAVは神経系における遺伝子送達に有用な場合があるが、ゲノムペイロードは限られており、特定のニューロン集団に対して本質的に選択的でない。ウイルス発現を広範なニューロンクラスに限定することができる調節エレメントの特定が本明細書において説明された。本明細書に記載のエンハンサーの選択に焦点を合わせるために、別個のニューロン集団において発現され、その破壊が重篤なてんかんと関連する遺伝子であるSCN1Aの調節特性を詳しく調べた。
シングル細胞ATAC-seqデータを種間の配列保存と組み合わせることで、SCN1A遺伝子の付近に10個の候補調節配列が特定された。ウイルス発現を誘導する能力があるかどうか、これらのエレメントをそれぞれ調べることによって、SCN1Aを発現するニューロン集団の範囲をひとまとめにターゲティングする3個のエンハンサー(E2、E5、E6)が特定された。これらのうち、特定の短い調節配列(本明細書中のE2)はウイルス発現をパルブアルブミン発現皮質介在ニューロン(PV cIN)に限定できることが見出された。レポーター発現を越える、このエレメントの有用性を十分に評価するために、エクスビボおよびインビボで、シナプスタギング(synaptic tagging)、カルシウムイメージング、ならびに光遺伝学的および化学遺伝学的アプローチを含む様々な状況でエンハンサーエレメントを検証した。さらに、このエンハンサーエレメントは、発達中に、およびげっ歯類、非ヒト霊長類およびヒトを含む種間でPV cINを選択的にターゲティングすることができた。このアプローチがエンハンサー発見のための一般化可能な戦略となることが証明されたので、PV INに豊富にある7つの遺伝子の付近で25個のさらなる調節エレメントが選択された(図15A-1、15A-2、16A-1、および16A-2)。これらから、さらなる4個のPV特異的調節エレメント(E11、E14、E22、およびE29)が特定された。これらのそれぞれに、特定の脳領域内で著しく選択的な発現があった。合わせると、動物モデル全体にわたって利用することができる様々な機能試験ツールの有用性が証明された。このような「ウイルス試薬」は、本明細書に記載の1つまたは複数のエンハンサーエレメントをコードするポリヌクレオチドと1つまたは複数の標的ポリヌクレオチドとを有するウイルス送達ベクターを含み、非ヒト霊長類における神経学的な、神経発達的な、および神経変性の疾患の状況で、機能的に異なるニューロン細胞タイプがどのように影響を受けるのか調べるのに使用することができる。最終的に、エンハンサーを含有するウイルスベクターは、特定のニューロン細胞集団における病理学的なニューロン活動または遺伝子発現を治療的に正常化する薬剤として役立つ可能性がある。
本明細書中で特定および説明されたエンハンサーは、特定の臨床的関連性があるニューロン集団にアクセスできるようにする。これらのエンハンサーは、ドラベ症候群の衰弱性の側面を、例えば、遺伝子療法を用いることで、またはニューロン活動を調節することによって軽減するのに活用され得る。前記の実施例で説明したように、脳への効果的なウイルスベクター送達のために局所注射および全身注射を利用した。局所注射を用いると、焦点性てんかん、前頭前皮質機能不全、または海馬記憶障害などの神経学的状態および神経学的病態が処置または寛解され得る。または、例えば、全般発作、または精神医学的障害および神経変性障害を補正するために全体的な介入が必要な状況では、ウイルスベクターの全身導入を使用できるかもしれない。本明細書に記載の調節エレメントは、治療状況のために特定の細胞タイプを特異的に評価することを提供する。
実際に、本明細書に記載のエンハンサー選択のための方法およびアプローチは他の遺伝子に一般化できるので有利である。限定することを意図しないが、7個の代表的なエンハンサー(例えば、本明細書中のE1、E5、E6、E11、E14、E22、E29)のサブセットが特定され、別個のニューロン集団と中枢神経系領域の両方に対してユニークな特異性を有することが証明された。ストリンジェントな判断基準(標的集団に対して>90％選択性)を適用しても、説明されたエンハンサー選択方法の成功率(>20％)は高い。さらに、高度の配列保存により予測されたように、代表的なエンハンサーサブセットはヒトを含む種間で等しく選択的であり、かつ有効なことが分かった。従って、説明された方法は、種間で機能する細胞タイプ特異的エンハンサーを系統立って特定するための信頼性の高い手段を提供する。
他の態様
前述の説明から、本明細書に記載の態様を様々な使用および条件に合わせるために、本明細書に記載の態様に変更および修正が加えられる場合があることは明らかである。このような態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書における変数の任意の定義における要素の一覧の説明は、任意の1つの要素として、または列挙された要素の組み合わせ(もしくはサブコンビネーション(subcombination))として、その変数を定義することを含む。本明細書における態様の説明は、例えば、本明細書中の1つまたは複数のセクションに記載のように、その態様を任意の1つの態様として、または他の任意の態様もしくはその一部と組み合わせて含む。本明細書で述べられた全ての特許および刊行物は、それぞれの独立した特許および刊行物が参照により組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (99)

  1. トランスジーンポリヌクレオチド配列と、トランスジーンの発現を脳のパルブアルブミン(PV)発現介在ニューロン細胞に特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列とを含む、ウイルスベクター。
  2. SCN1A遺伝子発現に特異的に関連するエンハンサーポリヌクレオチド配列と、トランスジーンポリヌクレオチド配列とを含むウイルスベクターであって、エンハンサー配列がトランスジーンの発現を脳のPV発現介在ニューロン細胞に制限する、ウイルスベクター。
