CN116710566A - Neurod1载体 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及AAV载体，涉及通过使用AAV载体中的NeuroD1编码序列将神经胶质细胞转化为神经元的组合物和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月29日提交的美国临时专利申请号63/084,908和于2021年9月21日提交的美国临时专利申请号63/246,545的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
序列表的并入
包含在名为P34822WO00_SL.txt的文件(21,632字节(在MS-中测量))中并于2021年9月27日创建的序列表以电子方式随此提交并通过引用整体并入。
技术领域
本公开包括使用包含编码人NeuroD1的核酸序列的AAV载体将神经胶质细胞转化为神经元的方法和组合物。
背景技术
在患有神经系统病症的受试者或在中枢神经系统(CNS)或周围神经系统(PNS)受伤后的受试者中，神经元常常会被杀死或损坏并且无法再生。
神经胶质细胞在CNS或PNS受伤(诸如脑损伤)或神经系统病症后变得具有反应性。
目前没有方法可用于使用腺相关病毒(AAV)在患有神经系统病症的人类受试者中再生功能性新神经元。
发明内容
在一个方面，本公开提供并包括一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，该hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中该hNeuroD1序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸编码序列，该hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中该编码序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含选自由SEQID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)具有SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ IDNO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码神经源性分化因子1(NeuroD1)蛋白的NeuroD1核酸编码序列，其中该编码序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)增强子；(c)嵌合内含子；(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)多聚腺苷酸化信号序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种用于将人的神经胶质细胞转化为功能性神经元的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中该AAV载体包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，该hNeuroD1序列具有SEQ ID NO:6的核酸序列，并且其中该序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种用于将人的神经胶质细胞转化为功能性神经元的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中该AAV载体包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸编码序列，该hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且其中该编码序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ IDNO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ IDNO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种用于治疗有此需要的受试者的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中该AAV载体包含可操作地连接到表达控制元件的神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，该表达控制元件包含：(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)增强子；(c)嵌合内含子；(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)多聚腺苷酸化信号。
在一个方面，本公开提供并包括一种将活人脑中的反应性星形胶质细胞转化为功能性神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)注射到有此需要的受试者中，其中该AAV包含DNA载体构建体，该DNA载体构建体包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，该hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中该序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ IDNO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ IDNO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种将活人脑中的反应性星形胶质细胞转化为功能性神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)注射到有此需要的受试者中，其中该AAV包含DNA载体构建体，该DNA载体构建体包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸编码序列，该hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中该编码序列可操作地连接到表达控制元件，该表达控制元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种将有此需要的受试者的神经胶质细胞转化为神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)递送至有此需要的受试者，其中该AAV包含DNA载体构建体，该DNA载体构建体包含神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，该序列可操作地连接到表达控制元件，该表达控制元件包含：(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)增强子；(c)嵌合内含子；(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)多聚腺苷酸化信号序列，其中该载体能够将该有此需要的受试者的至少一种神经胶质细胞转化为神经元。
在一个方面，本公开提供并包括一种治疗有此需要的受试者的神经系统病症的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)递送至受试者，其中给予有此需要的受试者的AAV包含DNA载体构建体，该DNA载体构建体包含可操作地连接到表达控制元件的神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，该表达控制元件包含：(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)增强子；(c)嵌合内含子；(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)多聚腺苷酸化信号。
在一个方面，本公开提供并包括一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，该hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中该hNeuroD1序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含SEQ ID NO:15的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子；(c)包含SEQ ID NO:16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含SEQ IDNO:18的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，该hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中该hNeuroD1序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含SEQ ID NO:15的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含SEQ ID NO:18的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
附图说明
图1A描绘了EF-1α:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:SV40(P35)的图。
图1B描绘了EF-1α:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:hGH的图。
图1C描绘了CE:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:SV40(P11)的图。
图1D描绘了CE:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:hGH的图。
图2A描绘了EF-1α:Gfa1.6:NeuroD1:WPRE:SV40(P39)的图。
图2B描绘了CE:Gfa1.6:NeuroD1:WPRE:hGH的图。
图2C描绘了CE:Gfa1.6:NeuroD1:WPRE:SV40(P38)的图。
图2D描绘了EF-1α:Gfa1.6:NeuroD1:WPRE:hGH的图。
图3A描绘了EF-1α:GFA2.2:NeuroD1:WPRE:SV40的图。
图3B描绘了EF-1α:GFA2.2:NeuroD1:WPRE:hGH的图。
图3C描绘了CE:GFA2.2:NeuroD1:WPRE:SV40的图。
图3D描绘了CE:GFA2.2:NeuroD1:WPRE:hGH的图。
图4是P35质粒的AAV病毒生产的测量图。使用目的基因(GOI)引物、ITR区引物和反向包装引物进行滴度分析。病毒产量计算为vg/细胞。
图5描绘了从出生后3天的Sprague-Dawley大鼠脑中建立大鼠星形胶质细胞原代培养物。左上图呈现GFAP染色细胞的图像。右上图呈现SOX9染色细胞的图像。左下图呈现DAPI染色细胞的图像。右下图呈现GFAP、SOX9和DAPI染色细胞的合并图像。
图6描绘了用质粒P5(pEF-1α:hNeuroD1:GFP)转染原代大鼠星形胶质细胞。左图呈现NeuroD1染色细胞的图像。中间左图呈现表达GFP的细胞的图像。中间右图代表DAPI染色细胞。右图代表NeuroD1、GFP和DAPI染色细胞的合并图像。
图7描绘了质粒NeuroD1表达水平的比较。原代大鼠星形胶质细胞转染有P6(pEF-1α:hNeuroD1:WPRE:SV40)表达载体、P11(CE:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:SV40)表达载体、P35(EF-1α:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:SV40)表达载体，或P39(EF-1α:Gfa1.6:NeuroD1:WPRE:SV40)。上图显示细胞的NeuroD1染色，下图显示合并的细胞NeuroD1和DAPI染色。
图8描绘了使用AAV9-P12(pGfaABC1D:GFP)在不同剂量下AAV病毒颗粒转导的比较。左图显示3x 1010vg/孔的剂量。中图显示1x 1010vg/孔的剂量。右图显示2.5x109vg/孔的剂量。
图9A和9B描绘了转导到原代大鼠星形胶质细胞中的AAV颗粒的定量分析。图9A呈现AAV9-P12(pGfaABC1D:GFP)和AAV5-P7(pEF-1α:GFP)在MOI为5x 105vg/细胞、2x105 vg/细胞和5x 104vg/细胞时的转导率。图9B呈现AAV9-P12(pGfaABC1D:GFP)在以一系列密度(2x104个细胞/孔、1.5x 104个细胞/孔、1x104个细胞/孔和5x 103个细胞/孔)接种并且用一系列量的病毒(100μl培养基中的1x 1013vg/ml病毒的2μl、1μl、0.5μl、0.25μl、0.125μl)感染的细胞中的转导率百分比。
图10描绘了将包含NeuroD1的AAV病毒颗粒转导到原代大鼠星形胶质细胞中。用AAV5-P1(AAV5:pGfa2.2:cre)和AAV4-P4(AAV5:pCAG:flex:hNeuroD1:GFP)(右图)、AAV9-P9(CE:GfaABC1D:NeuroD1:GFP)(中图)或AAV9-P11(CE:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:SV40)(左图)转导原代大鼠星形胶质细胞。
图11描绘了用对照质粒AAV9-P21(CE-pGFA681-CI-GFP-WPRE-SV40pA)以2X1010vg/ml转导后三周的RCA。使用针对神经元标记物NeuN和MAP2的抗体以及DAPI(核染料)对细胞进行免疫染色。GFP荧光表明存在用对照质粒转导的细胞。
图12描绘了在用NXL-P134(CE-pGfa681-CRGI-hND1-oPRE-bGHpA)转染后24小时用抗NeuroD1(ND1)抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图13描绘了在用AAV9-P134(CE-pGfa681-CRGI-hND1-oPRE-bGHpA)以2X1010vg/ml转导后6天用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图14描绘了在用AAV9-P134(CE-pGfa681-CRGI-hND1-oPRE-bGHpA)以2X1010vg/ml转导后3周用抗NeuN和抗MAP2抗体以及DAPI(核染料)免疫染色的RCA。使用含ND1的载体进行转导来从星形胶质细胞培养物中生成神经元(NeuN//MAP2+)。
图15描绘了在用NXL-P138(EE-pGfa681-CRGI-hND1-oPRE-bGHpA)转染后24小时用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图16描绘了在用AAV9-P138(EE-pGfa681-CRGI-hND1-oPRE-bGHpA)以2X1010vg/ml转导后6天用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图17描绘了在用AAV9-P138(EE-pGfa681-CRGI-hND1-oPRE-bGHpA)以2X1010vg/ml转导后3周用抗NeuN和抗MAP2抗体以及DAPI(核染料)免疫染色的RCA。使用含ND1的载体进行转导来从星形胶质细胞培养物中生成神经元(NeuN//MAP2+)。
图18描绘了在用AAV9-P9(CE-pGfa681-CI-hND1-p2A-GFP-WPRE-SV40pA)以2X1010vg/ml转导后6天用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。GFP荧光指示转导细胞的存在。
图19描绘了在用AAV9-P9(CE-pGfa681-CI-hND1-p2A-GFP-WPRE-SV40pA)以2X1010vg/ml转导后3周用抗NeuN和抗MAP2抗体以及DAPI(核染料)免疫染色的RCA。使用含ND1的载体进行转导来从星形胶质细胞培养物中生成神经元(NeuN//MAP2+)。
图20描绘了在用NXL-P22(CE-pGfa681-CI-hND1-WPRE-SV40pA)转染后24小时用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图21描绘了在用AAV9-P22(CE-pGfa681-CI-hND1 WPRE-SV40pA)以2X1010 vg/ml转导后6天用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图22描绘了在用AAV9-P22(CE-pGfa681-CI-hND1-WPRE-SV40pA)以2X1010 vg/ml转导后3周用抗NeuN和抗MAP2抗体以及DAPI(核染料)免疫染色的RCA。使用含ND1的载体进行转导来从星形胶质细胞培养物中生成神经元(NeuN//MAP2+)。
图23描绘了在用NXL-P35(EE-pGfa681-CI-hND1-WPRE-SV40pA)转染后24小时用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图24描绘了在用AAV9-P35(EE-pGfa681-CI-hND1 WPRE-SV40pA)以2X1010 vg/ml转导后6天用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图25描绘了在用AAV9-P35(EE-pGfa681-CI-hND1-WPRE-SV40pA)以2X1010 vg/ml转导后3周用抗NeuN抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。用含ND1的载体进行转导来从星形胶质细胞培养物中生成神经元(NeuN+)。
图26描绘了在用NXL-P107(CE-pGfa681-CI-hND1-bGHpA)转染后24小时用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图27描绘了在用NXL-P108(CE-pGfa681-CI-hND1-oPRE-bGHpA)转染后24小时用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图28描绘了在用NXL-P109(CE-pGfa681-CRGI-hND1-bGHpA)转染后24小时用抗ND1抗体和DAPI(核染料)免疫染色的RCA。
图29描绘了感染AAV9-P12(P12对照组)、AAV9-P12+AAV9-P134(P134组)和AAV9-P12+AAV9-P138(P138组)的小鼠在感染后10天(dpi)的脑皮层组织。
图30描绘了感染AAV9-P12+AAV9-P134(P134组)和AAV9-P12+AAV9-P138(P138组)的小鼠在感染后30天(dpi)的脑皮层组织。
图31描绘了感染AAV9-P12(P12对照组)和AAV9-P12+AAV9-P134(P134组)的小鼠(双侧损伤模型)在10dpi时的脑皮层组织。
图32是P134、P130、P138和P21质粒的AAV病毒生产的测量图。通过qPCR使用扩增目的基因(GOI)的引物和对质粒具有特异性的引物进行滴度分析。病毒产量计算为vg/细胞。
图33描绘了感染AAV9-P12(P12对照组)、AAV9-P12+AAV9-P134(P134组)和AAV9-P12+AAV9-P138(P138组)的小鼠在感染后10天(dpi)的脑皮层组织。使用针对NeuroD1、GFAP、NeuN的抗体和DAPI(核染料)对细胞进行免疫染色。GFP荧光表明存在感染对照病毒的细胞。
图34描绘了感染AAV9-P12(P12对照组)、AAV9-P12+AAV9-P134(P134组)和AAV9-P12+AAV9-P138(P138组)的小鼠在感染后30天(dpi)的脑皮层组织。使用针对GFAP、NeuN的抗体和DAPI(核染料)对细胞进行免疫染色。GFP荧光表明存在感染对照病毒的细胞。
图35描绘了感染AAV9-P12(P12对照组)和AAV9-P12+AAV9-P134(P134组)的小鼠(双侧损伤模型)在10dpi时的脑皮层组织。使用针对NeuroD1、GFAP、NeuN的抗体和DAPI(核染料)对细胞进行免疫染色。GFP荧光表明存在感染对照病毒的细胞。
图36A和36B描绘了感染AAV9-P12(P12对照组)和AAV9-P12+AAV9-P134(P134组)的小鼠(双侧损伤模型)在30dpi时的脑皮层组织。图36A描绘了用针对NeuroD1、GFAP、NeuN的抗体和DAPI(核染料)进行免疫染色的细胞。GFP荧光表明存在感染对照病毒的细胞。图36B是在30dpi时神经胶质细胞到神经元的转化率的量化。
序列简述
表1中提供了核酸序列和氨基酸序列的列表。
表1.核酸序列
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具体实施方式
除非另外定义，否则所使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在以单数形式提供术语的情况下，本发明的发明人还设想了以所述术语的复数形式描述的本公开的各个方面。在通过引用并入的参考文献中所使用的术语和定义存在差异的情况下，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。所使用的其它技术术语在其被使用的领域中具有其普通含义，如各种领域特定词典所例示的，例如“《American 科学词典》)”(《美国传统词典(American HeritageDictionaries)》的编辑,2011,波士顿和纽约霍顿米夫林出版公司(Houghton MifflinHarcourt,Boston and New York))、“《麦格劳-希尔科学技术术语词典(McGraw-HillDictionary of Scientific and Technical Terms)》”(第6版,2002,纽约麦格劳-希尔出版公司(McGraw-Hill,New York))或“《牛津生物学词典(Oxford Dictionary ofBiology)》”(第6版,2008,牛津和纽约牛津大学出版社(Oxford University Press,Oxfordand New York))。
包含例如所有专利、公开的专利申请和非专利出版物的本文引用的任何参考文献以全文引用的方式并入本文中。
当呈现一组替代方案时，具体地设想了构成所述组替代方案的成员的任何和所有组合。例如，如果项选自由A、B、C和D组成的组，则发明人将单独地具体地设想每个替代方案(例如，单独的A、单独的B等)以及诸如A、B和D；A和C；B和C；等的组合。术语“和/或”在两个或更多个项目的列表中使用时是指所列项目中的任何一个本身或与任何一个或多个其它所列项目的组合。例如，表达“A和/或B”旨在意指A和B中的任一者或两者，即单独的A、单独的B或A和B的组合。表达“A、B和/或C”旨在意指单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合、或A、B和C的组合。
当本文提供数字范围时，该范围被理解为包括范围的边缘以及范围的定义边缘之间的任何数字。例如，“1与10之间”包含1与10之间的任何数字以及数字1和数字10。
当提及数字使用术语“约”时，应理解为是指加或减10％。例如，“约100”将包括从90至110。
如本文所用，“hND1”是指人神经源性分化因子(NeuroD1)基因或蛋白质。
如本文所用，“CE”是指巨细胞病毒(CMV)启动子增强子序列。
如本文所用，“EE”是指Ef1α启动子增强子序列。
如本文所用，“pGfa681”是指大小为681bp的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子截短序列。
如本文所用，“CI”是指由来自人β-球蛋白基因第一内含子的5'-供体位点和来自免疫球蛋白基因重链可变区内含子的分支和3'-受体位点构成的嵌合内含子。
如本文所用，“CRGI”是指在CAG启动子中相似的兔β-球蛋白和鸡β肌动蛋白的嵌合内含子。
如本文所用，“GI”是指人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)第一内含子。
如本文所用，“WPRE”是指土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调控元件。
如本文所用，“oPRE”是指WPRE的优化版本。
如本文所用，“SV40pA”是指SV40病毒的多聚腺苷酸化信号。
如本文所用，“bGHpA”是指牛生长激素的多聚腺苷酸化信号。
如本文所用，“vg”是指病毒基因组。
如本文所用，“p2A”是指来自猪捷申病毒-1的2A自切割肽序列。
本文所提供的任何组合物或载体被具体地设想用于本文所提供的任何方法。
在一个方面，本文提供的方法和组合物包含载体。如本文所用，术语“载体”是指与染色体DNA物理分离的环状双链DNA分子。应当注意，术语“载体”可以与术语“质粒”互换使用。
在一个方面，本文提供的载体是重组载体。如本文所用，术语“重组载体”是指包含重组核酸的载体。如本文所用，“重组核酸”是指通过基因重组的实验室方法(诸如但不限于分子克隆)形成的核酸分子。基因载体可以通过遗传重组的实验室方法(诸如但不限于分子克隆)形成。而且，本领域技术人员可以通过由单个核苷酸合成质粒或通过将来自不同预先存在的载体的核酸分子剪接在一起来从头创建重组载体，但不限于此。
腺相关病毒(AAV)是感染人类和其他灵长类物种的复制缺陷型、无包膜的依赖性细小病毒属(Dependoparvovirus)病毒。已知AAV不会引起任何物种的疾病，但它们会引起轻微的免疫反应。AAV可以感染分裂细胞和休眠细胞。AAV稳定地整合到人类基因组中19号染色体上称为AAVS1基因座(GenBank登录号AC010327.8的核苷酸7774-11429)的特异性位点，尽管在人类基因组中其他基因座的随机整合是可能的。
AAV包含具有长约4700个核苷酸的单链DNA的线性基因组。AAV的基因组还包括位于基因组每一端的145个核苷酸长的反向末端重复序列(ITR)。ITR两侧有两个病毒基因：rep(用于复制，编码非结构蛋白)和cap(用于衣壳，编码结构蛋白)。ITR含有AAV基因组拯救、复制和包装所需的所有顺式作用元件。
当用于基因治疗方法时，AAV基因组序列的rep和cap基因被移除并替换为位于两个AAV ITR之间的目的DNA。如本文所用，“AAV载体构建体”是指包含插入两个AAV ITR序列之间的所需序列的DNA分子。如本文所用，“AAV载体”是指用DNA载体构建体包装的AAV。
如本文所用，术语“AAV载体血清型”主要是指AAV载体的衣壳蛋白内的变异。
在一个方面，AAV载体选自由以下项组成的组：AAV载体血清型1、AAV载体血清型2、AAV载体血清型3、AAV载体血清型4、AAV载体血清型5、AAV载体血清型6、AAV载体血清型7、AAV载体血清型8、AAV载体血清型9、AAV载体血清型10、AAV载体血清型11和AAV载体血清型12。在一个方面，AAV载体选自由AAV血清型2、AAV血清型5和AAV血清型9组成的组。在一个方面，AAV载体是AAV血清型1。在一个方面，AAV载体是AAV血清型2。在一个方面，AAV载体是AAV血清型3。在一个方面，AAV载体是AAV血清型4。在一个方面，AAV载体是AAV血清型5。在一个方面，AAV载体是AAV血清型6。在一个方面，AAV载体是AAV血清型7。在一个方面，AAV载体是AAV血清型8。在一个方面，AAV载体是AAV血清型9。在一个方面，AAV载体是AAV血清型10。在一个方面，AAV载体是AAV血清型11。在一个方面，AAV载体是AAV血清型12。
在一个方面，AAV载体ITR选自由以下项组成的组：AAV血清型1ITR、AAV血清型2ITR、AAV血清型3ITR、AAV血清型4ITR、AAV血清型5ITR、AAV血清型6ITR、AAV血清型7ITR、AAV血清型8ITR、AAV血清型9ITR、AAV血清型10ITR、AAV血清型11ITR和AAV血清型12ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型1ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型2ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型3ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型4ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型5ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型6ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型7ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型8ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型9ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型10ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型11ITR。在一个方面，AAV载体ITR是AAV血清型12ITR。
在一个方面，至少一个AAV载体ITR核酸序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO:1和9。在一个方面，至少一个AAV载体ITR核酸序列是SEQ ID NO:1。在一个方面，至少一个AAV载体ITR核酸序列是SEQ ID NO:9。
在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ IDNO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAVITR核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:1，或其互补序列。
在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ IDNO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAVITR核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。在一个方面，AAV ITR核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:9，或其互补序列。
如本文所用，关于两个或更多个核苷酸或氨基酸序列的术语“同一性百分比”或“相同百分比”通过以下方式计算：(i)在比较窗口(一个或多个“可比对”区域)上比较两个最佳比对的序列(核苷酸或氨基酸)，(ii)确定在两个序列中出现相同的核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白和多肽)的位置数以产生匹配位置数，(iii)将匹配位置数除以比较窗口中总位置数，然后(iv)将该商乘以100％以产生同一性百分比。如果“同一性百分比”是在没有指定特定比较窗口的情况下相对于参考序列计算的，那么通过将比对区域上匹配位置数除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，为了本申请的目的，当将两个序列(查询和主题)最佳比对(在其比对中允许空位)时，查询序列的“同一性百分比”等于两个序列之间相同位置数除以查询序列在其长度(或比较窗口)上的总位置数，然后乘以100％。
当参照氨基酸使用序列同一性百分比时，认为不相同的的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不改变分子的功能性质。当序列的保守取代不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性。由于此类保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。
