JP2023537980A - メチルｃｐｇ結合タンパク質２（ｍｅｃｐ２）プロモータ配列を含む核酸構築体を用いた遺伝子治療 - Google Patents

メチルｃｐｇ結合タンパク質２（ｍｅｃｐ２）プロモータ配列を含む核酸構築体を用いた遺伝子治療 Download PDF

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Abstract

本発明は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモータ配列を含む核酸構築体に関する。本発明はさらに、前記核酸構築体を含むベクター、ウイルスベクター、宿主細胞、及び医薬組成物に関する。本発明はまた、前記核酸構築体、ベクター、ウイルスベクター、及び医薬組成物の治療的使用に関する。

Description

本発明は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモータ配列を含む核酸構築体に関する。本発明はさらに、前記核酸構築体を含むベクター、ウイルスベクター、宿主細胞、及び医薬組成物に関する。本発明はまた、前記核酸構築体、ベクター、ウイルスベクター、及び医薬組成物の治療的使用に関する。
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、アルツハイマー病（Ｏｌｎｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．２０１７ Ｍａｙ；３５（２）：３３９－３７４）に続いて２番目に一般的なタイプの認知症である。タンパク質プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするＧＲＮ遺伝子の１つの対立遺伝子内の変異が、ＦＴＤの発症と関連する（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ Ａｕｇ ２４；４４２（７１０５）：９１６－９１９）。ＧＲＮ内のホモ接合変異は、神経セロイドリポフスチン症１１（ＮＣＬ１１）と関連し、これは、小脳性運動失調、発作、色素性網膜炎、及び認知障害によって特徴付けられ、通常は１３歳～２５歳の間に始まる（Ｆａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ．２０２０；１４３（１）：３０３－３１）。
種々の変異が、ＰＧＲＮの機能の喪失を引き起こし得る。ＰＧＲＮ欠損マウスモデルにおいて、ＡＡＶ遺伝子治療アプローチを用いてＰＧＲＮのニューロン発現を駆動することにより、ＦＴＤと関連する行動障害が修正されることが示されている（Ａｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ．２０１７；１４０．５：１４４７－１４６５）。ゆえに、中枢神経系（ＣＮＳ）の組織及び細胞におけるＰＧＲＮのレベルを増大させて、ＰＧＲＮ欠乏と関連する神経疾患を処置する治療アプローチについて、強い生物学的根拠がある。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、臨床障害を処置するための分子治療薬を送達するのに一般的に用いられるビヒクルである。多くのＡＡＶベースの治療が、遺伝子置換療法である。しかしながら、ロバストなＡＡＶ生成及び導入遺伝子発現を実現するために、注目する導入遺伝子を含むＡＡＶ構築体は、ＡＡＶの最適なパッケージングを可能にするために４．１ｋｂ～４．７ｋｂであるべきである。いわゆる「スタッファー配列」又は不活性ＤＮＡが、導入遺伝子又はベクター骨格に加えられて、構築体の全長を延ばすことができる。しかしながら、ベクターは、スタッファー配列に感受性であるので、導入遺伝子発現、患者の免疫応答、及びＡＡＶパッケージング効率に悪影響を及ぼさないように慎重に選択しなければならない。全長をＡＡＶ構築体中に組み込む別のアプローチは、導入遺伝子配列自体を改変するものである。しかしながら、このアプローチは、天然の（野生型）導入遺伝子ヌクレオチド配列を用いることが望ましい場合には、適切でない場合がある。
ＡＡＶ構築体の全長を延ばすための更なるアプローチは、操作された（engineered）プロモータ配列を含めることによるものである。そのようなプロモータは、適切なインビボ導入遺伝子発現レベルを確実にするように慎重に選択されなければならない。さらに、ＰＧＲＮ遺伝子治療の場合のように、部位特異的な導入遺伝子発現が神経障害の処置に必要とされる場合、所望の組織又は細胞型における注目する導入遺伝子の標的発現を実現するプロモータの選択が重要である。
典型的には、ＰＧＲＮコード配列をコードするヌクレオチド配列は、約１．８ｋｂ長であり、これは、核酸構築体をＡＡＶ中にパッケージングするための最適な４．１～４．７ｋｂ長よりもかなり短い。ゆえに、ウイルスベクター構築体の長さを延ばすと同時に、ＰＧＲＮのロバストなＣＮＳ標的発現を実現するのに用いることができるプロモータ配列が、依然として必要とされている。
メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）遺伝子に由来するプロモータは、遺伝子治療の場において、ＰＧＲＮのＣＮＳ標的発現を駆動するのに非常に有効であることが見出された。そのようなプロモータは、ニューロン特異的エノラーゼ１（ＮＳＥ１）遺伝子に由来するもの等の代替的なＣＮＳ特異的プロモータを含む等価なプロモータよりも高いＰＧＲＮ発現及び形質導入効率を実現することが観察された。
また、本発明者らは、２０００ｂｐを超える操作されたＭｅＣＰ２プロモータを生成した。最小ＭｅＣＰ２プロモータ配列に加えて、当該操作されたＭｅＣＰ２プロモータは、追加のイントロンを含む。当該イントロンのヌクレオチド配列は、ＭＥＣＰ２遺伝子の天然に存在するストレッチ（天然イントロン）に由来したか、又はＭＥＣＰ２遺伝子に由来する異なる配列（合成イントロン）を組み合わせることによって構築した。本発明の操作されたＭｅＣＰ２プロモータを含む遺伝子治療構築体は、最小プロモータを含む構築体と比較して、ＣＮＳ細胞のより高い発現レベル及び／又は向上した形質導入効率を実現することが見出された。さらに、合成イントロンを含むＭｅＣＰ２プロモータは、最も高い発現レベル及び形質導入効率を実現することが見出された。
ゆえに、本発明は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモータを含む核酸構築体を提供する。
また、本発明は、注目するタンパク質（ＰＯＩ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された操作されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモータを含む核酸構築体を提供し、操作されたＭｅＣＰ２プロモータは、最小プロモータ配列及び少なくとも１つのイントロンを含む。
本発明はさらに、本発明の核酸構築体を含むベクターを提供する。ベクターは、プラスミドであってもウイルスベクターであってもよい。
本発明はさらに、本発明の核酸構築体及び／もしくは本発明のベクターを含み、及び／又は本発明のウイルスベクターを生成する宿主細胞を提供し、任意に宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
本発明によってさらに提供されるのは、本発明の核酸構築体、本発明のベクター、及び／又は本発明のウイルスベクターを、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と一緒に含む医薬組成物である。
また、本発明によってさらに提供されるのは、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において当該疾患を処置又は予防する方法に用いられる本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物である。
本発明はさらに、ログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において当該疾患を処置又は予防する方法であって、患者に、治療有効量の本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
また、本発明は、本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物の、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において当該疾患を処置又は予防するための医薬品を製造するための使用を提供する。
Ａ．構築体ｐＡＫ１６９、ｐＰＧ２１、ｐＰＧ３５、及びｐＰＧ３６の構成を示す概略図。ＭｅＣＰ２（２５０ｂｐ）は、最小ＭｅＣＰ２プロモータ配列を示す。ＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を示す。５’ＭｅＣＰ２（２１００ｂｐ）は、ＭｅＣＰ２（２５０ｂｐ）の５’側に約２１００ｂｐの天然イントロンを示す。ＰＧＲＮ（１８００ｂｐ）は、ＰＧＲＮをコードするポリヌクレオチド配列を示す。イントロン（２１００ｂｐ）は、約１００ｂｐの合成イントロン配列を示す。Ｂ．プロモータ活性のウエスタンブロット分析の画像。ｐＡＫ１６９、ｐＰＧ２１、ｐＰＧ３５、及びｐＰＧ３６の各々について、ＰＧＲＮ発現を評価した。 Ａ．ｐＡＫ１６８、ｐＰＧ２０、ｐＰＧ３３、及びｐＰＧ３４の構成を示す概略図。ＮＳＥ１（１３００ｂｐ）は、最小ＮＳＥ１プロモータ配列を示す。ＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を示す。５’ＮＳＥ１（１１００ｂｐ）は、ＮＳＥ１（２５０ｂｐ）の５’側に約１１００ｂｐの天然イントロンを示す。ＰＧＲＮ（１８００ｂｐ）は、ＰＧＲＮをコードするポリヌクレオチド配列を示す。イントロン（９００ｂｐ）は、約９００ｂｐの合成イントロン配列を示す。Ｂ．プロモータ活性のウエスタンブロット分析の画像。ｐＡＫ１６８、ｐＰＧ２０、ｐＰＧ３３、及びｐＰＧ３４の各々について、ＰＧＲＮ発現を評価した。 構築体ｐＰＧ２０、ｐＰＧ３３、ｐＰＧ３４、ｐＰＧ２１、ｐＰＧ２１、ｐＰＧ３５、及びｐＰＧ３６についての、一次ニューロン及び星状細胞におけるＰＧＲＮ発現の評価。Ａ．（Ａ）ニューロンにおける形質導入効率；（Ｂ）形質導入されたニューロンにおけるＰＧＲＮ発現レベル；（Ｃ）星状細胞における形質導入効率；及び（Ｄ）形質導入された星状細胞におけるＰＧＲＮ発現レベルを示す棒グラフ。 一次ニューロン及び星状細胞によるＰＧＲＮ分泌の評価。構築体ｐＰＧ２１、ｐＰＧ３５、ｐＰＧ３６、ｐＰＧ２０、ｐＰＧ２６により形質導入したニューロン－アストロサイト共培養体によって分泌されるＰＧＲＮの濃度を示す棒グラフ。また、形質導入されていない対照を示している。 ＰＧＲＮをコードする核酸構築体のコドン最適化。Ａ．ＥＬＩＳＡによって判定した、ＰＧＲＮをコードするレンチウイルスベクターにより形質移入したＧＲＮ－／－ＨＡＰ－１細胞についてのＰＧＲＮの発現レベルを示す棒グラフ。ＰＧＲＮをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣｐＧ０、４、９、１７、２５、４０、７１、及び９０と表記）を含むベクターを、ＰＧＲＮをコードする野生型ヌクレオチド配列（ＷＴと表記）を含むベクターと比較した。また、空ベクターによる対照形質移入及びＷＴ ＨＡＰ－１細胞（ＧＲＮ＋／＋）についてのＰＧＲＮ発現レベルを示す。Ｂ．ＰＧＲＮをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣｐＧ２５、４０、７１、及び９０と表記）を含むレンチウイルスベクター、及びＰＧＲＮをコードする野生型ヌクレオチド配列（ＷＴと表記）を含むベクターにより形質移入したＧＲＮ－／－ＨＡＰ－１細胞におけるＰＧＲＮ発現レベルのウエスタンブロット分析の画像。また、ＰＧＲＮ発現レベルを、空ベクター（モックと表記）による対照形質移入、非形質移入野生型ＧＲＮ＋／＋ＨＡＰ－１細胞（ＷＴと表記）、及び非形質移入ＧＲＮ－／－ＨＡＰ－１細胞（ＫＯと表記）について示す。 ヒトＰＧＲＮの発現は、ＧＲＮ－／－マウス一次ニューロンにおけるリソソーム欠損を修正する。Ａ．ｐＰＧ３６構築体を含むレンチウイルスベクターにより形質導入したＷＴ（ＧＲＮ＋／＋）及びＫＯ（ＧＲＮ－／－）一次ニューロンにおけるリソソームタンパク質カテプシンＤのレベルを定量するために実行したウエスタンブロット分析の画像。Ｂ．カテプシンＤタンパク質（それぞれ未成熟、成熟重鎖、及び成熟軽鎖）のレベルを示す棒グラフ。カテプシンＤの発現についての値を、アクチン及びＧＡＤＰＨ発現レベルに対して正規化している。 ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６の線条体注射後のＷＴマウス及びＧＲＮ－／－マウスにおけるヒトＰＧＲＮ（ｈＰＧＲＮ）のＣＮＳ発現のＥＬＩＳＡ分析及びＦＲＥＴ分析。Ａ．ＥＬＩＳＡによって測定した、ｈＰＧＲＮ（ｎｇ／ｍｌ）のＣＳＦレベル及び血漿レベルを示す棒グラフ。高レベルのｈＰＧＲＮが、ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６（ｐＰＧ３６構築体を含むＡＡＶＴＴベクター）を注射した動物において、ＷＴマウス及びＧＲＮ－／－マウスの双方のＣＳＦ（１：１００希釈）中で検出された。また、ｈＰＧＲＮが、マウスの血漿（１：１０希釈）中で検出された。Ｂ．ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６を注射したＷＴマウス又はＧＲＮ－／－マウスの種々の脳領域におけるｈＰＧＲＮ濃度（ｎｇ／ｍｇ）のＦＲＥＴ測定の結果を示す棒グラフ。ｈＰＧＲＮの最も高い発現が、注射部位（線条体及び中脳）の近くで検出された。また、中レベルのｈＰＧＲＮ発現が、皮質及び海馬において検出された。低レベルのｈＰＧＲＮ発現が、脳幹、嗅球、及び小脳等の遠位脳領域（ｄｉｓｔａｎｔ ｂｒａｉｎ ｒｅｇｉｏｎ）において検出された。Ｃ．ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６及びＡＡＶＴＴ－ｐ２ＰＧ３６のＷＴマウス線条体注射後にＥＬＩＳＡによって測定したｈＰＧＲＮのＣＳＦレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフ。高レベルのｈＰＧＲＮが、双方のＡＡＶ構築体を注射した動物において、ＣＳＦ（１：１００希釈）中で検出された。 ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６の線条体注射後のＧＲＮ－／－マウスにおけるヒトＰＧＲＮ（ｈＰＧＲＮ）のＣＮＳ発現のＩＨＣ分析の画像。ｈＰＧＲＮのＩＨＣ染色が、ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６の線条体投与を受けたＧＲＮ－／－ＫＯマウスの脳において観察された。ビヒクル又は対照ＡＡＶ－ＧＦＰを受けたマウスではシグナルが観察されなかったので、免疫反応シグナルはヒトプログラニュリンに特異的であった。高レベルのｈＰＧＲＮが主に、ＧＲＮ－／－ＫＯマウスの前脳全体、特に、線条体、視床、視床下部、大脳皮質、及び海馬、ならびに中脳及び黒質において検出された。 ヒトＰＧＲＮ発現は、カテプシンＤ活性にインビボで影響を及ぼす。ビヒクルで処理したＷＴ（ＧＲＮ＋／＋）マウス（黒丸で示す）、及びビヒクル（黒丸）又はＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６（黒三角）で処理したＧＲＮ－／－ＫＯマウスの中脳溶解物におけるカテプシンＤ酵素活性の測定を示す棒グラフ。カテプシンＤ酵素活性の増大が、４ヶ月齢のＧＲＮ－／－マウスにおいて観察された。ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６を注射したＧＲＮ－／－マウスにおいて、ビヒクルを注射したマウスと比較して、カテプシンＤ活性の低下が観察された。 ＡＡＶＴＴ－ｐＰＧ３６構築体（配列番号１７）における構成核酸配列の構成を示す概略図。 全長マウスＭＥＣＰ２遺伝子内のＭｅＣＰ２＿２イントロン（配列番号２）の構成領域の位置を示す概略図。
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＭｅＣＰ２最小プロモータのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、ＭｅＣＰ２＿２イントロンのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ＭｅＣＰ２＿２プロモータのヌクレオチド配列である。
配列番号４は、ＭｅＣＰ２＿２イントロンのエクソン１のヌクレオチド配列である。
配列番号５は、ＭｅＣＰ２＿２イントロンの５’イントロンのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、ＭｅＣＰ２＿２イントロンの３’イントロンのヌクレオチド配列である。
配列番号７は、ＭｅＣＰ２＿２イントロンのエクソン２のヌクレオチド配列である。
配列番号８は、ＭｅＣＰ２＿１プロモータのヌクレオチド配列である。
配列番号９は、ＭｅＣＰ２＿１イントロンのヌクレオチド配列である。
配列番号１０及び１１は、それぞれ構築体ｐＰＧ３５及びｐＰＧ３６のヌクレオチド配列である。
配列番号１２及び１３は、それぞれヒトＰＧＲＮヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に相当する。
配列番号１４は、Ａｇｅ１制限部位（５’－ＡＣＣＧＧＴ－３’）のヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のヌクレオチド配列である。
配列番号１６は、ＳＶ４０ポリアデニル化（ポリ（Ａ）シグナル）配列のヌクレオチド配列である。
配列番号１７は、ＡＡＶＴＴ－ｐＰＧ３６構築体のヌクレオチド配列である。
配列番号１８は、ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６プラスミドのヌクレオチド配列である。
配列番号１９は、ＡＡＶＴＴ－ｐ２ＰＧ３６プラスミドのヌクレオチド配列である。
配列番号２０は、ＡＡＶＴＴ－ｐＰＧ３６構築体に用いられる５’ＩＴＲのヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、ＡＡＶＴＴ－ｐＰＧ３６構築体に用いられる５’隣接断片のヌクレオチド配列である。
配列番号２２は、ＡＡＶＴＴ－ｐＰＧ３６構築体に用いられる３’隣接断片のヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、ＡＡＶＴＴ－ｐＰＧ３６構築体に用いられる３’ＩＴＲのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、ＡＡＶＴＴ－ｐＰＧ３６構築体に用いられるＫｏｚａｋ配列のヌクレオチド配列である。
本明細書中で、上記又は下記に拘わらずに引用される刊行物、特許、及び特許出願は全て、それらの全体が参照によって組み込まれる。
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。ゆえに、例えば、「核酸（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」への言及は、「複数の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）」を含む等である。
用語「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ，ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、当該技術分野におけるその通常の意味を有すること、すなわち、記載される特徴又は特徴の群が含まれるが、当該用語が、他の記載されるいかなる特徴も特徴の群も存在することを除外しないことが理解されるべきである。例えば、最小プロモータ配列を含むプロモータは、１つ以上のイントロン等の他の構成要素を含有してよい。また、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」は、当該技術分野におけるその通常の意味を有すること、すなわち、記載される特徴又は特徴の群が、更なる特徴を除外して含まれることが理解されるべきである。例えば、最小プロモータ配列からなるプロモータは、最小プロモータ配列を含有し、他の構成要素を含有しない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が用いられる全ての実施形態について、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」が用いられる更なる実施形態が予想される。ゆえに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」の全ての開示は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」の開示であるとみなされるべきである。
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書中で互換的に用いられており、それらの最も広い意味において、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、又は他のペプチド模倣体の化合物を指す。ゆえに、用語「タンパク質」は、短いペプチド配列を、そしてより長いポリペプチドも含む。本明細書で用いられる用語「アミノ酸」は、Ｄ又はＬ光学異性体の双方、ならびにアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含む、天然及び／もしくは非天然のアミノ酸、又は合成アミノ酸を指す。
用語「患者」及び「対象」は、本明細書中で互換的に用いられる。典型的には、患者はヒトである。
配列相同性／同一性
また、配列相同性は、機能的類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考慮され得るが、本文書の文脈では、配列同一性に関して相同性を表すことが好ましい。
配列比較は、眼で見て、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの公的に、又は商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性パーセント（同一性パーセント等）を算出することができる。
同一性パーセントを、連続配列の全体にわたって算出することができ、すなわち、一方の配列を他方の配列とアラインして、一方の配列内の各アミノ酸を、他方の配列内の対応するアミノ酸と直接、１回に１残基ずつ比較する。これは、「ギャップなし」アライメントと呼ばれる。典型的には、そのようなギャップなしアラインメントは、比較的少数の残基（例えば、５０個未満の連続アミノ酸）の全体にわたってのみ実行される。より長い配列の全体にわたる比較については、ギャップスコアリングを用いて、互いに対して挿入又は欠失を有する関連配列における同一性レベルを正確に反映するのに最適なアラインメントを生成する。そのようなアライメントを実行するのに適したコンピュータプログラムとして、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）がある。配列比較を実行することができる他のソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツール一式が挙げられるが、これらに限定されない。
典型的には、配列比較は、参照配列の全長にわたって実行される。例えば、所与の配列が配列番号２と７０％同一であるかをユーザが判定したい場合、配列番号２は参照配列である。例えば、配列が配列番号２（参照配列の例）と少なくとも９０％同一であるかを評価するために、当業者であれば、配列番号２の全長にわたってアラインメントを実行して、試験配列内のいくつの位置が、配列番号２の位置と同一であったかを特定するであろう。位置の少なくとも７０％が同一であれば、試験配列は、配列番号２と少なくとも７０％同一である。配列が配列番号２７よりも短ければ、ギャップ又は欠落位置は、非同一の位置であるとみなされるべきである。