  3. トランスジーンが、レポーター遺伝子、デザイナー薬物によって排他的に活性化されるデザイナー受容体(DREADD)コード遺伝子、薬理学的選択的アクチュエーター分子(PSAM)コード治療用遺伝子、または治療用遺伝子である、請求項1または請求項2記載のウイルスベクター。
  4. トランスジーンがSCN1A遺伝子である、請求項1～3のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  5. トランスジーンがDREADDコード遺伝子である、請求項1～3のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  6. DREADDコード遺伝子が、ケモゲンクロザピン-N4-オキシド(CNO)によって活性化されるGq-DREADDコード遺伝子である、請求項5記載のウイルスベクター。
  7. トランスジーンが薬理学的選択的アクチュエーター分子(PSAM)コード治療用遺伝子である、請求項3記載のウイルスベクター。
  8. 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターである、請求項1～7のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  9. SCN1Aトランスジーンポリヌクレオチド配列またはその機能的部分と、SCN1Aトランスジーンの発現を脳の介在ニューロンまたはニューロン細胞に特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター。
  10. rAAVベクターによる介在ニューロン細胞への形質導入後に、SCN1AトランスジーンによってコードされるNav1.1ナトリウムチャンネルが介在ニューロン細胞において機能的に発現される、請求項4または請求項9記載のrAAVベクター。
  11. 介在ニューロン細胞がGABA作動性介在ニューロン細胞である、請求項1～10のいずれか一項記載のウイルスベクターまたはrAAVベクター。
  12. 介在ニューロン細胞が、脳の終脳内にあるGABA作動性介在ニューロン細胞である、請求項9記載のrAAVベクター。
  13. GABA作動性介在ニューロン細胞がパルブアルブミン(PV)を発現する、請求項11記載のrAAVベクター。
  14. GABA作動性介在ニューロン細胞が血管作用性小腸ペプチド(VIP)を発現する、請求項9～11のいずれか一項記載のrAAVベクター。
  15. ニューロン細胞が脳皮質の錐体(PYR)ニューロンである、請求項9～11のいずれか一項記載のrAAVベクター。
  16. エンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E7、E8、E9、またはE10(それぞれ、SEQ ID NO:15～18または21～24)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む、請求項1～13のいずれか一項記載のウイルスベクターまたはrAAVベクター。
  17. エンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E7、E8、E9、またはE10(それぞれ、SEQ ID NO:15～18または21～24)のポリヌクレオチド配列を含む、請求項1～13のいずれか一項記載のウイルスベクターまたはrAAVベクター。
  18. エンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE2(SEQ ID NO:16)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む、請求項13記載のウイルスベクターまたはrAAVベクター。
  19. エンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)またはヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む、請求項14または請求項15記載のrAAVベクター。
  20. エンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)のポリヌクレオチド配列またはヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)のポリヌクレオチド配列を含む、請求項19記載のrAAVベクター。
  21. 約4.7kbを超えるポリヌクレオチド配列をパッケージングするベクターの収容能力が、相同組換えによる複数のrAAVベクターの再集合またはアクセプター部位によって媒介されるスプライシングによる複数のrAAVベクターの再集合を含む、請求項1～20のいずれか一項記載のウイルスベクターまたはrAAVベクター。
  22. ベクターがSCN1A遺伝子を脳内のSCN1A発現GABA作動性介在ニューロン細胞に送達し、SCN1A遺伝子が機能的に発現され、それによって、対象へのベクターの投与後に介在ニューロン細胞において正常レベルのSCN1Aが回復する、請求項4または9～20のいずれか一項記載のウイルスベクターまたはrAAVベクター。
  23. 対象がヒト患者である、請求項22記載のウイルスベクターまたはrAAVベクター。
  24. ヒト患者が、ドラベ症候群(DS)に罹患している乳児である、請求項23記載のウイルスベクターまたはrAAVベクター。
  25. 請求項1～24のいずれか一項記載のウイルスベクターまたはrAAVベクターを含む、ウイルス粒子またはウイルス様粒子。
  26. 請求項1～24のいずれか一項記載のウイルスベクターまたはrAAVベクターを含む、細胞。
  27. 請求項25記載のウイルス粒子またはウイルス様粒子を含む、細胞。
  28. 請求項1～24のいずれか一項記載のウイルスベクターまたはrAAVベクターと、薬学的に許容されるビヒクル、担体、または希釈剤とを含む、薬学的組成物。
  29. 請求項25記載のウイルス粒子またはウイルス様粒子と、薬学的に許容されるビヒクル、担体、または希釈剤とを含む、薬学的組成物。
