JP2022536338A - Ａｒｓａ遺伝子移入のためのアデノ随伴ウイルス組成物およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
細胞内にアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）ポリペプチドを発現することができ、それによってＡＲＳＡ遺伝子機能を回復させるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）組成物が、本明細書において提供される。また、ＡＡＶ組成物を使用する方法、およびＡＡＶ組成物を作製するためのパッケージングシステムも提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８５９，５３９号、２０１９年６月２５日に出願された第６２／８６６，３７４号、２０１９年１０月１５日に出願された第６２／９１５，５２３号、２０２０年１月１３日に出願された第６２／９６０，４８７号、２０２０年３月１０日に出願された第６２／９８７，８５８号、および２０２０年４月１６日に出願された第６３／０１０，９７０号の利益を主張するものであり、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８５９，５３９号、２０１９年６月２５日に出願された第６２／８６６，３７４号、２０１９年１０月１５日に出願された第６２／９１５，５２３号、２０２０年１月１３日に出願された第６２／９６０，４８７号、２０２０年３月１０日に出願された第６２／９８７，８５８号、および２０２０年４月１６日に出願された第６３／０１０，９７０号の利益を主張するものであり、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、配列表はその全体が参照により本明細書に組み込まれる（当該ＡＳＣＩＩコピーは２０２０年４月１６日に作成され、「７０５１５１＿ＨＭＷ－０３０－６＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられ、サイズは２９５，９９５バイトである）。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、配列表はその全体が参照により本明細書に組み込まれる（当該ＡＳＣＩＩコピーは２０２０年４月１６日に作成され、「７０５１５１＿ＨＭＷ－０３０－６＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられ、サイズは２９５，９９５バイトである）。
異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）は、高い満たされていない医学的必要性を有する致命的なリソソーム蓄積障害である。この神経変性疾患は、三つの形態（乳児期後期型、若年型、および成人型）で発生し、リソソーム酵素アリールスルファターゼ－Ａ（ＡＲＳＡ）の欠乏による。ＡＲＳＡは、リソソームと呼ばれる細胞構造にあり、スルファチドを分解するのに役立つ。この酵素の欠如は、脳、脊髄、および末梢器官におけるスルファチドの大量蓄積をもたらし、神経線維の主要保護層であるミエリンの重度の損傷をもたらす。ミエリン産生細胞におけるスルファチド蓄積は、脳、脊髄、ならびに脳と脊髄とを、筋肉と触覚、疼痛、熱、および音などの刺激を認識する感覚細胞とに繋ぐ神経を含む神経系全体にわたって白質の進行性の破壊を引き起こす。したがって、ＭＬＤは、中枢神経系、次いで末梢神経系の進行性軸索脱髄によって特徴付けられる。これは、後天性機能および／または技能の喪失、筋緊張低下、運動失調、発作、失明、難聴、および早過ぎる死をもたらす。
異染性白質ジストロフィーの人では、白質の損傷は、知的機能、および歩行能力などの運動技能の進行性の低下を引き起こす。罹患した個人は、四肢の感覚喪失、失禁、発作、麻痺、発話不能、失明、および難聴も発症する。最終的に、このような個人は周囲に対する認識を失い、反応しなくなる。神経学的問題は異染性白質ジストロフィーの主な特徴であるが、他の器官および組織に対するスルファチド蓄積の影響が報告されており、最も頻繁に胆嚢に影響を与える。
ＭＬＤは、いくつかの治療で管理することができる。例えば、ＭＬＤの徴候および症状を低減し、関連する疼痛を緩和するための薬剤である。造血幹細胞移植は、罹患した細胞を置き換えるのに役立つ健康な細胞を導入することにより、ＭＬＤの進行を遅らせることが示されている。他の治療には、筋肉と関節の柔軟性を促進し、可動域を維持する理学療法、作業療法、および言語療法が含まれる。しかしながら、ＭＬＤに対する治療法はない。
ＭＬＤを有するほとんどの個体は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子に変異を有し、ＭＬＤを引き起こす１１０を超える別個のＡＲＳＡ変異が特定されている。保因者変異は、１００人に１人で発見され、米国で４万人の出生に１人、世界で１６万人に１人が罹患している。
遺伝子治療は、ＭＬＤを治療する無類の機会を提供する。レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターは、核酸を宿主細胞ゲノムに組み込むことができ、ゲノムへの非標的化挿入による安全性の懸念を提起する。例えば、ベクターが腫瘍抑制遺伝子を破壊するか、または発癌遺伝子を活性化し、それによって悪性腫瘍を引き起こすリスクがある。実際に、ガンマレトロウイルスベクターを用いてＣＤ３４＋骨髄前駆体を形質導入することによってＸ連鎖重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を治療するための臨床試験において、１０人中４人の患者が白血病を発症した（Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２００８）１１８（９）：３１３２－４２）。一方で、非組み込みベクターは、インビボで発現レベルの不十分さ、または発現期間の不十分さをしばしば被る。
Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２００８）１１８（９）：３１３２－４２
したがって、ＭＬＤ患者において、ＡＲＳＡ遺伝子機能を効率的かつ安全に回復させることができる遺伝子療法組成物および方法の改善に対する当技術分野のニーズがある。
細胞内のＡＲＳＡ遺伝子機能を回復させることができるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）組成物、およびＡＲＳＡ遺伝子機能の減少に関連する疾患（例えば、ＭＬＤ）を治療するために、それを使用する方法が本明細書において提供される。アデノ随伴ウイルス組成物を作製するためのパッケージングシステムも提供される。
したがって、一態様では、本開示は、細胞内にアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）ポリペプチドを発現する方法を提供し、方法は、細胞に、（ａ）ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、クレードＦキャプシドタンパク質）を含むＡＡＶキャプシド、および（ｂ）サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列に操作可能に連結された転写調節エレメントを含む移入ゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を形質導入することを含む。
特定の実施形態では、細胞は、ニューロンおよび／またはグリア細胞である。特定の実施形態では、細胞は、中枢神経系および／または末梢神経系のニューロンおよび／またはグリア細胞である。特定の実施形態では、細胞は、脊髄、運動野、感覚野、海馬、被殻、小脳、任意選択で小脳核、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される中枢神経系領域の細胞である。特定の実施形態では、細胞は、運動ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、中枢神経系の大脳皮質の細胞、末梢神経系の感覚ニューロン、シュワン細胞、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞である。特定の実施形態では、細胞は哺乳類の対象にあり、ＡＡＶは、対象において細胞を形質導入するのに有効な量で対象に投与される。