当業者であれば、２つの配列間の相同性又は同一性を判定するのに利用可能な様々なコンピュータプログラムを認識している。例えば、２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの判定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。一実施形態において、２つのアミノ酸又は核酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ ２５０マトリックスのいずれか、そして１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重み、及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重みを用いる、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／にて入手可能）内のＧＡＰプログラム中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）アルゴリズムを用いて判定される。
本明細書中で用いられる用語「断片」は、参照配列の連続部分を指す。例えば、５０ヌクレオチド長の配列番号２の断片は、配列番号２の５０個の連続ヌクレオチドを指す。
本明細書中で用いられる用語「機能的バリアント」は、参照配列と比較して修飾されているが、前記参照配列の機能を保持している核酸又はアミノ酸配列を指す。例えば、ＭｅＣＰ２プロモータの機能的バリアントは、ニューロン又は星状細胞等のＣＮＳの細胞内で、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列の発現を駆動する能力を保持している。同様に、ＰＧＲＮタンパク質の機能的バリアントは、参照ＰＧＲＮタンパク質の活性を保持している。
核酸
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、本明細書中で互換的に用いられており、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、又はその類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例として、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された形態又は実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、あらゆる周囲培地からのポリペプチドの完全ではないが実質的な単離であり得ることを意味する。ポリヌクレオチドは、その意図される用途を妨げることのない担体又は希釈剤と混合されていてもよく、依然として実質的に単離されているとみなされ得る。選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な調節配列の制御下、例えば発現ベクター中に置かれた場合に、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。本発明の目的のために、そのような核酸配列は、ウイルス、原核生物、又は真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルス又は原核生物のＤＮＡ又はＲＮＡ由来のゲノム配列、さらには合成ＤＮＡ配列を含むことができるが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置決めされ得る。
ポリヌクレオチドは、一例としてＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）に記載されているような、当該技術分野において周知の方法に従って合成することができる。
本明細書中で用いられる用語「核酸構築体」は、少なくとも１つの制御配列（プロモータ等）及び注目するタンパク質（ＰＯＩ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む人工（例えば、組換えにより生成又は合成される）核酸を指す。ゆえに、本発明の核酸構築体は、発現カセットとみなされ得る。本発明の核酸構築体は、単離又は実質的に単離されていてよい。典型的には、本発明の核酸構築体は、注目するタンパク質（例えばＰＧＲＮ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列（例えばＭｅＣＰ２プロモータ）を含むので、注目するタンパク質のインビボ発現を可能にする。本発明の核酸構築体は、適切なプロモータ、エンハンサ、イニシエータ、及び他の要素、例えば、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル及び／又はウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列を含んでよい。また、本発明の核酸構築体は、制限部位（例えば、配列番号１４のヌクレオチド配列を有するＡｇｅ１制限部位）等の、遺伝子操作を容易にするヌクレオチド配列を含んでもよい。
本明細書中で用いられる用語「作動可能に連結された」は、２つ以上のヌクレオチド配列の並置であって、前記２つ以上の配列の各々が、その正常な機能を実行することを可能にする並置を指す。典型的には、用語「作動可能に連結された」は、調節エレメント（例えば、プロモータ、エンハンサ、ポリＡシグナル配列、ＷＰＲＥ配列等）、及び注目するタンパク質（ＰＯＩ）をコードするヌクレオチド配列の並置を指すのに用いられる。例えば、プロモータと、タンパク質コードヌクレオチド配列との間の操作可能な連結により、プロモータは、ＰＯＩの発現をインビボで駆動するように機能することが可能となる。
ＭｅＣＰ２プロモータに加えて、本発明の核酸構築体は、１つ以上の更なる調節エレメントを含んでよい。好ましい調節エレメントは、核酸構築体から転写されたｍＲＮＡを安定化させ、及び／又は核酸構築体からの注目するタンパク質（ＰＯＩ）、例えばＰＧＲＮの発現を増強するように機能するものである。
本発明の核酸構築体に用いることができる好ましい調節エレメントとして、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）がある。ＷＰＲＥは、ｍＲＮＡに転写される場合、ｍＲＮＡ転写産物に三次構造をもたらすことによって、ｍＲＮＡの安定性、及び核酸構築体によってコードされるＰＯＩの発現を増強するＤＮＡ配列である。本発明の核酸構築体において、ＷＰＲＥは、ＰＯＩ又はＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’側にあり得る。ＷＰＲＥは、配列番号１５のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含み得る。ＷＰＲＥの機能的バリアント又は断片は、対応する非バリアント又は全長ＷＰＲＥの特徴を保持している。ゆえに、バリアント又は断片ＷＰＲＥは、ｍＲＮＡ転写産物に三次構造をもたらすこと、及び／又はｍＲＮＡ転写産物の安定性を増強すること、及び／又は核酸構築体によってコードされるＰＯＩの発現を増強することが可能であり得る。増強は、バリアント又は断片ＷＰＲＥを含有しないｍＲＮＡと比較したものである。
本発明の核酸構築体に用いることができる好ましい調節エレメントは、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナル配列である。真核細胞において、ｍＲＮＡ転写産物内のポリアデニル化シグナル配列が認識されて、ｍＲＮＡ転写産物の３’末端に複数のアデノシン一リン酸からなるポリ（Ａ）尾部を付加するようにプロセシングされる。ポリ（Ａ）尾部は、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を促進するように機能し、かつｍＲＮＡの分解を妨げることによって、核酸構築体によってコードされるＰＯＩの発現を増強する。本発明の核酸構築体において、ポリアデニル化シグナル配列は、ＰＯＩ又はＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’側にあり得る。ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号１６のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含み得る。ポリアデニル化配列の機能的バリアント又は断片は、対応する非バリアント又は全長ポリアデニル化シグナル配列の特徴を保持している。
本発明の核酸構築体は、５’から３’方向に、ＭｅＣＰ２プロモータ、ＰＯＩ又はＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ、及びポリアデニル化シグナル配列を含み得る。
本発明の核酸構築体は、ベクター（例えば、プラスミド又は組換えウイルスベクター）内に提供されてよい。適切なベクターは、十分な量の遺伝情報を有し、かつＰＯＩのインビボ発現を可能にすることができるあらゆるベクターであってよい。本発明の核酸構築体を含むベクターは、それを必要とする患者に直接投与されてよい。そのようなベクターは、分子生物学の技術分野においてルーチンで構築され、例えば、プラスミドＤＮＡ及び適切なイニシエータ、プロモータ、エンハンサ、及び他の要素、例えば、必須であり得、かつ本発明のペプチドの発現を可能にするように正しい向きに置かれているポリアデニル化シグナルの使用を包含し得る。他の適切なベクターが、当業者に明らかであろう。これに関する更なる例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）参照。
メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモータ
メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）は、転写リプレッサであり、遺伝子の転写を、この遺伝子のプロモータ内のメチル化シトシンヌクレオチドに結合してから、共リプレッサタンパク質複合体を動員することによって全体的にサイレンシングするという説が出されている。加えて、ＭｅＣＰ２は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１に結合し、そしてヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を調節する。これは、ＤＮＡメチル化を維持するのに役立ち、そしてヒストンＨ３におけるＬｙｓ９のメチル化を促進する。ゆえに、メチル化ＤＮＡに結合することによって、ＭｅＣＰ２は、ＤＮＡメチル化の維持、ならびにヒストンの脱アセチル化及びメチル化等の複数のエピジェネティック修飾により、その抑制機能を強化する。
ＭｅＣＰ２は、脳、肺、及び脾臓において高度に発現され、そして心臓及び腎臓において中程度に発現される。特に、中枢神経系（ＣＮＳ）内では、ＭｅＣＰ２がニューロンにおいて高濃度で発現される。
ヒトＭＥＣＰ２遺伝子（遺伝子ＩＤ：４２０４）は、約１２２ｋｂｐであり、Ｘ染色体の長腕（Ｘｑ２８）上に位置決めされており、４つのコードエクソンを含む（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．（２００８）Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．１９ ６０３５－６０４７）。マウスＭＥＣＰ２遺伝子（遺伝子ＩＤ：１７２５７）は、約５９ｋｂｐであり、マウスＸ染色体上に、位置ＣｈｒＸ：７３０７０１９８－７３１２９２９６ｂｐ（－鎖）にて位置決めされている。
２つのＭｅＣＰ２アイソフォーム：ＭｅＣＰ２＿ｅ１（ｅ１）及びＭｅＣＰ２＿ｅ２（ｅ２）が同定されている。ｅ１イソ型は、４９８アミノ酸長であり、エクソン１、３、及び４によってコードされる。ｅ２イソ型は、４８６アミノ酸長であり、エクソン２、３、及び４によってコードされる。マウス及びヒトＭＥＣＰ２遺伝子のプロモータ領域は、とりわけ、Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００５；１４（２３）：３７０９－３７２２）によって特徴付けられている。ＭＥＣＰ２遺伝子のセグメント（－６７７／＋５６）は、神経細胞株及び皮質ニューロンにおいて強いプロモータ活性を示すことが見出されたが、非神経細胞及びグリアにおいて不活性であった。ニューロン特異的プロモータ活性に必須の領域（ＭＲ要素と呼ばれる）は、１９ｂｐ領域内に位置決めされていることが観察された（－６３／－４５）。
Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００５；１４（２３）：３７０９－３７２２）に記載されるように、ＭＥＣＰ２遺伝子のマウス（－６７７／＋５６）領域の配列は、対応するヒトＭｅＣＰ２プロモータと６８％類似している。特に、ヒト配列及びマウス配列は、ＭＲ要素を含有するヌクレオチド位置－８７～＋５６の間で、９２％同一である。
本明細書中に記載され、かつ例示される構築体に用いられるＭｅＣＰ２配列（例えば、配列番号１～９）は、マウスＭＥＣＰ２遺伝子に由来する。しかしながら、上記のように、マウスＭＥＣＰ２遺伝子とヒトＭＥＣＰ２遺伝子との最小プロモータ領域間で、高いレベルの配列類似性がある。さらに、マウスＭＲ要素とヒトＭＲ要素との間で、非常に高度の配列同一性があり、これがニューロン特異的発現を担う。したがって、１つ以上のマウスＭｅＣＰ２ヌクレオチド配列を含む本発明の実施形態毎に、前記１つ以上のマウスＭｅＣＰ２ヌクレオチド配列が、対応するヒトＭｅＣＰ２ヌクレオチド配列によって置換されている実施形態も提供される。
ゆえに、本明細書中で用いられる用語「ＭｅＣＰ２プロモータ」は、プロモータとして機能することができる、すなわち、前記ＭｅＣＰ２プロモータが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の転写を駆動することによって、前記ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現を駆動することができる、ＭＥＣＰ２遺伝子（例えば、マウス又はヒトＭＥＣＰ２遺伝子）のヌクレオチド配列を指す。典型的には、本発明に用いられるＭｅＣＰ２プロモータ配列は、特定の組織又は細胞型に特異的である。好ましくは、本発明に用いられるＭｅＣＰ２プロモータは、ＣＮＳの細胞に特異的である。より好ましくは、本発明に用いられるＭｅＣＰ２プロモータは、ニューロン及び／又は星状細胞内で、注目するタンパク質（ＰＯＩ）、例えばＰＧＲＮの発現を特異的に駆動することとなる。
本発明の核酸構築体に用いられるＭｅＣＰ２プロモータは、本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータの機能的バリアント又は断片であり得る。本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータの機能的バリアント又は断片は、対応する非バリアント又は全長ＭｅＣＰ２プロモータの特徴を保持しているという意味で、機能的であり得る。ゆえに、本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータの機能的バリアント又は断片は、前記機能的バリアント又は断片が作動可能に連結されているヌクレオチド配列の転写を駆動することによって、前記ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現を駆動する能力を保持している。本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータの機能的バリアント又は断片は、特定の組織型に対する特異性を保持し得る。例えば、本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータの機能的バリアント又は断片は、ＣＮＳの細胞に特異的であり得る。本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータの機能的バリアント又は断片は、ニューロン及び／又は星状細胞内で、注目するタンパク質（ＰＯＩ）、例えばＰＧＲＮの発現を特異的に駆動し得る。
本発明に用いられるＭｅＣＰ２プロモータは、「最小プロモータ配列」を含み得、これは、十分な長さのＭＥＣＰ２遺伝子のプロモータ領域のヌクレオチド配列であると理解されるべきであり、そしてＭｅＣＰ２プロモータとして機能するために、すなわち、前記ＭｅＣＰ２プロモータが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の転写を駆動することによって、前記ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現を駆動することができるために必要とされる要素を含む。
本発明の核酸構築体に用いられる最小ＭｅＣＰ２プロモータは、本明細書中に記載される最小ＭｅＣＰ２プロモータの機能的バリアント又は断片であり得る。本明細書中に記載される最小ＭｅＣＰ２プロモータの機能的バリアント又は断片は、対応する非バリアント又は全長最小ＭｅＣＰ２プロモータの特徴を保持しているという意味で、機能的であり得る。ゆえに、本明細書中に記載される最小ＭｅＣＰ２プロモータの機能的バリアント又は断片は、十分な長さのものであり、ＭｅＣＰ２プロモータとして機能するのに必要とされる要素を含み、そして前記機能的バリアント又は断片が作動可能に連結されているヌクレオチド配列の転写を駆動することによって、前記ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現を駆動することができる。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられ得る好ましい最小プロモータ配列は、配列番号１のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含み得るか、又はそれからなり得る。また、配列番号１又は前記機能的バリアントの任意の長さの断片を、本発明の核酸構築体内の最小プロモータ配列として用いてもよい。最小プロモータ配列は、１６０～３００ｂｐ、１７０～２９０ｂｐ、１８０～２８０ｂｐ、１９０～２７０ｂｐ、２００～２６０ｂｐ、２１０～２５０ｂｐ、２２０～２４０ｂｐ、又は約２３０ｂｐであり得る。
本発明に用いられるＭｅＣＰ２プロモータは、１つ以上のイントロンを含み得る。本明細書中で用いられる用語「イントロン」は、遺伝子内非コードヌクレオチド配列を指す。典型的には、イントロンは、遺伝子の転写中にＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写されるが、ｍＲＮＡ転写産物から、その翻訳前のスプライシングによって切除される。
本発明に用いられるＭｅＣＰ２プロモータは、本明細書中に記載されるイントロンの機能的バリアント又は断片を含んでよい。本明細書中に記載されるイントロンの機能的バリアント又は断片は、対応する非バリアント又は全長イントロンの特徴を保持しているという意味で、機能的であり得る。ゆえに、本明細書中に記載されるイントロンの機能的バリアント又は断片は、非コードである。また、本明細書中に記載されるイントロンの機能的バリアント又は断片は、ＤＮＡからｍＲＮＡに転写される能力、及び／又はスプライシングによってｍＲＮＡから切除される能力を保持し得る。
最小プロモータ配列及びイントロンを含むＭｅＣＰ２プロモータは、本明細書中で「操作されたＭｅＣＰ２プロモータ」と称される。
本発明に用いられるＭｅＣＰ２プロモータに組み込まれ得るイントロンは、ＭＥＣＰ２遺伝子の天然の非コード領域に由来し得る。ゆえに、用語イントロンは、ＭＥＣＰ２遺伝子の天然に存在する連続ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を包含する。そのようなイントロンは、本明細書中で「天然」イントロンと称される。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられ得る好ましいイントロンは、配列番号９のヌクレオチド配列、又はその、配列番号９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含むか、又はそれからなる。また、前記イントロンの断片が用いられてもよい。そのような断片は、１０００～２１０７ｂｐ、１２００～２１００ｂｐ、１４００～２０００ｂｐ、１６００～１９００ｂｐ、又は１７００～１８００ｂｐであり得る。また、前記イントロンを含むより長いヌクレオチド配列が用いられてもよい。
本発明の核酸構築体に用いられ得る好ましいＭｅＣＰ２プロモータは、ＭｅＣＰ２＿１（配列番号８）と命名される。このＭｅＣＰ２プロモータは、配列番号９のヌクレオチド配列を有するイントロンを含む。ゆえに、本発明の核酸構築体に用いられるＭｅＣＰ２プロモータは、配列番号８のヌクレオチド配列、又はその、配列番号８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含み得るか、又はそれからなり得る。また、前記ＭｅＣＰ２プロモータの断片が用いられてもよい。そのような断片は、１０００～２３３６ｂｐ、１２００～２３００ｂｐ、１４００～２２００ｂｐ、１６００～２１００ｂｐ、１７００～２０００ｂｐ、又は１８００～１９００ｂｐであり得る。また、前記ＭｅＣＰ２プロモータを含むより長いヌクレオチド配列が用いられてもよい。
本発明の核酸構築体に用いられるＭｅＣＰ２プロモータは、「合成イントロン」を含んでよい。合成イントロンは、例えばＭＥＣＰ２遺伝子の、２つ以上の異なる（例えば、別個かつ不連続の）配列から構築されたものと理解されるべきである。合成イントロンを調製するのに用いられる２つ以上の配列は、ＭＥＣＰ２遺伝子のいかなる位置由来のものであってもよい。したがって、合成イントロンは、ＭＥＣＰ２遺伝子のイントロンのヌクレオチド配列を含んでよく、これは故に「イントロン配列」と称される。
これ以外にも、合成イントロンの構成ヌクレオチド配列は、ＭＥＣＰ２遺伝子のイントロンに由来する必要はなく、代わりにＭＥＣＰ２遺伝子のエクソン（すなわち、タンパク質コードヌクレオチド）に由来してもよい。典型的には、エクソンＭＥＣＰ２遺伝子のヌクレオチド配列は、エクソン配列が発現しないように、（例えば、トランケーション、欠失、置換等によって）修飾され、及び／又は合成イントロン内に配置されることとなる。ゆえに、そのようなヌクレオチド配列は、ポリペプチド（例えば、ＭｅＣＰ２タンパク質又はその断片）に翻訳され得る転写産物を生成することができない。したがって、本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられる合成イントロンは、例えばＭＥＣＰ２遺伝子の、１つ以上の「非発現エクソン配列」を含んでよい。適切には、前記非発現エクソン配列は、イントロン配列の側面に位置して、スプライス部位を提供してよい。当該スプライス部位により、合成イントロンを、前記合成イントロンを含む核酸構築体の転写によって産生されるｍＲＮＡからのスプライシングによって切除することが可能となる。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられる合成イントロンは、本明細書中に記載される非発現エクソン配列の機能的バリアント又は断片を含んでよい。本明細書中に記載される非発現エクソン配列の機能的バリアント又は断片は、対応する非バリアント又は全長エクソン配列の特徴を保持しているという意味で、機能的であり得る。ゆえに、本明細書中に記載される非発現エクソン配列の機能的バリアント又は断片は、イントロン配列の側面に位置する能力を保持し得、かつスプライス部位を含み得る。これらは、エクソンの除去により、一緒に接合（又はスプライシング）され得る。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられる合成イントロンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のイントロン配列、及び／又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の非発現エクソン配列を含んでよい。好ましくは、合成イントロンは、２つのイントロン配列及び２つの非発現エクソン配列を含む。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられ得る好ましい非発現エクソン配列は、配列番号４のヌクレオチド配列、又はその、配列番号４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含むか、又はそれからなる。また、前記非発現エクソン配列の断片が用いられてもよい。また、前記非発現エクソン配列を含むより長いヌクレオチド配列が用いられてもよい。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられ得る好ましい非発現エクソン配列は、配列番号７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含むか、又はそれからなる。また、前記非発現エクソン配列の断片が用いられてもよい。また、前記非発現エクソン配列を含むより長いヌクレオチド配列が用いられてもよい。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられ得る好ましいイントロン配列は、配列番号５のヌクレオチド配列、又はその、配列番号５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含むか、又はそれからなる。また、前記イントロン配列の断片が用いられてもよい。また、前記イントロン配列を含むより長いヌクレオチド配列が用いられてもよい。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられ得る好ましいイントロン配列は、配列番号６のヌクレオチド配列、又はその、配列番号６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含むか、又はそれからなる。また、前記イントロン配列の断片が用いられてもよい。また、前記イントロン配列を含むより長いヌクレオチド配列が用いられてもよい。