为了对序列进行最佳比对以计算它们的同一性百分比，各种成对或多重序列比对算法和程序是本领域已知的，诸如可用于比较两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的序列同一性或相似性的ClustalW或Basic Local Alignment Search(BLASTTM)等。尽管其他比对和比较方法是本领域已知的，但是两个序列之间的比对和同一性百分比(包括上述同一性百分比范围)可以通过ClustalW算法确定，参见例如，Chenna等人，“Multiplesequence alignment with the Clustal series of programs,”Nucleic AcidsResearch31:3497-3500(2003)；Thompson等人，“Clustal W:Improving the sensitivityof progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,”Nucleic AcidsResearch 22:4673-4680(1994)；Larkin MA等人，“Clustal W and Clustal X version2.0,”Bioinformatics 23:2947-48(2007)；和Altschul等人，“Basic local alignmentsearch tool.”J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，其全部内容和公开通过引用并入本文。
如本文所用，关于两个核苷酸序列的术语“互补性百分比”或“互补百分比”类似于同一性百分比的概念，但是是指当查询序列和主题序列线性排列并且最佳碱基配对而没有二级折叠结构(诸如环、茎或发夹)时，与主题序列的核苷酸最佳碱基对或杂交的查询序列的核苷酸的百分比。此类互补性百分比可以在两条DNA链、两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链之间。“互补性百分比”可以通过以下方式计算：(i)在比较窗口上以线性和完全延伸的排列(即，没有折叠或二级结构)最佳碱基配对或杂交两个核苷酸序列，(ii)在比较窗口上确定两个序列之间的碱基对位置数以产生互补的位置数，(iii)将互补的位置数除以比较窗口中总位置数，和(iv)将该商乘以100％以得到两个序列的互补性百分比。两个序列的最佳碱基配对可以基于核苷酸碱基的已知配对(诸如G-C、A-T和A-U)通过氢结合来确定。如果相对于参考序列计算“互补性百分比”而不指定特定的比较窗口，那么通过将两个线性序列之间的互补的位置数除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，为了本申请的目的，当两个序列(查询和主题)是最佳碱基配对(允许错配或非碱基配对的核苷酸)时，查询序列的“互补性百分比”等于两个序列之间碱基配对位置数除以查询序列在其长度上的总位置数，然后乘以100％。
使用术语“多核苷酸”、“核酸序列”或“核酸分子”并非旨在将本公开限制为包含脱氧核糖核酸(DNA)的多核苷酸。例如，还设想了核糖核酸(RNA)分子。本领域普通技术人员将意识到多核苷酸和核酸分子可以包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物二者。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，其包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。在一个方面，本文提供的核酸分子是DNA分子。在一个方面，本文提供的核酸分子是RNA分子。在一个方面，本文提供的核酸分子是单链的。在一个方面，本文提供的核酸分子是双链的。核酸分子可以编码多肽或小RNA。
如本文所用，术语“多肽”是指至少两个共价连接的氨基酸的链。多肽可以由本文提供的多核苷酸编码。本文提供的蛋白质可由本文提供的核酸分子编码。蛋白质可包含本文提供的多肽。如本文所用，“蛋白质”是指能够为细胞提供结构或酶促活性的氨基酸残基链。如本文所用，“编码序列”是指编码蛋白质的核酸序列。
如本文所用，术语“CpG位点”或“CG位点”是指胞嘧啶和鸟嘌呤仅被一个磷酸酯基团隔开的DNA序列区域。
如本文所用，术语“CG岛”的“CpG岛”是指以高频率出现的CpG位点。
如本文所用，术语“密码子”是指三个核苷酸的序列。
如本文所用，术语“密码子优化的”是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换序列的至少一个密码子同时保持原始氨基酸序列来修饰以增强在目的宿主细胞中的表达的密码子。
如本文所用，术语“增强子”是指运行以启动、辅助、影响、引起和/或促进相关可转录DNA序列或编码序列至少在某些组织、发育阶段和/或条件中的转录和表达的DNA序列区域。在一个方面，增强子是顺式增强子。在一个方面，增强子是反式增强子。
增强子序列可以通过利用本领域熟知的基因组技术来鉴定。非限制性示例包括使用报告基因和下一代测序方法，诸如染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)、DNA酶I超敏性测序(DNase-seq)、微球菌核酸酶测序(MNase-seq)、甲醛辅助分离调控元件测序(FAIRE-seq)以及染色质转座酶可及性测序测定(ATAC-seq)。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子或其他调控元件与基因(或转基因)的相关可转录DNA序列或编码序列之间的功能性连接，使得启动子等运行以启动、辅助、影响、引起和/或促进相关可转录DNA序列或编码序列至少在某些组织、发育阶段和/或条件中的转录和表达。如本文所用，“调控元件”指正向或负向调节可操作连接的序列的表达的任何序列元件。“调控元件”包括但不限于启动子、增强子、前导序列、转录起始位点(TSS)、接头、5'和3'非翻译区(UTR)、内含子、多聚腺苷酸化信号和终止区或序列等，它们对于调节或允许基因或可转录DNA序列在细胞中的表达是合适的、必需的或优选的。此类额外的调控元件可以是任选的并且用于增强或优化基因或可转录DNA序列的表达。
如本文所用，术语“启动子”是指含有RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA盒并辅助或促进相关可转录多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达的DNA序列。启动子可以通过合成产生自、改变自或源自已知或天然存在的启动子序列或其他启动子序列。启动子还可以包括包含两个或更多个异源序列的组合的嵌合启动子。因此，本申请的启动子可以包括在组成上与已知或本文提供的其他启动子序列相似但不相同的启动子序列的变体。
如本文所用，“内含子”是指当信使RNA(mRNA)从mRNA前体成熟时通过RNA剪接去除的核苷酸序列。
如本文所用，“mRNA”或“信使RNA”是指对应于基因的遗传序列的单链RNA。
可以使用本领域已知的任何合适的方法测量mRNA的表达。测量mRNA表达的非限制性示例包括定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)、RNA印迹(例如，Northern印迹)和RNA测序。表达差异可以描述为绝对量化或相对量化。参见，例如，Livak和Schmittgen，Methods,25:402-408(2001)。
如本文所用，术语“神经胶质”或“神经胶质细胞”是指CNS或PNS中的非神经元细胞。在一个方面，至少一种神经胶质细胞选自由以下项组成的组：至少一种少突胶质细胞、至少一种星形胶质细胞、至少一种NG2细胞、至少一种室管膜细胞和至少一种小神经胶质细胞。在一个方面，至少一种神经胶质细胞是至少一种少突胶质细胞。在一个方面，至少一种神经胶质细胞是至少一种NG2细胞。在一个方面，至少一种神经胶质细胞是至少一种室管膜细胞。在一个方面，至少一种神经胶质细胞是至少一种小神经胶质细胞。在一个方面，至少一种神经胶质细胞是至少一种反应性星形胶质细胞。在一个方面，至少一种星形胶质细胞是至少一种反应性星形胶质细胞。
如本文所用，术语“星形胶质细胞”是指作为脑的重要组成部分的神经胶质细胞。星形胶质细胞参与支持神经元功能，诸如突触形成和可塑性、钾缓冲、营养供应、神经或神经胶质递质的分泌和吸收，以及血脑屏障的维持。如本文所用，术语“反应性星形胶质细胞”是指星形胶质细胞在受伤或疾病后的异常状态。
如本文所用，术语“NG2细胞”或“多突胶质细胞”是指表达硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG4)和血小板衍生生长因子α受体(PDGFRA)的神经胶质细胞。
如本文所用，术语“神经元”或“神经元细胞”是指通过突触与其他神经元通讯的电可兴奋细胞。在一个方面，神经元选自由单极神经元、双极神经元、假单极神经元和多极神经元组成的组。在一个方面，神经元是单极神经元。在一个方面，神经元是双极神经元。在一个方面，神经元是假单极神经元。在一个方面，神经元是双极神经元。在一个方面，神经元选自由感觉神经元、运动神经元和中间神经元组成的组。在一个方面，神经元是感觉神经元。在一个方面，神经元是运动神经元。在一个方面，神经元是中间神经元。
如本文所用，术语“功能性神经元”是指可以执行生物过程的神经元。生物过程的示例包括但不限于信息的处理和传输以及经由化学和电突触的通讯。
如本文所用，术语“谷氨酸能神经元”是指产生谷氨酸并建立兴奋性突触的神经元亚类。如本文所用，术语“兴奋性突触”是指其中突触前神经元中的动作电位增加突触后细胞中动作电位发生概率的突触。如本文所用，术语“动作电位”或“神经冲动”是指穿过轴突膜的电脉冲。如本文所用，术语“轴突”或“神经纤维”是指传导动作电位的神经元。如本文所用，术语“GABA能神经元”是指产生GABA并建立抑制性突触的神经元子集。如本文所用，术语“GABA”或“γ-氨基丁酸”是指打开离子通道以允许带负电荷的氯离子流入细胞或带正电荷的钾离子流出细胞的化合物。如本文所用，术语“抑制性突触”是指使突触后神经元的膜电位远离生成动作电位的阈值的突触。如本文所用，术语“多巴胺能神经元”是指产生多巴胺的神经元子集。如本文所用，术语“多巴胺”是指一类神经递质。如本文所用，术语“神经递质”是指激活神经传递的一类内源性化学物质。如本文所用，术语“神经传递”是指由神经元的轴突末端释放神经递质的过程。如本文所用，术语“乙酰胆碱能神经元”或“胆碱能神经元”是指分泌乙酰胆碱的神经元子集。如本文所用，术语“乙酰胆碱”是指一类神经递质。如本文所用，术语“血清素能神经元”是指合成血清素的神经元子集。如本文所用，术语“血清素”是指一类神经递质。如本文所用，“肾上腺素能神经元”是指释放肾上腺素作为神经递质的神经元。如本文所用，术语“运动神经元”是指神经元的子集，其中细胞体位于运动皮层、脑干或脊髓中并且轴突投射到脊髓或脊髓外并直接或间接地控制肌肉和腺体。如本文所用，术语肽能神经元是指利用小肽分子作为其神经递质的神经元子集。
在一个方面，神经元是功能性神经元。在一个方面，功能性神经元选自由谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元组成的组。在一个方面，功能性神经元是谷氨酸能神经元。在一个方面，功能性神经元是GABA能神经元。在一个方面，功能性神经元是多巴胺能神经元。在一个方面，功能性神经元是胆碱能神经元。在一个方面，功能性神经元是血清素能神经元。在一个方面，功能性神经元是肾上腺素能神经元。在一个方面，功能性神经元是运动神经元。在一个方面，功能性神经元是肽能神经元。
如本文所用，术语“转化”或“转化的”是指将其物理形态和/或生物功能改变为不同的物理形态和/或不同的生物功能的细胞类型。在一个方面，本公开提供了至少一种神经胶质细胞向至少一种神经元的转化。在一个方面，至少一种神经胶质细胞向至少一种神经元的转化发生在CNS或PNS中。在一个方面，至少一种神经胶质细胞向至少一种神经元的转化发生在CNS中。在一个方面，至少一种神经胶质细胞向至少一种神经元的转化发生在PNS中。
在一个方面，本公开提供并包括一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，该hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中该hNeuroD1序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸编码序列，该hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中该编码序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和具有SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码神经源性分化因子1(NeuroD1)蛋白的NeuroD1核酸编码序列，其中该编码序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)增强子；(c)嵌合内含子；(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)多聚腺苷酸化信号序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种用于将人的神经胶质细胞转化为功能性神经元的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中该AAV载体包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，该hNeuroD1序列具有SEQ ID NO:6的核酸序列，并且其中该序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种用于将人的神经胶质细胞转化为功能性神经元的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中该AAV载体包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸编码序列，该hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且其中该编码序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ IDNO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ IDNO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种用于治疗有此需要的受试者的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中该AAV载体包含可操作地连接到表达控制元件的神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，该表达控制元件包含：(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)增强子；(c)嵌合内含子；(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)多聚腺苷酸化信号。
在一个方面，AAV载体包含编码AAV蛋白的核酸序列。在一个方面，AAV载体包含编码病毒蛋白的核酸序列。AAV蛋白和病毒蛋白的非限制性示例包括rep和cap蛋白。
神经源性分化因子1(NeuroD1；也称为β2)是一种基本螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子，其与其他bHLH蛋白形成异二聚体以激活含有称为E-盒的DNA序列的基因转录。
在一个方面，NeuroD1序列是人NeuroD1(hNeuroD1)序列。在一个方面，NeuroD1序列选自由以下项组成的组：黑猩猩NeuroD1序列、倭黑猩猩NeuroD1序列、红毛猩猩NeuroD1序列、大猩猩NeuroD1序列、猕猴NeuroD1序列、狨猴NeuroD1序列、卷尾猴NeuroD1序列、狒狒NeuroD1序列、长臂猿NeuroD1序列和狐猴NeuroD1序列。在一个方面，NeuroD1序列是黑猩猩NeuroD1序列。在一个方面，NeuroD1序列是倭黑猩猩NeuroD1序列。在一个方面，NeuroD1序列是红毛猩猩NeuroD1序列。在一个方面，NeuroD1序列是大猩猩NeuroD1序列。在一个方面，NeuroD1序列是猕猴NeuroD1序列。在一个方面，NeuroD1序列是狨猴NeuroD1序列。在一个方面，NeuroD1序列是卷尾猴NeuroD1序列。在一个方面，NeuroD1序列是狒狒NeuroD1序列。在一个方面，NeuroD1序列是长臂猿NeuroD1序列。在一个方面，NeuroD1序列是狐猴NeuroD1序列。
在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ IDNO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。在一个方面，NeuroD1核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。
在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少70％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少75％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少80％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少85％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少90％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少91％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少92％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少93％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少94％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少95％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少96％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少97％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少98％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少99％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少99.5％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少99.8％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ IDNO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下至少99.9％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。在一个方面，核酸编码序列编码包含与以下100％相同或相似的氨基酸序列的NeuroD1蛋白：SEQ ID NO:10。
神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)；也称为神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)是III型中间丝状蛋白家族的成员，其在中枢神经系统中表达并且在细胞通讯和血脑屏障功能中发挥作用。
在一个方面，启动子选自由以下项组成的组：GFAP启动子、Sox9启动子、S100b启动子、Aldh1l1启动子、脂质运载蛋白2(Lcn2)启动子、谷氨酰胺合成酶启动子、水通道蛋白-4(AQP4)启动子、少突胶质细胞转录因子(Olig2)启动子和突触蛋白启动子、NG2启动子、离子钙结合衔接分子1(Iba1)启动子、分化簇86(CD86)启动子、血小板衍生生长因子受体α(PDGFRA)启动子、血小板衍生生长因子受体β(PDGFRB)启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、泛素启动子。在一个方面，启动子是GFAP启动子。在一个方面，启动子是截短的GFAP启动子。在一个方面，启动子是Sox9启动子。在一个方面，启动子是S100b启动子。在一个方面，启动子是Aldhl1l启动子。在一个方面，启动子是Lcn2启动子。在一个方面，启动子是谷氨酰胺合成酶启动子。在一个方面，启动子是AQP4启动子。在一个方面，启动子是Olig2启动子。在一个方面，启动子是突触蛋白启动子。在一个方面，启动子是Iba1启动子。在一个方面，启动子是CD86启动子。在一个方面，启动子是PDGFRA启动子。在一个方面，启动子是PDGFRB启动子。在一个方面，启动子是EF1a启动子。在一个方面，启动子是CAG启动子。在一个方面，启动子是CMV启动子。在一个方面，启动子是泛素启动子。
在一个方面，GFAP启动子是指导称为神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的蛋白质在细胞中的星形胶质细胞特异性表达的启动子。在一个方面，GFAP启动子序列是人GFAP(hGFAP)启动子序列。在一个方面，GFAP启动子选自由GfaABC1D、Gfa1.6和hGFA2.2组成的组。在一个方面，GFAP启动子选自由GfaABC1D、Gfa1.6、hGFA2.2和pGfa681组成的组。在一个方面，GFAP启动子是GfaABC1D。在一个方面，GFAP启动子是Gfa1.6。在一个方面，GFAP启动子是hGFA2.2。在一个方面，GFAP启动子是pGfa681。在一个方面，pGfa681是SEQ ID NO:15。在一个方面，GFAP GfaABC1D是SEQ ID NO:15。在一个方面，GFAP Gfa1.6是SEQ ID NO:4。在一个方面，hGFa2.2是SEQ ID NO:12。在一个方面，GFAP启动子选自由以下项组成的组：SEQ IDNO:4、12和15。在一个方面，GFAP启动子是SEQ ID NO:15。在一个方面，GFAP启动子是SEQ IDNO:4。在一个方面，GFAP启动子是SEQ ID NO:12。
在一个方面，GFAP启动子序列选自由以下项组成的组：黑猩猩GFAP启动子序列、倭黑猩猩GFAP启动子序列、红毛猩猩GFAP启动子序列、大猩猩GFAP启动子序列、猕猴GFAP启动子序列、狨猴GFAP启动子序列、卷尾猴GFAP启动子序列、狒狒GFAP启动子序列、长臂猿GFAP启动子序列和狐猴GFAP启动子序列。在一个方面，GFAP启动子序列是黑猩猩GFAP启动子序列。在一个方面，GFAP启动子序列是倭黑猩猩GFAP启动子序列。在一个方面，GFAP启动子序列是红毛猩猩GFAP启动子序列。在一个方面，GFAP启动子序列是大猩猩GFAP启动子序列。在一个方面，GFAP启动子序列是猕猴GFAP启动子序列。在一个方面，GFAP启动子序列是狨猴GFAP启动子序列。在一个方面，GFAP启动子序列是卷尾猴GFAP启动子序列。在一个方面，GFAP启动子序列是狒狒GFAP启动子序列。在一个方面，GFAP启动子序列是长臂猿GFAP启动子序列。在一个方面，GFAP启动子序列是狐猴GFAP启动子序列。
在一个方面，GFAP启动子序列包含至少100个核苷酸。在一个方面，GFAP启动子包含至少500个核苷酸。在另一个方面，GFAP启动子包含至少1000个核苷酸。在又一个方面，GFAP启动子包含至少1500个核苷酸。
本领域理解启动子序列的片段可以起到驱动可操作连接的核酸分子转录的作用。例如，但不限于，如果1000个核苷酸的启动子被截短至500个核苷酸，并且该500个核苷酸的片段能够驱动转录，则该500个核苷酸的片段被称为“功能片段”。
在一个方面，启动子包含至少10个核苷酸。在一个方面，启动子包含至少50个核苷酸。在一个方面，启动子包含至少100个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少150个核苷酸。在一个方面，启动子包含至少200个核苷酸。在一个方面，启动子包含至少250个核苷酸。在一个方面，启动子包含至少300个核苷酸。在一个方面，启动子包含至少350个核苷酸。在一个方面，启动子包含至少400个核苷酸。在一个方面，启动子包含至少450个核苷酸。在一个方面，启动子包含至少500个核苷酸。在一个方面，启动子包含介于50个核苷酸与7500个核苷酸之间。在一个方面，启动子包含介于50个核苷酸与5000个核苷酸之间。在一个方面，启动子包含介于50个核苷酸与2500个核苷酸之间。在一个方面，启动子包含介于50个核苷酸与1000个核苷酸之间。在一个方面，启动子包含介于50个核苷酸与500个核苷酸之间。在一个方面，启动子包含介于10个核苷酸与7500个核苷酸之间。在一个方面，启动子包含介于10个核苷酸与5000个核苷酸之间。在一个方面，启动子包含介于10个核苷酸与2500个核苷酸之间。在一个方面，启动子包含介于10个核苷酸与1000个核苷酸之间。在一个方面，启动子包含介于10个核苷酸与500个核苷酸之间
在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少70％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少75％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少80％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少85％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少90％相同的序列：SEQID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少91％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少93％相同的序列：SEQID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少94％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少95％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少96％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少97％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少98％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少99％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。在一个方面，GFAP启动子核酸序列包含与选自由以下项组成的组的序列100％相同的序列：SEQ ID NO:4、12、15及其功能片段。
在一个方面，本文提供的核酸序列是密码子优化的。
在一个方面，本文提供的核酸序列是CpG位点耗尽的。
如本文所用，术语“脑”是指充当神经系统中枢的器官。在一个方面，脑包含大脑、大脑皮层、小脑和/或脑干。
如本文所用，术语“大脑皮层”是指大脑神经组织的外层。
如本文所用，术语“纹状体(striatum)”或“纹状体(corpus striatum)”是指前脑皮层下基底神经节中的神经元簇，并且包含腹侧纹状体和背侧纹状体。
如本文所用，术语“黑质”是指中脑皮层下基底神经节中的神经元簇并且包含致密部和网状部。
如本文所用，术语“前脑”是指脑的最前部。
如本文所用，术语“壳核”是指前脑基底的圆形结构并且是背侧纹状体的组成部分。
如本文所用，术语“尾状核”是指前脑基底的结构并且是背侧纹状体的组成部分。
如本文所用，术语“皮层下基底神经节”是指脑的大脑半球深部中的神经元簇。
如本文所用，术语“脊髓”是指在将神经信号从运动皮层传递到身体中起作用的结构。
如本文所用，术语“运动皮层”是指大脑皮层额叶中参与自主运动的计划、控制和执行的区域。
在一个方面，本文提供的方法将反应性星形胶质细胞转化为脑中的功能性神经元。在一个方面，本文提供的方法将反应性星形胶质细胞转化为脑的大脑皮层中的功能性神经元。在一个方面，本文提供的方法将反应性星形胶质细胞转化为脑的纹状体中的功能性神经元。在一个方面，本文提供的方法将反应性星形胶质细胞转化为脑的背侧纹状体中的功能性神经元。在一个方面，本文提供的方法将反应性星形胶质细胞转化为脑的脊髓中的功能性神经元。在一个方面，本文提供的方法将反应性星形胶质细胞转化为脑的壳核中的功能性神经元。在一个方面，本文提供的方法将反应性星形胶质细胞转化为脑的尾状核中的功能性神经元。在一个方面，本文提供的方法将反应性星形胶质细胞转化为脑的黑质中的功能性神经元。
延伸因子1α(EF-1α；也称为eEF1a1)是延伸因子1复合物的α亚基的同种型。该复合物参与将氨酰tRNA酶促递送至核糖体。EF-1α同种型在脑、胎盘、肺、肝、肾和胰腺中表达。
在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的人增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列选自由以下项组成的组：来自EF-1α启动子的黑猩猩增强子序列、来自EF-1α启动子的倭黑猩猩增强子序列、来自EF-1α启动子的红毛猩猩增强子序列、来自EF-1α启动子的大猩猩增强子序列、来自EF-1α启动子的猕猴增强子序列、来自EF-1α启动子的狨猴增强子序列、来自EF-1α启动子的卷尾猴增强子序列、来自EF-1α启动子的狒狒增强子序列、来自EF-1α启动子的长臂猿增强子序列和来自EF-1α启动子的狐猴增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的黑猩猩增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的倭黑猩猩增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的红毛猩猩增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的大猩猩增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的猕猴增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的狨猴增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的卷尾猴增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的狒狒增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的长臂猿增强子序列。在一个方面，来自EF-1α启动子的增强子序列是来自EF-1α启动子的狐猴增强子序列。
在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少80％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少85％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少95％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。在一个方面，来自EF-1α启动子核酸序列的增强子包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。
巨细胞病毒(CMV)是疱疹病毒目(Herpesvirale)中的一个病毒属。
在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的人增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列选自由以下项组成的组：来自CMV的黑猩猩增强子序列、来自CMV的倭黑猩猩增强子序列、来自CMV的红毛猩猩增强子序列、来自CMV的大猩猩增强子序列、来自CMV的猕猴增强子序列、来自CMV的狨猴增强子序列、来自CMV的卷尾猴增强子序列、来自CMV的狒狒增强子序列、来自CMV的长臂猿增强子序列和来自CMV的狐猴增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的黑猩猩增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的倭黑猩猩增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的红毛猩猩增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的大猩猩增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的猕猴增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的狨猴增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的卷尾猴增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的狒狒增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的长臂猿增强子序列。在一个方面，来自CMV的增强子序列是来自CMV的狐猴增强子序列。