別の態様では、本開示は、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を有する対象を治療する方法を提供し、方法は、（ａ）ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、クレードＦキャプシドタンパク質）を含むＡＡＶキャプシド、および（ｂ）サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列に操作可能に連結された転写調節エレメントを含む移入ゲノムを含む、有効量のｒＡＡＶを対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列は、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列は、配列番号１４、６２、または７２に記載されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、転写調節エレメントは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、小型ニワトリ－β－アクチン（ＳｍＣＢＡ）プロモーター、カルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）プロモーター、プロテオ脂質タンパク質１（ＰＬＰ１）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、シナプシン２（ＳＹＮ２）プロモーター、メタロチオネイン３（ＭＴ３）プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される一つ以上のエレメントを含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および５８からなる群から選択される配列に対し、少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および５８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは５’から３’の方向に、配列番号５８、２５、および３２に記載されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、配列番号３６に記載されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムはさらに、ポリアデニル化配列をサイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列の３’側に含む。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、外因性ポリアデニル化配列である。特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化配列である。特定の実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、配列番号４２に記載されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、スタッファー配列をさらに含む。特定の実施形態では、移入ゲノムはさらに、スタッファー配列をサイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列の３’側に含む。特定の実施形態では、スタッファー配列は、ポリアデニル化配列の３’側である。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４１、４４、４６、６５、６７、および７５からなる群から選択される配列を含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムはさらに、ゲノムの５’側の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、ゲノムの３’側の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１９に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号２６に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号２７に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号５７に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４７、４８、４９、６８、６９、および７６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、異染性白質ジストロフィーは、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異と関連している。特定の実施形態では、対象はヒト対象である。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。
特定の実施形態では、（ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、または（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣである。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸１５１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸１６０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＤであり、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。
特定の実施形態では、（ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、または（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣである。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＴであり、配列番号１６のアミノ酸６５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＶであり、配列番号１６のアミノ酸７７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸１１９に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＬであり、配列番号１６のアミノ酸１５１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸１６０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＤであり、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。
特定の実施形態では、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＴであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸６５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＹであり、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸７７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸１１９に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＬであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、（ｆ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、（ｇ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、（ｈ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、または（ｉ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣである。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、（ａ）ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、クレードＦキャプシドタンパク質）を含むＡＡＶキャプシド、および（ｂ）サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列に操作可能に連結された転写調節エレメントを含む移入ゲノムを含む、ｒＡＡＶ を提供する。