ゆえに、本発明の核酸構築体は：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、又はその、配列番号４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列、又はその、配列番号５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むイントロン配列；
（ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列、又はその、配列番号６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むイントロン配列；及び／あるいは
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列
を含む少なくとも１つの合成イントロンを含むＭｅＣＰ２プロモータを含み得るか、又はそれからなり得る。
合成イントロンは、先の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び／又は（ｄ）を、５’から３’方向にいかなる順序で含んでもよい。合成イントロンは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び／又は（ｄ）を、先に列挙した順序で含み得る。例えば、５’から３’方向に、合成イントロンは：
ｉ．（ａ）及び（ｂ）；
ｉｉ．（ａ）及び（ｃ）；
ｉｉｉ．（ａ）及び（ｄ）；
ｉｖ．（ｂ）及び（ｃ）；
ｖ．（ｂ）及び（ｄ）；
ｖｉ．（ｃ）及び（ｄ）；
ｖｉｉ．（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）；
ｖｉｉｉ．（ａ）、（ｂ）、及び（ｄ）；
ｉｘ．（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）；又は
ｘ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）を含み得る。
合成イントロンは、その５’末端に非発現エクソン配列を含んでよい。例えば、合成イントロンは、その５’末端に：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、又はその、配列番号４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列；あるいは
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列
を含んでよい。
合成イントロンは、その３’末端に非発現エクソン配列：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、又はその、配列番号４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列；あるいは
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列
を含んでよい。
合成イントロンは、その５’末端及びその３’末端に非発現エクソン配列を含んでよい。例えば、合成イントロンは、その５’末端に：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、又はその、配列番号４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列；あるいは
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列；
を含んでよく、そして
合成イントロンは、その３’末端に：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、又はその、配列番号４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列；あるいは
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列
を含んでよい。
５’末端及び３’末端の非発現エクソン配列は、１つ以上のイントロン配列、例えば本明細書中に記載される１つ以上のイントロン配列の側面に位置してよい。例えば、５’から３’方向に、本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられる合成イントロンは：
ｉ．（ａ）、（ｂ）、及び（ｄ）；
ｉｉ．（ａ）、（ｃ）、及び（ｄ）；
ｉｉｉ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）；
ｉｖ．（ａ）、（ｃ）、（ｂ）、及び（ｄ）；
ｖ．（ａ）、（ｂ）、及び（ａ）；
ｖｉ．（ａ）、（ｃ）、及び（ａ）；
ｖｉｉ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ａ）；
ｖｉｉｉ．（ａ）、（ｃ）、（ｂ）、及び（ａ）；
ｉｘ．（ｄ）、（ｂ）、及び（ｄ）；
ｘ．（ｄ）、（ｃ）、及び（ｄ）；
ｘｉ．（ｄ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）；
ｘｉｉ．（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、及び（ｄ）
ｘｉｉｉ．（ｄ）、（ｂ）、及び（ａ）；
ｘｉｖ．（ｄ）、（ｃ）、及び（ａ）；
ｘｖ．（ｄ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ａ）；又は
ｘｖｉ．（ｄ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ａ）を含み得：
（ａ）は、配列番号４のヌクレオチド配列、又はその、配列番号４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列に相当し；
（ｂ）は、配列番号５のヌクレオチド配列、又はその、配列番号５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むイントロン配列に相当し；
（ｃ）は、配列番号６のヌクレオチド配列、又はその、配列番号６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むイントロン配列に相当し；かつ
（ｄ）は、配列番号７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列に相当する。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられ得る好ましい合成イントロンは、５’から３’方向に：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、又はその、配列番号４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列、又はその、配列番号５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むイントロン配列；
（ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列、又はその、配列番号６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むイントロン配列；及び／あるいは
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列
を含むか、又はそれからなる。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられ得る好ましい合成イントロンは、５’から３’方向に：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、又はその、配列番号４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列、又はその、配列番号５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むイントロン配列；
（ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列、又はその、配列番号６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むイントロン配列；及び
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列
を含むか、又はそれからなる。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられ得る好ましい合成イントロンは、５’から３’方向に：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、又はその、配列番号４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列、又はその、配列番号５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むイントロン配列；
（ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列、又はその、配列番号６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むイントロン配列；及び
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む非発現エクソン配列
からなる。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータに用いられ得る好ましい合成イントロンは、配列番号２のヌクレオチド配列、又はその、配列番号２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含むか、又はそれからなる。また、前記合成イントロンの断片が用いられてもよい。そのような断片は、１０００～２００５ｂｐ、１２００～２０００ｂｐ、１４００～１９００ｂｐ、１６００～１８００ｂｐ、又は１７００～１８００ｂｐであり得る。また、前記合成イントロンを含むより長いヌクレオチド配列が用いられてもよい。
本発明の核酸構築体に用いられ得る好ましいＭｅＣＰ２プロモータは、ＭｅＣＰ２＿２（配列番号３）と命名される。このプロモータ領域は、配列番号２のヌクレオチド配列を有する合成イントロンを含む。ゆえに、本発明の核酸構築体に用いられるＭｅＣＰ２プロモータは、配列番号３のヌクレオチド配列、又はその、配列番号３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含み得るか、又はそれからなり得る。また、前記ＭｅＣＰ２プロモータの断片が用いられてもよい。そのような断片は、１０００～２２３４ｂｐ、１２００～２２００ｂｐ、１４００～２１００ｂｐ、１６００～２０００ｂｐ、又は１７００～１９００ｂｐであり得る。また、前記ＭｅＣＰ２プロモータを含むより長いヌクレオチド配列が用いられてもよい。
本明細書中に記載されるＭｅＣＰ２プロモータを含む核酸構築体は、これがコードする目的のタンパク質（ＰＯＩ）、例えばＰＧＲＮの発現を高める。また、前記構築体は、形質導入効率を高める。ゆえに、特定の実施形態において、ＭｅＣＰ２プロモータを含む本発明の核酸構築体からのＰＯＩ又はＰＧＲＮタンパク質の発現は、他の点では同一であるＭｅＣＰ２プロモータを欠く構築体と比較して、増し得る。特定の実施形態において、ＭｅＣＰ２プロモータを含む本発明の核酸構築体は、他の点では同一であるＭｅＣＰ２プロモータを欠く構築体と比較して、形質導入効率が増す。
本明細書中に記載される操作されたＭｅＣＰ２プロモータを含む核酸構築体は、これがコードする目的のタンパク質（ＰＯＩ）、例えばＰＧＲＮの発現を高める。また、前記構築体は、形質導入効率を高める。ゆえに、特定の実施形態において、操作されたＭｅＣＰ２プロモータを含む本発明の核酸構築体からのＰＯＩ又はＰＧＲＮタンパク質の発現は、操作されたＭｅＣＰ２プロモータを欠く構築体、例えば最小ＭｅＣＰ２プロモータを含む等価な構築体と比較して、増し得る。特定の実施形態において、操作されたＭｅＣＰ２プロモータを含む本発明の核酸構築体は、操作されたＭｅＣＰ２プロモータを欠く構築体、例えば最小ＭｅＣＰ２プロモータを含む等価な構築体と比較して、形質導入効率が増す。
本明細書中に記載される合成イントロンを含む操作されたＭｅＣＰ２プロモータを含む核酸構築体は、これがコードする注目するタンパク質（ＰＯＩ）の発現を高める。また、前記構築体は、形質導入効率を高める。ゆえに、特定の実施形態において、合成イントロンを含む操作されたＭｅＣＰ２プロモータを含む本発明の核酸構築体からのＰＯＩ又はＰＧＲＮタンパク質の発現は、合成イントロンを含む操作されたＭｅＣＰ２プロモータを欠く構築体、例えば最小ＭｅＣＰ２プロモータを含む構築体、又は合成イントロンを欠く操作されたＭｅＣＰ２プロモータを含む構築体と比較して、増し得る。特定の実施形態において、合成イントロンを含む操作されたＭｅＣＰ２プロモータを含む本発明の核酸構築体は、合成イントロンを含む操作されたＭｅＣＰ２プロモータを欠く構築体、例えば最小ＭｅＣＰ２プロモータを含む構築体、又は合成イントロンを欠く操作されたＭｅＣＰ２プロモータを含む構築体と比較して、形質導入効率が増す。
プログラニュリン（ＰＧＲＮ）
プログラニュリン（ＰＧＲＮ；グラニュリン－エピテリン前駆体、プロエピテリン、前立腺癌（ＰＣ）細胞由来成長因子、及びアクログラニンとしても知られている）は、全身の多くの細胞型によって発現される分泌糖タンパク質である。染色体１７ｑ２１上の単一遺伝子（ＧＲＮ；Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８９６）によってコードされるＰＧＲＮは、推定分子量６８．５ｋＤａの、５９３アミノ酸のシステインリッチタンパク質である。これは、７．５個のグラニュリン様ドメインを含有し、これらは各々、１２個のシステイニルモチーフの高度に保存されたタンデムリピートからなる。エラスターゼ等の細胞外プロテアーゼによるＰＧＲＮのタンパク質分解的切断は、グラニュリン又はエピテリンと称されるより小さなペプチド断片（例えば、グラニュリンＡ、グラニュリンＢ、グラニュリンＣ等）を生じる。これらの断片は、６～２５ｋＤａのサイズに及び、様々な生物学的機能に関係している。
ＰＧＲＮ欠乏は、前頭側頭葉認知症とも称される前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の病因と強く関連している。タンパク質プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするＧＲＮ遺伝子の１つの対立遺伝子内の変異が、ＦＴＤの発症と関連する（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ Ａｕｇ ２４；４４２（７１０５）：９１６－９１９）。ＦＴＤのＧＲＮ関連形態は、ユビキチン化かつ断片化されたＴＤＰ－４３（ＴＡＲＤＢＰによってコードされる）を含有する神経封入体の出現によって特徴付けられるプロテイノパチーである。ＰＧＲＮ欠損マウスモデルにおいて、ＡＡＶ遺伝子治療アプローチを用いてＰＧＲＮのニューロン発現を駆動することにより、ＦＴＤと関連する行動障害が修正されることが示されている（Ａｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ．２０１７；１４０．５：１４４７－１４６５）。
また、ＰＧＲＮ欠乏は、神経セロイドリポフスチン症１１（ＮＣＬ１１）とも関連する。特に、ＧＲＮ内のホモ接合変異は、神経セロイドリポフスチン症１１（ＮＣＬ１１）と関連し、これは、小脳性運動失調、発作、色素性網膜炎、及び認知障害によって特徴付けられ、通常は１３歳～２５歳の間に始まる（Ｆａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ．２０２０；１４３（１）：３０３－３１）。
ゆえに、中枢神経系におけるＰＧＲＮのレベルを増大させて、ＰＧＲＮ欠乏と関連する神経疾患を処置する治療アプローチについて、強い生物学的根拠がある。ＰＧＲＮ欠乏とＣＮＳ障害との関連（ＦＴＤ及びＮＣＬ１１が挙げられる）は、Ｍｏｌｅ ａｎｄ Ｃｏｔｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．２０１５；１８５２：２２３７－２２４１，Ｃｈｉｔｒａｍｕｔｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ．２０１７；１４０：３０８１－３１０４、及びＨｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ．２０２０；１４３：３０３－３１９において詳細に論じられている。
本発明の核酸構築体に用いられるＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＰＧＲＮタンパク質をコードしてよい。本発明の核酸構築体に用いられるＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、野生型ＰＧＲＮタンパク質をコードしてよい。本発明の核酸構築体に用いられるＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、野生型ヒトＰＧＲＮタンパク質をコードしてよい。
本発明者らは、ＭｅＣＰ２プロモータを含む核酸構築体及びベクターについて、ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化が、ＰＧＲＮをコードする野生型ヌクレオチド配列と比較して、より低いＰＧＲＮ発現レベルを実現することを見出した（例５及び図５参照）。ゆえに、本発明の一部の実施形態において、ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されていない。
本発明の核酸構築体に用いられ得るＰＧＲＮタンパク質をコードする好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含むか、又はそれからなる。また、前記ヌクレオチド配列の断片が用いられてもよい。そのような断片は、１０００～１７８１ｂｐ、１２００～１７５０ｂｐ、１４００～１７００ｂｐ、又は１５００～１６００ｂｐさであり得る。
本発明の核酸構築体に用いられ得るＰＧＲＮタンパク質をコードする好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１３のアミノ酸配列、又はその、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントを含むか、又はそれからなるＰＧＲＮタンパク質をコードする。また、前記ＰＧＲＮタンパク質の断片をコードするヌクレオチドが用いられてもよい。そのような断片は、３００～５９２、３５０～４９０、４００～４８０、又は４５０～４７５アミノ酸残基長であり得る。
本明細書中に記載されるあらゆるタンパク質又はポリペプチドにおいて、アミノ酸配列は、修飾された配列を有するポリペプチドが、修飾されていない配列を有するポリペプチドと比較して、同じ活性を示すことを条件として、付加、欠失、又は置換によって修飾されていてよい。「同じ」とは、修飾された配列のポリペプチドが、修飾されていない配列のポリペプチドと比較して、有意に引き下げられた活性を示さないことであると理解されるべきである。そのような修飾されたタンパク質又は前記修飾されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、「機能的バリアント」とみなされ得る。
本発明の核酸構築体は、本明細書中に記載されるＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の機能的バリアント又は断片を含み得る。本明細書中に記載されるＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の機能的バリアント又は断片は、対応する非バリアント又はＰＧＲＮタンパク質をコードする全長ヌクレオチド配列の特徴を保持しているという意味で、機能的であり得る。
本発明の核酸構築体は、本明細書中に記載されるＰＧＲＮタンパク質の機能的バリアント又は断片をコードするヌクレオチド配列を含み得る。本明細書中に記載されるＰＧＲＮタンパク質の機能的バリアント又は断片は、対応する非バリアント又は全長ＰＧＲＮタンパク質の特徴を保持しているという意味で、機能的であり得る。
ＰＲＧＮの機能及び細胞内相互作用を特徴付ける研究は、依然として進行中である。それにも拘わらず、ＰＧＲＮは、リソソームマーカータンパク質ＬＡＭＰ－１（リソソーム関連膜タンパク質１）と共局在化すること、そしてリソソームの酸性化によるリソソーム機能及び生合成の調節において役割を果たすことが観察されている（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１７；２６（５）：９６９－９８８）。
特定の実施形態において、ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の機能的バリアント又は断片は、ＬＡＭＰ－１と共局在化することができるＰＧＲＮタンパク質をコードする。機能的バリアント又は断片によってコードされるＰＧＲＮタンパク質、及びＬＡＭＰ－１の共局在化は、対応する非バリアント又は全長ヌクレオチド配列によってコードされるＰＧＲＮタンパク質とＬＡＭＰ－１との、同じ条件下での共局在化の少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。機能的バリアント又は断片によってコードされるＰＧＲＮタンパク質、及びＬＡＭＰ－１の共局在化は、対応する非バリアント又は全長ヌクレオチド配列によってコードされるＰＧＲＮタンパク質とＬＡＭＰ－１との、同じ条件下での共局在化と実質的に同じであり得るか、又はそれよりも大きくなり得る。