在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少70％相同的序列：SEQ IDNO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少80％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少85％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少92％相同的序列：SEQ IDNO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少95％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少98％相同的序列：SEQ IDNO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。在一个方面，来自CMV核酸序列的增强子包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。
在一个方面，增强子选自由来自EF1-α启动子的增强子和CMV增强子组成的组。在一个方面，增强子来自EF1-α启动子。在一个方面，增强子是CMV增强子。
在一个方面，本公开的载体包含嵌合内含子。在一个方面，嵌合内含子由来自人β-球蛋白基因第一内含子的5'-供体位点和来自免疫球蛋白基因重链可变区内含子的分支和3'-受体位点构成。在一个方面，嵌合内含子是在CAG启动子中相似的兔β-球蛋白和鸡β肌动蛋白的嵌合内含子。在一个方面，本公开的载体包含神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)内含子。在一个方面，本公开的载体包含神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)第一内含子。
内含子可分为至少五类，包括：剪接体内含子；转移RNA内含子；I组内含子；II组内含子；和III组内含子。内含子可以通过合成产生自、改变自或源自已知或天然存在的内含子序列或其他内含子序列。内含子还可以包括包含两个或更多个异源序列的组合的嵌合内含子。因此，本申请的内含子可以包括在组成上与已知或本文提供的其他内含子序列相似但不相同的内含子序列的变体。在一个方面，内含子包含至少10个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少50个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少100个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少150个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少200个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少250个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少300个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少350个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少400个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少450个核苷酸。在一个方面，内含子包含至少500个核苷酸。在一个方面，内含子包含介于50个核苷酸与7500个核苷酸之间。在一个方面，内含子包含介于50个核苷酸与5000个核苷酸之间。在一个方面，内含子包含介于50个核苷酸与2500个核苷酸之间。在一个方面，内含子包含介于50个核苷酸与1000个核苷酸之间。在一个方面，内含子包含介于50个核苷酸与500个核苷酸之间。在一个方面，内含子包含介于10个核苷酸与7500个核苷酸之间。在一个方面，内含子包含介于10个核苷酸与5000个核苷酸之间。在一个方面，内含子包含介于10个核苷酸与2500个核苷酸之间。在一个方面，内含子包含介于10个核苷酸与1000个核苷酸之间。在一个方面，内含子包含介于10个核苷酸与500个核苷酸之间。
在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ IDNO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。
在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。在一个方面，嵌合内含子核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。
在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ IDNO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。在一个方面，内含子核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:17，或其互补序列。
土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)是创建增强病毒载体中递送基因的表达的三级结构的DNA序列。
在一个方面，WPRE核酸序列是WPRE的优化版本。
在一个方面，WPRE核酸序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO:7和18。在一个方面，WPRE核酸序列是SEQ ID NO:7。在一个方面，WPRE核酸序列是SEQ ID NO:18。
在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:7，或其互补序列。
在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ ID NO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQ ID NO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ IDNO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ IDNO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ IDNO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ IDNO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ IDNO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQ IDNO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ IDNO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQ IDNO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ IDNO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ IDNO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQID NO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:18，或其互补序列。在一个方面，WPRE核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:18，或其互补序列。
SV40多聚腺苷酸化信号序列(也称为SV40 PolyA；猿猴病毒40PolyA；和PolyA)是可以终止转录并在信使RNA(mRNA)的3'端添加PolyA尾巴的DNA序列。
hGH多聚腺苷酸化信号序列(也称为hGH PolyA)是可以终止转录并在信使RNA(mRNA)的3'端添加PolyA尾巴的DNA序列。
bGH多聚腺苷酸化信号序列(也称为bGH PolyA或bGHpA)是指牛生长激素的Poly A信号或PolyA尾巴。
如本文所用，“PolyA尾巴”是指仅含核碱基腺嘌呤的一段RNA。在一个方面，从本文提供的AAV载体构建体转录的RNA分子包含PolyA尾巴。在一个方面，PolyA尾巴包含至少两个腺嘌呤。在一个方面，PolyA尾巴包含至少十个腺嘌呤。在一个方面，PolyA尾巴包含至少50个腺嘌呤。在一个方面，PolyA尾巴包含至少100个腺嘌呤。在一个方面，PolyA尾巴包含至少150个腺嘌呤。在一个方面，PolyA尾巴包含至少200个腺嘌呤。在一个方面，PolyA尾巴包含至少250个腺嘌呤。在一个方面，PolyA尾巴包含介于50个腺嘌呤与300个腺嘌呤之间。
在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99.8％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。在一个方面，SV40多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。
在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99.13％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。在一个方面，hGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列
在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少70％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少75％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少80％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少85％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少90％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少91％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少92％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少93％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少94％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少95％相同的序列：SEQID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少96％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少97％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少98％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99.5％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99.13％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下至少99.9％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。在一个方面，bGH多聚腺苷酸化信号核酸序列包含与以下100％相同的序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。
在一个方面，本公开的载体包含2A自切割肽序列。在一个方面，本公开的载体包含来自猪捷申病毒-1的2A自切割肽序列。在一个方面，本公开的载体包含核酸序列，其包含SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少70％相同的核酸序列：SEQ IDNO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少75％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少85％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少90％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少91％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少92％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少93％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少94％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少95％相同的核酸序列：SEQ IDNO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少96％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少97％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少98％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下至少99％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。在一个方面，本公开的载体包含与以下100％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3。
如本文所用，术语“中枢神经系统”或“CNS”是指双侧对称动物的脑和脊髓。CNS还包括视网膜、视神经、嗅觉神经和嗅觉上皮细胞。
如本文所用，术语“周围神经系统”或“PNS”是指脑和脊髓之外的神经和神经节，不包括视网膜、视神经、嗅觉神经和嗅觉上皮细胞。在一个方面，周围神经系统分为躯体神经系统和自主神经系统。
如本文所用，术语“躯体神经系统”是指与身体运动的自主控制相关的PNS部分。
如本文所用，术语“自主神经系统”是指调节内部器官功能的PNS部分
如本文所用，术语“GFAP阳性”是指具有可使用本领域标准技术检测的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的蛋白质积累或可使用本领域标准技术检测的GFAP mRNA表达积累的细胞。在一个方面，神经胶质细胞是GFAP阳性的。
如本文所用，术语“可检测的”是指可识别的蛋白质或mRNA积累。
可以使用抗体鉴定蛋白质积累。测量蛋白质积累的非限制性示例包括Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀和免疫荧光。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以使用本领域熟知的方法生成本文提供的对蛋白质具有特异性结合亲和力的抗体。可以使用本领域已知的方法将本文提供的抗体连接至固体支持物(诸如微量滴定板)。
如本文所用，术语“感染复数”和“MOI”是指在感染期间每个细胞添加的病毒体数量。
如本文所用，术语“病毒体”指宿主细胞外的病毒感染形式。
如本文所用，术语“神经系统病症”是指中枢神经系统或周围神经系统中的病症、病、病患、损伤或疾病。神经系统病症的非限制性示例可以在Neurological Disorders:course and treatment,第2版(2002)(Academic Press Inc.)和Christopher Goetz,Textbook of Clinical Neurology,第3版(2007)(Saunders)中找到。
如本文所用，术语“损伤”是指对中枢神经系统或周围神经系统的损伤。
在一个方面，神经系统病症选自由以下项组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病、癫痫、物理性损伤、卒中、脑动脉瘤、外伤性脑损伤、脑震荡、肿瘤、炎症、感染、共济失调、脑萎缩、脊髓萎缩、多发性硬化症、外伤性脊髓损伤、缺血性或出血性脊髓病(脊髓病)、全脑缺血、缺氧缺血性脑病、栓塞、纤维软骨栓塞性脊髓病、血栓形成、肾病、慢性炎性疾病、脑膜炎、和脑静脉窦血栓形成。在一个方面，神经系统病症是阿尔茨海默病。在一个方面，神经系统病症是帕金森病。在一个方面，神经系统病症是ALS。在一个方面，神经系统病症是亨廷顿病。在一个方面，神经系统病症是癫痫。在一个方面，神经系统病症是物理性损伤。在一个方面，神经系统病症是卒中。在一个方面，神经系统病症是缺血性卒中。在一个方面，神经系统病症是出血性卒中。在一个方面，神经系统病症是脑动脉瘤。在一个方面，神经系统病症是外伤性脑损伤。在一个方面，神经系统病症是脑震荡。在一个方面，神经系统病症是肿瘤。在一个方面，神经系统病症是炎症。在一个方面，神经系统病症是感染。在一个方面，神经系统病症是共济失调。在一个方面，神经系统病症是脑萎缩。在一个方面，神经系统病症是脊髓萎缩。在一个方面，神经系统病症是多发性硬化症。在一个方面，神经系统病症是外伤性脊髓损伤。在一个方面，神经系统病症是缺血性或出血性脊髓病(脊髓病)。在一个方面，神经系统病症是全脑缺血。在一个方面，神经系统病症是缺氧缺血性脑病。在一个方面，神经系统病症是栓塞。在一个方面，神经系统病症是纤维软骨栓塞性脊髓病。在一个方面，神经系统病症是血栓形成。在一个方面，神经系统病症是肾病。在一个方面，神经系统病症是慢性炎性疾病。在一个方面，神经系统病症是脑膜炎。在一个方面，神经系统病症是脑静脉窦血栓形成。
在一个方面，神经系统病症包括对CNS或PNS的损伤。在一个方面，神经系统病症包括对CNS的损伤。在一个方面，神经系统病症包括对PNS的损伤。
在一个方面，本公开提供并包括一种将活人脑的脑中的反应性星形胶质细胞转化为功能性神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)注射到有此需要的受试者中，其中该AAV包含DNA载体构建体，该DNA载体构建体包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，该hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中该序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ IDNO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ IDNO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种将活人脑中的反应性星形胶质细胞转化为功能性神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)注射到有此需要的受试者中，其中该AAV包含DNA载体构建体，该DNA载体构建体包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸编码序列，该hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中该编码序列可操作地连接到表达控制元件，该表达控制元件包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；(d)包含选自由SEQID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
在一个方面，本公开提供并包括一种将有此需要的受试者的神经胶质细胞转化为神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)递送至有此需要的受试者，其中AAV包含DNA载体构建体，DNA载体构建体包含神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，该序列可操作地连接到表达控制元件，该表达控制元件包含：(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)增强子；(c)嵌合内含子；(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)多聚腺苷酸化信号序列，其中该AAV载体能够将有此需要的受试者的至少一种神经胶质细胞转化为神经元。
在一个方面，本公开提供并包括一种治疗有此需要的受试者的神经系统病症的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)递送至受试者，其中给予有此需要的受试者的AAV包含DNA载体构建体，该DNA载体构建体包含可操作地连接到表达控制元件的神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，该表达控制元件包含：(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；(b)增强子；(c)嵌合内含子；(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和(e)多聚腺苷酸化信号。
在一个方面，本文提供的方法能够将至少一种神经胶质细胞转化为神经元。在一个方面，本文提供的方法将至少一种神经胶质细胞转化为神经元。
无远端同源框2(Dlx2；也称为TES1)是Dlx基因家族的成员，并且是含有在前脑和颅面发育中起作用的基因的同源框。
Achaete-scute家族BHLH转录因子1(Ascl1；也称为ASH1、HASH1、MASH-1和bHLHa46)编码转录因子基本螺旋-环-螺旋家族的成员，并且是在神经元承诺和分化中起作用的基因。
胰岛素基因增强子蛋白(ISL1；也称为ISL LIM同源框1和ISLET1)是一种编码转录因子的基因，该转录因子含有两个N末端LIM结构域和一个C末端同源结构域。编码的蛋白质在朗格汉斯胰岛的胚胎发生中起作用。
LIM-同源框3(LHX3；也称为LIM3和CPHD3)基因编码来自具有独特的富含半胱氨酸的锌结合结构域(LIM结构域)的蛋白质家族的蛋白质。
在一个方面，本文提供的方法使用根据本公开的包含NeuroD1编码序列的AAV载体。在一个方面，本文提供的方法使用包含NeuroD1编码序列的AAV载体与包含第二转录因子编码序列的第二AAV载体的组合。在一个方面，本文提供的方法使用包含NeuroD1编码序列和第二转录因子编码序列的AAV载体。在一个方面，第二转录因子选自由Dlx2、Ascl1、ISL1和LHX3组成的组。在一个方面，第二转录因子是Dlx2。在一个方面，第二转录因子是Ascl1。在一个方面，第二转录因子是ISL1。在一个方面，第二转录因子是LHX3。在一个方面，本文提供的方法使用包含NeuroD1编码序列和第二NeuroD1编码序列的AAV载体。在一个方面，本文提供的方法使用包含NeuroD1编码序列的AAV载体与包含NeuroD1编码序列的第二AAV载体的组合。
在一个方面，通过评估NeuN、双皮质素(DCX)、β3-微管蛋白、(神经丝200)NF-200、(微管相关蛋白2)MAP2、离子钙结合衔接分子(Iba1)的转录水平和蛋白质水平来测量本文提供的AAV载体的功能性。
如本文所用，术语“NeuN”或“Fox-3”或“Rbfox2”或“六核糖核苷酸结合蛋白-3”是指与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的性别决定基因的蛋白质产物同源的蛋白质，并且是神经元核抗原。
如本文所用，术语“DCX”或“doubling”或“lissencephalin-X”是指由胚胎和成人皮层结构中的神经元前体细胞和未成熟神经元表达的微管相关蛋白。
如本文所用，术语“β3-微管蛋白”或“III类β-微管蛋白”或“β-微管蛋白III”是指在神经元中发现的微管蛋白家族的微管元件。
如本文所用，术语“NF-200”是指一类蛋白质，其是在神经元细胞质中发现的IV型中间丝状蛋白。
如本文所用，术语“MAP2”是指属于微管相关蛋白家族并且在神经元发育期间在确定和稳定神经元形态中起作用的蛋白质。
如本文所用，术语“Iba1”是指小胶质细胞巨噬细胞特异性钙结合蛋白。
在一个方面，本文提供的组合物能够将至少一种神经胶质细胞转化为神经元。在一个方面，本文提供的组合物将至少一种神经胶质细胞转化为神经元
如本文所用，术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物纲的任何物种。
如本文所用，术语“人”是指智人(Homo sapiens)。在一个方面，人患有神经病症。
如本文所用，术语“活人”是指具有心脏、呼吸和脑活动的人。
如本文所用，术语“非人灵长类动物”是指分类为灵长目但不是智人的任何物种或亚种。非人灵长类动物的非限制性示例包括黑猩猩、倭黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩、猕猴、狨猴、卷尾猴、狒狒、长臂猿和狐猴。
如本文所用，术语“递送(delivering)”或“递送(delivery)”是指用本文提供的AAV载体或组合物治疗哺乳动物。在一个方面，将本文提供的AAV载体或组合物递送给有此需要的受试者。在一个方面，配制本文提供的AAV载体或组合物以递送给有此需要的受试者。在一个方面，递送包括局部递送。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物被配制用于局部递送。在一个方面，递送包括全身递送。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物被配制用于全身递送。在一个方面，递送包括将本文提供的AAV载体或组合物注射到有此需要的受试者中。在一个方面，递送选自由以下项组成的组：腹膜内、肌肉内、静脉内、鞘内、大脑内、颅内、脑的侧脑室内、小脑延髓池内、玻璃体内、视网膜下内、实质内、鼻内或口服施用。在一个方面，递送包括腹膜内递送。在一个方面，递送包括肌肉内递送。在一个方面，递送包括静脉内递送。在一个方面，递送包括鞘内递送。在一个方面，递送包括大脑内递送。在一个方面，递送包括颅内递送。在一个方面，递送包括脑的侧脑室内递送。在一个方面，递送包括小脑延髓池内递送。在一个方面，递送包括玻璃体内递送。在一个方面，递送包括视网膜下内递送。在一个方面，递送包括实质内递送。在一个方面，递送包括鼻内递送。在一个方面，递送包括口服施用。
如本文所用，术语“注射”是指在压力和用力下递送本文提供的AAV载体或组合物。作为非限制性示例，注射可包括使用注射器和针头。
在一个方面，将本文提供的AAV载体或组合物注射到受试者脑中。在一个方面，将AAV载体或组合物注射到受试者的大脑皮层中。在一个方面，将本文提供的AAV载体或组合物注射到脊髓或受试者中。在一个方面，将AAV载体或组合物注射到受试者的纹状体中。在一个方面，将AAV载体或组合物注射到受试者的背侧纹状体中。在一个方面，将AAV载体或组合物注射到受试者的壳核中。在一个方面，将AAV载体或组合物注射到受试者的尾状核中。在一个方面，将AAV载体或组合物注射到受试者的黑质中。
在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在脑中扩散介于约1％与约100％之间。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在脑中扩散介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间。
在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在大脑皮层中扩散介于约1％与约100％之间。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在大脑皮层中扩散介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间。
在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在脊髓中扩散介于约1％与约100％之间。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在脊髓中扩散介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间。
在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在纹状体中扩散介于约1％与约100％之间。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在纹状体中扩散介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间。
在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在背侧纹状体中扩散介于约1％与约100％之间。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在背侧纹状体中扩散介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间。
在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在壳核中扩散介于约1％与约100％之间。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在壳核中扩散介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间。
在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在尾状核中扩散介于约1％与约100％之间。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在尾状核中扩散介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间。
在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物从注射部位扩散介于约1％与约100％之间。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物从注射部位扩散介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间。
在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在黑质中扩散介于约1％与约100％之间。在一个方面，本文提供的AAV载体或组合物已在壳核中扩散介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间。
如本文所使用的，术语“AAV颗粒”是指将其核酸基因组传递到细胞的AAV病毒的包装衣壳形式。
在一个方面，包含由本文提供的AAV载体编码的AAV颗粒的组合物以介于1010个AAV颗粒/mL与1014个AAV颗粒/mL之间的浓度注射。在一个方面，包含由本文提供的AAV载体编码的AAV颗粒的组合物以介于1010个AAV颗粒/mL与1011个AAV颗粒/mL之间、介于1010个AAV颗粒/mL与1012个AAV颗粒/mL之间、介于1010个AAV颗粒/mL与1013个AAV颗粒/mL之间、介于1011个AAV颗粒/mL与1012个AAV颗粒/mL之间、介于1011个AAV颗粒/mL与1013个AAV颗粒/mL之间、介于1011个AAV颗粒/mL与1014个AAV颗粒/mL之间、介于1012个AAV颗粒/mL与1013个AAV颗粒/mL之间、介于1012个AAV颗粒/mL与1014个AAV颗粒/mL之间或介于1013个AAV颗粒/mL与1014个AAV颗粒/mL之间的浓度注射。