  30. 液体剤形である、請求項28または請求項29記載の薬学的組成物。
  31. SCN1A発現レベルに欠損または欠陥があるGABA作動性介在ニューロン細胞またはニューロン細胞において正常レベルのSCN1A発現を回復させる方法であって、有効量の請求項4または9～22のいずれか一項記載のウイルスベクターもしくはrAAVベクター、そのウイルス粒子または薬学的組成物に該細胞を接触させて、GABA作動性介在ニューロン細胞またはニューロン細胞における正常レベルのSCN1A発現を回復させる工程を含む、方法。
  32. てんかん、発作、もしくはドラベ症候群(DS)を有するか、またはてんかん、発作、もしくはドラベ症候群(DS)を有するリスクがある乳児において乳児てんかんおよび/または発作を処置する方法であって、治療的有効量の請求項1～24のいずれか一項記載のウイルスベクターもしくはrAAVベクター、請求項25記載のウイルス粒子もしくはウイルス様粒子、または請求項28～30のいずれか一項記載の薬学的組成物を該乳児に投与して、対象における発作、てんかん、またはDSを処置する工程を含む、方法。
  33. ドラベ症候群(DS)を有するか、またはドラベ症候群(DS)を有するリスクがある対象においてドラベ症候群(DS)を処置する方法であって、治療的有効量の請求項4もしくは9～22のいずれか一項記載のウイルスベクターもしくはrAAVベクター、そのウイルス粒子または薬学的組成物を対象に投与して、対象におけるDSを処置する工程を含む、方法。
  34. 発作および/もしくはてんかんを有するか、または発作および/もしくはてんかんを有するリスクがある対象において発作および/またはてんかんを阻害または阻止する方法であって、SCN1Aトランスジーンポリヌクレオチド配列またはその機能的部分と、SCN1Aトランスジーンの発現を対象の大脳皮質の介在ニューロン細胞またはニューロン細胞に特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列と、介在ニューロン細胞へのベクターの形質導入を強化するキャプシドとを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを対象に全身投与する工程を含む、方法。
  35. 乳児または対象がヒト患者である、請求項32～34のいずれか一項記載の方法。
  36. rAAVベクター中にあるエンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、またはE10(それぞれ、SEQ ID NO:15～24)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含む、請求項31～35のいずれか一項記載の方法。
  37. rAAVベクター中にあるエンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE2(SEQ ID NO:16)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含む、請求項36記載の方法。
  38. エンハンサーポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:16のヒトエンハンサーエレメントE2ポリヌクレオチド配列である、請求項37記載の方法。
  39. rAAVベクター中にあるエンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)のポリヌクレオチド配列またはヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含む、請求項36記載の方法。
  40. エンハンサーポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:20のヒトエンハンサーエレメントE6ポリヌクレオチド配列またはSEQ ID NO:19のヒトエンハンサーエレメントE5ポリヌクレオチド配列である、請求項39記載の方法。
  41. 発作および/またはてんかんの阻害または阻止を必要とする対象において発作および/またはてんかんを阻害または阻止するために、SCN1A遺伝子を発現する介在ニューロン細胞またはニューロン細胞における制限された発現のためにトランスジーンを送達する方法であって、SCN1Aトランスジーンポリヌクレオチド配列またはその機能的部分と、SCN1Aトランスジーンの発現を対象の大脳皮質の介在ニューロン細胞またはニューロン細胞に特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列とを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターに該細胞を接触させ、それによって、対象における発作および/またはてんかんを阻害または阻止する工程を含む、方法。
  42. 介在ニューロン細胞が、PV発現皮質介在ニューロン(PV-cIN)、血管作用性小腸ペプチドを発現する脱抑制性皮質介在ニューロン(VIP cIN)、または錐体ニューロンより選択される、請求項31または34～41のいずれか一項記載の方法。
  43. rAAVベクター中にあるエンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、またはE10(それぞれ、SEQ ID NO:15～24)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含む、請求項41または請求項42記載の方法。
  44. rAAVベクター中にあるエンハンサーポリヌクレオチド配列が、
    ヒトエンハンサーエレメントE2(SEQ ID NO:16)のポリヌクレオチド配列、
    ヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)のポリヌクレオチド配列、または
    ヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)のポリヌクレオチド配列