特定の実施形態において、ＰＧＲＮタンパク質の機能的バリアント又は断片は、ＬＡＭＰ－１と共局在化することができる。ＰＧＲＮタンパク質の断片のバリアント及びＬＡＭＰ－１の共局在化は、対応する非バリアント又は全長ＰＧＲＮタンパク質の、同じ条件下での共局在化の少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。ＰＧＲＮタンパク質の断片のバリアントの共局在化は、対応する非バリアント又は全長ＰＧＲＮタンパク質の、同じ条件下での共局在化と実質的に同じであり得るか、又はそれよりも大きくなり得る。
ＰＧＲＮタンパク質及びＬＡＭＰ－１の共局在化は、当該技術分野において知られている適切なあらゆる技術を用いて評価及び／又は定量することができる。例えば、ＰＧＲＮが欠損した培養細胞（例えば、ＧＲＮ－／－細胞、又は発現ＰＧＲＮ発現がｓｉＲＮＡによって下方制御されている細胞）が、ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の機能的バリアント又は断片を含む核酸構築体を含むベクターにより形質移入されてよい。次いで、当該細胞が、ＰＧＲＮに特異的な第１の蛍光標識された（例えば緑色）抗体及びＬＡＭＰ－１に特異的な第２の蛍光標識された（例えば赤色）抗体を用いて免疫染色されてよい。次いで、蛍光顕微鏡を用いて、赤色染色及び緑色染色の共局在化を評価することができる（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１７；２６（５）：９６９－９８８参照）。
特定の実施形態において、ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の機能的バリアント又は断片は、リソソーム酸性化を調節することができるＰＧＲＮタンパク質をコードする。機能的バリアント又は断片によってコードされるＰＧＲＮタンパク質によるリソソーム酸性化の調節は、対応する非バリアント又は全長ヌクレオチド配列によってコードされるＰＧＲＮタンパク質による、同じ条件下でのリソソーム酸性化の調節の少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。機能的バリアント又は断片によってコードされるＰＧＲＮタンパク質によるリソソーム酸性化の調節は、対応する非バリアント又は全長ヌクレオチド配列によってコードされるＰＧＲＮタンパク質による、同じ条件下でのリソソーム酸性化の調節と実質的に同じであり得るか、又はそれよりも大きくなり得る。
特定の実施形態において、ＰＧＲＮタンパク質の機能的バリアント又は断片は、リソソーム酸性化を調節することができる。ＰＧＲＮタンパク質のバリアント又は断片によるリソソーム酸性化の調節は、対応する非バリアント又は全長ＰＧＲＮタンパク質による、同じ条件下でのリソソーム酸性化の調節の少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。ＰＧＲＮタンパク質のバリアント又は断片によるリソソーム酸性化の調節は、対応する非バリアント又は全長ＰＧＲＮタンパク質による、同じ条件下でのリソソーム酸性化の調節と実質的に同じであり得るか、又はそれよりも大きくなり得る。
特定の実施形態において、ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の機能的バリアント又は断片は、リソソーム酸性化を増大させることができるＰＧＲＮタンパク質をコードする。機能的バリアント又は断片によってコードされるＰＧＲＮタンパク質は、対応する非バリアント又は全長ヌクレオチド配列によってコードされるＰＧＲＮタンパク質によって実現されるリソソーム酸性化の、同じ条件下での増大の少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％まで、リソソーム酸性化を増大させることができる。機能的バリアント又は断片によってコードされるＰＧＲＮタンパク質は、対応する非バリアント又は全長ヌクレオチド配列によってコードされるＰＧＲＮタンパク質によって提供されるリソソーム酸性化の、同じ条件下での増大と実質的に同じであるか、又はそれを超える程度まで、リソソーム酸性化を増大させることができる。
特定の実施形態において、ＰＧＲＮタンパク質の機能的バリアント又は断片は、リソソーム酸性化を増大させることができる。ＰＧＲＮタンパク質のバリアント又は断片は、対応する非バリアント又は全長ＰＧＲＮタンパク質によって提供されるリソソーム酸性化の、同じ条件下での増大の少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％まで、リソソーム酸性化を増大させることができる。ＰＧＲＮタンパク質のバリアント又は断片は、対応する非バリアント又は全長ＰＧＲＮタンパク質によるリソソーム酸性化の、同じ条件下での調節と実質的に同じであるか、又はそれを超える程度まで、リソソーム酸性化を増大させることができる。
リソソーム酸性化に及ぼすＰＧＲＮの効果を、当該技術分野における適切なあらゆる技術を用いて評価することができる。例えば、ＰＧＲＮが欠損した培養細胞（例えば、ＧＲＮ－／－細胞、又は発現ＰＧＲＮ発現がｓｉＲＮＡによって下方制御されている細胞）が、ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の機能的バリアント又は断片を含む核酸構築体を含むベクターにより形質移入されてよい。次いで、形質移入された細胞におけるリソソームの酸性化を、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ ＤＮＤ－１８９又はアクリジンオレンジ等の細胞透過性色素を用いて評価することができる（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１７；２６（５）：９６９－９８８参照）。ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ ＤＮＤ－１８９の蛍光は、リソソーム酸性度に依存して増す。アクリジンオレンジ単量体は、緑色蛍光を発するが、その二量体及びオリゴマーが、プロトン化されると形成される。ゆえに、赤色／緑色蛍光の比は、リソソームの相対酸性度を示す。色素によって生成される蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡又は蛍光プレートリーダーを用いて測定することができる。
配列間の活性のいかなる比較も、同じアッセイを用いて行うべきである。別段の定めがない限り、ポリペプチド配列に対する修飾は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学特性、又は類似の側鎖体積の他のアミノ酸で置換する。導入されるアミノ酸は、これが置換するアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性度、中性、又は電荷を有し得る。これ以外にも、保存的置換は、既存の芳香族又は脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族又は脂肪族である別のアミノ酸を導入してよい。保存的アミノ酸変化は、当該技術分野において周知であり、以下の表Ａ１に定義される２０個の主アミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が類似の極性を有する場合、表Ａ２のアミノ酸側鎖の疎水性スケールを参照することによって決定することができる。
ベクター
本発明は、本発明の核酸構築体を含むベクターを提供する。ベクターは、あらゆるタイプのものであってよい。例えば、ベクターは、プラスミドベクターであってもミニサークルＤＮＡであってもよい。しかしながら、典型的には、本発明のベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、又はレンチウイルスベースであってよい。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はその誘導体であってよい。ウイルスベクター誘導体は、キメラ、シャッフル、又はカプシド修飾誘導体であり得る。
ウイルスベクターは、ＡＡＶの天然由来の血清型、単離体、又はクレード由来のＡＡＶゲノムを含み得る。ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶウイルスの感染（又は向性）の組織特異性を決定する。好ましくは、本発明に用いられるＡＡＶは、ＣＮＳの細胞、例えば神経細胞、星状細胞、及び／又は乏突起膠細胞に形質導入することができる。例えば、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ８、好ましくはＡＡＶ２であり得る。
遺伝子治療の有効性は、一般に、供与されたＤＮＡの適切かつ効率的な送達次第である。この方法は、通常、ウイルスベクターによって媒介される。パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、遺伝子治療に一般的に用いられている。ウイルス遺伝子を含有する野生型ＡＡＶは、そのゲノム材料を、宿主細胞の第１９染色体中に挿入する（Ｋｏｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９９０．８７：２２１１－２２１５）。ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡゲノムは、構造（ｃａｐ）遺伝子及びパッケージング（ｒｅｐ）遺伝子を含有する２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び２つのオープンリーディングフレームを含む（Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ １９８４．５１：３２９－３３９）。治療目的のために、シスに必要な唯一の配列は、治療用遺伝子に加えて、ＩＴＲである。したがって、ＡＡＶウイルスは修飾される：ウイルス遺伝子は、ゲノムから除去されて、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が生じる。これは、治療用遺伝子、２つのＩＴＲのみを含有する。ウイルス遺伝子の除去により、ｒＡＡＶは、そのゲノムを宿主細胞ＤＮＡ中にアクティブに挿入することができなくなる。代わりに、ｒＡＡＶゲノムは、ＩＴＲを介して融合して、環状のエピソーム構造を形成するか、又は既存の染色体切断に挿入される。ウイルス生成のために、現在ｒＡＡＶから除去されている構造遺伝子及びパッケージング遺伝子は、ヘルパープラスミドの形態でトランスで供給される。ＡＡＶベクターは、約４．８ｋｂの比較的小さいパッケージング容量によって制限される。
ほとんどの遺伝子治療ベクター構築体は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）に基づく。ＡＡＶ２は、標的細胞にヘパラン硫酸プロテオグリカン受容体を介して結合する（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１９９８，７２：１４３８－１４４５）。ＡＡＶ２ゲノムは、全てのＡＡＶ血清型のゲノムと同様に、いくつかの異なるカプシドタンパク質内に封入され得る。ＡＡＶ２は、その天然のＡＡＶ２カプシド内にパッケージングすることができ（ＡＡＶ２／２）、又は他のカプシドによりシュードタイプ化することができる（例えば、ＡＡＶ１カプシド内のＡＡＶ２ゲノム；ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ５カプシド内のＡＡＶ２ゲノム；ＡＡＶ２／５、及びＡＡＶ８カプシド内のＡＡＶ２ゲノム；ＡＡＶ２／８）。
本発明のベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム又はその誘導体を含み得る。
ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子の生成に必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列である。当該機能として、宿主細胞内でのＡＡＶの複製及びパッケージングサイクルにおいて作動するものが挙げられ、ＡＡＶゲノムの、ＡＡＶウイルス粒子へのカプシド形成が挙げられる。天然に存在するＡＡＶウイルスは、複製欠損しており、そして複製及びパッケージングサイクルの完了のためのトランスでのヘルパー機能の提供に依存する。したがって、そしてＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の更なる除去により、本発明のベクターのＡＡＶゲノムは、複製欠損している。
ＡＡＶゲノムは、ポジティブセンスもしくはネガティブセンスのいずれかの一本鎖形態、又は二本鎖形態であり得る。二本鎖形態の使用は、標的細胞におけるＤＮＡ複製工程のバイパスを可能にするので、導入遺伝子発現を加速することができる。ＡＡＶゲノムは、天然由来のあらゆる血清型、又はＡＡＶの単離体もしくはクレードに由来し得る。当業者に知られているように、自然界に存在するＡＡＶウイルスは、種々の生物系に従って分類され得る。
一般に、ＡＡＶウイルスは、その血清型に関して言及される。血清型は、カプシド表面抗原の発現のプロファイルにより、他のバリアント亜種と区別するのに用いることができる特徴的な反応性を有するＡＡＶのバリアント亜種に対応する。典型的には、特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、他のあらゆるＡＡＶ血清型に特異的な中和抗体と効率的に交差反応しない。ＡＡＶ血清型として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０（ＡＡＶｒＨ１０）、及びＡＡＶ１１が挙げられ、また、組換え血清型、例えば、霊長類の脳から同定されたＲｅｃ２及びＲｅｃ３も挙げられる。本発明のベクターにおいて、ゲノムは、あらゆるＡＡＶ血清型に由来し得る。また、カプシドは、あらゆるＡＡＶ血清型に由来し得る。ゲノム及びカプシドは、同じ血清型に由来しても異なる血清型に由来してもよい。本発明のベクターにおいて、ゲノムは、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、又はＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）に由来することが好ましい。ゲノムは、ＡＡＶ２に由来することがより好ましい。
ＡＡＶがＡＡＶ－ＴＴであることがさらに好ましい。ＡＡＶ－ＴＴは、Ｔｏｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ．２０１８；１４１（７）：２０１４－２０３１及び国際公開第２０１５／１２１５０１号パンフレット（これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に詳細に説明されている。
ＡＡＶ血清型のレビューを、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５；５（３）；２９９－３１０）及びＷｕ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００６；１４（３），３１６－３２７）において見出すことができる。本発明に用いられるＩＴＲ配列、ｒｅｐ又はｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶゲノムの配列、又はＡＡＶゲノムの要素の配列は、ＡＡＶ全ゲノム配列について、以下の受託番号に由来し得る：アデノ随伴ウイルス１ ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７；アデノ随伴ウイルス２ ＮＣ＿００１４０１；アデノ随伴ウイルス３ ＮＣ＿００１７２９；アデノ随伴ウイルス３Ｂ ＮＣ＿００１８６３；アデノ随伴ウイルス４ ＮＣ＿００１８２９；アデノ随伴ウイルス５ Ｙ１８０６５、５ ＡＦ０８５７１６；アデノ随伴ウイルス６ ＮＣ＿００１８６２；トリＡＡＶ ＡＴＣＣ ＶＲ－８６５ ＡＹ１８６１９８、ＡＹ６２９５８３、ＮＣ＿００４８２８；トリＡＡＶ株ＤＡ－１ ＮＣ＿００６２６３、ＡＹ６２９５８３；ウシＡＡＶ ＮＣ＿００５８８９、ＡＹ３８８６１７。
また、ＡＡＶウイルスは、クレード又はクローンに関して言及され得る。これは、天然由来のＡＡＶウイルスの系統関係に言及し、そして典型的には、共通の祖先に遡ることができ、かつその全ての子孫を含むＡＡＶウイルスの系統群に言及する。加えて、ＡＡＶウイルスは、特定の単離体、すなわち自然界で見出される特定のＡＡＶウイルスの遺伝的単離体に関して言及され得る。用語遺伝的単離体は、他の天然に存在するＡＡＶウイルスとの遺伝的混合が限られていたことによって、遺伝子レベルで認識可能に異なる集団を定義するＡＡＶウイルスの集団を説明する。本発明に用いられ得るＡＡＶのクレード及び単離体の例として、以下が挙げられる：
・クレードＡ：ＡＡＶ１ ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７、ＡＡＶ６ ＮＣ＿００１８６２、Ｈｕ．４８ ＡＹ５３０６１１、Ｈｕ ４３ ＡＹ５３０６０６、Ｈｕ ４４ ＡＹ５３０６０７、Ｈｕ ４６ ＡＹ５３０６０９；
・クレードＢ：Ｈｕ．１９ ＡＹ５３０５８４、Ｈｕ．２０ ＡＹ５３０５８６、Ｈｕ ２３ ＡＹ５３０５８９、Ｈｕ２２ ＡＹ５３０５８８、Ｈｕ２４ ＡＹ５３０５９０、Ｈｕ２１ ＡＹ５３０５８７、Ｈｕ２７ ＡＹ５３０５９２、Ｈｕ２８ ＡＹ５３０５９３、Ｈｕ ２９ ＡＹ５３０５９４、Ｈｕ６３ ＡＹＳ３０６２４、Ｈｕ６４ ＡＹ５３０６２５、Ｈｕｌ３ ＡＹ５３０５７８、Ｈｕ５６ ＡＹ５３０６１８、Ｈｕ５７ ＡＹ５３０６１９、Ｈｕ４９ ＡＹ５３０６１２、Ｈｕ５８ ＡＹ５３０６２０、Ｈｕ３４ ＡＹ５３０５９８、Ｈｕ３５ ＡＹ５３０５９９、ＡＡＶ２ ＮＣ＿００１４０１、Ｈｕ４５ ＡＹ５３０６０８、Ｈｕ４７ ＡＹ５３０６１０、Ｈｕ５１ ＡＹ５３０６１３、Ｈｕ５２ ＡＹ５３０６１４、Ｈｕ Ｔ４１ ＡＹ６９５３７８、Ｈｕ Ｓ１７ ＡＹ６９５３７６、Ｈｕ Ｔ８８ ＡＹ６９５３７５、Ｈｕ Ｔ７１ ＡＹ６９５３７４、Ｈｕ Ｔ７０ ＡＹ６９５３７３、Ｈｕ Ｔ４０ ＡＹ６９５３７２、Ｈｕ Ｔ３２ ＡＹ６９５３７１、Ｈｕ Ｔ１７ ＡＹ６９５３７０、Ｈｕ ＬＧ１５ ＡＹ６９５３７７；
・クレードＣ：Ｈｕ９ ＡＹ５３０６２９、ＨｕｌＯ ＡＹ５３０５７６、Ｈｕｌｌ ＡＹ５３０５７７、Ｈｕ５３ ＡＹ５３０６１５、Ｈｕ５５ ＡＹ５３０６１７、Ｈｕ５４ ＡＹ５３０６１６、Ｈｕ７ ＡＹ５３０６２８、Ｈｕｌ８ ＡＹ５３０５８３、Ｈｕｌ５ ＡＹ５３０５８０、Ｈｕｌ６ ＡＹ５３０５８１、Ｈｕ２５ ＡＹ５３０５９１、Ｈｕ６０ ＡＹ５３０６２２、Ｃｈ５ ＡＹ２４３０２１、Ｈｕ３ ＡＹ５３０５９５，Ｈｕｌ ＡＹ５３０５７５、Ｈｕ４ ＡＹ５３０６０２ Ｈｕ２、ＡＹ５３０５８５、Ｈｕ６１ ＡＹ５３０６２３；
・クレードＤ：Ｒｈ６２ ＡＹ５３０５７３、Ｒｈ４８ ＡＹ５３０５６１、Ｒｈ５４ ＡＹ５３０５６７、Ｒｈ５５ ＡＹ５３０５６８、Ｃｙ２ ＡＹ２４３０２０、ＡＡＶ７ ＡＦ５１３８５１、Ｒｈ３５ ＡＹ２４３０００、Ｒｈ３７ ＡＹ２４２９９８、Ｒｈ３６ ＡＹ２４２９９９、Ｃｙ６ ＡＹ２４３０１６、Ｃｙ４ ＡＹ２４３０１８、Ｃｙ３ ＡＹ２４３０１９、Ｃｙ５ ＡＹ２４３０１７、Ｒｈｌ３ ＡＹ２４３０１３；
・クレードＥ：Ｒｈ３８ ＡＹ５３０５５８、Ｈｕ６６ ＡＹ５３０６２６、Ｈｕ４２ ＡＹ５３０６０５、Ｈｕ６７ ＡＹ５３０６２７、Ｈｕ４０ ＡＹ５３０６０３、Ｈｕ４１ ＡＹ５３０６０４、Ｈｕ３７ ＡＹ５３０６００、Ｒｈ４０ ＡＹ５３０５５９、Ｒｈ２ ＡＹ２４３００７、Ｂｂｌ ＡＹ２４３０２３、Ｂｂ２ ＡＹ２４３０２２、ＲｈｌＯ ＡＹ２４３０１５、Ｈｕｌ７ ＡＹ５３０５８２、Ｈｕｂ ＡＹ５３０６２１、Ｒｈ２５ ＡＹ５３０５５７、Ｐｉ２ ＡＹ５３０５５４、Ｐｉｌ ＡＹ５３０５５３、Ｐｉ３ ＡＹ５３０５５５、Ｒｈ５７ ＡＹ５３０５６９、Ｒｈ５０ ＡＹ５３０５６３、Ｒｈ４９ ＡＹ５３０５６２、Ｈｕ３９ ＡＹ５３０６０１、Ｒｈ５８ ＡＹ５３０５７０、Ｒｈｂｌ ＡＹ５３０５７２、Ｒｈ５２ＡＹ５３０５６５、Ｒｈ５３ ＡＹ５３０５６６、Ｒｈ５１ ＡＹ５３０５６４、Ｒｈ６４ ＡＹ５３０５７４、Ｒｈ４３ ＡＹ５３０５６０、ＡＡＶ８ ＡＦ５１３８５２、Ｒｈ８ ＡＹ２４２９９７、Ｒｈｌ ＡＹ５３０５５６；及び
・クレードＦ：Ｈｕ １４（ＡＡＶ９）ＡＹ５３０５７９、Ｈｕ３１ ＡＹ５３０５９６、Ｈｕ３２ ＡＹ５３０５９７；クローン単離体ＡＡＶ５ Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６、ＡＡＶ ３ ＮＣ＿００１７２９、ＡＡＶ ３Ｂ ＮＣ＿００１８６３、ＡＡＶ４ １５ ＮＣ＿００１８２９、Ｒｈ３４ ＡＹ２４３００１、Ｒｈ３３ ＡＹ２４３００２、Ｒｈ３２ ＡＹ２４３００３。
当業者であれば、共通の一般知識に基づいて、本発明に用いられるＡＡＶの適切な血清型、クレード、クローン、又は単離体を選択することができる。しかしながら、本発明はまた、まだ同定も特徴付けもされていない可能性がある他の血清型のＡＡＶゲノムの使用も包含することが理解されるべきである。
典型的には、ＡＡＶの天然由来の血清型、又は単離体もしくはクレードのＡＡＶゲノムは、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本発明のベクターは、２つのＩＴＲ、好ましくはゲノムの各末端に１つのＩＴＲを含み得る。ＩＴＲ配列は、シスで作用して、機能的複製起点を提供し、そしてベクターの組込み、及び細胞のゲノムからの切除を可能にする。好ましいＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２及びそのバリアントのＩＴＲ配列である。ＡＡＶゲノムは典型的に、ＡＡＶウイルス粒子のパッケージング機能をコードするｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子等のパッケージング遺伝子を含む。ｒｅｐ遺伝子は、タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０、又はそれらのバリアントの１つ以上をコードする。ｃａｐ遺伝子は、１つ以上のカプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、又はそれらのバリアントをコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶウイルス粒子のカプシドを構成する。カプシドバリアントを、以下で考察する。
好ましくは、ＡＡＶゲノムは、患者への投与を目的として誘導体化されることとなる。そのような誘導体化は、当該技術分野において標準的であり、そして本発明は、ＡＡＶゲノムの知られているあらゆる誘導体、及び当該技術分野において知られている技術を用いることによって生成され得る誘導体の使用を包含する。ＡＡＶゲノムの、そしてＡＡＶカプシドの誘導体化は、Ｃｏｕｒａ ａｎｄ Ｎａｒｄｉ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ．２００７；４：９９）及び上記のＣｈｏｉ ｅｔ ａｌにおいてレビューされている。
ＡＡＶゲノムの誘導体として、本発明のベクターからのＲｅｐ－１導入遺伝子のインビボ発現を可能にするあらゆるトランケート形態又は修飾形態のＡＡＶゲノムが挙げられる。典型的には、最小ウイルス配列を含むが、先の機能を保持するようにＡＡＶゲノムをかなりトランケートすることが可能である。これは、ベクターの、野生型ウイルスとの組換えのリスクを引き下げ、そしてまた、標的細胞内でのウイルス遺伝子タンパク質の存在によって細胞性免疫応答をトリガーするのを回避する安全上の理由から、好ましい。典型的には、誘導体は、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、好ましくは複数のＩＴＲ、例えば２つ以上のＩＴＲを含むこととなる。ＩＴＲの１つ以上が、異なる血清型を有するＡＡＶゲノムに由来してもよいし、キメラ又は変異ＩＴＲであってもよい。好ましい変異ＩＴＲは、ｔｒｓ（末端分離部位）の欠失を有する変異ＩＴＲである。この欠失は、ゲノムの継続的な複製を可能にして、コード配列及び相補配列の双方を含有する一本鎖ゲノム、すなわち自己相補性ＡＡＶゲノムを生成する。これは、標的細胞におけるＤＮＡ複製のバイパスを可能にするので、導入遺伝子発現の加速を可能にする。