在一个方面，包含由本文提供的AAV载体编码的AAV颗粒的组合物以介于10μl与1000μl之间的体积注射。在一个方面，包含由本文提供的AAV载体编码的AAV颗粒的组合物以介于10μl与100μl之间、介于10μl与200μl之间、介于10μl与300μl之间、介于100μl与200μl之间、介于100μl与300μl之间、介于100μl与400μl之间、介于200μl与300μl之间、介于200μl与400μl之间、介于200μl与500μl之间、介于300μl与400μl之间、介于300μl与500μl之间、介于300μl与600μl之间、介于400μl与500μl之间、介于400μl与600μl之间、介于400μl与700μl之间、介于500μl与600μl之间、介于500μl与700μl之间、介于500μl与800μl之间、介于600μl与700μl之间、介于600μl与800μl之间、介于600μl与900μl之间、介于700μl与800μl之间、介于700μl与900μl之间、介于700μl与1000μl之间、介于800μl与900μl之间、介于800μl与1000μl之间或介于900μl与1000μl之间的体积注射。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物受试者。动物受试者的非限制性示例包括人、实验动物(例如，非人灵长类动物、大鼠、小鼠)、家畜(例如，牛、绵羊、山羊、猪、火鸡、鸡)和家庭宠物(例如，狗、猫、啮齿动物等)。
如本文所用，“有此需要的受试者”是指患有神经系统病症的受试者。在一个方面，有此需要的受试者患有选自由以下项组成的组的神经系统病症：阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病、癫痫、物理性损伤、卒中、脑动脉瘤、外伤性脑损伤、脑震荡、肿瘤、炎症、感染、共济失调、脑萎缩、脊髓萎缩、多发性硬化症、外伤性脊髓损伤、缺血性或出血性脊髓病(脊髓病)、全脑缺血、缺氧缺血性脑病、栓塞、纤维软骨栓塞性脊髓病、血栓形成、肾病、慢性炎性疾病、脑膜炎、和脑静脉窦血栓形成。在一个方面，有此需要的受试者患有阿尔茨海默病。在一个方面，有此需要的受试者患有帕金森病。在一个方面，有此需要的受试者患有ALS。在一个方面，有此需要的受试者患有亨廷顿病。在一个方面，有此需要的受试者患有癫痫。在一个方面，有此需要的受试者患有物理性损伤。在一个方面，有此需要的受试者患有卒中。在一个方面，有此需要的受试者患有缺血性卒中。在一个方面，有此需要的受试者患有出血性卒中。在一个方面，有此需要的受试者患有脑动脉瘤。在一个方面，有此需要的受试者患有外伤性脑损伤。在一个方面，有此需要的受试者患有脑震荡。在一个方面，有此需要的受试者患有肿瘤。在一个方面，有此需要的受试者患有炎症。在一个方面，有此需要的受试者患有感染。在一个方面，有此需要的受试者患有共济失调。在一个方面，有此需要的受试者患有脑萎缩。在一个方面，有此需要的受试者患有脊髓萎缩。在一个方面，有此需要的受试者患有多发性硬化症。在一个方面，有此需要的受试者患有外伤性脊髓损伤。在一个方面，有此需要的受试者患有缺血性或出血性脊髓病(脊髓病)。在一个方面，有此需要的受试者患有全脑缺血。在一个方面，有此需要的受试者患有缺氧缺血性脑病。在一个方面，有此需要的受试者患有栓塞。在一个方面，有此需要的受试者患有纤维软骨栓塞性脊髓病。在一个方面，有此需要的受试者患有血栓形成。在一个方面，有此需要的受试者患有肾病。在一个方面，有此需要的受试者患有慢性炎性疾病。在一个方面，有此需要的受试者患有脑膜炎。在一个方面，有此需要的受试者患有脑静脉窦血栓形成。
在一个方面，有此需要的受试者是哺乳动物。在一个方面，有此需要的受试者是人。在一个方面，有此需要的受试者是非人灵长类动物。在一个方面，有此需要的受试者选自由黑猩猩、倭黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩、猕猴、狨猴、卷尾猴、狒狒、长臂猿和狐猴组成的组。在一个方面，有此需要的受试者是黑猩猩。在一个方面，有此需要的受试者是倭黑猩猩。在一个方面，有此需要的受试者是猩猩。在一个方面，有此需要的受试者是大猩猩。在一个方面，有此需要的受试者是猕猴。在一个方面，有此需要的受试者是狨猴。在一个方面，有此需要的受试者是卷尾猴。在一个方面，有此需要的受试者是狒狒。在一个方面，有此需要的受试者是长臂猿。在一个方面，有此需要的受试者是狐猴。
在一个方面，有此需要的受试者是男性。在一个方面，有此需要的受试者是女性。在一个方面，有此需要的受试者是中性。在一个方面，有此需要的受试者是早产儿。在一个方面，早产儿在妊娠36周之前出生。在一个方面，有此需要的受试者是足月儿。在一个方面，足月儿小于约2月龄。在一个方面，有此需要的受试者是新生儿。在一个方面，新生儿小于约1月龄。在一个方面，有此需要的受试者是婴儿。在一个方面，婴儿介于2月龄与24月龄之间。在一个方面，婴儿介于2月龄与3月龄之间、介于2月龄与4月龄之间、介于2月龄与5月龄之间、介于3月龄与4月龄之间、介于3月龄与5月龄之间、介于3月龄与6月龄之间、介于4月龄与5月龄之间、介于4月龄与6月龄之间、介于4月龄与7月龄之间、介于5月龄与6月龄之间、介于5月龄与7月龄之间、介于5月龄与8月龄之间、介于6月龄与7月龄之间、介于6月龄与8月龄之间、介于6月龄与9月龄之间、介于7月龄与8月龄之间、介于7月龄与9月龄之间、介于7月龄与10月龄之间、介于8月龄与9月龄之间、介于8月龄与10月龄之间、介于8月龄与11月龄之间、介于9月龄与10月龄之间、介于9月龄与11月龄之间、介于9月龄与12月龄之间、介于10月龄与11月龄之间、介于10月龄与12月龄之间、介于10月龄与13月龄之间、介于11月龄与12月龄之间、介于11月龄与13月龄之间、介于11月龄与14月龄之间、介于12月龄与13月龄之间、介于12月龄与14月龄之间、介于12月龄与15月龄之间、介于13月龄与14月龄之间、介于13月龄与15月龄之间、介于13月龄与16月龄之间、介于14月龄与15月龄之间、介于14月龄与16月龄之间、介于14月龄与17月龄之间、介于15月龄与16月龄之间、介于15月龄与17月龄之间、介于15月龄与18月龄之间、介于16月龄与17月龄之间、介于16月龄与18月龄之间、介于16月龄与19月龄之间、介于17月龄与18月龄之间、介于17月龄与19月龄之间、介于17月龄与20月龄之间、介于18月龄与19月龄之间、介于18月龄与20月龄之间、介于18月龄与21月龄之间、介于19月龄与20月龄之间、介于19月龄与21月龄之间、介于19月龄与22月龄之间、介于20月龄与21月龄之间、介于20月龄与22月龄之间、介于20月龄与23月龄之间、介于21月龄与22月龄之间、介于21月龄与23月龄之间、介于21月龄与24月龄之间、介于22月龄与23月龄之间、介于22月龄与24月龄之间和介于23月龄与24月龄之间。在一个方面，有此需要的受试者是幼儿。在一个方面，幼儿介于1岁与4岁之间。在一个方面，幼儿介于1岁与2岁之间、介于1岁与3岁之间、介于1岁与4岁之间、介于2岁与3岁之间、介于2岁与4岁之间和介于3岁与4岁之间。在一个方面，有此需要的受试者是小儿。在一个方面，小儿介于2岁与5岁之间。在一个方面，小儿介于2岁与3岁之间、介于2岁与4岁之间、介于2岁与5岁之间、介于3岁与4岁之间、介于3岁与5岁之间和介于4岁与5岁之间。在一个方面，有此需要的受试者是儿童。在一个方面，儿童介于6岁与12岁之间。在一个方面，儿童介于6岁与7岁之间、介于6岁与8岁之间、介于6岁与9岁之间、介于7岁与8岁之间、介于7岁与9岁之间、介于7岁与10岁之间、介于8岁与9岁之间、介于8岁与10岁之间、介于8岁与11岁之间、介于9岁与10岁之间、介于9岁与11岁之间、介于9岁与12岁之间、介于10岁与11岁之间、介于10岁与12岁之间和介于11岁与12岁之间。在一个方面，有此需要的受试者是青少年。在一个方面，青少年介于13岁与19岁之间。在一个方面，青少年介于13岁与14岁之间、介于13岁与15岁之间、介于13岁与16岁之间、介于14岁与15岁之间、介于14岁与16岁之间、介于14岁与17岁之间、介于15岁与16岁之间、介于15岁与17岁之间、介于15岁与18岁之间、介于16岁与17岁之间、介于16岁与18岁之间、介于16岁与19岁之间、介于17岁与18岁之间、介于17岁与19岁之间和介于18岁与19岁之间。在一个方面，有此需要的受试者是儿科受试者。在一个方面，儿科受试者介于1天龄与18岁之间。在一个方面，儿科受试者介于1天龄与1岁之间、介于1天龄与2岁之间、介于1天龄与3岁之间、介于1岁与2岁之间、介于1岁与3岁之间、介于1岁与4岁之间、介于2岁与3岁之间、介于2岁与4岁之间、介于2岁与5岁之间、介于3岁与4岁之间、介于3岁与5岁之间、介于3岁与6岁之间、介于4岁与5岁之间、介于4岁与6岁之间、介于4岁与7岁之间、介于5岁与6岁之间、介于5岁与7岁之间、介于5岁与8岁之间、介于6岁与7岁之间、介于6岁与8岁之间、介于6岁与9岁之间、介于7岁与8岁之间、介于7岁与9岁之间、介于7岁与10岁之间、介于8岁与9岁之间、介于8岁与10岁之间、介于8岁与11岁之间、介于9岁与10岁之间、介于9岁与11岁之间、介于9岁与12岁之间、介于10岁与11岁之间、介于10岁与12岁之间、介于10岁与13岁之间、介于11岁与12岁之间、介于11岁与13岁之间、介于11岁与14岁之间、介于12岁与13岁之间、介于12岁与14岁之间、介于12岁与15岁之间、介于13岁与14岁之间、介于13岁与15岁之间、介于13岁与16岁之间、介于14岁与15岁之间、介于14岁与16岁之间、介于14岁与17岁之间、介于15岁与16岁之间、介于15岁与17岁之间、介于15岁与18岁之间、介于16岁与17岁之间、介于16岁与18岁之间和介于17岁与18岁之间。在一个方面，有此需要的受试者是老年受试者。在一个方面，老年受试者介于65岁与95岁或更高之间。在一个方面，老年受试者介于65岁与70岁之间、介于65岁与75岁之间、介于65岁与80岁之间、介于70岁与75岁之间、介于70岁与80岁之间、介于70岁与85岁之间、介于75岁与80岁之间、介于75岁与85岁之间、介于75岁与90岁之间、介于80岁与85岁之间、介于80岁与90岁之间、介于80岁与95岁之间、介于85岁与90岁之间和介于85岁与95岁之间。在一个方面，有此需要的受试者是成年受试者。在一个方面，成年受试者介于20岁与95岁或更高之间。在一个方面，成年受试者介于20岁与25岁之间、介于20岁与30岁之间、介于20岁与35岁之间、介于25岁与30岁之间、介于25岁与35岁之间、介于25岁与40岁之间、介于30岁与35岁之间、介于30岁与40岁之间、介于30岁与45岁之间、介于35岁与40岁之间、介于35岁与45岁之间、介于35岁与50岁之间、介于40岁与45岁之间、介于40岁与50岁之间、介于40岁与55岁之间、介于45岁与50岁之间、介于45岁与55岁之间、介于45岁与60岁之间、介于50岁与55岁之间、介于50岁与60岁之间、介于50岁与65岁之间、介于55岁与60岁之间、介于55岁与65岁之间、介于55岁与70岁之间、介于60岁与65岁之间、介于60岁与70岁之间、介于60岁与75岁之间、介于65岁与70岁之间、介于65岁与75岁之间、介于65岁与80岁之间、介于70岁与75岁之间、介于70岁与80岁之间、介于70岁与85岁之间、介于75岁与80岁之间、介于75岁与85岁之间、介于75岁与90岁之间、介于80岁与85岁之间、介于80岁与90岁之间、介于80岁与95岁之间、介于85岁与90岁之间和介于85岁与95岁之间。在一个方面，有此需要的受试者介于1岁与5岁之间、介于2岁与10岁之间、介于3岁与18岁之间、介于21岁与50岁之间、介于21岁与40岁之间、介于21岁与30岁之间、介于50岁与90岁之间、介于60岁与90岁之间、介于70岁与90岁之间、介于60岁与80岁之间、或介于65岁与75岁之间。在一个方面，有此需要的受试者是年轻老年受试者(65至74岁)。在一个方面，有此需要的受试者是中间老年受试者(75至84岁)。在一个方面，有此需要的受试者是老年受试者(>85岁)。
如本文所用，术语“流速”是指AAV载体或组合物的递送速率。在一个方面，流速介于0.1μL/分钟与5.0μL/分钟之间。在一个方面，流速介于0.1μL/分钟与0.2μL/分钟之间、介于0.1μL/分钟与0.3μL/分钟之间、介于0.1μL/分钟与0.4μL/分钟之间、介于0.2μL/分钟与0.3μL/分钟之间、介于0.2μL/分钟与0.4μL/分钟之间、介于0.2μL/分钟与0.5μL/分钟之间、介于0.3μL/分钟与0.4μL/分钟之间、介于0.3μL/分钟与0.5μL/分钟之间、介于0.3μL/分钟与0.6μL/分钟之间、介于0.4μL/分钟与0.5μL/分钟之间、介于0.4μL/分钟与0.6μL/分钟之间、介于0.4μL/分钟与0.7μL/分钟之间、介于0.5μL/分钟与0.6μL/分钟之间、介于0.5μL/分钟与0.7μL/分钟之间、介于0.5μL/分钟与0.8μL/分钟之间、介于0.6μL/分钟与0.7μL/分钟之间、介于0.6μL/分钟与0.8μL/分钟之间、介于0.6μL/分钟与0.9μL/分钟之间、介于0.7μL/分钟与0.8μL/分钟之间、介于0.7μL/分钟与0.9μL/分钟之间、介于0.7μL/分钟与1.0μL/分钟之间、介于0.8μL/分钟与0.9μL/分钟之间、介于0.8μL/分钟与1.0μL/分钟之间、介于0.8μL/分钟与1.1μL/分钟之间、介于0.9μL/分钟与1.0μL/分钟之间、介于0.9μL/分钟与1.1μL/分钟之间、介于0.9μL/分钟与1.2μL/分钟之间、介于1.0μL/分钟与1.1μL/分钟之间、介于1.0μL/分钟与1.2μL/分钟之间、介于1.0μL/分钟与1.3μL/分钟之间、介于1.1μL/分钟与1.2μL/分钟之间、介于1.1μL/分钟与1.3μL/分钟之间、介于1.1μL/分钟与1.4μL/分钟之间、介于1.2μL/分钟与1.3μL/分钟之间、介于1.2μL/分钟与1.4μL/分钟之间、介于1.2μL/分钟与1.5μL/分钟之间、介于1.3μL/分钟与1.4μL/分钟之间、介于1.3μL/分钟与1.5μL/分钟之间、介于1.3μL/分钟与1.6μL/分钟之间、介于1.4μL/分钟与1.5μL/分钟之间、介于1.4μL/分钟与1.6μL/分钟之间、介于1.4μL/分钟与1.7μL/分钟之间、介于1.5μL/分钟与1.6μL/分钟之间、介于1.5μL/分钟与1.7μL/分钟之间、介于1.5μL/分钟与1.8μL/分钟之间、介于1.6μL/分钟与1.7μL/分钟之间、介于1.6μL/分钟与1.8μL/分钟之间、介于1.6μL/分钟与1.9μL/分钟之间、介于1.7μL/分钟与1.8μL/分钟之间、介于1.7μL/分钟与1.9μL/分钟之间、介于1.7μL/分钟与2.0μL/分钟之间、介于1.8μL/分钟与1.9μL/分钟之间、介于1.8μL/分钟与2.0μL/分钟之间、介于1.8μL/分钟与2.1μL/分钟之间、介于1.9μL/分钟与2.0μL/分钟之间、介于1.9μL/分钟与2.1μL/分钟之间、介于1.9μL/分钟与2.2μL/分钟之间、介于2.0μL/分钟与2.1μL/分钟之间、介于2.0μL/分钟与2.2μL/分钟之间、介于2.0μL/分钟与2.3μL/分钟之间、介于2.1μL/分钟与2.2μL/分钟之间、介于2.1μL/分钟与2.3μL/分钟之间、介于2.1μL/分钟与2.4μL/分钟之间、介于2.2μL/分钟与2.3μL/分钟之间、介于2.2μL/分钟与2.4μL/分钟之间、介于2.2μL/分钟与2.5μL/分钟之间、介于2.3μL/分钟与2.4μL/分钟之间、介于2.3μL/分钟与2.5μL/分钟之间、介于2.3μL/分钟与2.6μL/分钟之间、介于2.4μL/分钟与2.5μL/分钟之间、介于2.4μL/分钟与2.6μL/分钟之间、介于2.4μL/分钟与2.7μL/分钟之间、介于2.5μL/分钟与2.6μL/分钟之间、介于2.5μL/分钟与2.7μL/分钟之间、介于2.5μL/分钟与2.8μL/分钟之间、介于2.6μL/分钟与2.7μL/分钟之间、介于2.6μL/分钟与2.8μL/分钟之间、介于2.6μL/分钟与2.9μL/分钟之间、介于2.7μL/分钟与2.8μL/分钟之间、介于2.7μL/分钟与2.9μL/分钟之间、介于2.7μL/分钟与3.0μL/分钟之间、介于2.8μL/分钟与2.9μL/分钟之间、介于2.8μL/分钟与3.0μL/分钟之间、介于2.8μL/分钟与3.1μL/分钟之间、介于2.9μL/分钟与3.0μL/分钟之间、介于2.9μL/分钟与3.1μL/分钟之间、介于2.9μL/分钟与3.2μL/分钟之间、介于3.0μL/分钟与3.1μL/分钟之间、介于3.0μL/分钟与3.2μL/分钟之间、介于3.0μL/分钟与3.3μL/分钟之间、介于3.1μL/分钟与3.2μL/分钟之间、介于3.1μL/分钟与3.3μL/分钟之间、介于3.1μL/分钟与3.4μL/分钟之间、介于3.2μL/分钟与3.3μL/分钟之间、介于3.2μL/分钟与3.4μL/分钟之间、介于3.2μL/分钟与3.5μL/分钟之间、介于3.3μL/分钟与3.4μL/分钟之间、介于3.3μL/分钟与3.5μL/分钟之间、介于3.3μL/分钟与3.6μL/分钟之间、介于3.4μL/分钟与3.5μL/分钟之间、介于3.4μL/分钟与3.6μL/分钟之间、介于3.4μL/分钟与3.7μL/分钟之间、介于3.5μL/分钟与3.6μL/分钟之间、介于3.5μL/分钟与3.7μL/分钟之间、介于3.5μL/分钟与3.8μL/分钟之间、介于3.6μL/分钟与3.7μL/分钟之间、介于3.6μL/分钟与3.8μL/分钟之间、介于3.6μL/分钟与3.9μL/分钟之间、介于3.7μL/分钟与3.8μL/分钟之间、介于3.7μL/分钟与3.9μL/分钟之间、介于3.7μL/分钟与4.0μL/分钟之间、介于3.8μL/分钟与3.9μL/分钟之间、介于3.8μL/分钟与4.0μL/分钟之间、介于3.8μL/分钟与4.1μL/分钟之间、介于3.9μL/分钟与4.0μL/分钟之间、介于3.9μL/分钟与4.1μL/分钟之间、介于3.9μL/分钟与4.2μL/分钟之间、介于4.0μL/分钟与4.1μL/分钟之间、介于4.0μL/分钟与4.2μL/分钟之间、介于4.0μL/分钟与4.3μL/分钟之间、介于4.1μL/分钟与4.2μL/分钟之间、介于4.1μL/分钟与4.3μL/分钟之间、介于4.1μL/分钟与4.4μL/分钟之间、介于4.2μL/分钟与4.3μL/分钟之间、介于4.2μL/分钟与4.4μL/分钟之间、介于4.2μL/分钟与4.5μL/分钟之间、介于4.3μL/分钟与4.4μL/分钟之间、介于4.3μL/分钟与4.5μL/分钟之间、介于4.3μL/分钟与4.6μL/分钟之间、介于4.4μL/分钟与4.5μL/分钟之间、介于4.4μL/分钟与4.6μL/分钟之间、介于4.4μL/分钟与4.7μL/分钟之间、介于4.5μL/分钟与4.6μL/分钟之间、介于4.5μL/分钟与4.7μL/分钟之间、介于4.5μL/分钟与4.8μL/分钟之间、介于4.6μL/分钟与4.7μL/分钟之间、介于4.6μL/分钟与4.8μL/分钟之间、介于4.6μL/分钟与4.9μL/分钟之间、介于4.7μL/分钟与4.8μL/分钟之间、介于4.7μL/分钟与4.9μL/分钟之间、介于4.7μL/分钟与5.0μL/分钟之间、介于4.8μL/分钟与4.9μL/分钟之间、介于4.8μL/分钟与5.0μL/分钟之间或介于4.9μL/分钟与5.0μL/分钟之间。
如本文所用，术语“治疗有效剂量”或“药物活性剂量”是指有效治疗神经系统病症的本文提供的AAV颗粒或组合物的量。在一个方面，本文提供的AAV颗粒或组合物可以与药学上可接受的载体一起提供。如本文所用，“药学上可接受的载体”是指与本文提供的AAV颗粒或组合物混合的无毒溶剂、分散剂、赋形剂、佐剂或其他材料。
药学上可接受的载体的非限制性示例包括液体(例如，盐水)、凝胶、纳米颗粒、外来体、脂质囊泡或固体形式的稀释剂、佐剂、赋形剂或耐酸包封成分。合适的稀释剂和赋形剂的非限制性示例包括药物级的生理盐水、葡萄糖、甘油、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等，及其组合。在一个方面，治疗有效剂量含有辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂。在一个方面，将治疗有效剂量的本文提供的AAV颗粒或组合物注射至受试者。在一个方面，将治疗有效剂量的本文提供的AAV颗粒或组合物递送至受试者。在一个方面，治疗有效剂量与至少一种药学上可接受的载体一起施用。在一个方面，治疗有效剂量含有介于约1％与约5％之间、介于约5％与约10％之间、介于约10％与约15％之间、介于约15％与约20％之间、介于约20％与约25％之间、介于约25％与约30％之间、介于约30％与约35％之间、介于约40与约45％之间、介于约50％与约55％之间、介于约1％与约95％之间、介于约2％与约95％之间、介于约5％与约95％之间、介于约10％与约95％之间、介于约15％与约95％之间、介于约20％与约95％之间、介于约25％与约95％之间、介于约30％与约95％之间、介于约35％与约95％之间、介于约40％与约95％之间、介于约45％与约95％之间、介于约50％与约95％之间、介于约55％与约95％之间、介于约60％与约95％之间、介于约65％与约95％之间、介于约70％与约95％之间、介于约45％与约95％之间、介于约80％与约95％之间或介于约85％与约95％之间的本文提供的AAV颗粒或组合物。
在一个方面，至少每天一次或至少每周一次将治疗有效剂量递送至有此需要的受试者，持续至少两个连续日或周。在一个方面，至少每天一次或至少每周一次将治疗有效剂量递送至有此需要的受试者，持续至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续日或周。在一个方面，至少每天一次或至少每周一次将治疗有效剂量递送至有此需要的受试者，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续周。在一个方面，至少每天一次或至少每周一次将治疗有效剂量递送至有此需要的受试者，持续至多4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续日或周。在一个方面，至少每天一次或至少每周一次将治疗有效剂量递送至有此需要的受试者，持续至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续周或月。在一个方面，将治疗有效剂量递送至有此需要的受试者，至少施用一次，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续月或年，长期地持续受试者的整个生命周期，或无限期的时间段。在一个方面，每年一次将治疗有效剂量递送至有此需要的受试者，持续连续2年、连续3年或连续5年。在一个方面，每年一次将治疗有效剂量递送至有此需要的受试者，持续连续2年。在一个方面，每年一次将治疗有效剂量递送至有此需要的受试者，持续连续3年。在一个方面，每年一次将治疗有效剂量递送至有此需要的受试者，持续连续5年。
如本文所用，术语“缓解”、“治愈”或“消退率”是指有此需要的受试者响应于治疗有效剂量而被治愈神经系统病症或获得神经系统病症的缓解或完全消退的百分比。
如本文所用，术语“响应率”是指有此需要的受试者积极响应(例如，一种或多种症状的严重程度或频率降低)治疗有效剂量的百分比。
在一个方面，治疗有效剂量实现了至少约50％的神经系统病症的缓解、治愈、响应率或消退率。在一个方面，治疗有效剂量消除、减少、减缓或延迟一种或多种神经系统病症症状。神经系统病症症状的非限制性示例包括震颤、动作迟缓(运动徐缓)、肌肉僵硬、姿势和平衡受损、自动运动丧失、运动不协调、不受控制的运动、自发的冲击运动、言语变化、麻木和书写变化。在一个方面，神经系统病症症状是运动症状。运动症状的非限制性实例包括不自主运动障碍或自主运动障碍。在一个方面，神经系统病症症状是认知症状。认知症状的非限制性示例包括精细运动技能、震颤、癫痫、舞蹈病、肌张力障碍、运动障碍、缓慢或异常的眼球运动、步态受损、姿势受损、平衡受损、言语困难、吞咽困难、组织困难、优先排序困难(difficulty prioritizing)、难以专注于任务、缺乏灵活性、缺乏冲动控制、爆发、对自己的行为和/或能力缺乏意识、处理思想缓慢、学习新信息困难、记忆事情困难、沟通困难、遵照命令困难、执行任务困难。
在一个方面，神经系统病症症状是精神症状。精神症状的非限制性实例包括抑郁、易怒、悲伤或冷漠、社交退缩、失眠、疲劳、缺乏精力、强迫症、躁狂症、躁郁症和体重减轻。在一个方面，神经系统病症症状是至少一个血管受损。在一个方面，神经系统病症症状是血脑屏障受损。在一个方面，神经系统病症症状是血流受损。用于评价神经病况症状的消除、减少、减缓或延迟的测试的非限制性实例包括统一亨廷顿病评定量表(UHDRS)评分、UHDRS总功能能力(TFC)、UHDRS功能评估、UHDRS步态评分、UHDRS总运动评分(TMS)、汉密尔顿抑郁量表(HAM-D)、哥伦比亚自杀严重程度评定量表(C-SSRS)、蒙特利尔认知评估(MoCA)、改良Rankin量表(mRS)、美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)和巴氏指数(BI)、起立-行走计时测试(TUG)、Chedoke上肢和手功能活动量表(CAHAI)、符号数字模态测试、受控口语词语联想任务(Controlled Oral Word Association tasks)、磁共振成像(MRI)、功能磁共振成像(fMRI)和正电子发射断层扫描(PET)扫描。
在一个方面，治疗有效剂量实现介于约10％与约100％或更多之间的神经系统病症的缓解、治愈、响应率或消退率。在一个方面，治疗有效剂量实现介于10％与100％之间的神经系统病症的缓解、治愈、响应率或消退率，诸如介于10％与15％之间、介于10％与20％之间、介于10％与25％之间、介于15％与20％之间、介于15％与25％之间、介于15％与30％之间、介于20％与25％之间、介于20％与30％之间、介于20％与35％之间、介于25％与30％之间、介于25％与35％之间、介于25％与40％之间、介于30％与35％之间、介于30％与40％之间、介于35％与45％之间、介于35％与50％之间、介于40％与45％之间、介于40％与50％之间、介于40％与55％之间、介于45％与50％之间、介于45％与55％之间、介于45％与60％之间、介于50％与55％之间、介于50％与60％之间、介于50％与65％之间、介于55％与60％之间、介于55％与65％之间、介于55％与70％之间、介于60％与65％之间、介于60％与70％之间、介于60％与75％之间、介于65％与70％之间、介于65％与75％之间、介于65％与80％之间、介于70％与75％之间、介于70％与80％之间、介于70％与85％之间、介于75％与80％之间、介于75％与85％之间、介于75％与90％之间、介于80％与85％之间、介于80％与90％之间、介于80％与95％之间、介于85％与90％之间、介于85％与95％之间、介于85％与100％之间、介于90％与95％之间、介于90％与100％之间或介于95％与100％之间。
在一个方面，治疗有效剂量消除、减少、减缓或延迟一种或多种神经系统病症症状介于10％与100％之间，诸如介于10％与约15％之间、介于10％与20％之间、介于10％与25％之间、介于15％与20％之间、介于15％与25％之间、介于15％与30％之间、介于20％与25％之间、介于20％与30％之间、介于20％与35％之间、介于25与30％之间、介于25％与35％之间、介于25％与40％之间、介于30％与35％之间、介于30％与40％之间、介于35％与45％之间、介于35％与50％之间、介于40％与45％之间、介于40％与50％之间、介于40％与55％之间、介于45％与50％之间、介于45％与55％之间、介于45％与60％之间、介于50％与55％之间、介于50％与60％之间、介于50％与65％之间、介于55％与60％之间、介于55％与65％之间、介于55％与70％之间、介于60％与65％之间、介于60％与70％之间、介于60％与75％之间、介于65％与70％之间、介于65％与75％之间、介于65％与80％之间、介于70％与75％之间、介于70％与80％之间、介于70％与85％之间、介于75％与80％之间、介于75％与85％之间、介于75％与90％之间、介于80％与85％之间、介于80％与90％之间、介于80％与95％之间、介于85％与90％之间、介于85％与95％之间、介于85％与100％之间、介于90％与95％之间、介于90％与100％之间或介于95％与100％之间。
在一个方面，在治疗当天、治疗后1天、治疗后3个月、治疗后6个月、治疗后1年和治疗后每年评估神经系统病症症状。
在一个方面，神经系统病症症状在介于治疗后1天与治疗后7天之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1天与治疗后2天之间、介于治疗后1天与治疗后3天之间、介于治疗后1天与治疗后4天之间、介于治疗后2天与治疗后3天之间、介于治疗后2天与治疗后4天之间、介于治疗后2天与治疗后5天之间、介于治疗后3天与治疗后4天之间、介于治疗后3天与治疗后5天之间、介于治疗后3天与治疗后6天之间、介于治疗后4天与治疗后5天之间、介于治疗后4天与治疗后6天之间、介于治疗后4天与治疗后7天之间、介于治疗后5天与治疗后6天之间、介于治疗后5天与治疗后7天之间或介于治疗后6天与治疗后7天之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1周与治疗后4周之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1周与治疗后2周之间、介于治疗后1周与治疗后3周之间、介于治疗后1周与治疗后4周之间、介于治疗后2周与治疗后3周之间、介于治疗后2周与治疗后4周之间或介于治疗后3周与治疗后4周之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1个月与治疗后12个月之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1个月与治疗后2个月之间、介于治疗后1个月与治疗后3个月之间、介于治疗后1个月与治疗后4个月之间、介于治疗后2个月与治疗后3个月之间、介于治疗后2个月与治疗后4个月之间、介于治疗后2个月与治疗后5个月之间、介于治疗后3个月与治疗后4个月之间、介于治疗后3个月与治疗后5个月之间、介于治疗后3个月与治疗后6个月之间、介于治疗后4个月与治疗后5个月之间、介于治疗后4个月与治疗后6个月之间、介于治疗后4个月与治疗后7个月之间、介于治疗后5个月与治疗后6个月之间、介于治疗后5个月与治疗后7个月之间、介于治疗后5个月与治疗后8个月之间、介于治疗后6个月与治疗后7个月之间、介于治疗后6个月与治疗后8个月之间、介于治疗后6个月与治疗后9个月之间、介于治疗后7个月与治疗后8个月之间、介于治疗后7个月与治疗后9个月之间、介于治疗后7个月与治疗后10个月之间、介于治疗后8个月与治疗后9个月之间、介于治疗后8个月与治疗后10个月之间、介于治疗后8个月与治疗后11个月之间、介于治疗后9个月与治疗后10个月之间、介于治疗后9个月与治疗后11个月之间、介于治疗后9个月与治疗后12个月之间、介于治疗后10个月与治疗后11个月之间、介于治疗后10个月与治疗后12个月之间或介于治疗后11个月与治疗后12个月之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1年与治疗后约20年之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1年与治疗后5年之间、介于治疗后1年与治疗后10年之间、介于治疗后1年与治疗后15年之间、介于治疗后5年与治疗后10年之间、介于治疗后5年与治疗后15年之间、介于治疗后5年与治疗后20年之间、介于治疗后10年与治疗后15年之间、介于治疗后10年与治疗后20年之间或介于治疗后15年与治疗后20年之间评估。
如本文所用，术语“存活率”是指治疗组中的受试者队列在诊断神经系统病症后在给定时间段后仍然存活。
在一个方面，治疗有效剂量实现了介于约10％与100％或更多之间的存活率增加。在一个方面，治疗有效剂量实现了介于10％与100％之间的存活率增加，诸如介于10％与15％之间、介于10％与20％之间、介于10％与25％之间、介于15％与20％之间、介于15％与25％之间、介于15％与30％之间、介于20％与25％之间、介于20％与30％之间、介于20％与35％之间、介于25％与30％之间、介于25％与35％之间、介于25％与40％之间、介于30％与35％之间、介于30％与40％之间、介于35％与45％之间、介于35％与50％之间、介于40％与45％之间、介于40％与50％之间、介于40％与55％之间、介于45％与50％之间、介于45％与55％之间、介于45％与60％之间、介于50％与55％之间、介于50％与60％之间、介于50％与65％之间、介于55％与60％之间、介于55％与65％之间、介于55％与70％之间、介于60％与65％之间、介于60％与70％之间、介于60％与75％之间、介于65％与70％之间、介于65％与75％之间、介于65％与80％之间、介于70％与75％之间、介于70％与80％之间、介于70％与85％之间、介于75％与80％之间、介于75％与85％之间、介于75％与90％之间、介于80％与85％之间、介于80％与90％之间、介于80％与95％之间、介于85％与90％之间、介于85％与95％之间、介于85％与100％之间、介于90％与95％之间、介于90％与100％之间或介于95％与100％之间。
如本文所用，术语“预期寿命”是指预期受试者存活的时间段。