特定の実施形態では、サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列は、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列は、配列番号１４に記載されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列は、配列番号６２または７２に記載されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、転写調節エレメントは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、小型ニワトリ－β－アクチン（ＳｍＣＢＡ）プロモーター、カルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）プロモーター、プロテオ脂質タンパク質１（ＰＬＰ１）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、シナプシン２（ＳＹＮ２）プロモーター、メタロチオネイン３（ＭＴ３）プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される一つ以上のエレメントを含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および５８からなる群から選択される配列に対し、少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および５８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは５’から３’の方向に、配列番号５８、２５、および３２に記載されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、配列番号３６に記載されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムはさらに、ポリアデニル化配列をサイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列の３’側に含む。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、外因性ポリアデニル化配列である。特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化配列である。特定の実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、配列番号４２に記載されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４１、４４、４６、６５、６７、および７５からなる群から選択される配列を含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムはさらに、ゲノムの５’側の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、ゲノムの３’側の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１９に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４７、４８、４９、６８、６９、および７６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号４７、４８、４９、６８、６９、および７６からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、移入ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号４８に記載されるヌクレオチド配列からなる。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。
特定の実施形態では、（ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、または（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣである。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸１５１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸１６０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＤであり、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。
特定の実施形態では、（ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、または（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣである。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＴであり、配列番号１６のアミノ酸６５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＶであり、配列番号１６のアミノ酸７７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸１１９に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＬであり、配列番号１６のアミノ酸１５１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸１６０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＤであり、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。
特定の実施形態では、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＴであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸６５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＹであり、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸７７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸１１９に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＬであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、（ｆ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、（ｇ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、（ｈ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、または（ｉ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣである。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、配列番号１４、６２、および７２に記載される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本開示は、ｒＡＡＶの調製のためのパッケージングシステムを提供し、ここで、パッケージングシステムは、（ａ）一つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、（ｂ）請求項４１～７１のいずれか一項に記載のＡＡＶのキャプシドタンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列、および（ｃ）請求項４１～７１のいずれか一項に記載のＡＡＶのｒＡＡＶゲノム配列を含む第三のヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、パッケージングシステムは、第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列とを含む第一のベクター、および第三のヌクレオチド配列を含む第二のベクターを含む。
特定の実施形態では、パッケージングシステムは、一つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第四のヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、第四のヌクレオチド配列は、第三のベクター内に含有される。特定の実施形態では、第四のヌクレオチド配列は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からなる群から選択されるウイルス由来の一つ以上の遺伝子を含む。
特定の実施形態では、第一のベクター、第二のベクター、および／または第三のベクターはプラスミドである。
別の態様では、本開示は、ｒＡＡＶの組換え調製のための方法を提供し、方法は、ｒＡＡＶが産生される条件下で、本明細書に記載のパッケージングシステムを細胞内に導入することを含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるように細胞でアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）ポリペプチドを発現するための方法における使用のための、本明細書に記載のｒＡＡＶを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるように異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を有する対象を治療するための方法における使用のための、本明細書に記載のｒＡＡＶを提供する。