１つ以上のＩＴＲは、好ましくは、本発明の核酸構築体、すなわち、ＭｅＣＰ２プロモータを含むヌクレオチド配列及びＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の側面に位置することとなる。１つ以上のＩＴＲを含めることは、本発明のベクターの、ウイルス粒子中へのパッケージングを助けるのに好ましい。好ましい実施形態において、ＩＴＲ要素は、誘導体内の天然ＡＡＶゲノムから保持される唯一の配列となる。ゆえに、誘導体は、好ましくは、天然ゲノム及び天然ゲノムの他のあらゆる配列のｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を含むこととはならない。これは、上記の、そしてまた、宿主細胞ゲノム中へのベクターの組込みの可能性を引き下げる理由から、好ましい。加えて、ＡＡＶゲノムのサイズを引き下げることにより、導入遺伝子に加えて、他の配列要素（調節エレメント等）をベクター内に組み込む際のフレキシビリティを増大させることが可能になる。
したがって、ＡＡＶ２ゲノムを参照して、本発明の誘導体内の以下の部分を除去することができる：１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、複製（ｒｅｐ）及びカプシド（ｃａｐ）遺伝子。しかしながら、インビトロ実施形態を含む一部の実施形態において、誘導体は加えて、ＡＡＶゲノムの１つ以上のｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ遺伝子又は他のウイルス配列を含んでよい。誘導体は、１つ以上の天然に存在するＡＡＶウイルスのキメラ、シャッフル、又はカプシド修飾誘導体であってよい。本発明は、同じベクター内でのＡＡＶの異なる血清型、クレード、クローン、又は単離体由来のカプシドタンパク質配列の使用を包含する。また、本発明は、一方の血清型のゲノムを、もう一方の血清型のカプシド中にパッケージングすること、すなわちシュードタイプ化することを包含する。キメラ、シャッフル、又はカプシド修飾誘導体は、ウイルスベクターに１つ以上の所望の官能基を提供するように選択され得る。ゆえに、これらの誘導体は、天然に存在するＡＡＶゲノム（ＡＡＶ２のもの等）を含むＡＡＶウイルスベクターと比較して、遺伝子送達の効率の向上、免疫原性（体液性又は細胞性）の低下、向性範囲の改変、及び／又は特定の細胞型の標的化の向上を示し得る。遺伝子送達の効率の向上は、細胞表面での受容体又は共受容体結合の向上、インターナリゼーションの向上、細胞内及び核中への輸送の向上、ウイルス粒子のアンコーティングの向上、ならびに一本鎖ゲノムの、二本鎖形態への変換の向上によって達成され得る。また、効率の向上は、ベクター用量が、これを必要としない組織への投与によって希釈されないような、特定の細胞集団の向性範囲又は標的化の改変に関連し得る。
キメラカプシドタンパク質として、天然に存在するＡＡＶ血清型の２つ以上のカプシドコード配列間の組換えによって生成されるものが挙げられる。これは、例えば、１つの血清型の非感染性カプシド配列を、異なる血清型のカプシド配列と同時形質移入して、指向性選択を用いて、所望の特性を有するカプシド配列を選択するマーカーレスキューアプローチによって実行され得る。異なる血清型のカプシド配列は、細胞内の相同組換えによって変更されて、新規キメラカプシドタンパク質を生成することができる。また、キメラカプシドタンパク質として、２つ以上のカプシドタンパク質間、例えば異なる血清型の２つ以上のカプシドタンパク質間に、特定のカプシドタンパク質ドメイン、表面ループ、又は特定のアミノ酸残基を移入するようにカプシドタンパク質配列を操作することによって生成されるものが挙げられる。また、シャッフル又はキメラカプシドタンパク質は、ＤＮＡシャッフル又はエラープローンＰＣＲによって生成され得る。ハイブリッドＡＡＶカプシド遺伝子は、関連するＡＡＶ遺伝子、例えば複数の異なる血清型のカプシドタンパク質をコードする遺伝子の配列をランダムに断片化してから、自己プライミングポリメラーゼ反応において断片を再アセンブルすることによって作出することができ、これはまた、配列相同性の領域において交差を引き起こし得る。いくつかの血清型のカプシド遺伝子をシャッフルすることによって、このようにして作成されるハイブリッドＡＡＶ遺伝子のライブラリをスクリーニングして、所望の機能性を有するウイルスクローンを同定することができる。同様に、エラープローンＰＣＲを用いて、ＡＡＶカプシド遺伝子をランダムに変異させて、バリアントの多様なライブラリを作成することができ、これはその後、所望の特性について選択され得る。
また、カプシド遺伝子の配列は、天然の野生型配列に対して特異的な欠失、置換、又は挿入を導入するように遺伝子修飾され得る。特に、カプシド遺伝子は、カプシドコード配列のオープンリーディングフレーム内に、又はカプシドコード配列のＮ末端及び／もしくはＣ末端に、無関係のタンパク質又はペプチドの配列を挿入することによって修飾され得る。無関係なタンパク質又はペプチドは、有利には、特定の細胞型に対するリガンドとして作用することによって、標的細胞への結合の向上を付与するか、又は特定の細胞集団に対するベクターの標的化の特異性を向上させるものであり得る。また、無関係なタンパク質は、生成方法の一部としてウイルス粒子の精製を補助するもの、すなわちエピトープであってもアフィニティタグであってもよい。挿入部位は、典型的には、ウイルス粒子の他の機能、例えば内在化、ウイルス粒子の輸送に干渉しないように選択されることとなる。当業者であれば、一般知識に基づいて、挿入に適した部位を特定することができる。特定の部位が、上記のＣｈｏｉ ｅｔ ａｌに開示されている。
本発明は加えて、ネイティブＡＡＶゲノムの配列とは異なる順序及び構成のＡＡＶゲノムの配列の使用を包含する。また、本発明は、１つ以上のＡＡＶ配列又は遺伝子を、別のウイルス由来の配列、又は複数のウイルス由来の配列で構成されるキメラ遺伝子と置換することを包含する。そのようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の２つ以上の関連ウイルスタンパク質由来の配列で構成されていてよい。
また、本発明は、本発明のベクターを含むＡＡＶウイルス粒子を提供する。本発明のＡＡＶ粒子は、一血清型のＩＴＲを有するＡＡＶゲノム又は誘導体が、異なる血清型のキャプシド内にパッケージングされているトランスキャプシド化形態を含む。また、本発明のＡＡＶ粒子は、２つ以上の異なる血清型に由来する未修飾カプシドタンパク質の混合物が、ウイルスエンベロープを構成するモザイク形態を含む。また、ＡＡＶ粒子は、キャプシド表面に吸着されるリガンドを有する化学修飾形態を含む。例えば、そのようなリガンドは、特定の細胞表面受容体を標的とするための抗体を含み得る。
本発明の、ＡＡＶベクターが挙げられるベクター、及び本発明のＡＡＶウイルス粒子は、遺伝子治療のためのベクターを提供するための、当該技術分野において知られている標準的な手段によって調製され得る。ゆえに、十分に確立されたパブリックドメイン形質移入、パッケージング、及び精製方法を用いて、適切なベクター調製物を調製することができる。
ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸構築体及びベクターは、例えば、患者のＧＲＮ遺伝子の一方又は双方の対立遺伝子内の変異によって生じ得るＰＧＲＮ機能の消失をレスキューする能力を有する。「レスキュー」は、一般に、ＰＲＧＮ欠乏と関連する表現型のあらゆる改善又は進行の遅延、例えば、脳内のＰＧＲＮタンパク質の存在の回復及び／又は神経病態の軽減を意味する。
本発明の核酸構築体及びベクターの特性は、当業者に知られている技術を用いて試験されてよい。例えば、本発明の核酸構築体が、本発明のベクター中にアセンブルされて、マウス又は霊長類等のＰＲＧＮ欠損試験動物に送達されて、効果を観察して、対照と比較することができる。
配列番号１０は、ＭｅＣＰ２＿２プロモータを含む構築体ｐＰＧ３６のヌクレオチド配列に相当する。特定の実施形態において、本発明の核酸構築体又はウイルスベクターは、配列番号１０のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１０のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれらからなる。
配列番号１１は、ＭｅＣＰ２＿１プロモータを含む構築体ｐＰＧ３５のヌクレオチド配列に相当する。特定の実施形態において、本発明の核酸構築体又はウイルスベクターは、配列番号１１のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれらからなる。
配列番号１７は、ＡＡＶＴＴ－ｐＰＧ３６のヌクレオチド配列、すなわち構築体ｐＰＧ３６のヌクレオチド配列を含むＡＡＶＴＴベクターゲノムに相当する。特定の実施形態において、本発明のウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター又はＡＡＶＴＴベクターは、配列番号１７のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１７のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれらからなる。
配列番号１８及び１９は、それぞれＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６及びＡＡＶＴＴ－ｐ２ＰＧ３６と称される２つの代替ＡＡＶＴＴベクターゲノムのヌクレオチド配列に相当する。ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６（配列番号１８）及びＡＡＶＴＴ－ｐ２ＰＧ３６（配列番号１９）は双方とも、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、本発明のウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター又はＡＡＶＴＴベクターは、配列番号１８のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１８のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれらからなる。特定の実施形態において、本発明のウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター又はＡＡＶＴＴベクターは、配列番号１９のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１９のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれらからなる。
医薬組成物及び投薬量
本発明の核酸構築体及びベクターは、医薬組成物に製剤化することができる。ゆえに、本発明は、本発明の核酸構築体、本発明のベクター、及び／又は本発明のウイルスベクターを、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と一緒に含む医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファ、安定化剤、又は当業者に周知の他の材料を含んでよい。そのような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性に干渉すべきでない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に従って、当業者によって決定され得る。
医薬組成物は、液体形態で提供され得る。液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油、又は合成油等の液体担体を含む。生理食塩水、塩化マグネシウム、デキストロース、もしくは他の糖の溶液、又はグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールが含まれてもよい。任意に、プルロン酸（ＰＦ６８）０．００１％等の界面活性剤が用いられ得る。
罹患部位での注射のために、活性成分は、パイロジェンフリーであり、かつｐＨ、等張性、及び安定性が適切な水溶液の形態となる。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、ラクトリンガー注射液、ハルトマン溶液等の等張性ビヒクルを用いて、適切な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、防腐剤、安定化剤、バッファ、酸化防止剤、及び／又は他の添加剤が含まれてよい。遅延放出のために、ベクターは、当該技術分野において知られている方法に従って、徐放用に製剤化されている医薬組成物内に、例えば、生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセル内に、又はリポソーム担体系内に含まれてよい。
投薬量及び投薬レジメンは、組成物の投与を担当する医師の通常の技能の範囲内で決定することができる。
治療方法及び医学的使用
また、本発明は、本明細書中に記載される核酸構築体、ベクター、ウイルスベクター、及び医薬組成物の、患者において疾患又は症状を処置又は予防する際の使用を包含する。
ゆえに、本発明は、疾患又は症状の処置又は予防を必要とする患者において疾患又は症状を処置又は予防する方法に用いられる本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物を提供する。本発明はさらに、疾患又は症状の処置又は予防を必要とする患者において疾患又は症状を処置又は予防する方法であって、患者に、治療有効量の本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。また、本発明は、本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物の、疾患又は症状の処置又は予防を必要とする患者において疾患又は症状を処置又は予防するための医薬品を製造するための使用を提供する。
疾患又は症状は、ＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられ得る。前記ＰＧＲＮ欠乏は、処置されることとなる患者のＧＲＮ遺伝子の一方又は双方の対立遺伝子における機能変異の消失の結果として生じ得る。
ゆえに、本発明は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において当該疾患を処置又は予防する方法に用いられる本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物を提供する。本発明はさらに、ログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において当該疾患を処置又は予防する方法であって、患者に、治療有効量の本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。また、本発明は、本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物の、ログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患を処置又は予防するための医薬品を製造するための使用を提供する。
本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物により処置されることとなるＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患は、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患であり得る。
本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物により処置されることとなるＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）であり得る。
本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物により処置されることとなるＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患は、神経セロイドリポフスチン症１１型（ＮＣＬ１１）であり得る。
本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物により処置されることとなるＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患はさらに、リソソーム酸性化の調節不全等のリソソーム機能不全によって特徴付けられ得る。前記リソソーム機能不全は、カテプシンＤ、好ましくは成熟重鎖及び／又は軽鎖カテプシンＤの発現レベル及び／又は活性の増大によって特徴付けられ得る。
本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物による処置を必要とする患者は、男性であっても女性であってもよい。前記患者は、ＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患のリスクがあるか、又は当該疾患を有すると以前に特定されていてよい。前記患者は、ＦＴＤのリスクがあるか、又はＦＴＤを有すると以前に特定されていてよい。前記患者は、ＮＣＬ１１のリスクがあるか、又はＮＣＬ１１を有すると以前に特定されていてよい。
本発明のベクターの用量は、種々のパラメータに従って、とりわけ処置されることとなる患者の年齢、体重、及び状態；投与経路；ならびに必要とされるレジメンに従って決定され得る。医師は、任意の特定の患者に必要とされる投与経路及び投薬量を決定することができる。
本発明の核酸構築体、ベクター、ウイルスベクター、又は医薬組成物は、患者の脳及び／又は脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与され得る。脳への送達は、脳内送達、実質内送達、被殻内送達、及びそれらの組合せから選択され得る。脳内の更なる標的領域として、視床、小脳、視床下核、及びそれらの組合せが挙げられ得る。ＣＳＦへの送達は、大槽内送達、髄腔内送達、脳室内（ＩＣＶ）送達、及びそれらの組合せから選択され得る。
患者の脳及び／又は脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達は、注射によるものであり得る。脳への注射は、脳内注射、実質内注射、被殻内注射、及びそれらの組合せから選択され得る。ＣＳＦへの送達は、大槽内注射、髄腔内注射、脳室内（ＩＣＶ）注射、及びそれらの組合せから選択され得る。
脳及び／又は脳脊髄液への注射は、対流増強送達（ＣＥＤ）を含み得る。ＣＥＤ手順は、脳の低侵襲性外科的曝露と、それに続く脳の標的領域中への小径カテーテルの直接的配置とを含む。ＣＥＤは、例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．９（１０）：１５１９－２７によって説明されている。
本発明の核酸構築体、ベクター、ウイルスベクター、又は医薬組成物の用量は、単回用量として提供されてもよいが、正しい領域をベクターが標的としなかった場合に、繰り返されてもよい。処置は、好ましくは単回注射であるが、例えば将来の数年間の、及び／又は異なるＡＡＶ血清型による反復注射が考慮されてもよい。
宿主細胞
本発明は加えて、本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明のＡＡＶウイルス粒子を含む宿主細胞を提供する。また、本発明は、本発明のウイルスベクター及び／又は本発明のＡＡＶ粒子を生成する宿主細胞を提供する。
適切なあらゆる宿主細胞は、本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明のＡＡＶウイルス粒子を含み得る。さらに、適切なあらゆる宿主細胞を用いて、本発明のウイルスベクター及び／又は本発明のＡＡＶ粒子を生成することができる。一般に、そのような細胞は、形質移入される哺乳動物細胞となるが、他の細胞型、例えば昆虫細胞を用いることもできる。哺乳動物細胞生成系に関して、ＨＥＫ２９３及びＨＥＫ２９３ＴがＡＡＶベクターに好ましい。また、ＢＨＫ細胞又はＣＨＯ細胞を用いてもよい。
キット
本発明はさらに、本発明の核酸構築体、本発明のベクター、本発明のウイルスベクター、及び／又は本発明の医薬組成物を含むキットを提供する。
本発明を、以下の例によってさらに説明するが、当該例は、保護の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。前述の説明及び以下の例に開示される特徴は、別々に、そしてそれらのあらゆる組合せで、本発明をその多様な形態で実現するための材料となり得る。
例
例１－材料及び方法
細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得て、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で維持した。Ａ５４９細胞を、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から得て、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＨａｍ’ｓ Ｆ－１２培地（Ｆ－１２Ｋ）のＫａｉｇｈｎ改変内で維持した。ＣａＳｋｉ細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得て、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したロズウェルパーク記念研究所の１６４０培地（ＲＰＭＩ－１６４０）で維持した。ＣＯＳ－７細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得て、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で維持した。ＶＥＲＯ細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得て、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）内で維持した。Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得て、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）内で維持した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得て、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で維持した。ＨＡＰ１細胞及びＨＡＰ１ ＧＲＮ ＫＯ細胞を、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｗａｔｅｒｂｅａｃｈ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から得て、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＩｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＥＭ）内で維持した。
コドン最適化
ＣｐＧ含量が引き下げられたＰＧＲＮをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を生成した。コドン最適化配列を「ＣｐＧ Ｘ」と命名し、式中、Ｘは、コドン最適化配列内に保持された野生型ＣｐＧ部位のパーセンテージを示す。例えば、ＣｐＧ ９０と命名したヌクレオチド配列は、対応する野生型配列のＣｐＧ部位の９０％を含む。結果として生じた配列を、発現ベクター中にクローニングした。
レンチウイルス生成