在一个方面，治疗有效剂量使预期寿命增加介于约10％与100％或更多之间。在一个方面，治疗有效剂量使预期寿命增加介于10％与100％之间，诸如介于10％与15％之间、介于10％与20％之间、介于10％与25％之间、介于15％与20％之间、介于15％与25％之间、介于15％与30％之间、介于20％与25％之间、介于20％与30％之间、介于20％与35％之间、介于25％与30％之间、介于25％与35％之间、介于25％与40％之间、介于30％与35％之间、介于30％与40％之间、介于35％与45％之间、介于35％与50％之间、介于40％与45％之间、介于40％与50％之间、介于40％与55％之间、介于45％与50％之间、介于45％与55％之间、介于45％与60％之间、介于50％与55％之间、介于50％与60％之间、介于50％与65％之间、介于55％与60％之间、介于55％与65％之间、介于55％与70％之间、介于60％与65％之间、介于60％与70％之间、介于60％与75％之间、介于65％与70％之间、介于65％与75％之间、介于65％与80％之间、介于70％与75％之间、介于70％与80％之间、介于70％与85％之间、介于75％与80％之间、介于75％与85％之间、介于75％与90％之间、介于80％与85％之间、介于80％与90％之间、介于80％与95％之间、介于85％与90％之间、介于85％与95％之间、介于85％与100％之间、介于90％与95％之间、介于90％与100％之间或介于95％与100％之间。
在一个方面，治疗有效剂量使有此需要的受试者脑内的萎缩量减少介于约10％与100％或更多之间。在一个方面，治疗有效剂量使有此需要的受试者脑内的萎缩量减少介于10％与100％之间，诸如介于10％与15％之间、介于10％与20％之间、介于10％与25％之间、介于15％与20％之间、介于15％与25％之间、介于15％与30％之间、介于20％与25％之间、介于20％与30％之间、介于20％与35％之间、介于25％与30％之间、介于25％与35％之间、介于25％与40％之间、介于30％与35％之间、介于30％与40％之间、介于35％与45％之间、介于35％与50％之间、介于40％与45％之间、介于40％与50％之间、介于40％与55％之间、介于45％与50％之间、介于45％与55％之间、介于45％与60％之间、介于50％与55％之间、介于50％与60％之间、介于50％与65％之间、介于55％与60％之间、介于55％与65％之间、介于55％与70％之间、介于60％与65％之间、介于60％与70％之间、介于60％与75％之间、介于65％与70％之间、介于65％与75％之间、介于65％与80％之间、介于70％与75％之间、介于70％与80％之间、介于70％与85％之间、介于75％与80％之间、介于75％与85％之间、介于75％与90％之间、介于80％与85％之间、介于80％与90％之间、介于80％与95％之间、介于85％与90％之间、介于85％与95％之间、介于85％与100％之间、介于90％与95％之间、介于90％与100％之间或介于95％与100％之间。
在一个方面，在治疗当天、治疗后1天、治疗后3个月、治疗后6个月、治疗后1年和治疗后每年评估有此需要的受试者脑内的萎缩量。
在一个方面，有此需要的受试者脑内的萎缩量在介于治疗后1天与治疗后7天之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1天与治疗后2天之间、介于治疗后1天与治疗后3天之间、介于治疗后1天与治疗后4天之间、介于治疗后2天与治疗后3天之间、介于治疗后2天与治疗后4天之间、介于治疗后2天与治疗后5天之间、介于治疗后3天与治疗后4天之间、介于治疗后3天与治疗后5天之间、介于治疗后3天与治疗后6天之间、介于治疗后4天与治疗后5天之间、介于治疗后4天与治疗后6天之间、介于治疗后4天与治疗后7天之间、介于治疗后5天与治疗后6天之间、介于治疗后5天与治疗后7天之间或介于治疗后6天与治疗后7天之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1周与治疗后4周之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1周与治疗后2周之间、介于治疗后1周与治疗后3周之间、介于治疗后1周与治疗后4周之间、介于治疗后2周与治疗后3周之间、介于治疗后2周与治疗后4周之间或介于治疗后3周与治疗后4周之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1个月与治疗后12个月之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1个月与治疗后2个月之间、介于治疗后1个月与治疗后3个月之间、介于治疗后1个月与治疗后4个月之间、介于治疗后2个月与治疗后3个月之间、介于治疗后2个月与治疗后4个月之间、介于治疗后2个月与治疗后5个月之间、介于治疗后3个月与治疗后4个月之间、介于治疗后3个月与治疗后5个月之间、介于治疗后3个月与治疗后6个月之间、介于治疗后4个月与治疗后5个月之间、介于治疗后4个月与治疗后6个月之间、介于治疗后4个月与治疗后7个月之间、介于治疗后5个月与治疗后6个月之间、介于治疗后5个月与治疗后7个月之间、介于治疗后5个月与治疗后8个月之间、介于治疗后6个月与治疗后7个月之间、介于治疗后6个月与治疗后8个月之间、介于治疗后6个月与治疗后9个月之间、介于治疗后7个月与治疗后8个月之间、介于治疗后7个月与治疗后9个月之间、介于治疗后7个月与治疗后10个月之间、介于治疗后8个月与治疗后9个月之间、介于治疗后8个月与治疗后10个月之间、介于治疗后8个月与治疗后11个月之间、介于治疗后9个月与治疗后10个月之间、介于治疗后9个月与治疗后11个月之间、介于治疗后9个月与治疗后12个月之间、介于治疗后10个月与治疗后11个月之间、介于治疗后10个月与治疗后12个月之间或介于治疗后11个月与治疗后12个月之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1年与治疗后约20年之间评估。在一个方面，症状可以在介于治疗后1年与治疗后5年之间、介于治疗后1年与治疗后10年之间、介于治疗后1年与治疗后15年之间、介于治疗后5年与治疗后10年之间、介于治疗后5年与治疗后15年之间、介于治疗后5年与治疗后20年之间、介于治疗后10年与治疗后15年之间、介于治疗后10年与治疗后20年之间或介于治疗后15年与治疗后20年之间评估。
评估有此需要的受试者脑内的萎缩量的测试的非限制性示例包括Nissle染色、MRI、功能性磁共振fMRI和PET扫描。
虽然已经参考优选实施例描述了本公开，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物替换其元件以适应特定情况。因此，意图是本公开不限于作为预期用于实施本公开的最佳模式而公开的特定实施例，而是本公开将包含落入所附权利要求的范围和精神内的所有实施例。
本文所列出的实例说明了本公开的几个实施例，但不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
实例
实例1.AAV载体构建体
构建了十二个AAV载体构建体：
EF-1α:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:SV40(P35)(图1A)；
EF-1α:Gfa1.6:NeuroD1:WPRE:SV40(P39)(图2A)，
EF-1α:GFA2.2:NeuroD1:WPRE:SV40(图3A)，
EF-1α:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:hGH(图1B)，
EF-1α:Gfa1.6:NeuroD1:WPRE:hGH(图2D)，
EF-1α:GFA2.2:NeuroD1:WPRE:hGH(图3B)，
CE:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:SV40(P11)(图1C)，
CE:Gfa1.6:NeuroD1:WPRE:SV40(P38)(图2C)，
CE:GFA2.2:NeuroD1:WPRE:SV40(图3C)，
CE:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:hGH(图1D)，
CE:Gfa1.6:NeuroD1:WPRE:hGH(图2B)和
CE:GFA2.2:NeuroD1:WPRE:hGH(图3D)。
所有12个载体构建体均利用PHSG-299(Takara,Mountain View,CA)，这是一种基于pUC的载体构建体，其含有复制起点、卡那霉素抗性基因和多克隆位点(MSC)，以lacZ基因为骨架。
表达盒的5'端是来自人延伸因子1α启动子的增强子(EF-1α增强子；SEQ ID NO:2)或巨细胞病毒增强子(CMV增强子；SEQ ID NO:11)，该增强子将5′放置在以下启动子：681个核苷酸的GFAP启动子(GfaABC1D；SEQ ID NO:15)，1667个核苷酸的GFAP启动子(Gfa1.6；SEQID NO:4)，或2214个核苷酸的GFAP启动子(GFA2.2 SEQ ID NO:12)。
在增强子/GFAP启动子之后(例如，增强子/GFAP启动子的3')，将几个额外的序列以5'到3'的方向引入表达盒，该序列包括：嵌合内含子(SEQ ID NO:5)；人NeuroD1编码序列(hNeuroD1；SEQ ID NO:6)；和修饰的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE；SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18)。这些序列都可操作地连接到SV40 poly(A)信号(SEQ ID NO:8)或hGHpoly(A)信号(SEQ ID NO:13)或bGH poly(A)信号(SEQ ID NO:14。增强子、GFAP启动子、嵌合内含子、hNeuroD1编码序列、WPRE和poly(A)信号两侧是两个AAV ITR序列。
实例2.AAV病毒产生
使用聚乙烯亚胺将十二个质粒中的每一个与Rep-Cap质粒(包含驱动AAV rep和cap基因表达的启动子的质粒)和辅助质粒(包含驱动腺病毒的E2A、E4和VA RNA表达的启动子的质粒)一起共转染到293AAV细胞中以产生重组AAV病毒颗粒。
转染后72小时，将转染细胞刮取并离心。将细胞沉淀冷冻并解冻，即置于干冰/乙醇混合物中，然后置于37℃水浴中。将冷冻/解冻循环再重复三次。AAV裂解物通过在不连续的碘克沙醇梯度中以350,000g超速离心1小时来纯化(例如，去除细胞碎片)。收集含有病毒的层，然后使用Millipore Amicon超滤离心器浓缩。然后使用扩增ITR区域的引物或基因/表达盒特异性序列通过qPCR确定病毒滴度。
实例3.星形胶质细胞培养物
人皮层星形胶质细胞(HA1800；ScienCell Research Laboratories,Inc.,Carlsbad,California)在汇合度超过90％时进行传代培养。对于传代培养，使用TrypLETMSelect(Invitrogen,Carlsbad,California)对细胞进行胰蛋白酶化，以200×g离心5分钟，然后重悬并接种在包含DMEM/F12(Gibco)；10％胎牛血清(Gibco)；青霉素/链霉素(Gibco)；3.5mM葡萄糖(Sigma-Aldrich)；B27(Gibco)；10ng/mL表皮生长因子(Invitrogen)；和10ng/mL成纤维细胞生长因子2(Invitrogen)的培养基上。星形胶质细胞在24孔板(BDBiosciences)的聚-D-赖氨酸(Sigma-Aldrich)包被的盖玻片(12mm)上以每个盖玻片约20,000个细胞的密度培养。
大鼠原代星形胶质细胞(分离自Sprague Dawley大鼠皮层或纹状体)在包含DMEM/F12(Gibco)；10％胎牛血清(Gibco)、青霉素/链霉素(Gibco)；3.5mM葡萄糖(Gibco)的培养基中培养。
所有细胞都于37℃保持在含有5％二氧化碳的潮湿空气中。
实例4.星形胶质细胞培养物中AAV载体的测试(在体外)
使用从实例2的方法获得的重组AAV以1010个颗粒/mL和1014个颗粒/mL的浓度范围感染来自实例3的人皮层星形胶质细胞和大鼠原代星形胶质细胞。感染细胞后二十四小时，将培养基替换为包含DMEM/F12(Gibco)；N2添加剂(Gibco)；和20ng/mL脑源性神经营养因子(Invitrogen)的分化培养基。每四天将分化培养基添加到细胞培养物中。参见Song等人，Nature,417:39-44(2002)。
用额外的人星形胶质细胞填充细胞培养物中的空隙以支持星形胶质细胞或大鼠原代星形胶质细胞转化为神经元时转化神经元的功能发育。
实例5.AAV载体效力的测试
使用从实例2的方法获得的重组AAV以1010个颗粒/mL和1014个颗粒/mL的浓度范围感染实例3的人皮层星形胶质细胞和大鼠原代星形胶质细胞(或其他脑区域或脊髓的星形胶质细胞)的第4代至第7代。进行qPCR、酶联免疫吸附(ELISA)和western印迹以确定NeuroD1转录物和蛋白质水平的表达。
NeuN、双皮质素(DCX)、β3-微管蛋白、NF-200和MAP2的表达通过qPCR、ELISA、western印迹和免疫染色进行评估以确定重组AAV的功能输出。
实例6.AAV载体滴度和感染率的测试。
纯化的AAV载体用DNA酶I处理以消除残留质粒污染。以100倍、500倍、2500倍和12500倍进行AAV载体连续稀释。稀释AAV质粒骨架以通过连续稀释生成标准曲线。质粒稀释为104、105、106、107和108个分子/μl。对稀释的AAV载体和稀释的AAV质粒进行qPCR。使用的引物针对ITR区域(正向ITR引物5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT，反向ITR引物5'-CGGCCTCAGTGAGCGA)。qPCR混合物包含10μl的Universal SYBR Master Mix 2X、2μl的5μM正向ITR引物、2μl的5μM反向ITR引物、5μl的测试样品或稀释标准品和1μl的H2O。qPCR程序是95℃10分钟，然后是95℃15秒、60℃30秒的40个循环，然后是熔解曲线。使用qPCR循环仪软件分析数据。根据标准曲线计算AAV样品的物理滴度(病毒基因组(vg)/ml)。
AAV载体感染率通过使用美国典型培养物菌种保藏中心(ATCC；anassas,VA)的标准方案进行的50％组织培养感染剂量(TCID50)测定来测试。
实例7.AAV剂量范围的测试(在体内)。
将从实例2的方法获得的重组AAV通过双侧颅内注射到运动皮层中来注射到C57/BL6小鼠中。每个AAV以1x 1011、3x 1011、1x 1012、3x 1012、1x 1013个病毒基因组/mL的剂量以1μl体积注射。在注射后4天、20天和60天评估每个剂量以确定细胞和组织水平的最佳有效剂量(OED)、最大耐受剂量(MTD)和最小有效剂量(MED)。每个时间点三只小鼠。OED、MTD和MED通过经由NeuroD1、GFAP、NeuN和Iba1的免疫染色评估星形胶质细胞到神经元的转化效率和潜在毒性来确定。如果第一个剂量范围不足以确定OED、MTD和MED，则以1x 1010GC/mL至1x 1014GC/mL以1μl体积进行第二个剂量范围。
实例8.非人灵长类动物的剂量标度测定
来自实例7的表达NeuroD1的脑组织的体积除以载体基因组的数量(mm3/载体基因组)用于确定脑组织的病毒感染率。计算非人灵长类动物中特定待治疗脑区域体积(mm3)，并且载体基因组的剂量范围依照实例7获得的感染率。如实例7进行剂量范围研究并且OED、MTD和MED通过经由NeuroD1、GFAP、NeuN和Iba1的免疫染色评估星形胶质细胞到神经元的转化效率和潜在毒性来确定。
实例9.人类受试者中AAV载体的测试(在体内)
使用从实例2的方法获得的重组AAV在体内感染人脑或脊髓星形胶质细胞。将重组AAV以1010个颗粒/mL与1014个颗粒/mL的浓度范围以10μl至1mL的体积范围注射到患有神经系统病症的人类受试者的大脑皮层中。在注射前、注射期间和注射后观察人类受试者的神经系统病症症状、脑或脊髓成像(包括MRI、PET扫描或MRI和PET的组合)以及行为指标。每周一次进行注射后观察，直至注射后第一个月。在注射后第一个月后，每月一次进行观察，持续接下来的11个月，并可延长至病毒注射后2年。实例10.患有卒中的有此需要的受试者的治疗(在体内)
用从实例2的方法获得的重组AAV治疗患有卒中的受试者。受试者的神经症状包括言语变化、麻木和书写变化。将重组AAV以1010个颗粒/mL与1014个颗粒/mL的浓度范围以10μl至1000μl的体积范围注射到患有神经系统病症的人类受试者的大脑皮层中。在注射前、注射期间和注射后观察人类受试者的神经系统病症症状、脑成像(包括MRI、PET扫描或MRI和PET的组合)以及行为指标。每周一次进行注射后观察，直至注射后第一个月。在注射后第一个月后，每月一次进行观察，持续接下来的11个月，并可延长至病毒注射后2年。
实例11.P35的AAV病毒生产
如实例2中所述获得重组AAV。将P35质粒与表达血清型9衣壳蛋白的Rep-Cap质粒和辅助质粒P40Helper(P40H)或pALD-X80(X80)共转染到AAV293细胞以产生重组AAV病毒颗粒(P35-P40H或P35-X80)。病毒产量是通过qPCR使用扩增目的基因(GOI)的引物，对P34质粒和ITR区域具有特异性的引物来确定。反向包装引物用于评估非特异性包装。与P40H辅助质粒相比，X80辅助质粒观察到病毒产量增加(图4)。实例12.大鼠星形胶质细胞原代培养物的成功建立
从出生后3天的Sprague-Dawley大鼠脑中分离出皮层和纹状体组织。组织用木瓜蛋白酶处理以生成单细胞悬液并接种在聚-D-赖氨酸包被的烧瓶中。细胞在汇合度90％时进行传代培养。第6代细胞用GFAP抗体和SOX9抗体进行免疫染色。细胞用DAPI抗体复染。超过95％的细胞是通过GFAP和SOX9染色鉴定的星形胶质细胞(图5)。左上图呈现GFAP染色细胞的图像。右上图呈现SOX9染色细胞的图像。左下图呈现DAPI染色细胞的图像。右下图呈现GFAP、SOX9和DAPI染色细胞的合并图像。
实例13.大鼠星形胶质细胞的成功转染
将原代大鼠星形胶质细胞接种在24孔板中，玻璃盖玻片包被有聚-D-赖氨酸，并使用Thermo Fisher Scientific的标准方案用质粒P5(pEF-1α:hNeuroD1:GFP)、对照质粒和Lipofectamine LTX试剂进行转染。转染后四十八小时，固定细胞并用抗NeuroD1抗体进行免疫染色，然后用标记有Alexa-568的二抗进行免疫染色。细胞用DAPI复染以显示所有细胞核(图6)。左图呈现NeuroD1染色细胞的图像。中间左图呈现表达GFP的细胞的图像。中间右图代表DAPI染色细胞。右图代表NeuroD1、GFP和DAPI染色细胞的合并图像。
实例14.质粒转染的比较
将原代大鼠星形胶质细胞接种，并如实例11所述用表达载体P6(pEF-1α:hNeuroD1:WPRE:SV40)、P11(CE:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:SV40)、P35(EF-1α:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:SV40)和P39(EF-1α:Gfa1.6:NeuroD1:WPRE:SV40)转染以测试NeuroD1转染细胞的效率。P11导致由细胞的NeuroD1染色显示的最高NeuroD1表达(图7；上图显示细胞的NeuroD1染色，下图显示合并的细胞NeuroD1和DAPI染色)。
实例15.AAV病毒颗粒至原代大鼠星形胶质细胞的成功转导
使用来自AAV9-P12(pGfaABC1D:GFP)的对照病毒颗粒，以3x 1010vg/孔、1x1010vg/孔、2.5x 1019vg/孔的转导，在96孔板中的100ul培养基中将从实例2的方法获得的重组AAV转导到原代大鼠星形胶质细胞中。在转导前24-48小时，将第5-7代的RCA接种在24孔板中包被有聚D-赖氨酸(PDL)的玻璃盖玻片上，汇合度为30％-50％。用新鲜星形胶质细胞培养基中指定滴度的病毒转导细胞。培养基在第二天更新并且每3-4天更新一次。在GFP阳性细胞转导后六天获得的图像显示，当病毒滴度较高时，转导率较高(图8)。
实例16.AAV病毒颗粒至原代大鼠星形胶质细胞的转导的定量分析。
将从实例2的方法获得的重组AAV转导到接种在24孔板或96孔板中的原代大鼠星形胶质细胞中，所述板具有病毒颗粒AAV9-P12(pGfaABC1D:GFP)和AAV5-P7(pEF-1α:GFP)。感染后7天通过胰蛋白酶化收获细胞。将细胞固定、洗涤并悬浮在PBS中。使用流式细胞术分析病毒转导率以计数与所有细胞相比的GFP阳性细胞(图9A-9B)。图9A显示了不同MOI下的转导率百分比。以5x 105vg/细胞、2x105 vg/细胞和5x 104vg/细胞的MOI感染以1x 105个细胞/孔接种在24孔板中的细胞。病毒转导率随着MOI的降低而降低。图9B显示了以一系列密度(2x104个细胞/孔、1.5x 104个细胞/孔、1x104个细胞/孔和5x 103个细胞/孔)接种在96孔板中并且用一系列量的病毒(100μl培养基中的1x 1013vg/ml病毒的2μl、1μl、0.5μl、0.25μl、0.125μl)感染的细胞中AAV病毒颗粒的转导率。这分别相当于每孔2x1010 vg、1x1010 vg、5x109 vg、2.5x109 vg和1.25x109 vg。随着每孔细胞数量的减少，病毒转导率不变。
实例17.含有NeuroD1的AAV病毒颗粒至原代大鼠星形胶质细胞的成功转导。
将从实例2的方法获得的重组AAV转导到接种在24孔板中的原代大鼠星形胶质细胞中，所述板具有病毒颗粒1)AAV5-P1(AAV5:pGfa2.2:cre)和AAV4-P4(AAV5:pCAG:flex:hNeuroD1:GFP)；2)AAV9-P9(CE:GfaABC1D:NeuroD1:GFP)；和3)AAV9-P11(CE:GfaABC1D:NeuroD1:WPRE:SV40)。在转导前24-48小时，将第5-7代的RCA接种在24孔板中包被有聚D-赖氨酸(PDL)的玻璃盖玻片上，汇合度为30％-50％。用新鲜星形胶质细胞培养基中滴度为2x1010vg/ml(MOI为1x 106vg/细胞)的病毒转导细胞。培养基在第二天更新并且每3-4天更新一次。细胞在感染后六天固定，并对NeuroD1进行免疫染色。细胞用DAPI复染以识别细胞核(图10)。用P1+P4组合、P9和P11转导的细胞均显示NeuroD1表达。
实例18.NeuroD1载体诱导的在体外转基因表达和星形胶质细胞到神经元的转化。
材料和方法
原代大鼠星形胶质细胞培养物：从出生后3天的Sprague Dawley大鼠皮层组织中分离大鼠皮层星形胶质细胞(RCA)。将细胞维持在星形胶质细胞培养基(AM)中，该培养基由补充有10％ FBS、2.5mM谷氨酰胺、3.5mM葡萄糖、青霉素/链霉素的DMEM构成。在低细胞密度下以1:3-1:4的比例传代培养细胞的前两代，以促进残余祖细胞分化。当达到90％-100％汇合度时，后续传代培养的比例为1:2或1:3。第5-7代细胞用于转染和转导。用GFAP抗体进行免疫染色显示>90％的细胞是GFAP阳性星形胶质细胞。第6代星形胶质细胞培养物用星形胶质细胞标记物GFAP和Sox9进行免疫染色(图5)。
载体：AAV由选定的载体产生，并使用大鼠星形胶质细胞在体外测试：
·NXL-P9(CE-pGfa681-CI-hND1-p2A-GFP-WPRE-SV40pA)
·NXL-P22(CE-pGfa681-CI-hND1-WRPE-SV40pA)
·NXL-P35(EE-pGfa681-CI-hND1-WRPE-SV40pA)
·NXL-P37(EE-pGfa681-CI-hND1-p2A-GFP-WPRE-SV40pA)
·NXL-P107(CE-pGfa681-CI-hND1-bGHpA)
·NXL-P108(CE-pGfa681-CI-hND1-oPRE-bGHpA)
·NXL-P109(CE-pGfa681-CRGI-hND1-bGHpA)
·NXL-P130(CE-pGfa681-GI-hND1-oPRE-bGHpA)
·NXL-P134(CE-pGfa681-CRGI-hND1-oPRE-bGHpA)
·NXL-P136(EE-Gfa681-CRGI-hND1-bGHpA)
·NXL-P138(EE-Gfa681-CRGI-hND1-oPRE-bGHpA)
病毒生产：用于在体外研究的病毒使用贴壁AAV293细胞通过三重转染(GOI、辅助和Rep/Cap质粒)利用聚乙烯亚胺(PEI)产生。病毒回收和纯化通过超速离心或使用商业纯化试剂盒来实现。
具体而言，AAV293细胞(Cell Biolabs,Cat#AAV-100)在转染前24小时接种在15-cm的培养皿中。在每个培养皿中用10μg GOI、10μg Rep/Cap和14μg pALD-X80(Aldevron)或pHelper(Cell Biolabs)，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染70％-85％汇合度的细胞，DNA:PEI比例为1:4。根据所需规模转染多个培养皿以用于生产。每天更新培养基。转染后七十二小时，按照制造商的方案，使用AAVpro纯化试剂盒(Takara,Cat#6666,6675,6235)收集并裂解细胞以收获病毒。
病毒滴度通过实时定量PCR使用ITR区域中的引物对、扩增目的基因(GOI)的引物或载体特异性引物确定。质粒DNA用作标准品。生产产量为约103-104vg/细胞水平。图32描绘了qPCR测量的与表达血清型9衣壳蛋白的Rep-Cap质粒和辅助质粒pALD-X80(X80)一起共转染到AAV293细胞中的P134、P130、P138和P21质粒中的每一个如何产生重组AAV病毒颗粒。
转染和免疫荧光：在转染前24-48小时，将第5-7代大鼠皮层星形胶质细胞(RCA)接种在24孔板中包被有聚D-赖氨酸(PDL)的玻璃盖玻片上，汇合度为30％-50％。按照制造商的方案，使用Lipofectamine试剂(Thermo Fisher Cat#15338)用300ng载体DNA转染细胞。转染后24-48小时，用PBS中的4％多聚甲醛固定细胞，随后洗涤并用抗NeuroD1(抗ND1)抗体(Abcam Cat#ab60704)进行免疫染色，然后用与荧光染料缀合的二抗(Invitrogen,AlexaFluor)进行免疫染色。在荧光显微镜(Zeiss Axiovert A1,Zen Blue)下拍摄图像。通过比较荧光强度来评估基因表达水平。
转导和免疫荧光：在转导前24-48小时，将第5-7代的RCA接种在24孔板中包被有聚D-赖氨酸(PDL)的玻璃盖玻片上，汇合度为30％-50％。用新鲜星形胶质细胞培养基中2-6X1010个病毒基因组(vg)/ml的AAV转导细胞。培养基在第二天更新并且每3-4天更新一次。转导后三至六天，用PBS中的4％多聚甲醛固定细胞，随后洗涤并用抗ND1抗体(Abcam Cat#ab60704)进行免疫染色，然后用与荧光染料缀合的二抗(Invitrogen,Alexafluor)进行免疫染色，以用于观察并且在荧光显微镜(Zeiss Axiovert A1,Zen Blue)下拍摄图像。通过比较荧光强度来评估基因表达水平。
星形胶质细胞到神经元转化评估在转导前24-48小时，将第5-7代的RCA接种在24孔板中包被有聚-D-赖氨酸(PDL)的玻璃盖玻片上，汇合度为30％-50％。用500μl新鲜星形胶质细胞培养基(补充有10％ FBS、2.5mM谷氨酰胺、3.5mM葡萄糖、青霉素/链霉素的DMEM)中2-6X1010 vg/ml的病毒转导细胞。在转导后48小时，将培养基替换为5％ FBS星形胶质细胞培养基。随后，每天添加100μl转化培养基(DMEM/F12+1％ FBS+B27+N2和1uM Rock抑制剂和10ng/ml BDNF)，持续4天。4天后，将培养基完全替换为转化培养基。
在不同的所需时间点(转导后三天、一到五周)用PBS中的4％多聚甲醛固定细胞，随后洗涤并且用针对ND1的抗体(Abcam Cat#ab60704)、针对NeuN的抗体(Millipore,Cat#ABN78)、针对Map2的抗体(Invitrogen,Cat#PA5-17646)进行免疫染色，然后用与荧光染料缀合的二抗(Invitrogen,Alexafluor)进行免疫染色以用于观察并且在荧光显微镜(ZeissAxiovert A1,Zen Blue)下成像。
在体外研究结果：
所有测试的NeuroD1(ND1)质粒都有效驱动NeuroD1的表达(图12-28)。NeuroD1的表达水平受载体中元件的影响。在三个版本的GFA启动子中，681bp启动子显示出最高的NeuroD1表达水平，并且1.6kb启动子显示出最弱的NeuroD1表达水平。启动子增强子元件显著影响NeuroD1的表达水平。CMV增强子对NeuroD1表达水平的增加超过ef1增强子。嵌合内含子和WPRE也增加NeuroD1的表达水平。
如NeuN和/或MAP2的阳性染色所示(图14、17、19、22和25)，所有测试的含有ND1的AAV都在培养的大鼠星形胶质细胞中有效地驱动ND1的表达并诱导星形胶质细胞到神经元的转化。当星形胶质细胞被驱动更高ND1表达的载体转导时，转化率更高。载体NXL-P134和NXL-P138，以及使用这些载体产生的病毒(即分别为AAV9-P134和AAV9-P138)在驱动ND1表达和诱导星形胶质细胞到神经元转化方面最有效，其中AAV-P134是最有效的(图12-17)。不含ND1序列的质粒AAV9-P21(CE-pGFA681-CI-GFP-WPRE-SV40pA)用作对照，并且它不会诱导星形胶质细胞到神经元的转化，如缺乏针对NeuN和/或Map2的阳性染色所显示的(图11)。
NeuN/RBFOX3(神经元核蛋白)是染色神经元的核和核周细胞质的神经元分化标记物。MAP2(微管相关蛋白2)是另一种染色细胞质微管(包括神经元中的树突)的神经元标记物。
用含有ND1的AAV转导后一周，观察到少量NeuN和MAP2阳性细胞(神经元)。两周和三周后，观察到更多NeuN/MAP2阳性细胞。一些NeuN/MAP2阳性细胞显示出典型的神经元形态。
实例19.NeuroD1病毒载体诱导的在体内转基因表达和星形胶质细胞到神经元的转化。
AAV9-P134和AAV9-P138病毒用于在体内研究。在GFAP启动子下驱动单独GFP表达(无ND1)的AAV9-P12用于对照和识别表达GFAP的细胞(星形胶质细胞)。
将单链腺病毒相关病毒(ssAAV，简称AAV)载体NXL-P12、NXL-P134和NXL-P138包装成AAV血清型9(AAV9)，然后进行随后的碘克沙醇梯度超速离心和浓缩。使用基于定量PCR的方法对纯化的AAV病毒进行滴定。本研究中使用的所有AAV均在PBS(pH 7.4)中的0.001％Pluronic F-68(Poloxamer 188溶液,PFL01-100ML,Caisson Laboratories,Smithfield,UT,USA)中制备。
按如下方式给超过8周龄的正常C57BL/6J小鼠注射AAV9-P134、AAV-P138和AAV9-P12病毒：
·P12对照组：AAV9-P12 5x1011 GC/ml，1μL，皮层注射1次(单侧)(n＝6)
·P134组：AAV9-P12 2.5x1011 GC/ml+AAV9-P134 2.5x1011 GC/ml，1μL，皮质注射1次(单侧)(n＝6)
·P138组：AAV9-P12 2.5x1011 GC/ml+AAV9-P138 2.5x1011 GC/ml，1μL，皮质注射1次(单侧)(n＝6)
在感染后10天(dpi)和30dpi处死小鼠并分析脑皮层组织。动物用1.25％ Avertin麻醉，然后先用盐溶液(0.9％ NaCl)再用4％多聚甲醛(PFA)依次心内灌注。将脑收集，在4％ PFA中固定过夜后，依次放置在4℃的20％和30％蔗糖中，直到组织下沉。将脱水的脑嵌入最佳切割温度(Tissue-O.C.T.化合物，/>Finetek,Torrance,CA,USA)，然后在低温恒温器(Thermo Scientific,Shanghai,China)上以30μm厚度在冠状面连续切片。对于免疫荧光，首先用PBS洗涤自由漂浮的脑切片，并在室温(RT)下在PBS中制备的5％正常驴血清、3％牛血清白蛋白和0.3％ TritonX-100中封闭1小时，然后在4℃用在封闭液中稀释的一抗孵育过夜。用0.2％ PBST(PBS中的0.2％tween-20)额外洗涤后，将样品与0.5μg/μL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；F.Hoffmann-La Roche,Natley,NJ,USA)以及与AlexaFluor 555缀合的适当驴抗小鼠/兔二抗，与Alexa Fluor 488缀合的山羊抗鸡二抗(1:1000,Life technologies,Carlsbad,CA,USA)和与Alexa Fluor 647缀合的山羊抗大鼠(Life technologies)/豚鼠(Jackson immune research)二抗(1:500)在室温下孵育2小时，然后用PBS充分洗涤。样品最终用/>封片剂(VECTOR Laboratories,Burlingame,CA,USA)封片并用指甲油密封。用共聚焦显微镜(LSM880,Zeiss,Jena,Germany)拍摄代表性图像。使用的一抗如下：大鼠抗GFAP(星形胶质细胞标记物，1:1000,Cat#13-0300,Invitrogen)、豚鼠抗NeuN(神经元标记物，1:1000,Cat#ABN90,Millipore)、小鼠抗NeuroD1(1:500,Cat#ab60704,Abcam)和鸡抗GFP(1:1000,Cat#ab13970,Abcam)。由Zeiss Axioplan荧光显微镜(Axio Imager Z2,Zeiss,/>Germany)或共聚焦显微镜(LSM880,Zeiss,Jena,Germany)拍摄代表性图像。基于4个随机选择的视野(212μm x 212μm，从LSM880共聚焦显微镜放大400倍获得)由每只小鼠的3个脑切片(每组3只小鼠)进行定量分析。数据示出为平均值±SEM。