細胞内のＡＲＳＡ遺伝子機能を回復させることができるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）組成物、およびＡＲＳＡ遺伝子機能の減少に関連する疾患（例えば、ＭＬＤ）を治療するために、それを使用する方法が本明細書において提供される。アデノ随伴ウイルス組成物を作製するためのパッケージングシステムも提供される。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、用語「複製欠損アデノ随伴ウイルス」は、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を欠くゲノムを含むＡＡＶを指す。
本明細書で使用される場合、用語「複製欠損アデノ随伴ウイルス」は、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を欠くゲノムを含むＡＡＶを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ＡＲＳＡ遺伝子」は、アリールスルファターゼＡ遺伝子を指す。ヒトＡＲＳＡ遺伝子は、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））遺伝子 ＩＤ ４１０により特定される。ＡＲＳＡ ｍＲＮＡの例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１４として提供される。ＡＲＳＡポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２３として提供される。
本明細書で使用される場合、用語「移入ゲノム」は、移入ゲノムが細胞内に導入されるときに、コード配列の発現を媒介する外因性転写調節エレメントに操作可能に連結されるコード配列を含む組換えＡＡＶゲノムを指す。特定の実施形態では、移入ゲノムは、細胞の染色体ＤＮＡ内に統合しない。当業者は、ＡＲＳＡコード配列に操作可能に連結された転写調節エレメントを含む移入ゲノムの一部分が、ＡＲＳＡコード配列の転写の方向に対して、センスまたはアンチセンスの配向であってもよいことを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、用語「クレードＦキャプシドタンパク質」は、本明細書の配列番号１のアミノ酸１～７３６、１３８～７３６、および２０３～７３６でそれぞれ記載されるＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の同一性を有するＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３キャプシドタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、二つのヌクレオチド配列間、または二つのアミノ酸配列間の「パーセンテージ同一性」は、対になった整列配列間の合致数を１００倍し、内部ギャップを含む整列領域の長さで割ることによって計算される。同一性スコアリングは、完全一致のみを数え、アミノ酸の相互の類似性の程度を考慮しない。配列末端のギャップではなく、内部ギャップのみが長さに含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ＡＲＳＡ遺伝子変異に関連する疾患または障害」は、ＡＲＳＡ遺伝子の変異によって引き起こされる、悪化する、またはＡＲＳＡ遺伝子の変異に遺伝子的に関連する任意の疾患または障害を指す。特定の実施形態では、ＡＲＳＡ遺伝子変異に関連する疾患または障害は、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）である。
本明細書で使用される場合、用語「コード配列」は、開始コドンで始まり、終止コドンで終わる、ポリペプチドをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の部分を指す。遺伝子は、母集団内の代替的なスプライシング、代替的な翻訳開始、および変動に起因して、一つ以上のコード配列を有してもよい。コード配列は、野生型またはコドン改変のいずれかであってもよい。例示的な野生型ＡＲＳＡコード配列は、配列番号２４に記載される。
本明細書で使用される場合、用語「サイレントに改変された」は、コード配列、またはスタッファー挿入コード配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更することがない、遺伝子のコード配列またはスタッファー挿入コード配列（例えば、ヌクレオチド置換による）の改変を指す。こうしたサイレント改変は、コード配列の翻訳効率を増加させ、および／またはコード配列が細胞内に形質導入されるときに内因性遺伝子の対応する配列との組み換えを防止し得るという点で有利である。
本開示では、ＡＲＳＡ遺伝子中のヌクレオチド位置は、開始コドンの第一のヌクレオチドに対して特定される。開始コドンの第一のヌクレオチドは、位置１であり、開始コドンの第一のヌクレオチドの５’側のヌクレオチドは負の数を有し、開始コドンの第一のヌクレオチドの３’側のヌクレオチドは正の数を有する。ヒトＡＲＳＡ遺伝子の例示的なヌクレオチド１は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９２６０．２（領域：５０２８～１０４２６）のヌクレオチド３７４であり、ヒトＡＲＳＡ遺伝子の例示的なヌクレオチド３は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９２６０．２（領域：５０２８～１０４２６）のヌクレオチド３７６である。開始コドンの５’側に隣接するヌクレオチドは、ヌクレオチド－１である。
本開示では、ＡＲＳＡ遺伝子中のエクソンおよびイントロンは、開始コドンの第一のヌクレオチドを包含するエクソンに対して指定され、これはＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９２６０．２（領域：５０２８～１０４２６）のヌクレオチド３７４である。開始コドンの第一のヌクレオチドを包含するエクソンは、エクソン１である。エクソン１の３’側のエクソンは、５’から３’の方向に：エクソン２、エクソン３などである。エクソン１の３’側のイントロンは、５’から３’の方向に：イントロン１、イントロン２などである。したがって、ＡＲＳＡ遺伝子は、５’から３’の方向に：エクソン１、イントロン１、エクソン２、イントロン２、エクソン３などを含む。ヒトＡＲＳＡ遺伝子の例示的なエクソン１は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９２６０．２（５０２８～１０４２６）のヌクレオチド３７４～５９７である。ヒトＡＲＳＡ遺伝子の例示的なイントロン１は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９２６０．２（領域：５０２８～１０４２６）のヌクレオチド５９８～７４６である。
本明細書で使用される場合、用語「転写調節エレメント」または「ＴＲＥ」は、ＲＮＡポリメラーゼによる操作可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を調節（例えば、制御、増加、または減少）してＲＮＡ分子を形成するシス作用性ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列を指す。ＴＲＥは、転写を調節するために、転写因子などの一つ以上のトランス作用性分子に依存する。したがって、一つのＴＲＥは、異なるトランス作用性分子と接触しているとき、例えば、異なるタイプの細胞にあるとき、異なる方法で転写を調節することができる。ＴＲＥは、一つ以上のプロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメントを含んでもよい。当業者であれば、遺伝子中のプロモーターおよびエンハンサーエレメントが位置的に近い場合もあり、用語「プロモーター」は、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを含む配列を指してもよいことを理解するであろう。したがって、用語「プロモーター」は、配列中のエンハンサーエレメントを除外しない。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、同じ遺伝子または種に由来する必要はない。各プロモーターまたはエンハンサーエレメントの配列は、ゲノム中の対応する内因性配列と同一であるか、または実質的に同一であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「操作可能に連結された」は、ＴＲＥと転写されるコード配列との間の接続を記述するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、一つ以上のプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントを含むＴＲＥの制御下に置かれる。コード配列の転写がＴＲＥによって制御または影響を受ける場合、コード配列はＴＲＥに「操作可能に連結」されている。ＴＲＥのプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、所望の転写活性が得られる限り、コード配列から任意の配向および／または距離にありうる。特定の実施形態では、ＴＲＥは、コード配列の上流にある。