用いたレンチウイルスベクターは全て、第２世代であり、Ｓａｌｍｏｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｄ．Ｔｒｏｎｏ（「レンチウイルスベクターの生成及び滴定」（’Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ’）．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００６．Ｃｈａｐｔｅｒ ４：Ｕｎｉｔ ４．２１）において以前に説明された標準的なウイルス生成方法を用いて生成した。簡潔には、１０ｃｍディッシュあたり５７０万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプレーティングした。翌日、細胞を、１０μｇのトランスファーベクター、３μｇのｐＭＤ２Ｇ、及び８μｇのｐｓＰＡＸ２を有するリポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により形質移入した。培地を、形質移入の１２～１４時間後に交換した。この培地交換の２４時間後及び４８時間後に、合計２０ｍＬのウイルスについて、ウイルス上清を収集して、０．４５μｍフィルターに通した。ウイルス上清を、急速凍結する前にＬｅｎｔｉ－Ｘ（商標）コンセントレータ（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）を用いてＰＢＳ中に２０×に濃縮した。
レンチウイルス滴定
全てのレンチウイルスを、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｑＲＴ－ＰＣＲ滴定キット（Ｔａｋａｒａ）を用いて滴定した。
レンチウイルス形質導入
細胞を再懸濁させて、４μｇ／ｍｌポリブレンを補充した等しい濃度のウイルス上清中にプレーティングした。１２～２４時間後、ウイルス上清をフレッシュな培地と交換した。Ｃｏｓ－８、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＣａＳＫｉ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞を、２００のＭＯＩにて形質導入した。ＶＥＲＯ及びＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞を、１０００のＭＯＩにて形質導入した。
ウエスタンブロット分析
リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、製造業者の指示に従って、注目する構築体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。形質移入の２日後、細胞を、プロテアーゼインヒビタカクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＩＰＡバッファ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に溶解した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＶａｒｉｏｓｋａｂ ＬＵＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて測定した。溶解物をローディングバッファと混合した；等量のタンパク質を、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ ４～１５％プレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で泳動して、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてニトロセルロース膜に転写した。非特異的抗体結合を、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ ＴＢＳブロッキングバッファ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）により、室温にて１時間ブロッキングした。膜を、以下の一次抗体とインキュベートした：抗ＰＧＲＮ（１：２００希釈、ＡＦ２４２０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｔ２０ ＴＢＳ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）中）、４℃にて一晩；抗アクチン（１：５０００希釈、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ ２０６６）（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｔ２０ ＴＢＳ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）中）、４℃にて一晩。膜を、ＴＢＳＴで１５分間洗浄して、ロバ抗ヤギ６８０ ＲＤ（Ｌｉ－Ｃｏｒ、１：５０００）及びロバ抗ウサギ８００ＣＷ（Ｌｉ－Ｃｏｒ、１：５０００）抗体（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｔ２０ ＴＢＳ中）と４５分間インキュベーションしてから、ＴＢＳＴで１５分間洗浄した。膜を、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を用いて視覚化した。
リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、製造業者の指示に従って、注目する構築体をＧＲＮ＋／＋ＨＡＰ－１（野生型）細胞及びＧＲＮ－／－ＨＡＰ－１（ＫＯ）細胞に形質移入した。形質移入の２日後、細胞を、ＲＩＰＡバッファ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に溶解した。タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。溶解物をローディングバッファと混合した；等量のタンパク質を、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ ４～１５％プレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で泳動して、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてニトロセルロース膜に転写した。非特異的抗体結合を、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ ＴＢＳブロッキングバッファ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）により、室温にて１時間ブロッキングした。膜を、以下の一次抗体とインキュベートした：抗ＰＧＲＮ（１：２００希釈、ＡＦ２４２０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｔ２０ ＴＢＳ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）中）、４℃にて一晩；抗アクチン（１：１００００希釈、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ ２０６６）（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｔ２０ ＴＢＳ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）中）、４℃にて一晩。膜を、ＴＢＳＴで１５分間洗浄して、ロバ抗ヤギ６８０ ＲＤ（Ｌｉ－Ｃｏｒ、１：５０００）及びロバ抗マウス８００ＣＷ（Ｌｉ－Ｃｏｒ、１：５０００）抗体（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｔ２０ ＴＢＳ中）と１時間インキュベーションしてから、ＴＢＳＴで１５分間洗浄した。膜を、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を用いて視覚化した。
ニューロン－星状細胞の共培養及び形質導入
一次ニューロン－星状細胞共培養体を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ，Ｆｒａｎｃｅ）の１７日目の胚から調製した。新たに切開した皮質組織を最初に、パパイン溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ４７６２）を用いて解離させた。細胞をニューロンアタッチメント培地中に希釈して、ポリ－Ｄ－リジン（ＣＯＲＮＩＮＧ ３５６６９２）によりプレコーティングした９６ウェルプレート上にプレーティングした（１００００個の細胞／ウェル）。ニューロンアタッチメント培地は、２．５％熱不活化ウシ胎仔血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ３８４０００２）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１１３６００７０）、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ－１００Ｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，３５０５００６１）、Ｂ２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１７５０４０４４）、及び５０単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１５０７００６３）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｐｌｕｓ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ３５８２９０１）からなる。細胞を、フレッシュな無血清ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を毎週補充することによって維持した。レンチウイルス媒介形質導入を、ＤＩＶ３（インビトロ日）に実行した。レンチウイルスストックを、培養培地中に希釈して、図の説明文に示すように、所与のＭＯＩ（感染多重度）にて細胞の上部にアプライした。ＤＩＶ１４、すなわち形質導入の１０日後に、細胞を固定して、免疫細胞化学を実行した。
免疫標識及び画像化
免疫細胞化学を、一次ニューロン及び星状細胞における形質導入の後に実行した。細胞を３回洗浄してから（１×ＰＢＳ）、４％ＰＦＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２８９０８）を用いて室温にて１０分間固定した。次いで、細胞を、０．２５％－Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ／３％－ＢＳＡ／１Ｘ－ＰＢＳ溶液（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＶＷＲ、１００５－３０－１Ｌ；Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈのＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００，Ｔ８７８７）を用いて１０分間透過処理した。透過処理後、細胞を、３％－ＢＳＡ／１Ｘ－ＰＢＳ溶液を用いて３０分間ブロッキングした。次いで、細胞を、一次抗体で標識してから（６０分）、蛍光コンジュゲート二次抗体で標識した（４５分）（抗体のリストについては以下を参照）。画像化を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞）及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＯｐｅｒａＰｈｅｎｉｘ（ニューロン／星状細胞）機器で実行した。閾値設定及び定量化を、Ｉｍａｇｅ Ｊ又はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェアで実行した。
ＥＬＩＳＡ
ヒトプログラニュリンＥＬＩＳＡキット（ＡＧ－４５Ａ－００１８ＹＥＫ－ＫＩ ０１，Ａｄｉｐｏｇｅｎ）を用いて、マウスニューロン－星状細胞共培養体の形質導入後の分泌されたヒトＰＧＲＮのレベルを定量した。細胞培養培地を、形質導入の１０日後に収集した。サンプルを１：１００に希釈して、ＥＬＩＳＡ測定を、供給元の指示に従って実行した。比色反応を、標準プレートリーダー（Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。
ヒトプログラニュリンＥＬＩＳＡキット（ＤＰＧＲＮ０，ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＧＲＮ＋／＋ＨＡＰ－１（野生型）細胞及びＧＲＮ－／－ＨＡＰ－１（ＫＯ）細胞の形質移入後の分泌されたヒトプログラニュリンのレベルを定量した。細胞培養培地を、形質移入の２４時間後に収集した。ＥＬＩＳＡ測定を、供給元の指示に従って実施した。比色反応を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により測定した。
脳の切片化、免疫組織化学、及び獲得
脳切片化を、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＴＮ，ＵＳＡ）にて実行した。最初に、脳を２０％グリセロール及び２％ジメチルスルホキシドにより一晩処理して凍結アーチファクトを防止して、ＭｕｌｔｉＢｒａｉｎ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いてゼラチンマトリックス内に包埋した。硬化後、ブロックを、クラッシュしたドライアイスにより－７０℃に冷却したイソペンタン中に浸漬することによって急速に凍結させて、ＡＯ８６０スライド式ミクロトームの凍結ステージ上に載せた。ＭｕｌｔｉＢｒａｉｎ（登録商標）ブロックを、冠状面で４０μｍに切片化した。抗原保存液（４９％ＰＢＳ ｐＨ７．０、５０％エチレングリコール、１％ポリビニルピロリドン）で満たした、ブロックあたり２４個の容器中に、全ての切片を連続して収集した。直ぐに染色しなかった切片を、－２０℃にて保存した。
自由浮遊性の切片を、ヒトプログラニュリン（Ｒ＆Ｄ－ＡＦ２４２０）に対する抗体（１：１５．０００に希釈）により免疫化学によって染色した。ブロッキング血清以降の全てのインキュベーション溶液は、ビヒクルとしてトリトンＸ－１００入りトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を用いた；リンスは全てＴＢＳによった。内因性ペルオキシダーゼ活性を０．９％過酸化水素処理によってブロックして、非特異的結合を１．２６％正常全血清によりブロックした。リンス後、切片を一次抗体により室温にて一晩染色した。ビヒクル溶液に、透過処理用の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有させた。リンス後、切片を、アビジン－ビオチン－ＨＲＰ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と室温にて１時間インキュベートした。リンス後、切片を、四塩酸ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）及び０．００１５％過酸化水素により処理して、可視反応生成物を作出して、ゲル化した（サブベッド）スライドガラス上に載せて、風乾して、チオニンにより軽く染色して、アルコール中で脱水して、キシレン中でクリアにして、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ封入剤によりカバースリップした。染色した切片のデジタル画像を、２０×対物レンズを備えるＡｘｉｏＳｃａｎ Ｚ１スライドスキャナ（Ｚｅｉｓｓ）を用いて得た。
ＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターを、２つの異なる供給元から得た。対応するプラスミド配列を、配列番号１８（ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６）及び配列番号１９（ＡＡＶＴＴ－ｐ２ＰＧ３６）に示す。ヘルパープラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐコードプラスミド、及び配列番号１７を含むプラスミド（ＡＡＶＴＴ－ｐＰＧ３６）を含む、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞又はＨＥＫ２９３細胞をそれぞれ用いる、Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ（「懸濁ＨＥＫ２９３細胞、ならびにＧＭＰ ＦＩＸ及びＦＬＴ１臨床ベクター用の培養培地からのベクターの連続収集を用いる組換えアデノ随伴ウイルスベクターの生成」（’Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ＨＥＫ２９３ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｈａｒｖｅｓｔ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＧＭＰ ＦＩＸ ａｎｄ ＦＬＴ１ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｅｃｔｏｒ’）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．２４ ｎｏ．２，２８７－２９７ ｆｅｂ．２０１６）において以前に説明されるようなトリプルプラスミド形質移入法を用いて、ＡＡＶベクターを生成した。図１０は、配列番号１７のヌクレオチド配列の構成部分を示す概略図を提供する。
例２－操作されたプロモータ構築体の生成及び評価
レンチウイルスベクター構築体ｐＡＫ１６９、ｐＰＧ２１、ｐＰＧ３５、及びｐＰＧ３６を、上記のように生成した。これらの構築体は全て、図１Ａに示すように、ニューロン特異的ＭｅＣＰ２プロモータ配列を含む。構築体ｐＡＫ１６９及びｐＰＧ２１は各々、２２９ｂｐの最小ＭｅＣＰ２プロモータ配列（配列番号１）を含む。
構築体ｐＰＧ３５（配列番号１０）は、ＭｅＣＰ２＿１（配列番号８）と称される操作されたプロモータ領域を含む。ＭｅＣＰ２＿１プロモータは、最小プロモータ配列（配列番号１）及び天然イントロンを含む。天然イントロンは、マウスＭｅＣＰ２遺伝子の２１０８ｂｐヌクレオチド配列（配列番号９）であり、最小プロモータ配列に対して５’側に配置されている。ＭｅＣＰ２＿１プロモータ配列は、２３３７ｂｐである。
構築体ｐＰＧ３６（配列番号１１）は、ＭｅＣＰ２＿２（配列番号３）と称される操作されたプロモータ領域を含む。ＭｅＣＰ２＿２プロモータは、最小ＭｅＣＰ２プロモータ配列（配列番号１）、及び最小プロモータ配列に対して３’側に配置されている２００６ｂｐの合成イントロン（配列番号２）を含む。ＭｅＣＰ２＿２プロモータは、２２３５ｂｐである。合成イントロン（ＭｅＣＰ ２＿２イントロン；配列番号２）を、マウスＭＥＣＰ２遺伝子の２つのイントロン配列及び２つのサイレンシングされた（すなわち、非発現）エクソンから構築した。エクソンを、開始コドンを除去するような定方向変異によってサイレンシングした。ＭｅＣＰ２＿２イントロン（配列番号２）の構築を示す概略図について、図１１参照。
操作されたＭｅＣＰ２＿２プロモータは、５’から３’に：ＭｅＣＰ２最小プロモータ配列（配列番号１）、Ａｇｅ１制限部位（ＡＣＣＧＧＴ；配列番号１４）、エクソン１（配列番号５）、５’イントロン（配列番号６）、３’イントロン（配列番号７）、及びエクソン２（配列番号８）を含む。
また、対照レンチウイルスベクター構築体ｐＡＫ１６８、ｐＰＧ２０、ｐＰＧ３３、及びｐＰＧ３４を生成した。これらの構築体は各々、図２Ａに示すように、ニューロン特異的ＮＳＥ１プロモータ配列を含む。構築体ｐＡＫ１６８及びｐＰＧ２０は、約１３００ｂｐの最小ＮＳＥ１プロモータ配列を含む。構築体ｐＡＫ１６８及びｐＰＧ２０を、それぞれｐＡＫ１６９及びｐＰＧ２１の等価対照として用いた。
構築体ｐＰＧ３３は、最小プロモータ配列であるＮＳＥ１＿１と称される操作されたプロモータ領域、及び最小プロモータ配列に対して５’側に配置されているヒトＮＳＥ１遺伝子の１１００ｂｐの天然に存在する配列を含む。構築体ｐＰＧ３４は、約０．９ｋｂ長の合成イントロンを含む、ＮＳＥ＿２と称される操作されたプロモータ領域を含む。構築体ｐＰＧ３３及びｐＰＧ３４を、それぞれｐＰＧ３５及びｐＰＧ３６の等価対照として用いた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＭｅＣＰ２ベクター及びＮＳＥ１ベクターの各々により形質移入した。ＰＧＲＮの発現を、ウエスタンブロットによって評価した。これらの実験の結果を図１Ｂ及び図２Ｂに示す。
ＭｅＣＰ２プロモータを含む構築体、すなわちｐＰＧ２１、ｐＰＧ３５、及びｐＰＧ３６は、ＮＳＥ１プロモータを含む構築体（すなわち、ｐＰＧ２０、ｐＰＧ３３、及びｐＰＧ３４）よりも高いＰＧＲＮ発現レベルを実現した。
また、構築体ｐＰＧ３６（ＭｅＣＰ２＿２プロモータを含む）は、構築体ｐＰＧ２１（最小ＭｅＣＰ２プロモータ配列を含む）及びｐＰＧ３５（ＭｅＣＰ２＿１プロモータを含む）と比較して、より高いＰＧＲＮ発現レベルを実現することが観察された。
例３－一次ニューロン及び星状細胞内でのＮＳＥ１プロモータ及びＭｅＣＰ２プロモータによる導入遺伝子発現の評価
野生型マウス一次皮質ニューロン－星状細胞共培養体に、レンチウイルスを用いてヒトプログラニュリンタンパク質を発現するように形質導入した。レンチウイルスを、図３に示すように、様々な感染多重度（ＭＯＩ）にてアプライした。レンチウイルス形質導入の１０日後、細胞を固定して、ＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）、ＧＦＡＰ（アストロサイトマーカー）、及びヒトプログラニュリン抗体を用いて免疫標識した。形質導入された細胞のパーセンテージを、図３Ａ（ニューロン）及び図３Ｃ（星状細胞）に示し、そして発現レベル（蛍光強度／細胞）を、図３Ｂ（ニューロン）及び図３Ｄ（星状細胞）に示す。
操作されたＮＳＥ１プロモータ（ｐＰＧ３３及びｐＰＧ３４）を含む構築体は、最小ＮＳＥ１プロモータを含む構築体ｐＰＧ２０と比較して、形質導入効率又は発現レベルを変化させないことが見出された。対照的に、プロモータＭｅＣＰ２＿１及びＭｅＣＰ２＿２を含む構築体（それぞれｐＰＧ３５及びｐＰＧ３６）は、最小ＭｅＣＰ２プロモータを含む構築体ｐＰＧ２１と比較して、形質導入効率又は発現レベルを増大させた。特に、ＭｅＣＰ２＿２プロモータ（ｐＰＧ３６）は、形質導入効率及びＰＧＲＮ発現レベルに関して試験した全てのプロモータの中で最も良好に機能した。
例４－ＭｅＣＰ２プロモータを含むベクターにより形質移入したニューロン及び星状細胞によるＰＧＲＮ分泌の評価
野生型マウス一次皮質ニューロン－星状細胞共培養体に、レンチウイルスベクターを用いてヒトプログラニュリンタンパク質を発現するように形質導入した。レンチウイルスを、２０の感染多重度（ＭＯＩ）にてアプライした。レンチウイルス形質導入の１０日後、培養培地を収集して、ＥＬＩＳＡを実行した。この実験の結果を、図４に示す。操作されたプロモータＭｅＣＰ２＿１及びＭｅＣＰ２＿２を含む構築体（それぞれｐＰＧ３５及びｐＰＧ３６）は、最小ＭｅＣＰ２プロモータを含む構築体（ｐＰＧ２１）と比較して、分泌ＰＧＲＮを増大させることが見出された。プロモータＭｅＣＰ２＿２（ｐＰＧ３６）は、試験した全てのプロモータの中で最も高い発現レベルの分泌ＰＧＲＮを提供した。
例５－ＰＧＲＮコドン最適化
非メチル化ＣｐＧ部位は、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって媒介される自然免疫応答を誘導し得る。ゆえに、ＣｐＧ含量が引き下げられたヒトＰＧＲＮをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を生成して、ＣｐＧ ０、４、９、１７、２５、４０、７１、及び９０と示される発現ベクター中にクローニングした。これらのベクターは各々、対応するＷＴ配列と比較して、ＣｐＧ含量が引き下げられたコドン最適化ヒトＰＧＲＮヌクレオチド配列を含む。