首先将表达单独GFP报告基因的对照病毒P12与表达NeuroD1的病毒P134和P138(均将P12添加在一起以追踪转化的神经元)进行比较。当将对照病毒P12注射到未受伤的小鼠皮层时，在10dpi(注射后天数)时感染细胞主要是没有NeuroD1表达的星形胶质细胞(图33)。相反，在P134和P138组中都清楚地检测到NeuroD1表达。虽然在10dpi时P138组中大多数表达NeuroD1的细胞仍然是星形胶质细胞，但P134组中的一部分表达NeuroD1的细胞已经是NeuN+神经元(图33)，表明P134可能具有比P138更好的转化能力。此外，在10dpi时，对P134组小鼠皮层脑组织的分析显示，星形胶质细胞向神经元的转化水平高，GFP阳性细胞的形态学变化(诸如长突起的存在)证明了这一点(图29)。P138组显示出较低水平的转化。
病毒注射后30天，对照组(P12)中的感染细胞仍为星形胶质细胞，但P134组中的大多数GFP阳性细胞是表达NeuN的神经元(图34)。但是，P138组的转化率低于P134组。此阶段P138组中大部分感染细胞仍为星形胶质细胞，并且转化神经元中的GFP信号弱(图34)。此外，在30dpi时，对P134组小鼠皮层脑组织的分析显示，星形胶质细胞向神经元的转化水平甚至更高，GFP阳性细胞中长突起的存在证明了这一点(图30)。
AAV9-P134病毒在双侧损伤小鼠模型中也有效。在正常C57BL/6J小鼠(超过8周龄)中，通过在皮层的每一侧注射1μL的Endophilin 1,1-31aa(1μg/μL)诱导缺血性卒中。用20mg/kg的1.25％ Avertin(12.5mg/mL的2,2,2-三溴乙醇和25μL/mL的2-甲基-2-丁醇的混合物，Sigma,St.Louis,MO,USA)通过腹膜内注射麻醉小鼠，然后将其以俯卧位置于立体定位架上。通过玻璃移液管将Endothelin-1(ET-1)和病毒注射到运动皮层的坐标+0.2mm前后(AP，距前囟)，-1.5mm中外(ML，距前囟，左侧)，-0.7mm背腹侧(DV，距硬脑膜)处。注射速度为80nL/min。注射后将移液管保持在原位约10分钟，然后慢慢抽出。注射Endothelin-1后七天，按如下方式给小鼠注射AAV9-P12和AAV9-P134病毒：
·P12组：AAV9-P12 5x1011 GC/ml,1μL，皮层每侧注射1次(双侧)
·P134组：AAV9-P12 2.5x1011 GC/ml+AAV9-P134 2.5x1011 GC/ml,1μL，皮层每侧注射1次(双侧)
在病毒注射后10天(dpi)处死小鼠，并对脑皮层组织进行分析。当将对照病毒P12注射到ET-1损伤小鼠皮层时，在10dpi(注射后天数)时感染细胞主要是没有NeuroD1表达的星形胶质细胞(图35)。相反，在P134组中检测到NeuroD1表达(图35)。此外，在10dpi时，对P134组小鼠皮层脑组织的分析显示，星形胶质细胞向神经元的转化水平高，GFP阳性细胞中观察到的形态学变化(诸如长突起的存在)证明了这一点(图31)。
在ET-1损伤的小鼠皮层中进行病毒注射后30天，对照组(P12)中的感染细胞仍为星形胶质细胞，但P134组中的大多数GFP阳性细胞变为表达NeuN的转化神经元(图36A)。在30dpi时，P134在ET-1损伤小鼠皮层中的转化率为约64％(图36B，NeuN+GFP+/GFP+:P12,1.0±0.2％；P12+P134,63.8±1.2％,*P<0.0001，未配对学生t检验)。这些研究表明P134是可以在体内将星形胶质细胞有效地转化为缺血损伤小鼠皮层中的神经元的载体。
对本公开的组合物和方法的各种进一步修改和改进对于本领域技术人员来说将是显而易见的。设想以下非限制性实施例：
1.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，所述hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中该hNeuroD1序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
2.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸编码序列，所述hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中所述编码序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)具有SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
3.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码神经源性分化因子1(NeuroD1)蛋白的NeuroD1核酸编码序列，其中所述编码序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)增强子；
(c)嵌合内含子；
(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)多聚腺苷酸化信号序列。
4.一种用于将人的神经胶质细胞转化为功能性神经元的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中所述AAV载体包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，所述hNeuroD1序列具有SEQ ID NO:6的核酸序列，并且其中所述序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
5.一种用于将人的神经胶质细胞转化为功能性神经元的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中所述AAV载体包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸序列，所述hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸编码序列，
并且其中所述编码序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
6.一种用于治疗有此需要的受试者的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中所述AAV载体包含可操作地连接到表达控制元件的神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，所述表达控制元件包含：
(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)增强子；
(c)嵌合内含子；
(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)多聚腺苷酸化信号。
7.根据实施例1至3中任一项所述的AAV载体或根据实施例4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体选自由AAV血清型2、AAV血清型5和AAV血清型9组成的组。
8.根据实施例7所述的AAV载体或组合物，其中所述AAV载体是AAV血清型2。
9.根据实施例7所述的AAV载体或组合物，其中所述AAV载体是AAV血清型5。
10.根据实施例7所述的AAV载体或组合物，其中所述AAV载体是AAV血清型9。
11.根据实施例4或5所述的组合物，其中所述神经胶质细胞是反应性星形胶质细胞。
12.根据实施例4或5所述的组合物，其中所述功能性神经元选自由谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元组成的组。
13.根据实施例4或5所述的组合物，其中所述人患有神经系统病症。
14.根据实施例3所述的AAV载体或根据实施例6所述的组合物，其中所述NeuroD1是人NeuroD1(hNeuroD1)。
15.根据实施例3所述的AAV载体或根据实施例6所述的组合物，其中所述NeuroD1选自由黑猩猩NeuroD1、倭黑猩猩NeuroD1、红毛猩猩NeuroD1、大猩猩NeuroD1、猕猴NeuroD1、狨猴NeuroD1、卷尾猴NeuroD1、狒狒NeuroD1、长臂猿NeuroD1和狐猴NeuroD1组成的组。
16.根据实施例14所述的AAV载体或组合物，其中所述hNeuroD1包含编码与以下至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸编码序列：SEQ ID NO:10。
17.根据实施例14所述的AAV载体或组合物，其中所述hNeuroD1序列包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。
18.根据实施例3所述的AAV载体或根据实施例6所述的组合物，其中所述GFAP启动子是人GFAP(hGFAP)启动子。
19.根据实施例3所述的AAV载体或根据实施例6所述的组合物，其中所述GFAP启动子选自由黑猩猩GFAP启动子、倭黑猩猩GFAP启动子、红毛猩猩GFAP启动子、大猩猩GFAP启动子、猕猴GFAP启动子，狨猴GFAP启动子、卷尾猴GFAP启动子、狒狒GFAP启动子、长臂猿GFAP启动子和狐猴GFAP启动子组成的组。
20.根据前述实施例中任一项所述的AAV载体或组合物，其中所述AAV载体进一步包含与以下至少80％相同的2A自切割肽序列：SEQ ID NO:3，或其互补序列。
21.根据实施例18所述的AAV载体或组合物，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:4，或其互补序列。
22.根据实施例18所述的AAV载体或组合物，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:12，或其互补序列。
23.根据实施例18所述的AAV载体或组合物，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:15，或其互补序列。
24.根据实施例3所述的AAV载体或根据实施例6所述的组合物，其中所述增强子选自由来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子和巨细胞病毒(CMV)增强子组成的组。
25.根据实施例24所述的AAV载体或组合物，其中所述EF1-α包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。
26.根据实施例24所述的AAV载体或组合物，其中所述CMV增强子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。
27.根据实施例3所述的AAV载体或根据实施例6所述的组合物，其中所述嵌合内含子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。
28.根据实施例3所述的AAV载体或根据实施例6所述的组合物，其中所述嵌合内含子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。
29.根据实施例3所述的AAV载体或根据实施例6所述的组合物，其中所述WPRE包含与选自由以下项组成的组的核酸序列至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:7和18，或其互补序列。
30.根据实施例3所述的AAV载体或根据实施例6所述的组合物，其中所述多聚腺苷酸化信号选自由SV40多聚腺苷酸化信号和hGH多聚腺苷酸化信号组成的组。
31.根据实施例30所述的AAV载体或组合物，其中所述SV40多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。
32.根据实施例30所述的AAV载体或组合物，其中所述hGH多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。
33.根据实施例30所述的AAV载体或组合物，其中所述bGH多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。
34.根据实施例3所述的AAV载体或根据实施例6所述的组合物，其中所述AAV载体进一步包含编码AAV蛋白序列的核酸序列。
35.根据实施例1至3中任一项所述的AAV载体或根据实施例4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体包含AAV血清型2反向末端重复序列(ITR)。
36.根据实施例1至3中任一项所述的AAV载体或根据实施例4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体包含AAV血清型5反向末端重复序列(ITR)。
37.根据实施例1至3中任一项所述的AAV载体或根据实施例4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体包含AAV血清型9反向末端重复序列(ITR)。
38.根据实施例1至3中任一项所述的AAV载体或根据实施例4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体包含至少一个与以下至少80％相同的ITR核酸序列：SEQ ID NO:1。
39.根据实施例1至3中任一项所述的AAV载体或根据实施例4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体包含至少一个与以下至少80％相同的ITR核酸序列：SEQ ID NO:9。
40.根据实施例6所述的组合物，其中所述有此需要的受试者是哺乳动物。
41.根据实施例40所述的组合物，其中所述哺乳动物是人。
42.根据实施例40所述的组合物，其中所述哺乳动物是非人灵长类动物。
43.根据实施例6所述的组合物，其中所述有此需要的受试者患有神经系统病症。
44.根据实施例13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症包括中枢神经系统(CNS)或周围神经系统的损伤。
45.根据实施例13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症包括CNS的损伤。
46.根据实施例13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症选自由以下项组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病、癫痫、物理性损伤、卒中、脑动脉瘤、外伤性脑损伤、脑震荡、肿瘤、炎症、感染、共济失调、脑萎缩、脊髓萎缩、多发性硬化症、外伤性脊髓损伤、缺血性或出血性脊髓病(脊髓病)、全脑缺血、缺氧缺血性脑病、栓塞、纤维软骨栓塞性脊髓病、血栓形成、肾病、慢性炎性疾病、脑膜炎、和脑静脉窦血栓形成。
47.根据实施例13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症是阿尔茨海默病。
48.根据实施例13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症是帕金森病。
49.根据实施例13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症是ALS。
50.根据实施例13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症是亨廷顿病。
51.根据实施例13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症是卒中。
52.根据实施例51所述的组合物，其中所述卒中是缺血性卒中。
53.根据实施例51所述的组合物，其中所述卒中是出血性卒中。
54.根据实施例43所述的组合物，其中所述组合物能够将至少一种神经胶质细胞转化为神经元。
55.根据实施例54所述的组合物，其中所述神经胶质细胞选自由星形胶质细胞和NG2细胞组成的组。
56.根据实施例54所述的组合物，其中所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。
57.根据实施例56所述的组合物，其中所述星形胶质细胞是反应性星形胶质细胞。
58.根据实施例54所述的组合物，其中所述神经胶质细胞是GFAP阳性的。
59.根据实施例54所述的组合物，其中所述神经元是功能性神经元。
60.根据实施例54所述的组合物，其中所述功能性神经元选自由谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元组成的组。
61.根据实施例60所述的组合物，其中所述功能性神经元是谷氨酸能神经元。
62.根据实施例6所述的组合物，其中所述组合物被配制以递送给有此需要的受试者。
63.根据实施例62所述的组合物，其中所述组合物被配制以用于局部递送。
64.根据实施例62所述的组合物，其中所述组合物被配制以用于全身递送。
65.根据实施例62至64中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制以用于经由腹膜内、肌肉内、静脉内、鞘内、大脑内、颅内、脑的侧脑室内、小脑延髓池内、玻璃体内、视网膜下内、实质内、鼻内或口服施用进行的递送。
66.一种方法，其包括将根据实施例6所述的组合物递送给所述有此需要的受试者。
67.根据实施例66所述的方法，其中所述组合物被配制以递送给有此需要的受试者。
68.根据实施例66所述的方法，其中所述递送包括局部施用。
69.根据实施例66所述的方法，其中所述递送包括全身施用。
70.根据实施例66至69中任一项所述的方法，其中所述递送包括腹膜内、肌肉内、静脉内、鞘内、大脑内、颅内、脑的侧脑室内、小脑延髓池内、玻璃体内、视网膜下内、实质内、鼻内或口服施用。
71.一种将活人脑中的反应性星形胶质细胞转化为功能性神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)注射到有此需要的受试者中，其中所述AAV包含DNA载体构建体，所述DNA载体构建体包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，所述hNeuroD1序列包含SEQ IDNO:6的核酸序列，其中所述序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
72.一种将活人脑中的反应性星形胶质细胞转化为功能性神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)注射到有此需要的受试者中，其中所述AAV包含DNA载体构建体，所述DNA载体构建体包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸序列，所述hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸编码序列，其中所述编码序列可操作地连接到表达控制元件，所述表达控制元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
73.一种将有此需要的受试者的神经胶质细胞转化为神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)递送至所述有此需要的受试者，其中所述AAV包含DNA载体构建体，所述DNA载体构建体包含神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，所述NeuroD1序列可操作地连接到表达控制元件，所述表达控制元件包含：
(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)增强子；
(c)嵌合内含子；
(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)和多聚腺苷酸化信号序列，
其中所述载体能够将所述有此需要的受试者的至少一种神经胶质细胞转化为神经元。
74.一种治疗有此需要的受试者的神经系统病症的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)递送至所述受试者，其中给予所述有此需要的受试者的所述AAV包含DNA载体构建体，所述DNA载体构建体包含可操作地连接到表达控制元件的神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，所述表达控制元件包含：
(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)增强子；
(c)嵌合内含子；
(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)多聚腺苷酸化信号。
75.根据实施例71至74中任一项所述的方法，其中所述AAV选自由AAV血清型2、AAV血清型5和AAV血清型9组成的组。
76.根据实施例75所述的方法，其中所述AAV是AAV血清型2。
77.根据实施例75所述的方法，其中所述AAV是AAV血清型5。
78.根据实施例75所述的方法，其中所述AAV是AAV血清型9。
79.根据实施例71或72所述的方法，其中所述功能性神经元是谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元。
80.根据实施例73或74所述的方法，其中所述NeuroD1是人NeuroD1(hNeuroD1)。
81.根据实施例73或74所述的方法，其中所述NeuroD1选自由黑猩猩NeuroD1、倭黑猩猩NeuroD1、红毛猩猩NeuroD1、大猩猩NeuroD1、猕猴NeuroD1、狨猴NeuroD1、卷尾猴NeuroD1、狒狒NeuroD1、长臂猿NeuroD1和狐猴NeuroD1组成的组。
82.根据实施例80所述的方法，其中所述hNeuroD1包含编码与以下至少80％相同或相似的氨基酸编码序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:10。
83.根据实施例80所述的方法，其中所述hNeuroD1序列包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。
84.根据实施例73或74所述的方法，其中所述GFAP启动子是人GFAP(hGFAP)启动子。
85.根据实施例73或74所述的方法，其中所述GFAP启动子选自由黑猩猩GFAP启动子、倭黑猩猩GFAP启动子、红毛猩猩GFAP启动子、大猩猩GFAP启动子、猕猴GFAP启动子，狨猴GFAP启动子、卷尾猴GFAP启动子、狒狒GFAP启动子、长臂猿GFAP启动子和狐猴GFAP启动子组成的组。
86.根据实施例71至85中任一项所述的方法，其中所述DNA载体构建体进一步包含与以下至少80％相同的2A自切割肽序列：SEQ ID NO:3，或其互补序列。
87.根据实施例84所述的方法，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:4，或其互补序列。
88.根据实施例84所述的方法，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:12，或其互补序列。
89.根据实施例84所述的方法，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:15，或其互补序列。
90.根据实施例73或74所述的方法，其中所述增强子选自由来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子和巨细胞病毒(CMV)增强子组成的组。
91.根据实施例90所述的方法，其中所述EF1-α包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。
92.根据实施例90所述的方法，其中所述CMV增强子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。
93.根据实施例73或74所述的方法，其中所述嵌合内含子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。
94.根据实施例73或74所述的方法，其中所述嵌合内含子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。
95.根据实施例73或74所述的方法，其中所述WPRE包含与选自由以下项组成的组的核酸序列至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:7和18，或其互补序列。
96.根据实施例73或74所述的方法，其中所述多聚腺苷酸化信号选自由SV40多聚腺苷酸化信号、hGH多聚腺苷酸化信号和bGH多聚腺苷酸化信号组成的组。
97.根据实施例73或74所述的方法，其中所述SV40多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。
98.根据实施例73或74所述的方法，其中所述hGH多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。
99.根据实施例73或74所述的方法，其中所述bGH多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。
100.根据实施例73或74所述的方法，其中所述载体进一步包含编码AAV蛋白序列的核酸序列。
101.根据实施例71至74中任一项所述的方法，其中所述载体包含AAV血清型2反向末端重复序列(ITR)。
102.根据实施例71至74中任一项所述的方法，其中所述载体包含AAV血清型5反向末端重复序列(ITR)。
103.根据实施例71至74中任一项所述的方法，其中所述载体包含AAV血清型9反向末端重复序列(ITR)。
104.根据实施例71至74中任一项所述的方法，其中所述载体包含至少一个与以下至少80％相同的ITR核酸序列：SEQ ID NO:1。
105.根据实施例71至74中任一项所述的方法，其中所述载体包含至少一个与以下至少80％相同的ITR核酸序列：SEQ ID NO:9。
106.根据实施例71所述的方法，其中所述转化发生在中枢神经系统(CNS)或周围神经系统中。
107.根据实施例73所述的方法，其中所述转化发生在CNS中。
108.根据实施例73或74所述的方法，其中所述有此需要的受试者是哺乳动物。
109.根据实施例108所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
110.根据实施例108所述的方法，其中所述哺乳动物是非人灵长类动物。
111.根据实施例73或74所述的方法，其中所述递送包括局部施用。
112.根据实施例73或74所述的方法，其中所述递送包括全身施用。
113.根据实施例73或74所述的方法，其中所述递送包括选自由以下项组成的组的施用：腹膜内施用、肌肉内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、颅内、脑的侧脑室内、小脑延髓池内、玻璃体内、视网膜下内、实质内施用、鼻内施用和口服施用。
114.根据实施例71或72所述的方法，其中所述注射包括选自由以下项组成的组的注射：腹膜内注射、肌肉内注射、静脉内注射、鞘内注射、大脑内注射、颅内、脑的侧脑室内、小脑延髓池内、玻璃体内、视网膜下内、实质内注射、鼻内注射和经口注射。
115.根据实施例73或74所述的方法，其中所述递送包括注射。
116.根据实施例71、72或115中任一项所述的方法，其中所述注射以介于1010个颗粒/mL与1014个颗粒/mL之间的浓度进行。
117.根据实施例116所述的方法，其中所述注射进一步包括介于0.1ul/分钟与5.0ul/分钟之间的流速。
118.根据实施例73所述的方法，其中所述至少一种神经胶质细胞选自由至少一种星形胶质细胞和至少一种NG2细胞组成的组。
119.根据实施例71所述的方法，其中所述至少一种神经胶质细胞是至少一种星形胶质细胞。
120.根据实施例118或119所述的方法，其中所述至少一种星形胶质细胞是反应性星形胶质细胞。
121.根据实施例73所述的方法，其中所述神经元是功能性神经元。
122.根据实施例71、72和121中任一项所述的方法，其中所述功能性神经元选自由谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元组成的组。
123.根据实施例73所述的方法，其中与所述递送之前的所述受试者相比，所述受试者表现出至少一种神经系统病症症状的改善。
124.根据实施例123所述的方法，其中所述改善是在所述递送的1年内测量的。
125.根据实施例71、72或115中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述AAV直接注射到所述受试者的脑中。
126.根据实施例71或72中任一项所述的方法，其中所述转化是在所述脑的大脑皮层中。
127.根据实施例71、72或115中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述AAV直接注射到所述受试者的脊髓中。
128.根据实施例74所述的方法，其中所述神经系统病症包括中枢神经系统(CNS)或周围神经系统的损伤。
129.根据实施例74所述的方法，其中所述神经系统病症选自由以下项组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病、癫痫、物理性损伤、卒中、脑动脉瘤、外伤性脑损伤、脑震荡、肿瘤、炎症、感染、共济失调、脑萎缩、脊髓萎缩、多发性硬化症、外伤性脊髓损伤、缺血性或出血性脊髓病(脊髓病)、全脑缺血、缺氧缺血性脑病、栓塞、纤维软骨栓塞性脊髓病、血栓形成、肾病、慢性炎性疾病、脑膜炎、和脑静脉窦血栓形成。
130.根据实施例74所述的方法，其中所述神经系统病症是阿尔茨海默病。
131.根据实施例74所述的方法，其中所述神经系统病症是帕金森病。
132.根据实施例74所述的方法，其中所述神经系统病症是ALS。
133.根据实施例74所述的方法，其中所述神经系统病症是亨廷顿病。
134.根据实施例74所述的方法，其中所述神经系统病症是卒中。
135.根据实施例134所述的方法，其中所述卒中是缺血性卒中。
136.根据实施例134所述的方法，其中所述卒中是出血性卒中。
137.根据实施例74所述的方法，其中所述方法能够将至少一种神经胶质细胞转化为神经元。
138.根据实施例137所述的方法，其中所述神经胶质细胞选自由星形胶质细胞和NG2细胞组成的组。
139.根据实施例137所述的方法，其中所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。
140.根据实施例139所述的方法，其中所述星形胶质细胞是反应性星形胶质细胞。
141.根据实施例137所述的方法，其中所述神经胶质细胞是GFAP阳性的。
142.根据实施例137所述的方法，其中所述神经元是功能性神经元。
143.根据实施例142所述的方法，其中所述功能性神经元选自由谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元组成的组。
144.根据实施例71或72所述的方法，其中将治疗有效剂量的所述AAV载体注射到所述受试者中。
145.根据实施例73或74所述的方法，其中将治疗有效剂量的所述AAV载体递送到所述受试者中。
146.根据实施例144或145所述的方法，其中所述治疗有效剂量与药学上可接受的载体一起施用。
147.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，所述hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中该hNeuroD1序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：
(a)包含SEQ ID NO:15的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子；
(c)包含SEQ ID NO:16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含SEQ ID NO:18的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
148.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，所述hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中该hNeuroD1序列可操作地连接到调控元件，该调控元件包含：
(a)包含SEQ ID NO:15的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含SEQ ID NO:18的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
序列表
<110> NEUEXCELL THERAPEUTICS INC
<120> NEUROD1载体
<130> P34822WO00
<140>
<141>
<150> 63/246,545
<151> 2021-09-21
<150> 63/084,908
<151> 2020-09-29
<160> 21