本明細書で使用される場合、用語「リボソームスキッピングエレメント」は、一つのｍＲＮＡ分子の翻訳から二つのペプチド鎖を生成することができる短いペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、リボソームスキッピングエレメントは、Ｘ１Ｘ２ ＥＸ３ＮＰＧＰのコンセンサスモチーフを含むペプチドをコードし、式中、Ｘ１はＤまたはＧであり、Ｘ２はＶまたはＩであり、Ｘ３は任意のアミノ酸である（配列番号３４）。特定の実施形態では、リボソームスキッピングエレメントは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、ブタテシオウイルス－１ ２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、足と口の疾患ウイルス２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａペプチド（ＢｍＣＰＶ ２Ａ）、またはＢ．ｍｏｒｉの軟化病ウイルス２Ａペプチド（ＢｍＩＦＶ ２Ａ）をコードする。Ｔ２ＡペプチドおよびＰ２Ａペプチドの例示的なアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３７および３８に記載される。Ｔ２ＡエレメントおよびＰ２Ａエレメントの例示的なヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号６６および６３に記載される。特定の実施形態では、リボソームスキッピングエレメントは、Ｎ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙの配列をさらに含むペプチドをコードし、任意選択的にＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙの配列は、ＧＧＣＡＧＣＧＧＡのヌクレオチド配列によってコードされる。理論に拘束されるものではないが、リボソームスキッピングエレメントは、第一のペプチド鎖の翻訳を終了し、第二のペプチド鎖の翻訳を再開始することによって、あるいはコードされるペプチドの内因性プロテアーゼ活性による、または環境（例えば、サイトゾル）中の別のプロテアーゼによる、リボソームスキッピングエレメントによってコードされるペプチド配列中のペプチド結合の開裂によって、機能すると仮定される。
本明細書で使用される場合、用語「リボソームスキッピングペプチド」は、リボソームスキッピングエレメントによってコードされるペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ポリアデニル化配列」は、ＲＮＡに転写された場合にポリアデニル化シグナル配列を構成するＤＮＡ配列を指す。ポリアデニル化配列は、天然型（例えば、ＡＲＳＡ遺伝子由来）または外因性であってもよい。外因性ポリアデニル化配列は、哺乳類またはウイルスポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化配列）であってもよい。
本明細書で使用される場合、「外因性ポリアデニル化配列」は、ＡＲＳＡ遺伝子（例えば、ヒトＡＲＳＡ遺伝子）の内因性ポリアデニル化配列と同一でも、実質的に同一でもないポリアデニル化配列を指す。特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列は、同じ種（例えば、ヒト）における非ＡＲＳＡ遺伝子のポリアデニル化配列である。特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列は、異なる種（例えば、ウイルス）のポリアデニル化配列である。
本明細書で使用される場合、ＡＡＶの対象への投与の文脈における用語「有効量」は、所望の予防的または治療効果を達成するＡＡＶの量を指す。
ＩＩ．アデノ随伴ウイルス組成物
一態様では、本明細書では、低下したＡＲＳＡ遺伝子機能、または欠陥のあるＡＲＳＡ遺伝子機能を有する細胞内でＡＲＳＡポリペプチドを発現するのに有用な新規の組換えＡＡＶ（例えば、複製欠損ＡＡＶ）組成物が提供される。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶは、キャプシドタンパク質（例えば、クレードＦキャプシドタンパク質）を含むＡＡＶキャプシドと、ＡＲＳＡコード配列（例えば、サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列）に操作可能に連結された転写調節エレメントを含む移入ゲノムとを含み、ＡＡＶで形質導入された細胞におけるＡＲＳＡの染色体外発現を可能にする。
一態様では、本明細書では、低下したＡＲＳＡ遺伝子機能、または欠陥のあるＡＲＳＡ遺伝子機能を有する細胞内でＡＲＳＡポリペプチドを発現するのに有用な新規の組換えＡＡＶ（例えば、複製欠損ＡＡＶ）組成物が提供される。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶは、キャプシドタンパク質（例えば、クレードＦキャプシドタンパク質）を含むＡＡＶキャプシドと、ＡＲＳＡコード配列（例えば、サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列）に操作可能に連結された転写調節エレメントを含む移入ゲノムとを含み、ＡＡＶで形質導入された細胞におけるＡＲＳＡの染色体外発現を可能にする。
以下に限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９血清型由来のキャプシドタンパク質を含む、当該技術分野で公知の任意のキャプシド由来のキャプシドタンパク質を、本明細書に開示されるｒＡＡＶ組成物に使用することができる。例えば、特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣである。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含む。
例えば、特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６のアミノ酸１５１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸１６０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＤであり、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣである。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含む。
例えば、特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６のアミノ酸２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＴであり、配列番号１６のアミノ酸６５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＶであり、配列番号１６のアミノ酸７７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸１１９に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＬであり、配列番号１６のアミノ酸１５１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸１６０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＤであり、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＴであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＱである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸６５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＹである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸７７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＫである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸１１９に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＬであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＳである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＭである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＣである。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの二つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号８のアミノ酸１～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの一つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号８のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの一つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号８のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの二つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号８のアミノ酸１～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸２０３～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸１３８～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１１のアミノ酸１～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの一つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１１のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの一つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１１のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの二つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸２０３～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸１３８～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１１のアミノ酸１～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの一つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの一つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの二つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの一つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの一つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの二つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、を含む。
本明細書に開示されるＡＡＶ組成物に有用な移入ゲノムは、概して、ＡＲＳＡコード配列に操作可能に連結された転写調節エレメント（ＴＲＥ）を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは、ＴＲＥおよびＡＲＳＡコード配列の５’側の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、ＴＲＥおよびＡＲＳＡコード配列の３’側の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列とを含む。
特定の実施形態では、ＡＲＳＡコード配列は、ＡＲＳＡ遺伝子のコード配列のすべてまたは実質的にすべてを含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号２３をコードするヌクレオチド配列を含み、任意選択で、ＡＲＳＡコード配列の３’側の外因性ポリアデニル化配列をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、配列番号２３をコードするヌクレオチド配列は、野生型である（例えば、配列番号２４に記載される配列を有する）。特定の実施形態では、配列番号２３をコードするヌクレオチド配列は、サイレントに改変される（例えば、配列番号１４、６２、または７２に記載される配列を有する）。
特定の実施形態では、ＡＲＳＡコード配列は、ＡＲＳＡタンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは実質的にすべてを含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、ＡＲＳＡコード配列は、野生型ＡＲＳＡタンパク質（例えば、ヒトＡＲＳＡタンパク質）のアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、ＡＲＳＡコード配列は、変異ＡＲＳＡタンパク質（例えば、ヒトＡＲＳＡタンパク質）のアミノ酸配列をコードし、変異ＡＲＳＡポリペプチドは、野生型ＡＲＳＡポリペプチドと機能的に同等であり、すなわち、野生型ＡＲＳＡポリペプチドとして機能することができる。特定の実施形態では、機能的に同等なＡＲＳＡポリペプチドは、野生型ＡＲＳＡポリペプチドに見出されない特徴、例えばタンパク質分解に抵抗する能力など、を少なくとも一つさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ組成物に有用な移入ゲノムは、概して、ＡＲＳＡおよび／またはＳＵＭＦ１をコードするコード配列に操作可能に連結された転写調節エレメント（ＴＲＥ）を含む。スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）遺伝子は、スルファターゼ基質（ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｕｌｆａｔａｓｅ）中のシステイン残基を酸化して活性点の３－オキソアラニン残基（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ３－ｏｘｏａｌａｎｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）とすることによって硫酸エステルの加水分解を触媒する酵素をコードし、これはＣ－アルファ－ホルミルグリシンとしても知られる。ＳＵＭＦ１に関連する疾患には、マルチプルスルファターゼ欠損症および異染性白質ジストロフィーが含まれる。
特定の実施形態では、ＳＵＭＦ１コード配列は、ＳＵＭＦ１遺伝子のコード配列のすべてまたは実質的にすべてを含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号２９をコードするヌクレオチド配列を含み、任意選択で、さらに外因性ポリアデニル化配列をＳＵＭＦ１コード配列の３’側に含んでもよい。特定の実施形態では、配列番号２９をコードするヌクレオチド配列は、野生型である（例えば、配列番号６４に記載される配列を有する）。特定の実施形態では、配列番号２９をコードするヌクレオチド配列はサイレントに改変される。
特定の実施形態では、ＳＵＭＦ１コード配列は、ＳＵＭＦ１タンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは実質的にすべてを含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、ＳＵＭＦ１コード配列は、野生型ＳＵＭＦ１タンパク質（例えば、ヒトＳＵＭＦ１タンパク質（ｈＳＵＭＦ１））のアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、ＳＵＭＦ１コード配列は、変異ＳＵＭＦ１タンパク質（例えば、ヒトＳＵＭＦ１タンパク質）のアミノ酸配列をコードし、変異ＳＵＭＦ１ポリペプチドは、野生型ＳＵＭＦ１ポリペプチドと機能的に同等であり、すなわち、野生型ＳＵＭＦ１ポリペプチドとして機能することができる。特定の実施形態では、機能的に同等なＳＵＭＦ１ポリペプチドは、野生型ＳＵＭＦ１ポリペプチドに見出されない特徴、例えばタンパク質分解に抵抗する能力など、を少なくとも一つさらに含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、ｈＡＲＳＡおよびｈＳＵＭＦ１の両方を発現するように設計され、ｈＡＲＳＡをコードする第一のコード配列、およびｈＳＵＭＦ１をコードする第二のコード配列を含むヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡをコードする第一のコード配列と、ｈＳＵＭＦ１をコードする第二のコード配列とは、リボソームスキッピングエレメントによって分離される。