コドン最適化ベクター、そしてＷＴベクターにより形質移入したＨＡＰ－１ ＧＲＮノックアウト（ＧＲＮ－／－）細胞について、ＰＧＲＮ発現レベルを、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットによって評価した。発現レベルデータを図５に示す。ＷＴ ＰＧＲＮヌクレオチド配列を含むベクターは、試験した全てのコドン最適化ベクターよりも高いレベルのＰＧＲＮ発現を実現することが観察された。
例６－ヒトＰＧＲＮの発現は、ＧＲＮ－／－マウス一次ニューロンにおけるリソソーム欠損を修正する。
ウエスタンブロット分析を実行して、リソソームタンパク質カテプシンＤのレベルを定量した。カテプシンＤは、可溶性リソソームアスパラギン酸エンドペプチダーゼである。未成熟形態は、タンパク質分解的に切断されて、非共有結合性相互作用によって連結される重鎖（約３０ｋＤａ）及び軽鎖（１４ｋＤａ）で構成される成熟活性リソソームプロテアーゼが生じる。カテプシンＤは、リソソーム機能不全のマーカーであり、カテプシンＤのレベルの増大は、タンパク質分解及びオートファジーカーゴの蓄積の障害を示唆している。
マウス一次皮質ニューロンを、ＷＴマウス又はＧＲＮ－／－（ＫＯ）マウスから調製した。プレーティングの３日後、ニューロンにレンチウイルス構築体（２０のＭＯＩ）を形質導入して、ヒトＰＧＲＮタンパク質を発現させた。形質導入の１０日後、細胞を収集して、タンパク質を、ＲＩＰＡバッファを用いて抽出した。次いで、タンパク質溶解物をウエスタンブロッティングに供して、カテプシンＤタンパク質を検出した。カテプシンＤのウエスタンブロットレベルを、アクチン及びＧＡＰＤＨの発現レベルに対して正規化した。データは、３つの独立した実験に由来する。
ＷＴニューロンと比較して、成熟カテプシンＤのレベルの増大が、形質導入されていない状態のＫＯニューロンにおいて観察された。ｈＰＧＲＮ（ｐＰＧ３６）のレンチウイルス媒介発現は、カテプシンＤの成熟を妨げた。これらの結果を図６に示す。
例７－ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６の線条体注射後のＷＴマウス及びＧＲＮ－／－マウスにおけるヒトＰＧＲＮ（ｈＰＧＲＮ）のＣＮＳ発現
成体（４ヶ月齢）ＷＴマウス又はＧＲＮ－／－マウスの線条体に、ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６（ＭｅＣＰ２＿２プロモータ＋ヒトＰＧＲＮ導入遺伝子の構築体を含有するＡＡＶＴＴ；配列番号１８）又はＡＡＶＴＴ－ＧＦＰ（ＭｅＣＰ２＿２プロモータ＋ＧＦＰ導入遺伝子）又はビヒクルを、２１０ベクターゲノム（ｖｇ）の総用量にて両側に注射した。４週後に動物を犠牲にして、ＣＳＦ、血漿、及び脳組織を収集して、分析した。切開前に、経心腔的灌流を１×ＰＢＳにより実行した。脳の半分を免疫組織化学分析のために固定して、他方の半分を生化学分析（ＦＲＥＴ）に用いた。異なる脳領域を切開して、凍結した。
ＥＬＩＳＡ分析及びＦＲＥＴ分析
ｈＰＧＲＮ（ｎｇ／ｍｌ）のＣＳＦレベル及び血漿レベルを、ＥＬＩＳＡ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）を用いて測定した。高レベルのｈＰＧＲＮが、ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６（配列番号１８）及びＡＡＶＴＴ－ｐ２ＰＧ３６（配列番号１９）を注射した動物において、ＷＴマウス及びＧＲＮ－／－マウスの双方のＣＳＦ（１：１００希釈）中で検出された。これらの結果を図７Ａ及び図７Ｃに示す。また、低レベルのｈＰＧＲＮが、マウスの血漿（１：１０希釈）中で検出された。これらの結果を図７Ａに示す。
ＦＲＥＴ（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いて、ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６を注射したＷＴマウス又はＧＲＮ－／－マウスの種々の脳領域におけるｈＰＧＲＮ濃度（ｎｇ／ｍｇ）を測定した。ｈＰＧＲＮの最も高い発現が、注射部位（線条体及び中脳）の近くで検出された。また、中レベルのｈＰＧＲＮ発現が、皮質及び海馬において検出された。低レベルのｈＰＧＲＮ発現が、脳幹、嗅球、及び小脳等の遠位脳領域において検出された。これらの結果を図７Ｂに示す。
免疫組織化学
ｈＰＧＲＮのＩＨＣ染色が、ＡＡＶ－ｐ１ＰＧ３６（配列番号１８）の線条体内投与を受けたＧＲＮ－／－ＫＯマウスの脳において観察された。特異的なヒトＰＧＲＮシグナルは、ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６注射マウスにおいてのみ検出され、ＧＦＰ注射マウスにおいては検出されなかった。ＦＲＥＴ結果と同様に、注射を実行したマウスの線条体において強い免疫反応性が観察された。また、ｈＰＧＲＮ免疫反応性が、注射部位から離れた脳領域、すなわち視床、中脳、黒質、皮質、及び海馬において観察された。細胞（細胞体）免疫反応性は、注射部位の近く、すなわち線条体、皮質の一部、海馬の一部、視床、中脳において主に観察された。このことは、これらの領域におけるＡＡＶＴＴ－ｐ １ＰＧ３６による細胞の形質導入を示唆している。拡散染色が、注射部位から強度が低下しながら、他のほとんどの脳領域内で観察することができた。これは、ｈＰＧＲＮが細胞外空間内に分泌されて、ＩＳＦ及びＣＳＦのフローを介して遠位脳領域に拡散することを示している。ＧＲＮ－／－マウスについて得られた結果を図８に示すが、ＡＡＶ－ｐ１ＰＧ３６を注射したＷＴマウスについても同様の画像が得られた。
免疫蛍光
ＭｅＣＰ２プロモータが、一次混合星状細胞－ニューロン培養体において、ｈＰＧＲＮのニューロン特異的発現をインビトロで駆動することができることが示された（上記の例３及び例４参照）。このニューロン特異性がマウスにおいてインビボで維持されているかを判定するために、以下のプロトコルに従って、ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６（配列番号１８）を注射したマウスから得た切片に二重免疫蛍光標識を実行して、ヒトＰＧＲＮ及びＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）を標識した（全ての工程を室温にて実行）：
切片を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中に希釈したニューロンマーカーＮｅｕＮ（１：２，０００；Ａｂｃａｍ，ａｂ １７７４８７）及びヒトプログラニュリン（１：１，０００；Ｒ＆Ｄ－ＡＦ２４２０）一次抗体と一緒に、加湿チャンバ内で一晩インキュベートした。インキュベーション後、切片をＰＢＳで３回洗浄してから、抗ウサギＡｌｅｘａ ４８８及び抗ヤギＡｌｅｘａ ６４７二次抗体と１時間インキュベートした（全てＰＢＳ中に１：１，０００にて希釈；全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）。次いで、切片をＤＡＰＩにより対比染色して、細胞核を標識し、そしてＰＢＳにより３回洗浄した。最後に、切片をＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止封入剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により封入して、カバースリップをアプライした。染色した切片のデジタル画像を、２０×対物レンズを備えるＡｘｉｏＳｃａｎ Ｚ１スライドスキャナ（Ｚｅｉｓｓ）を用いて得た。
細胞体内でヒトＰＧＲＮを発現する細胞はほぼ全てＮｅｕＮ陽性であることが観察された。これは、ｈＧＲＮのＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６媒介発現がインビボでニューロン特異的であることを実証している。ｈＧＲＮのニューロン発現は、線条体、皮質、海馬、及び視床が挙げられる種々の全ての脳領域において観察された。重要なことに、細胞発現ｈＧＲＮは、星状細胞（ＧＦＡＰ染色を用いて識別）又はミクログリア（Ｉｂａ１染色を用いて識別）の細胞体において観察されなかった。ゆえに、これらのインビボデータは、用いられるＭｅＣＰ２＿２プロモータがニューロン特異的プロモータであるという結論を支持している。
例８－ヒトＰＧＲＮ（ｈＰＧＲＮ）発現は、ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６の線条体注射後にＷＴマウス及びＧＲＮ－／－マウスにおいてカテプシンＤ活性にインビボで影響を及ぼす。
カテプシンＤのレベルの増大は、タンパク質分解及びオートファジーカーゴの蓄積の障害を示唆している。カテプシンＤ酵素活性を、ビヒクルで処置したＷＴ（ＧＲＮ＋／＋）マウス（黒丸で示す）、及びビヒクル又はＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６（配列番号１８）で処置したＧＲＮ－／－ＫＯマウスの中脳溶解物において測定した。これらの結果を図９に示す。
インビトロ研究により、ｐＰＧ３６の発現によって覆されているＧＲＮ－／－一次ニューロンにおけるカテプシンＤ成熟の加速成熟が明らかとなった（上記の例６参照）。成熟の増大は、カテプシンＤ活性の増大と関連すると予想される。ＷＴマウスと比較して、若齢（４～５ヶ月齢）ＧＲＮ－／－マウスの種々の脳領域におけるカテプシンＤ酵素活性が僅かに増す。特に、カテプシンＤ活性の増大は、より高齢の動物（例えば１歳齢）において、より顕著である。ゆえに、カテプシンＤ活性は、４～５ヶ月齢という早い時期に検出可能な、ＧＲＮ－／－マウスにおけるストレスの初期マーカーであることが提唱されている。
いずれの場合も、４ヶ月齢のＧＲＮ－／－マウスにおける、ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６によって媒介されるｈＧＲＮの発現は、カテプシンＤ酵素活性の低下をもたらした。これは、ニューロン特異的ＭｅＣＰ２＿２プロモータによって駆動されるＡＡＶ媒介ｈＰＧＲＮ発現が、カテプシンＤ活性（リソソーム機能不全のマーカー）に直接影響を及ぼすことを実証している。















本発明の更なる態様：
１．プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモータを含む核酸構築体。
２．ＭｅＣＰ２プロモータは、最小プロモータ配列及び少なくとも１つのイントロンを含む操作されたＭｅＣＰ２プロモータである、段落１に記載の核酸構築体。
３．注目するタンパク質（ＰＯＩ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された操作されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモータを含む核酸構築体であって、操作されたＭｅＣＰ２プロモータは、最小プロモータ配列及び少なくとも１つのイントロンを含む、核酸構築体。
４．ＰＯＩはプログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質である、段落３に記載の核酸構築体。
５．（ａ）少なくとも１つのイントロンは、最小プロモータ配列の３’側にあり；又は（ｂ）少なくとも１つのイントロンは、最小プロモータ配列の５’側にある、段落２～４のいずれかに記載の核酸構築体。
６．少なくとも１つのイントロンは、合成イントロンである、段落２～５のいずれかに記載の核酸構築体。
７．少なくとも１つの合成イントロンは、ＭＥＣＰ２遺伝子の１つ以上のヌクレオチド配列を含み、任意に、少なくとも１つの合成イントロンは、ＭＥＣＰ２遺伝子の１つ以上のイントロン配列及び／又はＭＥＣＰ２遺伝子の１つ以上の非発現エクソン配列を含み、好ましくは、ＭＥＣＰ２遺伝子はヒトＭＥＣＰ２遺伝子である、段落６に記載の核酸構築体。
８．少なくとも１つの合成イントロンは、ヒトＭＥＣＰ２遺伝子の２つのイントロン配列、及びヒトＭＥＣＰ２遺伝子の２つの非発現エクソン配列を含む、段落６又は７に記載の核酸構築体。
９．少なくとも１つの合成イントロンは：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、もしくは配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む非発現エクソン配列；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むイントロン配列；
（ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列、もしくは配列番号６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むイントロン配列；及び／又は
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、もしくは配列番号７のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む非発現エクソン配列
を含む、段落６～８のいずれかに記載の核酸構築体。
１０．５’から３’方向に、少なくとも１つの合成イントロンは：
（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、又は配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む非発現エクソン配列；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むイントロン配列；
（ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列、又は配列番号６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むイントロン配列；及び
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、又は配列番号７のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む非発現エクソン配列
を含む、段落６～９のいずれかに記載の核酸構築体。
１１．少なくとも１つの合成イントロンは、配列番号２のヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落６～１０のいずれかに記載の核酸構築体。
１２．少なくとも１つのイントロンは、天然イントロンである、段落２～５のいずれかに記載の核酸構築体。
１３．少なくとも１つの天然イントロンは、ＭｅＣＰ２遺伝子、好ましくはヒトＭｅＣＰ２遺伝子のヌクレオチド配列を含む、段落１２に記載の核酸構築体。
１４．少なくとも１つの天然イントロンは、配列番号９のヌクレオチド配列、又は配列番号９のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落１３に記載の核酸構築体。
１５．最小プロモータ配列は、配列番号１のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む、段落２～１４のいずれかに記載の核酸構築体。
１６．操作されたＭｅＣＰ２プロモータは、配列番号３のヌクレオチド配列、又はその、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む、段落１～１１のいずれかに記載の核酸構築体。
１７．操作されたＭｅＣＰ２プロモータは、配列番号８のヌクレオチド配列、又はその、配列番号８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む、段落１～５又は１２～１４のいずれかに記載の核酸構築体。
１８．ＭｅＣＰ２プロモータは、少なくとも約１０００ｂｐ、１５００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２１５０ｂｐ、２１７５ｂｐ、２２００ｂｐ、２２１０ｂｐ、２２２０ｂｐ、２２３０ｂｐ、２２４０ｂｐ、２２５０ｂｐ、２２６０ｂｐ、２２８０ｂｐ、２２９０ｂｐ、２３００ｂｐ、２３１０ｂｐ、２３２０ｂｐ、２３３０ｂｐであり、好ましくはＭｅＣＰ２プロモータは約２２００～２３５０ｂｐである、段落１～１７のいずれかに記載の核酸配列。
１９．（ａ）ＰＧＲＮタンパク質はヒトＰＧＲＮタンパク質であり；
（ｂ）ＰＧＲＮタンパク質は野生型タンパク質であり；
（ｃ）ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ヒトヌクレオチド配列であり；
（ｄ）ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、野生型ヌクレオチド配列であり；
（ｅ）ＰＧＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されておらず；及び／又は
（ｆ）ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１７５０ｂｐ、１７６０ｂｐ、１７７０ｂｐ、もしくは１７８０ｂｐであり、好ましくは、ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、約１７８０ｂｐである、
段落１、２、又は４～１８のいずれかに記載の核酸構築体。
２０．ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含み；及び／又は
ＰＧＲＮタンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列、又はその、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む、
段落１、２、又は４～１９のいずれかに記載の核酸構築体。
２１．（ａ）ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列であって、任意に、ＷＰＲＥは、ＰＯＩもしくはＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’側にあり、及び／又は配列番号１５のヌクレオチド配列、もしくはその、配列番号１５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含む、ＷＰＲＥ配列；
（ｂ）ポリアデニル化シグナル配列であって、任意に、ＰＯＩ又はＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’側にあり、及び／又は配列番号１６のヌクレオチド配列、又はその、配列番号１６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片を含むポリアデニル化シグナル配列；あるいは
（ｃ）先の（ａ）及び（ｂ）
をさらに含む、段落１～２０のいずれかに記載の核酸構築体であって、
任意に、５’から３’方向に、ＭｅＣＰ２プロモータ、ＰＯＩ又はＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ、及びポリアデニル化シグナル配列を含む、核酸構築体。
２２．３７００～４７００ｂｐ、３８００～４８００ｂｐ、３９００～４７００ｂｐ、４０００～４６００ｂｐ、４０００～４５００ｂｐ、４０００～４４００ｂｐ、４０００～４３００ｂｐ、又は４０００～４２００ｂｐである、段落１～２１のいずれかに記載の核酸構築体。
２３．段落１～２２のいずれか１つに定義される核酸構築体を含むベクター。
２４．プラスミド又はウイルスベクターである、段落２３に記載のベクター。
２５．（ａ）配列番号１１、又はその、配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片；あるいは
（ｂ）配列番号１０、又はその、配列番号１０のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する機能的バリアントもしくは断片
のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターである、段落２３又は２４に記載のベクター。
２６．ウイルスベクターであり、以下から選択される、段落２３～２５のいずれかに記載のベクター：
（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又は、
ＡＡＶゲノムもしくはその誘導体を含むウイルスベクター、ただし該誘導体はキメラ、シャッフルもしくはキャプシド修飾誘導体であってよい；又は
（ｂ）レンチウイルスベクター、又は、
レンチウイルスゲノムもしくはその誘導体を含むウイルスベクター。
（The vector of paragraph any one of paragraphs 23-25, which is a viral vector selected from: (a) an adeno-associated virus (AAV) vector or which comprises an AAV genome or a derivative thereof, optionally wherein said derivative is a chimeric, shuffled or capsid modified derivative; or (b) a lentiviral vector or which comprises a lentivirus genome or a derivative thereof.）
２７．ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、又はＡＡＶ血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）に由来するゲノムを含むＡＡＶベクターであり、好ましくは、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒＨ１０に由来するゲノムを含む、段落２６に記載のウイルスベクター。
２８．ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２に由来するゲノムを含み、好ましくは、ＡＡＶはＡＡＶ－ＴＴである、段落２７に記載のＡＡＶベクター。
２９．段落１～２２のいずれかに記載の核酸構築体及び／もしくは段落２３～２８のいずれかに記載のベクターを含み、及び／又は段落２５～２８のいずれかに記載のウイルスベクターを生成する宿主細胞であって、任意に、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３ Ｔ細胞である宿主細胞。
３０．段落１～２２のいずれかに記載の核酸構築体、段落２３もしくは２４に記載のベクター、及び／又は段落２５～２８のいずれかに記載のウイルスベクターを、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と共に含む医薬組成物。
３１．プログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において当該疾患を処置又は予防する方法に用いられる、段落１～２２のいずれか１つに定義される核酸構築体、段落２３もしくは２４に定義されるベクター、段落２５～２８のいずれか１つに定義されるウイルスベクター、及び／又は段落３０に定義される医薬組成物。
３２．プログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において当該疾患を処置又は予防する方法であって、患者に、治療有効量の、段落１～２２のいずれか１つに定義される核酸構築体、段落２３もしくは２４に定義されるベクター、段落２５～２８のいずれか１つに定義されるウイルスベクター、及び／又は段落３０に定義される医薬組成物を投与することを含む方法。