    と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含む、請求項41または請求項42記載の方法。
  45. rAAVベクター中にあるエンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、またはE10(それぞれ、SEQ ID NO:15～24)より選択される、請求項41または請求項42記載の方法。
  46. エンハンサーポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:16のヒトエンハンサーエレメントE2ポリヌクレオチド配列、ヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)、またはヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)である、請求項45記載の方法。
  47. rAAVベクター、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、または薬学的組成物が全身投与される、請求項32～46のいずれか一項記載の方法。
  48. rAAVベクター、ウイルス粒子、または薬学的組成物が非経口投与される、請求項32～46のいずれか一項記載の方法。
  49. rAAVベクター、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、または薬学的組成物が静脈内投与される、請求項47または請求項48記載の方法。
  50. rAAVベクター、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、または薬学的組成物が脳内投与される、請求項32～46のいずれか一項記載の方法。
  51. rAAVベクター、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、または薬学的組成物が予防薬として投与される、請求項32～50のいずれか一項記載の方法。
  52. 補助的抗てんかん処置を乳児または対象に施す工程をさらに含む、請求項32～51のいずれか一項記載の方法。
  53. トランスジーンポリヌクレオチド配列と、トランスジーンの発現を脳の血管作用性小腸ペプチド発現皮質介在ニューロン細胞(VIP cIN)に特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列とを含む、ウイルスベクター。
  54. SCN1A遺伝子発現に特異的に関連するエンハンサーポリヌクレオチド配列と、トランスジーンポリヌクレオチド配列とを含むウイルスベクターであって、エンハンサー配列がトランスジーンの発現を脳の血管作用性小腸ペプチド発現皮質介在ニューロン細胞(VIP cIN)に制限する、ウイルスベクター。
  55. エンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む、請求項53または請求項54記載のウイルスベクター。
  56. エンハンサーポリヌクレオチド配列がヒトエンハンサーエレメントE6(SEQ ID NO:20)である、請求項53～55のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  57. トランスジーンポリヌクレオチド配列と、トランスジーンの発現を脳の錐体ニューロンに特異的に制限するエンハンサーポリヌクレオチド配列とを含む、ウイルスベクター。
  58. SCN1A遺伝子発現に特異的に関連するエンハンサーポリヌクレオチド配列と、トランスジーンポリヌクレオチド配列とを含むウイルスベクターであって、エンハンサー配列がトランスジーンの発現を脳の錐体ニューロンに制限する、ウイルスベクター。
  59. エンハンサーポリヌクレオチド配列が、ヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)のポリヌクレオチド配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有する約100bp以上の1つまたは複数の領域を含有するヌクレオチド配列を含む、請求項57または請求項58記載のウイルスベクター。
  60. エンハンサーポリヌクレオチド配列がヒトエンハンサーエレメントE5(SEQ ID NO:19)である、請求項57～59のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  61. エンハンサー配列がトランスジーンの発現を脳のグルタミン酸作動性錐体ニューロンに制限する、請求項58～60のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  62. エンハンサー配列がトランスジーンの発現を脳の皮質層5の錐体ニューロンに制限する、請求項58～61のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  63. レンチウイルスベクターまたは組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターである、請求項53～62のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  64. トランスジーンがSCN1A遺伝子である、請求項53～63のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  65. SEQ ID NO:15～24より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、SCN1A発現ニューロン細胞を特異的に標的とする、ウイルスベクター。
  66. ニューロン細胞がパルブアルブミン皮質介在ニューロン(PV cIN)、錐体(PYR)ニューロン、または血管作用性小腸ペプチド皮質介在ニューロン(VIP cIN)である、請求項65記載のウイルスベクター。