当技術分野で公知の任意のリボソームスキッピングエレメント、例えば、本明細書の別の箇所に記載されるリボソームスキッピングエレメントを使用してもよい。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡをコードする第一のコード配列、およびｈＳＵＭＦ１をコードする第二のコード配列を含むヌクレオチド配列は、配列番号３０に記載されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ組成物に有用な移入ゲノムは、概して、ＡＲＳＡおよび／またはＳａｐＢをコードするコード配列に操作可能に連結された転写調節エレメント（ＴＲＥ）を含む。プロサポシン（ＰＳＡＰ）遺伝子は、タンパク質分解的に処理されて、サポシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを含む四つの主要な開裂産物を生成する高度に保存されたプレプロタンパク質をコードする。前駆体タンパク質の各ドメインは、およそ８０アミノ酸残基長であり、システイン残基およびグリコシル化部位のほぼ同一の配置を有する。サポシンＡ～Ｄは、主にリソソーム区画に局在し、そこで短いオリゴ糖基を有するスフィンゴ糖脂質の異化を促進する。前駆体タンパク質は、分泌タンパク質として、および内在性膜タンパク質として存在し、神経栄養活性を有する。この遺伝子の変異はゴーシェ病および異染性白質ジストロフィーと関連している。サポシンＢ（ＳａｐＢ）は、ＡＲＳＡによるガラクト－セレブロシド硫酸塩の加水分解、ベータ－ガラクトシダーゼによるＧＭ１ガングリオシドの加水分解、およびアルファ－ガラクトシダーゼＡによるグロボトリアオシルセラミドの加水分解を刺激することが示されている。ＳａｐＢは、スフィンゴ脂質加水分解物の基質と可溶化複合体を形成することが示されている。
特定の実施形態では、ＳａｐＢコード配列は、ＳａｐＢ遺伝子のコード配列のすべてまたは実質的にすべてを含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号３３をコードするヌクレオチド配列を含み、任意選択で、さらに外因性ポリアデニル化配列をＳａｐＢコード配列の３’側に含んでもよい。特定の実施形態では、配列番号３３をコードするヌクレオチド配列は、野生型である（例えば、配列番号７３に記載される配列を有する）。特定の実施形態では、配列番号３３をコードするヌクレオチド配列はサイレントに改変される。
特定の実施形態では、ＳａｐＢコード配列は、ＳａｐＢタンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは実質的にすべてを含むポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、ＳａｐＢコード配列は、野生型ＳａｐＢタンパク質（例えば、ヒトＳａｐＢタンパク質（ｈＳａｐＢ））のアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、ＳａｐＢコード配列は、変異ＳａｐＢタンパク質（例えば、ヒトＳａｐＢタンパク質）のアミノ酸配列をコードし、変異ＳａｐＢポリペプチドは、野生型ＳａｐＢポリペプチドと機能的に同等であり、すなわち、野生型ＳａｐＢポリペプチドとして機能することができる。特定の実施形態では、機能的に同等なＳａｐＢポリペプチドは、野生型ＳａｐＢポリペプチドに見出されない特徴、例えばタンパク質分解に抵抗する能力など、を少なくとも一つさらに含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、ｈＡＲＳＡおよびｈＳａｐＢの両方を発現するように設計され、ｈＡＲＳＡをコードする第一のコード配列、およびｈＳａｐＢをコードする第二のコード配列を含むヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡをコードする第一のコード配列と、ｈＳａｐＢをコードする第二のコード配列とは、リボソームスキッピングエレメントによって分離される。当技術分野で公知の任意のリボソームスキッピングエレメント、例えば、本明細書の別の箇所に記載されるリボソームスキッピングエレメントを使用してもよい。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡをコードする第一のコード配列、およびｈＳａｐＢをコードする第二のコード配列を含むヌクレオチド配列は、配列番号７４に記載されるヌクレオチド配列を含む。
移入ゲノムは、任意の哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、ＡＲＳＡ、ＳＵＭＦ１、および／またはＳａｐＢを発現するために使用され得る。したがって、ＴＲＥは、任意の哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）で活性であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＥは、広範な範囲のヒト細胞において活性である。かかるＴＲＥは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー（例えば、配列番号５８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、ＳＶ４０プロモーター、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター（例えば、配列番号５９または２５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、ｓｍＣＢＡプロモーター（例えば、配列番号５５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、ヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター（例えば、配列番号４０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、転写因子結合部位を含むマウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン（例えば、配列番号３５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトベータアクチンプロモーター、ヒトニューロン特異的エノラーゼ（ＥＮＯ２）プロモーター、ヒトベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ウサギベータグロビンエレメント（例えば、配列番号６０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、ヒトカルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）プロモーター（例えば、配列番号５４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、および／またはヒトメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターを含む、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントを含み得る。これらのＴＲＥのいずれも、効率的な転写を駆動するために任意の順序で組み合わせることができる。例えば、移入ゲノムは、ＣＡＧプロモーターと総称される、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、およびウサギベータグロビン遺伝子のエクソン３からのスプライスアクセプターを含んでもよい（例えば、配列番号２８に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む）。例えば、移入ゲノムは、ＣＡＳＩプロモーター領域と総称される、ＣＭＶエンハンサーとＣＢＡプロモーターとのハイブリッド、続いてスプライスドナーとスプライスアクセプターとを含んでもよい（例えば、配列番号６３に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む）。
あるいは、ＴＲＥは、組織特異的ＴＲＥであってもよく、すなわち、特定の組織および／または器官で活性である。組織特異的ＴＲＥは、一つ以上の組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメント、ならびに任意選択で一つ以上の構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントを含む。当業者であれば、組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントが、当該技術分野で公知の方法によって、組織に特異的に発現される遺伝子から単離され得ることを理解するであろう。