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 1
tgcaggcagc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttcct 128
<210> 2
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 2
tgcaaagatg gataaagttt taaacagaga ggaatctttg cagctaatgg accttctagg 60
tcttgaaagg agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca 120
cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gca 153
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 3
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 4
<211> 1667
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 4
ctgcaagcag acctggcagc attgggctgg ccgcccccca gggcctcctc ttcatgccca 60
gtgaatgact caccttggca cagacacaat gttcggggtg ggcacagtgc ctgcttcccg 120
ccgcacccca gcccccctca aatgccttcc gagaagccca ttgagtaggg ggcttgcatt 180
gcaccccagc ctgacagcct ggcatcttgg gataaaagca gcacagcccc ctaggggctg 240
cccttgctgt gtggcgccac cggcggtgga gaacaaggct ctattcagcc tgtgcccagg 300
aaaggggatc aggggatgcc caggcatgga cagtgggtgg caggggggga gaggagggct 360
gtctgcttcc cagaagtcca aggacacaaa tgggtgaggg gactgggcag ggttctgacc 420
ctgtgggacc agagtggagg gcgtagatgg acctgaagtc tccagggaca acagggccca 480
ggtctcaggc tcctagttgg gcccagtggc tccagcgttt ccaaacccat ccatccccag 540
aggttcttcc catctctcca ggctgatgtg tgggaactcg aggaaataaa tctccagtgg 600
gagacggagg ggtggccagg gaaacggggc gctgcaggaa taaagacgag ccagcacagc 660
cagctcatgc gtaacggctt tgtggagctg tcaaggcctg gtctctggga gagaggcaca 720
gggaggccag acaaggaagg ggtgacctgg agggacagat ccaggggcta aagtcctgat 780
aaggcaagag agtgccggcc ccctcttgcc ctatcaggac ctccactgcc acatagaggc 840
catgattgac ccttagacaa agggctggtg tccaatccca gcccccagcc ccagaactcc 900
agggaatgaa tgggcagaga gcaggaatgt gggacatctg tgttcaaggg aaggactcca 960
ggagtctgct gggaatgagg cctagtagga aatgaggtgg cccttgaggg tacagaacag 1020
gttcattctt cgccaaattc ccagcacctt gcaggcactt acagctgagt gagataatgc 1080
ctgggttatg aaatcaaaaa gttggaaagc aggtcagagg tcatctggta cagcccttcc 1140
ttcccttttt tttttttttt ttttgtgaga caaggtctct ctctgttgcc caggctggag 1200
tggcgcaaac acagctcact gcagcctcaa cctactgggc tcaagcaatc ctccagcctc 1260
agcctcccaa agtgctggga ttacaagcat gagccacccc actcagccct ttccttcctt 1320
tttaattgat gcataataat tgtaagtatt catcatggtc caaccaaccc tttcttgacc 1380
caccttccta gagagagggt cctcttgatt cagcggtcag ggccccagac ccatggtctg 1440
gctccaggta ccacctgcct catgcaggag ttggcgtgcc caggaagctc tgcctctggg 1500
cacagtgacc tcagtggggt gaggggagct ctccccatag ctgggctgcg gcccaacccc 1560
accccctcag gctatgccag ggggtgttgc caggggcacc cgggcatcgc cagtctagcc 1620
cactccttca taaagccctc gcatcccagg agcgagcaga gccagag 1667
<210> 5
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 5
gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60
cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120
tttctctcca cag 133
<210> 6
<211> 1068
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
atgaccaaat cgtacagcga gagtgggctg atgggcgagc ctcagcccca aggtcctcca 60
agctggacag acgagtgtct cagttctcag gacgaggagc acgaggcaga caagaaggag 120
gacgacctcg aagccatgaa cgcagaggag gactcactga ggaacggggg agaggaggag 180
gacgaagatg aggacctgga agaggaggaa gaagaggaag aggaggatga cgatcaaaag 240
cccaagagac gcggccccaa aaagaagaag atgactaagg ctcgcctgga gcgttttaaa 300
ttgagacgca tgaaggctaa cgcccgggag cggaaccgca tgcacggact gaacgcggcg 360
ctagacaacc tgcgcaaggt ggtgccttgc tattctaaga cgcagaagct gtccaaaatc 420
gagactctgc gcttggccaa gaactacatc tgggctctgt cggagatcct gcgctcaggc 480
aaaagcccag acctggtctc cttcgttcag acgctttgca agggcttatc ccaacccacc 540
accaacctgg ttgcgggctg cctgcaactc aatcctcgga cttttctgcc tgagcagaac 600
caggacatgc ccccccacct gccgacggcc agcgcttcct tccctgtaca cccctactcc 660
taccagtcgc ctgggctgcc cagtccgcct tacggtacca tggacagctc ccatgtcttc 720
cacgttaagc ctccgccgca cgcctacagc gcagcgctgg agcccttctt tgaaagccct 780
ctgactgatt gcaccagccc ttcctttgat ggacccctca gcccgccgct cagcatcaat 840
ggcaacttct ctttcaaaca cgaaccgtcc gccgagtttg agaaaaatta tgcctttacc 900
atgcactatc ctgcagcgac actggcaggg gcccaaagcc acggatcaat cttctcaggc 960
accgctgccc ctcgctgcga gatccccata gacaatatta tgtccttcga tagccattca 1020
catcatgagc gagtcatgag tgcccagctc aatgccatat ttcatgat 1068
<210> 7
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 7
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 8
<211> 251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 8
cgatccaccg gatctagata actgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta 60
cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt 120
gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca 180
aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 240
aatgtatctt a 251
<210> 9
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 9
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgca 139
<210> 10
<211> 356
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Thr Lys Ser Tyr Ser Glu Ser Gly Leu Met Gly Glu Pro Gln Pro
1 5 10 15
Gln Gly Pro Pro Ser Trp Thr Asp Glu Cys Leu Ser Ser Gln Asp Glu
20 25 30
Glu His Glu Ala Asp Lys Lys Glu Asp Asp Leu Glu Ala Met Asn Ala
35 40 45
Glu Glu Asp Ser Leu Arg Asn Gly Gly Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu
50 55 60
Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys
65 70 75 80
Pro Lys Arg Arg Gly Pro Lys Lys Lys Lys Met Thr Lys Ala Arg Leu
85 90 95
Glu Arg Phe Lys Leu Arg Arg Met Lys Ala Asn Ala Arg Glu Arg Asn
100 105 110
Arg Met His Gly Leu Asn Ala Ala Leu Asp Asn Leu Arg Lys Val Val
115 120 125
Pro Cys Tyr Ser Lys Thr Gln Lys Leu Ser Lys Ile Glu Thr Leu Arg
130 135 140
Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Trp Ala Leu Ser Glu Ile Leu Arg Ser Gly
145 150 155 160
Lys Ser Pro Asp Leu Val Ser Phe Val Gln Thr Leu Cys Lys Gly Leu
165 170 175
Ser Gln Pro Thr Thr Asn Leu Val Ala Gly Cys Leu Gln Leu Asn Pro
180 185 190
Arg Thr Phe Leu Pro Glu Gln Asn Gln Asp Met Pro Pro His Leu Pro
195 200 205
Thr Ala Ser Ala Ser Phe Pro Val His Pro Tyr Ser Tyr Gln Ser Pro
210 215 220
Gly Leu Pro Ser Pro Pro Tyr Gly Thr Met Asp Ser Ser His Val Phe
225 230 235 240
His Val Lys Pro Pro Pro His Ala Tyr Ser Ala Ala Leu Glu Pro Phe
245 250 255
Phe Glu Ser Pro Leu Thr Asp Cys Thr Ser Pro Ser Phe Asp Gly Pro
260 265 270
Leu Ser Pro Pro Leu Ser Ile Asn Gly Asn Phe Ser Phe Lys His Glu
275 280 285
Pro Ser Ala Glu Phe Glu Lys Asn Tyr Ala Phe Thr Met His Tyr Pro
290 295 300
Ala Ala Thr Leu Ala Gly Ala Gln Ser His Gly Ser Ile Phe Ser Gly
305 310 315 320
Thr Ala Ala Pro Arg Cys Glu Ile Pro Ile Asp Asn Ile Met Ser Phe
325 330 335
Asp Ser His Ser His His Glu Arg Val Met Ser Ala Gln Leu Asn Ala
340 345 350
Ile Phe His Asp
355
<210> 11
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 11
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg 380
<210> 12
<211> 2214
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
cgcgtcccac ctccctctct gtgctgggac tcacagaggg agacctcagg aggcagtctg 60
tccatcacat gtccaaatgc agagcatacc ctgggctggg cgcagtggcg cacaactgta 120
attccagcac tttgggaggc tgatgtggaa ggatcacttg agcccagaag ttctagacca 180
gcctgggcaa catggcaaga ccctatctct acaaaaaaag ttaaaaaatc agccacgtgt 240
ggtgacacac acctgtagtc ccagctattc aggaggctga ggtgagggga tcacttaagg 300
ctgggaggtt gaggctgcag tgagtcgtgg ttgcgccact gcactccagc ctgggcaaca 360
gtgagaccct gtctcaaaag acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagaaca tatcctggtg 420
tggagtaggg gacgctgctc tgacagaggc tcgggggcct gagctggctc tgtgagctgg 480
ggaggaggca gacagccagg ccttgtctgc aagcagacct ggcagcattg ggctggccgc 540
cccccagggc ctcctcttca tgcccagtga atgactcacc ttggcacaga cacaatgttc 600
ggggtgggca cagtgcctgc ttcccgccgc accccagccc ccctcaaatg ccttccgaga 660
agcccattga gcagggggct tgcattgcac cccagcctga cagcctggca tcttgggata 720
aaagcagcac agccccctag gggctgccct tgctgtgtgg cgccaccggc ggtggagaac 780
aaggctctat tcagcctgtg cccaggaaag gggatcaggg gatgcccagg catggacagt 840
gggtggcagg gggggagagg agggctgtct gcttcccaga agtccaagga cacaaatggg 900
tgaggggact gggcagggtt ctgaccctgt gggaccagag tggagggcgt agatggacct 960
gaagtctcca gggacaacag ggcccaggtc tcaggctcct agttgggccc agtggctcca 1020
gcgtttccaa acccatccat ccccagaggt tcttcccatc tctccaggct gatgtgtggg 1080
aactcgagga aataaatctc cagtgggaga cggaggggtg gccagggaaa cggggcgctg 1140
caggaataaa gacgagccag cacagccagc tcatgtgtaa cggctttgtg gagctgtcaa 1200
ggcctggtct ctgggagaga ggcacaggga ggccagacaa ggaaggggtg acctggaggg 1260
acagatccag gggctaaagt cctgataagg caagagagtg ccggccccct cttgccctat 1320
caggacctcc actgccacat agaggccatg attgaccctt agacaaaggg ctggtgtcca 1380
atcccagccc ccagccccag aactccaggg aatgaatggg cagagagcag gaatgtggga 1440
catctgtgtt caagggaagg actccaggag tctgctggga atgaggccta gtaggaaatg 1500
aggtggccct tgagggtaca gaacaggttc attcttcgcc aaattcccag caccttgcag 1560
gcacttacag ctgagtgaga taatgcctgg gttatgaaat caaaaagttg gaaagcaggt 1620
cagaggtcat ctggtacagc ccttccttcc cttttttttt tttttttttt gtgagacaag 1680
gtctctctct gttgcccagg ctggagtggc gcaaacacag ctcactgcag cctcaaccta 1740
ctgggctcaa gcaatcctcc agcctcagcc tcccaaagtg ctgggattac aagcatgagc 1800
caccccactc agccctttcc ttccttttta attgatgcat aataattgta agtattcatc 1860
atggtccaac caaccctttc ttgacccacc ttcctagaga gagggtcctc ttgcttcagc 1920
ggtcagggcc ccagacccat ggtctggctc caggtaccac ctgcctcatg caggagttgg 1980
cgtgcccagg aagctctgcc tctgggcaca gtgacctcag tggggtgagg ggagctctcc 2040
ccatagctgg gctgcggccc aaccccaccc cctcaggcta tgccaggggg tgttgccagg 2100
ggcacccggg catcgccagt ctagcccact ccttcataaa gccctcgcat cccaggagcg 2160
agcagagcca gagcaggttg gagaggagac gcatcacctc cgctgctcgc cggg 2214
<210> 13
<211> 477
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60
gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120
ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180
acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 240
ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 300
ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 360
ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 420
tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtcctt 477
<210> 14
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 14
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagagaa tagcaggcat gctgggga 208
<210> 15
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 15
aacatatcct ggtgtggagt aggggacgct gctctgacag aggctcgggg gcctgagctg 60
gctctgtgag ctggggagga ggcagacagc caggccttgt ctgcaagcag acctggcagc 120
attgggctgg ccgcccccca gggcctcctc ttcatgccca gtgaatgact caccttggca 180
cagacacaat gttcggggtg ggcacagtgc ctgcttcccg ccgcacccca gcccccctca 240
aatgccttcc gagaagccca ttgagcaggg ggcttgcatt gcaccccagc ctgacagcct 300
ggcatcttgg gataaaagca gcacagcccc ctaggggctg cccttgctgt gtggcgccac 360
cggcggtgga gaacaaggct ctattcagcc tgtgcccagg aaaggggatc aggggatgcc 420
caggcatgga cagtgggtgg caggggggga gaggagggct gtctgcttcc cagaagtcca 480
aggacacaaa tgggtgaggg gagagctctc cccatagctg ggctgcggcc caaccccacc 540
ccctcaggct atgccagggg gtgttgccag gggcacccgg gcatcgccag tctagcccac 600
tccttcataa agccctcgca tcccaggagc gagcagagcc agagcaggtt ggagaggaga 660
cgcatcacct ccgctgctcg c 681
<210> 16
<211> 1062
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 16
ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60
cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctccctcc 120
gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 180
ccttaaaggg ctccgggagg gcctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 240
gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc 300
gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg ggccgggggc 360
ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 420
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctggcaccc 480
ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgtg cggggcgtgg 540
cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg 600
gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggccccggag cgccggcggc 660
tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag 720
ggacttcctt tgtcccaaat ctggcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 780
ctagcgggcg cgggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct 840
tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccatctccag cctcggggct gccgcagggg 900
gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc 960
ggctttagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc 1020
aacgtgctgg ttgttgtgct gtctcatcat tttggcaaag at 1062
<210> 17
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 17
ggccactgtg aggcagaagt gaggagggga tggggaaggg gggccttgtg agcagaaggg 60
gctgaatccc caagaaggag tgcccgagaa gtctcaggga ggggccgaac ctccctgctc 120
cctgggcctc cctacctctt gatggggcac tatccttgcc ccccaacatg atgggaggga 180
ccagaaacag gcccagggcc ccggggatct gatgcccgca tgccttctgc caggagtcca 240
gggtcccctc agcacctccc tactggggaa agcagtgcag gagcagcggg gcccctgtgt 300
ttcattcatg gctgggcttt gtgactgtgg gcagcgagct cacctattct gagcctgtgt 360
ccatataaag gaggagttgg aagcggagaa ggttgatgtc catgagggag attggattct 420
ggggtgaaga aagtgaggga aagagcaggc aggtctgggc gcaaagcaca ggtgactgcc 480
tgccaccagc ttgtgacccc catcaagtta ctttgacttg cacagctgtg aagcggtggt 540
cataataaaa ttcatttcaa aaggtggtta cctgggatca gaggaatccc caggggcatg 600
gcgcttcact gagctgacag gacatgcatg tgtgccttca agtgcaggag gacatgtgcg 660
tgtgtgtgtg tgtgtgtgca acagtgagtg tatgcttgtg gatgcgcctg tgtgagcaga 720
agcaggtgca ccaaccctga taaggcacct tagtaatgag ttaaggcaaa agcccacatc 780
tgctcatcct ccagacaagt cctctgtcta aggcccccca acccttaatc ctcctgctgc 840
tctactggtc ctgggtgggg gtggtctctg tgacagctgc ctcaagggag actgaggcag 900
gtattcaagt gtcctcagaa gagcctggac ccaggaatgt gtccccccac tccaggctcc 960
aggatgaaac caacctga 978
<210> 18
<211> 581
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<400> 18
gagcatctta ccgccattta tacccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60
ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120
actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180
tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240
aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300
attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360
ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420
gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480
ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540
ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成引物
<400> 19
ggaaccccta gtgatggagt t 21
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成引物
<400> 20
cggcctcagt gagcga 16
<210> 21
<211> 300
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成多核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(300)
<223> 该序列可能涵盖50至300个核苷酸
<220>
<223> 关于替代和优选实施例的详细描述请参见提交的说明书
<400> 21
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
Claims (148)
1.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，所述hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中所述hNeuroD1序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
2.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸编码序列，所述hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中所述编码序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)具有SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