  67. SEQ ID NO:25～27より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Pvalb発現細胞を特異的に標的とする、ウイルスベクター。
  68. SEQ ID NO:28～31より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Acan発現細胞を特異的に標的とする、ウイルスベクター。
  69. SEQ ID NO:32～39より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Tmem132c発現細胞を特異的に標的とする、ウイルスベクター。
  70. SEQ ID NO:40またはSEQ ID NO:41より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Lrrc38発現細胞を特異的に標的とする、ウイルスベクター。
  71. SEQ ID NO:42またはSEQ ID NO:43より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Inpp5j発現細胞を特異的に標的とする、ウイルスベクター。
  72. SEQ ID NO:44～47より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Mef2c発現細胞を特異的に標的とする、ウイルスベクター。
  73. SEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:49より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、Pthlh発現細胞を特異的に標的とする、ウイルスベクター。
  74. SEQ ID NO:15～49より選択されるエンハンサーポリヌクレオチド配列またはその機能的部分を含むウイルスベクターであって、PV発現細胞を特異的に標的とする、ウイルスベクター。
  75. 標的細胞がPV発現ニューロン細胞である、請求項65または67～74のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  76. 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターである、請求項65～75のいずれか一項記載のウイルスベクター。
  77. 請求項65～76のいずれか一項記載のウイルスベクターを含む、ウイルス粒子またはウイルス様粒子。
  78. 請求項65～76のいずれか一項記載のウイルスベクターを含む、細胞。
  79. 請求項77記載のウイルス粒子またはウイルス様粒子を含む、細胞。
  80. 請求項65～76のいずれか一項記載のウイルスベクターまたは請求項77記載のウイルス粒子もしくはウイルス様粒子と、薬学的に許容されるビヒクル、担体、または希釈剤とを含む、薬学的組成物。
  81. トランスジーンの発現を対象のニューロン細胞に制限する方法であって、SEQ ID NO:15～49の配列を含む少なくとも1つのエンハンサーエレメントポリヌクレオチドとトランスジーンポリヌクレオチドとを含む送達ベクターを対象に投与する工程を含み、トランスジーンがニューロン細胞において特異的に発現される、方法。
  82. トランスジーンがSCN1Aである、請求項81記載の方法。
  83. ニューロン細胞がパルブアルブミン発現皮質介在ニューロン(PV cIN)である、請求項82記載の方法。
  84. エンハンサーエレメントポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:15～18またはSEQ ID NO:21～24に示される配列を含む、請求項82または請求項83記載の方法。
  85. ニューロン細胞が錐体(PYR)細胞である、請求項82記載の方法。
  86. エンハンサーエレメントポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:19に示される配列を含む、請求項85記載の方法。
  87. ニューロン細胞が血管作用性小腸ペプチド発現皮質介在ニューロン(VIP cIN)である、請求項82記載の方法。
  88. エンハンサーエレメントポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:20に示される配列を含む、請求項87記載の方法。
  89. 送達ベクターがレンチウイルスベクターまたはrAAVである、請求項81～88のいずれか一項記載の方法。
  90. 送達ベクターが脳に投与される、請求項89記載の方法。
  91. 送達ベクターが局所投与または全身投与される、請求項90記載の方法。
  92. 対象が哺乳動物である、請求項81～91のいずれか一項記載の方法。
  93. 対象がヒトである、請求項92記載の方法。
  94. SEQ ID NO:15～49より選択されるヒトエンハンサーポリヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクター。
  95. 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターである、請求項94記載のウイルスベクター。
  96. 請求項94または請求項95記載のウイルスベクターを含む、ウイルス粒子またはウイルス様粒子。
  97. 請求項94または請求項95記載のウイルスベクターを含む、細胞。
  98. 請求項96記載のウイルス粒子またはウイルス様粒子を含む、細胞。
  99. 請求項94もしくは請求項95記載のウイルスベクターまたは請求項96記載のウイルス粒子もしくはウイルス様粒子と、薬学的に許容されるビヒクル、担体、または希釈剤とを含む、薬学的組成物。
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