３３．段落１～２２のいずれか１つに定義される核酸構築体、段落２３もしくは２４に定義されるベクター、段落２５～２８のいずれか１つに定義されるウイルスベクター、及び／又は段落３０に定義される医薬組成物の、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において当該疾患を処置又は予防するための医薬品を製造するための使用。
３４．ＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患は、中枢神経系の疾患であり；
ＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患は、患者のニューロン及び／又は星状細胞におけるＰＧＲＮの欠乏によって特徴付けられ；
患者は、そのＧＲＮ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子内に機能喪失変異を有し；及び／又は
患者は、そのＧＲＮ遺伝子の双方の対立遺伝子内に機能喪失変異を有する、
段落３１、段落３２に記載の方法、又は段落３３に記載の使用に従って用いられる核酸構築体、ベクター、ウイルスベクター、又は医薬組成物。
３５．ＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）又は神経セロイドリポフスチン症１１型（ＮＣＬ１１）である、段落３１もしくは３４、段落３２もしくは３４に記載の方法、又は段落３３もしくは３４に記載の使用に従って用いられる核酸構築体、ベクター、ウイルスベクター、又は医薬組成物。
３６．前記核酸構築体、ベクター、ウイルスベクター、又は医薬組成物は、患者に、患者の脳及び／又は脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達によって投与され、任意に、送達は、注射によって：
（ｉ）患者の脳；及び／又は
（ｉｉ）患者のＣＳＦになされ、
好ましくは、脳への注射は、脳内注射、実質内注射、視床下部内注射、及びそれらの組合せから選択され；
好ましくは、ＣＳＦへの注射は、大槽内注射、髄腔内注射、脳室内（ＩＣＶ）注射、及びそれらの組合せから選択される、
段落３１、３４、もしくは３５、段落３２、３４、もしくは３５に記載の方法、又は段落３３～３５のいずれか一項に記載の使用に従って用いられる核酸構築体、ベクター、ウイルスベクター、又は医薬組成物。
配列表１ ＜２２３＞ＭｅＣＰ２最小プロモータ
配列表２ ＜２２３＞ＭｅＣＰ２＿２イントロン
配列表３ ＜２２３＞ＭｅＣＰ２＿２プロモータ
配列表４ ＜２２３＞ＭｅＣＰ２＿２イントロン－エクソン１
配列表５ ＜２２３＞ＭｅＣＰ２＿２イントロン－５’イントロン
配列表６ ＜２２３＞ＭｅＣＰ２＿２イントロン－３’イントロン
配列表７ ＜２２３＞ＭｅＣＰ２＿２イントロン－エクソン２
配列表８ ＜２２３＞ＭｅＣＰ２＿１プロモータ
配列表９ ＜２２３＞ＭｅＣＰ２＿１イントロン
配列表１０ ＜２２３＞ｐＰＧ３５
配列表１１ ＜２２３＞ｐＰＧ３６
配列表１４ ＜２２３＞Ａｇｅ１制限部位
配列表１６ ＜２２３＞ポリＡシグナル配列
配列表１７ ＜２２３＞ＡＡＶＴＴ－ｐＰＧ３６
配列表１８ ＜２２３＞ＡＡＶＴＴ－ｐ１ＰＧ３６
配列表１９ ＜２２３＞ＡＡＶＴＴ－ｐ２ＰＧ３６
配列表２０ ＜２２３＞５’ＩＴＲ
配列表２１ ＜２２３＞５’隣接断片
配列表２２ ＜２２３＞３’隣接断片
配列表２３ ＜２２３＞３’ＩＴＲ
配列表２４ ＜２２３＞Ｋｏｚａｋ配列

Claims (41)

  1. プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモータを含む、核酸構築体。
  2. ＭｅＣＰ２プロモータが、最小プロモータ配列及び少なくとも１つのイントロンを含む操作されたＭｅＣＰ２プロモータである、請求項１に記載の核酸構築体。
  3. 注目するタンパク質（ＰＯＩ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された操作されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモータを含む核酸構築体であって、前記操作されたＭｅＣＰ２プロモータが、最小プロモータ配列及び少なくとも１つのイントロンを含む、核酸構築体。
  4. ＰＯＩがプログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質である、請求項３に記載の核酸構築体。
  5. （ａ）少なくとも１つのイントロンが、最小プロモータ配列の３’側にあり；又は（ｂ）少なくとも１つのイントロンが、最小プロモータ配列の５’側にある、請求項２～４のいずれかに記載の核酸構築体。
  6. 少なくとも１つのイントロンが、合成イントロンである、請求項２～５のいずれかに記載の核酸構築体。
  7. 少なくとも１つの合成イントロンが、ＭＥＣＰ２遺伝子の１つ以上のヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの合成イントロンが、ＭＥＣＰ２遺伝子の１つ以上のイントロン配列及び／又はＭＥＣＰ２遺伝子の１つ以上の非発現エクソン配列を含んでよく、好ましくは、前記ＭＥＣＰ２遺伝子が、マウス又はヒトＭＥＣＰ２遺伝子であり、より好ましくは、前記ＭＥＣＰ２遺伝子がマウスＭＥＣＰ２遺伝子である、請求項６に記載の核酸構築体。
  8. 少なくとも１つの合成イントロンが、マウスＭＥＣＰ２遺伝子の２つのイントロン配列、及びマウスＭＥＣＰ２遺伝子の２つの非発現エクソン配列を含む、請求項６又は７に記載の核酸構築体。
  9. 少なくとも１つの合成イントロンが以下を含む、請求項６～８のいずれかに記載の核酸構築体：
    （ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、もしくは配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む非発現エクソン配列；
    （ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むイントロン配列；
    （ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列、もしくは配列番号６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むイントロン配列；及び／又は
    （ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、もしくは配列番号７のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む非発現エクソン配列。
  10. ５’から３’方向に、少なくとも１つの合成イントロンが以下を含む、請求項６～９のいずれかに記載の核酸構築体：
    （ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、又は配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む非発現エクソン配列；
    （ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むイントロン配列；
    （ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列、又は配列番号６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むイントロン配列；及び
    （ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列、又は配列番号７のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む非発現エクソン配列。
  11. 少なくとも１つの合成イントロンが、配列番号２のヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項６～１０のいずれかに記載の核酸構築体。
  12. 少なくとも１つのイントロンが、天然イントロンである、請求項２～５のいずれかに記載の核酸構築体。
  13. 少なくとも１つの天然イントロンが、ＭＥＣＰ２遺伝子、好ましくはマウス又はヒトＭＥＣＰ２遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の核酸構築体。
  14. 少なくとも１つの天然イントロンが、マウスＭＥＣＰ２遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の核酸構築体。
  15. 少なくとも１つの天然イントロンが、配列番号９のヌクレオチド配列、又は配列番号９のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の核酸構築体。
  16. 最小プロモータ配列が、配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含む、請求項２～１５のいずれかに記載の核酸構築体。
  17. 操作されたＭｅＣＰ２プロモータが、配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含む、請求項１～１１のいずれかに記載の核酸構築体。
  18. 操作されたＭｅＣＰ２プロモータが、配列番号８のヌクレオチド配列、又は配列番号８のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含む、請求項１～５及び１２～１５のいずれかに記載の核酸構築体。
  19. ＭｅＣＰ２プロモータが、少なくとも約１０００ｂｐ、１５００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２１５０ｂｐ、２１７５ｂｐ、２２００ｂｐ、２２１０ｂｐ、２２２０ｂｐ、２２３０ｂｐ、２２４０ｂｐ、２２５０ｂｐ、２２６０ｂｐ、２２８０ｂｐ、２２９０ｂｐ、２３００ｂｐ、２３１０ｂｐ、２３２０ｂｐ、２３３０ｂｐの長さであり、好ましくはＭｅＣＰ２プロモータが約２２００～２３５０ｂｐの長さである、請求項１～１８のいずれかに記載の核酸配列。
  20. 以下である、請求項１、２、及び４～１９のいずれかに記載の核酸構築体：
    （ａ）ＰＧＲＮタンパク質がヒトＰＧＲＮタンパク質である；
    （ｂ）ＰＧＲＮタンパク質が野生型タンパク質である；
    （ｃ）ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ヒトヌクレオチド配列である；
    （ｄ）ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、野生型ヌクレオチド配列である；
    （ｅ）ＰＧＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、コドン最適化されていない；及び／又は
    （ｆ）ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、少なくとも約１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１７５０ｂｐ、１７６０ｂｐ、１７７０ｂｐ、もしくは１７８０ｂｐであり、好ましくは、ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、約１７８０ｂｐの長さである。
  21. ＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２のヌクレオチド配列であるか、又は配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含む；及び／又は
    ＰＧＲＮタンパク質が、配列番号１３のアミノ酸配列であるか、又は配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含む、
    請求項１、２、及び４～２０のいずれかに記載の核酸構築体。
  22. さらに以下を含む、請求項１～２１のいずれかに記載の核酸構築体：
    （ａ）ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列であって、ＷＰＲＥが、ＰＯＩもしくはＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’側にある、及び／又は配列番号１５のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含んでよい、ＷＰＲＥ配列；
    （ｂ）ポリアデニル化シグナル配列、ただし、以下であってよい：
    ＰＯＩ又はＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’側にあり、及び／又は配列番号１６のヌクレオチド配列、又は配列番号１６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含むポリアデニル化シグナル配列；あるいは
    （ｃ）前記（ａ）及び前記（ｂ）、

    ５’から３’方向に、ＭｅＣＰ２プロモータ、ＰＯＩ又はＰＧＲＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列、前記ＷＰＲＥ、及び前記ポリアデニル化シグナル配列を含んでよい。
  23. ３７００～４７００ｂｐ、３８００～４８００ｂｐ、３９００～４７００ｂｐ、４０００～４６００ｂｐ、４０００～４５００ｂｐ、４０００～４４００ｂｐ、４０００～４３００ｂｐ、又は４０００～４２００ｂｐである、請求項１～２２のいずれかに記載の核酸構築体。
  24. 請求項１～２３のいずれかに記載の核酸構築体を含むベクター。
  25. プラスミド又はウイルスベクターである、請求項２４に記載のベクター。
  26. （ａ）配列番号１１、又は配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片；
    （ｂ）配列番号１０、又は配列番号１０のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片
    のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターである、請求項２４又は２５に記載のベクター。
  27. ウイルスベクターであり、以下から選択される、請求項２４～２６のいずれかに記載のベクター：
    （ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又は、
    ＡＡＶゲノムもしくはその誘導体を含むウイルスベクター、ただし該誘導体はキメラ、シャッフルもしくはキャプシド修飾誘導体であってよい；又は
    （ｂ）レンチウイルスベクター、又は、
    レンチウイルスゲノムもしくはその誘導体を含むウイルスベクター。
  28. ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、又はＡＡＶ血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）に由来するゲノムを含むＡＡＶベクターであり、好ましくは、ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒＨ１０に由来するゲノムを含む、請求項２７に記載のウイルスベクター。
  29. ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２に由来するゲノムを含み、好ましくは、ＡＡＶがＡＡＶ－ＴＴである、請求項２８に記載のＡＡＶベクター。
  30. ＡＡＶベクターが、５’から３’方向に：
    （ａ）５’ＩＴＲ；
    （ｂ）５’隣接断片；
    （ｃ）最小ＭｅＣＰ２プロモータ配列；
    （ｄ）少なくとも１つの合成イントロン；
    （ｅ）Ｋｏｚａｋ配列；
    （ｆ）ＰＧＲＮタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；
    （ｇ）ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列；
    （ｈ）３’隣接断片；及び
    （ｉ）３’ＩＴＲ
    の１つ又は２つ以上を含むヌクレオチド配列を含む、請求項２８又は２９に記載のＡＡＶベクター。
  31. 以下である、 請求項３０に記載のＡＡＶベクター：
    （ａ）５’ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列、又は配列番号２０と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれからなる；
    （ｂ）５’隣接断片が、配列番号２１のヌクレオチド配列、又は配列番号２１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれからなる；
    （ｃ）最小ＭｅＣＰ２プロモータ配列が、配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれからなる；
    （ｄ）少なくとも１つの合成イントロンが、配列番号２のヌクレオチド配列、又は配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれからなる；
    （ｅ）Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号２４のヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる；
    （ｆ）ＰＧＲＮタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号１２のヌクレオチド配列、又は配列番号１２に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれからなる；
    （ｇ）ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列が、配列番号１６のヌクレオチド配列、又は配列番号１６に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれからなる；
    （ｈ）３’隣接断片が、配列番号２２のヌクレオチド配列、又は配列番号２２に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれからなる；及び／又は
    （ｉ）３’ＩＴＲが、配列番号２３のヌクレオチド配列、又は配列番号２３に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含むか、又はそれからなる。
  32. ＡＡＶベクターが、配列番号１７のヌクレオチド配列、又は配列番号１７のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片を含む、請求項２９～３１のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
  33. ＡＡＶベクターが：
    （ａ）配列番号１８、又は配列番号１８のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片；あるいは
    （ｂ）配列番号１９、又は配列番号１９のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントもしくは断片
    のヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、請求項２９～３２のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
  34. 請求項１～２３のいずれかに記載の核酸構築体及び／もしくは請求項２４～３３のいずれかに記載のベクターを含む、及び／又は請求項２６～３３のいずれかに記載のウイルスベクターを生成する、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３ Ｔ細胞であってよい、宿主細胞。
  35. 請求項１～２３のいずれかに記載の核酸構築体、請求項２４もしくは２５に記載のベクター、及び／又は請求項２６～３３のいずれかに記載のウイルスベクターを、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と共に含む医薬組成物。
  36. プログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において前記疾患を処置又は予防する方法での使用のための、請求項１～２３のいずれかに記載の核酸構築体、請求項２４もしくは２５に記載のベクター、請求項２６～３３のいずれかに記載のウイルスベクター、及び／又は請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. プログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において前記疾患を処置又は予防する方法であって、前記患者に、治療有効量の、請求項１～２３のいずれかに記載の核酸構築体、請求項２４もしくは２５に記載のベクター、請求項２６～３３のいずれかに記載のウイルスベクター、及び／又は請求項３５に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
  38. 請求項１～２３のいずれかに記載の核酸構築体、請求項２４もしくは２５に記載のベクター、請求項２６～３３のいずれかに記載のウイルスベクター、及び／又は請求項３５に記載の医薬組成物の、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）欠乏によって特徴付けられる疾患の処置又は予防を必要とする患者において前記疾患を処置又は予防するための医薬品を製造するための使用。
  39. 以下である、請求項３６に記載の使用のための核酸構築体、ベクター、ウイルスベクターもしくは医薬組成物、請求項３７に記載の方法、又は請求項３８に記載の使用：
    ＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患が、中枢神経系の疾患である；
    ＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患が、患者のニューロン及び／又は星状細胞におけるＰＧＲＮの欠乏によって特徴付けられる；
    患者が、そのＧＲＮ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子内に機能喪失変異を有する；及び／又は
    患者が、そのＧＲＮ遺伝子の双方の対立遺伝子内に機能喪失変異を有する。
  40. ＰＧＲＮ欠乏によって特徴付けられる疾患が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）又は神経セロイドリポフスチン症１１型（ＮＣＬ１１）である、請求項３６もしくは３９に記載の使用のための核酸構築体、ベクター、ウイルスベクターもしくは医薬組成物、請求項３７もしくは３９に記載の方法、又は請求項３８もしくは３９に記載の使用。
  41. 以下である、請求項３６、３９、もしくは４０に記載の使用のための核酸構築体、ベクター、ウイルスベクターもしくは医薬組成物、請求項３７、３９、もしくは４０に記載の方法、又は請求項３８～４０のいずれかに記載の使用：
    前記核酸構築体、ベクター、ウイルスベクター、又は医薬組成物は、患者に、該患者の脳及び／又は脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達によって投与される、
    ここで、前記送達は、注射によって以下になされてよい：
    （ｉ）患者の脳；前記脳への前記注射は、好ましくは脳内注射、実質内注射、視床下部内注射、及びそれらの組合せから選択される；及び／又は
    （ｉｉ）患者のＣＳＦ；前記ＣＳＦへの前記注射は、好ましくは大槽内注射、髄腔内注射、脳室内（ＩＣＶ）注射、及びそれらの組合せから選択される。
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