3.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码神经源性分化因子1(NeuroD1)蛋白的NeuroD1核酸编码序列，其中所述编码序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)增强子；
(c)嵌合内含子；
(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)多聚腺苷酸化信号序列。
4.一种用于将人的神经胶质细胞转化为功能性神经元的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中所述AAV载体包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，所述hNeuroD1序列具有SEQ ID NO:6的核酸序列，并且其中所述序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
5.一种用于将人的神经胶质细胞转化为功能性神经元的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中所述AAV载体包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸序列，所述hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸编码序列，并且其中所述编码序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ IDNO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
6.一种用于治疗有此需要的受试者的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，其中所述AAV载体包含可操作地连接到表达控制元件的神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，所述表达控制元件包含：
(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)增强子；
(c)嵌合内含子；
(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)多聚腺苷酸化信号。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的AAV载体或根据权利要求4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体选自由AAV血清型2、AAV血清型5和AAV血清型9组成的组。
8.根据权利要求7所述的AAV载体或组合物，其中所述AAV载体是AAV血清型2。
9.根据权利要求7所述的AAV载体或组合物，其中所述AAV载体是AAV血清型5。
10.根据权利要求7所述的AAV载体或组合物，其中所述AAV载体是AAV血清型9。
11.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述神经胶质细胞是反应性星形胶质细胞。
12.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述功能性神经元选自由谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元组成的组。
13.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述人患有神经系统病症。
14.根据权利要求3所述的AAV载体或根据权利要求6所述的组合物，其中所述NeuroD1是人NeuroD1(hNeuroD1)。
15.根据权利要求3所述的AAV载体或根据权利要求6所述的组合物，其中所述NeuroD1选自由黑猩猩NeuroD1、倭黑猩猩NeuroD1、红毛猩猩NeuroD1、大猩猩NeuroD1、猕猴NeuroD1、狨猴NeuroD1、卷尾猴NeuroD1、狒狒NeuroD1、长臂猿NeuroD1和狐猴NeuroD1组成的组。
16.根据权利要求14所述的AAV载体或组合物，其中所述hNeuroD1包含编码与以下至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸编码序列：SEQ ID NO:10。
17.根据权利要求14所述的AAV载体或组合物，其中所述hNeuroD1序列包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。
18.根据权利要求3所述的AAV载体或根据权利要求6所述的组合物，其中所述GFAP启动子是人GFAP(hGFAP)启动子。
19.根据权利要求3所述的AAV载体或根据权利要求6所述的组合物，其中所述GFAP启动子选自由黑猩猩GFAP启动子、倭黑猩猩GFAP启动子、红毛猩猩GFAP启动子、大猩猩GFAP启动子、猕猴GFAP启动子，狨猴GFAP启动子、卷尾猴GFAP启动子、狒狒GFAP启动子、长臂猿GFAP启动子和狐猴GFAP启动子组成的组。
20.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体或组合物，其中所述AAV载体进一步包含与以下至少80％相同的2A自切割肽序列：SEQ ID NO:3，或其互补序列。
21.根据权利要求18所述的AAV载体或组合物，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:4，或其互补序列。
22.根据权利要求18所述的AAV载体或组合物，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:12，或其互补序列。
23.根据权利要求18所述的AAV载体或组合物，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:15，或其互补序列。
24.根据权利要求3所述的AAV载体或根据权利要求6所述的组合物，其中所述增强子选自由来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子和巨细胞病毒(CMV)增强子组成的组。
25.根据权利要求24所述的AAV载体或组合物，其中所述EF1-α包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。
26.根据权利要求24所述的AAV载体或组合物，其中所述CMV增强子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。
27.根据权利要求3所述的AAV载体或根据权利要求6所述的组合物，其中所述嵌合内含子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。
28.根据权利要求3所述的AAV载体或根据权利要求6所述的组合物，其中所述嵌合内含子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。
29.根据权利要求3所述的AAV载体或根据权利要求6所述的组合物，其中所述WPRE包含与选自由以下项组成的组的核酸序列至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:7和18，或其互补序列。
30.根据权利要求3所述的AAV载体或根据权利要求6所述的组合物，其中所述多聚腺苷酸化信号选自由SV40多聚腺苷酸化信号和hGH多聚腺苷酸化信号组成的组。
31.根据权利要求30所述的AAV载体或组合物，其中所述SV40多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。
32.根据权利要求30所述的AAV载体或组合物，其中所述hGH多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。
33.根据权利要求30所述的AAV载体或组合物，其中所述bGH多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。
34.根据权利要求3所述的AAV载体或根据权利要求6所述的组合物，其中所述AAV载体进一步包含编码AAV蛋白序列的核酸序列。
35.根据权利要求1至3中任一项所述的AAV载体或根据权利要求4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体包含AAV血清型2反向末端重复序列(ITR)。
36.根据权利要求1至3中任一项所述的AAV载体或根据权利要求4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体包含AAV血清型5反向末端重复序列(ITR)。
37.根据权利要求1至3中任一项所述的AAV载体或根据权利要求4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体包含AAV血清型9反向末端重复序列(ITR)。
38.根据权利要求1至3中任一项所述的AAV载体或根据权利要求4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体包含至少一个与以下至少80％相同的ITR核酸序列：SEQ ID NO:1。
39.根据权利要求1至3中任一项所述的AAV载体或根据权利要求4至6中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体包含至少一个与以下至少80％相同的ITR核酸序列：SEQ ID NO:9。
40.根据权利要求6所述的组合物，其中所述有此需要的受试者是哺乳动物。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述哺乳动物是人。
42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述哺乳动物是非人灵长类动物。
43.根据权利要求6所述的组合物，其中所述有此需要的受试者患有神经系统病症。
44.根据权利要求13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症包括中枢神经系统(CNS)或周围神经系统的损伤。
45.根据权利要求13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症包括CNS的损伤。
46.根据权利要求13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症选自由以下项组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病、癫痫、物理性损伤、卒中、脑动脉瘤、外伤性脑损伤、脑震荡、肿瘤、炎症、感染、共济失调、脑萎缩、脊髓萎缩、多发性硬化症、外伤性脊髓损伤、缺血性或出血性脊髓病(脊髓病)、全脑缺血、缺氧缺血性脑病、栓塞、纤维软骨栓塞性脊髓病、血栓形成、肾病、慢性炎性疾病、脑膜炎、和脑静脉窦血栓形成。
47.根据权利要求13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症是阿尔茨海默病。
48.根据权利要求13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症是帕金森病。
49.根据权利要求13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症是ALS。
50.根据权利要求13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症是亨廷顿病。
51.根据权利要求13或43所述的组合物，其中所述神经系统病症是卒中。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述卒中是缺血性卒中。
53.根据权利要求51所述的组合物，其中所述卒中是出血性卒中。
54.根据权利要求43所述的组合物，其中所述组合物能够将至少一种神经胶质细胞转化为神经元。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述神经胶质细胞选自由星形胶质细胞和NG2细胞组成的组。
56.根据权利要求54所述的组合物，其中所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述星形胶质细胞是反应性星形胶质细胞。
58.根据权利要求54所述的组合物，其中所述神经胶质细胞是GFAP阳性的。
59.根据权利要求54所述的组合物，其中所述神经元是功能性神经元。
60.根据权利要求54所述的组合物，其中所述功能性神经元选自由谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元组成的组。
61.根据权利要求60所述的组合物，其中所述功能性神经元是谷氨酸能神经元。
62.根据权利要求6所述的组合物，其中所述组合物被配制以递送给有此需要的受试者。
63.根据权利要求62所述的组合物，其中所述组合物被配制以用于局部递送。
64.根据权利要求62所述的组合物，其中所述组合物被配制以用于全身递送。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制以用于经由腹膜内、肌肉内、静脉内、鞘内、大脑内、颅内、脑的侧脑室内、小脑延髓池内、玻璃体内、视网膜下内、实质内、鼻内或口服施用进行的递送。
66.一种方法，其包括将根据权利要求6所述的组合物递送给所述有此需要的受试者。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述组合物被配制以递送给有此需要的受试者。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述递送包括局部施用。
69.根据权利要求66所述的方法，其中所述递送包括全身施用。
70.根据权利要求66至69中任一项所述的方法，其中所述递送包括腹膜内、肌肉内、静脉内、鞘内、大脑内、颅内、脑的侧脑室内、小脑延髓池内、玻璃体内、视网膜下内、实质内、鼻内或口服施用。
71.一种将活人脑中的反应性星形胶质细胞转化为功能性神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)注射到有此需要的受试者中，其中所述AAV包含DNA载体构建体，所述DNA载体构建体包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，所述hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中所述序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
72.一种将活人脑中的反应性星形胶质细胞转化为功能性神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)注射到有此需要的受试者中，其中所述AAV包含DNA载体构建体，所述DNA载体构建体包含编码人神经源性分化因子1(hNeuroD1)蛋白的核酸序列，所述hNeuroD1蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸编码序列，其中所述编码序列可操作地连接到表达控制元件，所述表达控制元件包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:4、12和15组成的组的核酸序列的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的增强子或包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:5或16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含选自由SEQ ID NO:7和18组成的组的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:8的核酸序列的SV40多聚腺苷酸化信号序列、包含SEQ ID NO:13的核酸序列的hGH多聚腺苷酸化序列或包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
73.一种将有此需要的受试者的神经胶质细胞转化为神经元的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)递送至所述有此需要的受试者，其中所述AAV包含DNA载体构建体，所述DNA载体构建体包含神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，所述NeuroD1序列可操作地连接到表达控制元件，所述表达控制元件包含：
(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)增强子；
(c)嵌合内含子；
(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)和多聚腺苷酸化信号序列，
其中所述载体能够将所述有此需要的受试者的至少一种神经胶质细胞转化为神经元。
74.一种治疗有此需要的受试者的神经系统病症的方法，其包括：将腺相关病毒(AAV)递送至所述受试者，其中给予所述有此需要的受试者的所述AAV包含DNA载体构建体，所述DNA载体构建体包含可操作地连接到表达控制元件的神经源性分化因子1(NeuroD1)序列，所述表达控制元件包含：
(a)神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)增强子；
(c)嵌合内含子；
(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)多聚腺苷酸化信号。
75.根据权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述AAV选自由AAV血清型2、AAV血清型5和AAV血清型9组成的组。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述AAV是AAV血清型2。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述AAV是AAV血清型5。
78.根据权利要求75所述的方法，其中所述AAV是AAV血清型9。
79.根据权利要求71或72所述的方法，其中所述功能性神经元是谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元。
80.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述NeuroD1是人NeuroD1(hNeuroD1)。
81.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述NeuroD1选自由黑猩猩NeuroD1、倭黑猩猩NeuroD1、红毛猩猩NeuroD1、大猩猩NeuroD1、猕猴NeuroD1、狨猴NeuroD1、卷尾猴NeuroD1、狒狒NeuroD1、长臂猿NeuroD1和狐猴NeuroD1组成的组。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述hNeuroD1包含编码与以下至少80％相同或相似的氨基酸编码序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:10。
83.根据权利要求80所述的方法，其中所述hNeuroD1序列包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:6，或其互补序列。
84.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述GFAP启动子是人GFAP(hGFAP)启动子。
85.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述GFAP启动子选自由黑猩猩GFAP启动子、倭黑猩猩GFAP启动子、红毛猩猩GFAP启动子、大猩猩GFAP启动子、猕猴GFAP启动子，狨猴GFAP启动子、卷尾猴GFAP启动子、狒狒GFAP启动子、长臂猿GFAP启动子和狐猴GFAP启动子组成的组。
86.根据权利要求71至85中任一项所述的方法，其中所述DNA载体构建体进一步包含与以下至少80％相同的2A自切割肽序列：SEQ ID NO:3，或其互补序列。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:4，或其互补序列。
88.根据权利要求84所述的方法，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:12，或其互补序列。
89.根据权利要求84所述的方法，其中所述hGFAP启动子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:15，或其互补序列。
90.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述增强子选自由来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子和巨细胞病毒(CMV)增强子组成的组。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述EF1-α包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:2，或其互补序列。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述CMV增强子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:11，或其互补序列。
93.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述嵌合内含子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:5，或其互补序列。
94.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述嵌合内含子包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:16，或其互补序列。
95.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述WPRE包含与选自由以下项组成的组的核酸序列至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:7和18，或其互补序列。
96.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述多聚腺苷酸化信号选自由SV40多聚腺苷酸化信号、hGH多聚腺苷酸化信号和bGH多聚腺苷酸化信号组成的组。
97.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述SV40多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:8，或其互补序列。
98.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述hGH多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13，或其互补序列。
99.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述bGH多聚腺苷酸化信号包含与以下至少80％相同的核酸序列：SEQ ID NO:14，或其互补序列。
100.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述载体进一步包含编码AAV蛋白序列的核酸序列。
101.根据权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述载体包含AAV血清型2反向末端重复序列(ITR)。
102.根据权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述载体包含AAV血清型5反向末端重复序列(ITR)。
103.根据权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述载体包含AAV血清型9反向末端重复序列(ITR)。
104.根据权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述载体包含至少一个与以下至少80％相同的ITR核酸序列：SEQ ID NO:1。
105.根据权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述载体包含至少一个与以下至少80％相同的ITR核酸序列：SEQ ID NO:9。
106.根据权利要求71所述的方法，其中所述转化发生在中枢神经系统(CNS)或周围神经系统中。
107.根据权利要求73所述的方法，其中所述转化发生在CNS中。
108.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述有此需要的受试者是哺乳动物。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
110.根据权利要求108所述的方法，其中所述哺乳动物是非人灵长类动物。
111.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述递送包括局部施用。
112.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述递送包括全身施用。
113.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述递送包括选自由以下项组成的组的施用：腹膜内施用、肌肉内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、颅内、脑的侧脑室内、小脑延髓池内、玻璃体内、视网膜下内、实质内施用、鼻内施用和口服施用。
114.根据权利要求71或72所述的方法，其中所述注射包括选自由以下项组成的组的注射：腹膜内注射、肌肉内注射、静脉内注射、鞘内注射、大脑内注射、颅内、脑的侧脑室内、小脑延髓池内、玻璃体内、视网膜下内、实质内注射、鼻内注射和经口注射。
115.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述递送包括注射。
116.根据权利要求71、72或115中任一项所述的方法，其中所述注射以介于1010个颗粒/mL与1014个颗粒/mL之间的浓度进行。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述注射进一步包括介于0.1ul/分钟与5.0ul/分钟之间的流速。
118.根据权利要求73所述的方法，其中所述至少一种神经胶质细胞选自由至少一种星形胶质细胞和至少一种NG2细胞组成的组。
119.根据权利要求71所述的方法，其中所述至少一种神经胶质细胞是至少一种星形胶质细胞。
120.根据权利要求118或119所述的方法，其中所述至少一种星形胶质细胞是反应性星形胶质细胞。
121.根据权利要求73所述的方法，其中所述神经元是功能性神经元。
122.根据权利要求71、72和121中任一项所述的方法，其中所述功能性神经元选自由谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元组成的组。
123.根据权利要求73所述的方法，其中与所述递送之前的所述受试者相比，所述受试者表现出至少一种神经系统病症症状的改善。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述改善是在所述递送的1年内测量的。
125.根据权利要求71、72或115中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述AAV直接注射到所述受试者的脑中。
126.根据权利要求71或72中任一项所述的方法，其中所述转化是在所述脑的大脑皮层中。
127.根据权利要求71、72或115中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述AAV直接注射到所述受试者的脊髓中。
128.根据权利要求74所述的方法，其中所述神经系统病症包括中枢神经系统(CNS)或周围神经系统的损伤。
129.根据权利要求74所述的方法，其中所述神经系统病症选自由以下项组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病、癫痫、物理性损伤、卒中、脑动脉瘤、外伤性脑损伤、脑震荡、肿瘤、炎症、感染、共济失调、脑萎缩、脊髓萎缩、多发性硬化症、外伤性脊髓损伤、缺血性或出血性脊髓病(脊髓病)、全脑缺血、缺氧缺血性脑病、栓塞、纤维软骨栓塞性脊髓病、血栓形成、肾病、慢性炎性疾病、脑膜炎、和脑静脉窦血栓形成。
130.根据权利要求74所述的方法，其中所述神经系统病症是阿尔茨海默病。
131.根据权利要求74所述的方法，其中所述神经系统病症是帕金森病。
132.根据权利要求74所述的方法，其中所述神经系统病症是ALS。
133.根据权利要求74所述的方法，其中所述神经系统病症是亨廷顿病。
134.根据权利要求74所述的方法，其中所述神经系统病症是卒中。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述卒中是缺血性卒中。
136.根据权利要求134所述的方法，其中所述卒中是出血性卒中。
137.根据权利要求74所述的方法，其中所述方法能够将至少一种神经胶质细胞转化为神经元。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述神经胶质细胞选自由星形胶质细胞和NG2细胞组成的组。
139.根据权利要求137所述的方法，其中所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述星形胶质细胞是反应性星形胶质细胞。
141.根据权利要求137所述的方法，其中所述神经胶质细胞是GFAP阳性的。
142.根据权利要求137所述的方法，其中所述神经元是功能性神经元。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述功能性神经元选自由谷氨酸能神经元、GABA能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、肾上腺素能神经元、运动神经元和肽能神经元组成的组。
144.根据权利要求71或72所述的方法，其中将治疗有效剂量的所述AAV载体注射到所述受试者中。
145.根据权利要求73或74所述的方法，其中将治疗有效剂量的所述AAV载体递送到所述受试者中。
146.根据权利要求144或145所述的方法，其中所述治疗有效剂量与药学上可接受的载体一起施用。
147.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，所述hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中所述hNeuroD1序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含SEQ ID NO:15的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的来自人延伸因子-1α(EF1-α)启动子的增强子；
(c)包含SEQ ID NO:16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含SEQ ID NO:18的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
148.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含人神经源性分化因子1(hNeuroD1)序列，所述hNeuroD1序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列，其中所述hNeuroD1序列可操作地连接到调控元件，所述调控元件包含：
(a)包含SEQ ID NO:15的核酸序列的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；
(b)包含SEQ ID NO:11的核酸序列的巨细胞病毒(CMV)增强子；
(c)包含SEQ ID NO:16的核酸序列的嵌合内含子；
(d)包含SEQ ID NO:18的核酸序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；和
(e)包含SEQ ID NO:14的核酸序列的bGH多聚腺苷酸化序列。
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