特定の実施形態では、ＴＲＥは、脳特異的（例えば、ニューロン特異的、グリア細胞特異的、星状細胞特異的、オリゴデンドロサイト特異的、ミクログリア特異的、および／または中枢神経系特異的）である。例示的な脳特異的ＴＲＥは、限定されないが、ヒトグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトシナプシン１（ＳＹＮ１）プロモーター、ヒトシナプシン２（ＳＹＮ２）プロモーター、ヒトメタロチオネイン３（ＭＴ３）プロモーター、および／またはヒトプロテオ脂質タンパク質１（ＰＬＰ１）プロモーターからの一つ以上のエレメントを含んでもよい。より多くの脳特異的プロモーターエレメントが、ＷＯ２０１６／１００５７５Ａ１に開示されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、二つ以上のＴＲＥを含み、任意選択的に、上記に開示されたＴＲＥのうちの少なくとも一つを含む。当業者であれば、これらのＴＲＥのいずれかが任意の順序で組み合わされてもよく、構成的ＴＲＥと組織特異的ＴＲＥとの組み合わせが、効率的で組織特異的転写を駆動できることを理解するであろう。
特定の実施形態では、移入ベクターは、非コードスタッファー配列（例えば、配列番号３９に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む）をさらに含む。非コードスタッファー配列は、効率的なＤＮＡパッケージングのための適切な制限内にベクターのサイズを維持するために用いられてもよく、そのためＤＮＡパッケージングの有効性を高めるために用いられてもよい。当業者であれば、スタッファー配列の性質がベクターの機能に影響を与え得ることを認識し、それに応じて、使用に最も適したスタッファー配列を選択するであろう。
特定の実施形態では、移入ベクターはさらに、ＡＲＳＡコード配列の５’側に、またはＡＲＳＡコード配列に挿入されて、イントロンを含む。かかるイントロンは、例えば、転写サイレンシングを低下させることによって、および核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を強化することによって、導入遺伝子発現を増加させることができる。特定の実施形態では、移入ゲノムは、５’から３’の方向に、非コードエクソン、イントロン、およびＡＲＳＡコード配列を含む。特定の実施形態では、イントロン配列は、ＡＲＳＡコード配列に挿入され、任意選択的に、イントロンは、二つの天然エクソンを連結するヌクレオチド間結合に挿入される。特定の実施形態では、イントロンは、天然エクソン１およびエクソン２を連結するヌクレオチド間結合に挿入される。
イントロンは、ＡＲＳＡ遺伝子の天然イントロン配列、異なる種由来のイントロン配列、または同じ種由来の異なる遺伝子、および／または合成イントロン配列を含み得る。当業者であれば、合成イントロン配列は、当該技術分野で公知の任意のコンセンサススプライシングモチーフを導入することによって、ＲＮＡスプライシングを媒介するように設計され得ることを理解するであろう（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｉｂｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７，４０７－２１に）。例示的なイントロン配列は、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１（５）：９５４－６３、およびＬｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２８（１）：１２５－３４に提供されており、当該文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、移入ゲノムは、ＳＶ４０イントロン（例えば、配列番号３１に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む）、またはマウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン（例えば、配列番号３５に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む）を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは、ＳＶ４０イントロン（例えば、配列番号３１に記載されるヌクレオチド配列を含む）、またはマウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン（例えば、配列番号３５に記載されるヌクレオチド配列を含む）を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは、転写されていないニワトリＡＣＴＢ（ｃＡＣＴＢ）プロモーターを部分的に、ｃＡＣＴＢエクソン１をすべて、ｃＡＣＴＢイントロン１を部分的に、ウサギＨＢＢ２（ｒＨＢＢ２）イントロン２を部分的に、およびｒＨＢＢ２エクソン３（例えば、配列番号３２）を部分的に含む、ニワトリ配列とウサギ配列の組み合わせを含むキメライントロン配列を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは、キメライントロン配列を含む（例えば、配列番号３２に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む）。特定の実施形態では、移入ゲノムは、キメライントロン配列を含む（例えば、配列番号３２に記載されるヌクレオチド配列を含む）。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、およびキメライントロン配列を含むＴＲＥを含む（例えば、配列番号３６に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む）。特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号３６を含むＴＲＥを含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示される移入ゲノムは、転写ターミネーター（例えば、ポリアデニル化配列）をさらに含む。特定の実施形態では、転写ターミネーターは、ＡＲＳＡコード配列の３’側である。転写ターミネーターは、転写を効果的に終了する任意の配列であってもよく、当業者であれば、そのような配列が、ＡＲＳＡコード配列の転写が所望される細胞内で発現される任意の遺伝子から単離され得ることを理解するであろう。特定の実施形態では、転写ターミネーターは、ポリアデニル化配列を含む。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ヒトＡＲＳＡ遺伝子の内因性ポリアデニル化配列と同一であるか、または実質的に同一である。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、外因性ポリアデニル化配列である。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化配列である（例えば、配列番号３１、４２、４３、または４５に記載されるヌクレオチド配列、またはそれらに相補的なヌクレオチド配列を含む）。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、配列番号４２に記載される配列を含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムは５’から３’の方向に：ＴＲＥ、ＡＲＳＡコード配列、およびポリアデニル化配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＥは、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および／または５８のうちのいずれか一つに対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＡＲＳＡコード配列は、配列番号１４、２４、６２、または７２に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、および／またはポリアデニル化配列は、配列番号４２、４３、および４５のいずれか一つに対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
特定の実施形態では、ＴＲＥは、配列番号３６に記載される配列を含み、ＡＲＳＡコード配列は、配列番号１４に記載される配列を含み、および／またはポリアデニル化配列は、配列番号４２に記載される配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＥは５’から３’の方向に、配列番号５８に記載される配列、配列番号２５に記載される配列、および配列番号３２に記載される配列を含む。
特定の実施形態では、ＴＲＥは、配列番号５４に記載される配列を含み、ＡＲＳＡコード配列は、配列番号６２に記載される配列を含み、および／またはポリアデニル化配列は、配列番号４２に記載される配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＥは、配列番号５５に記載される配列を含み、ＡＲＳＡコード配列は、配列番号６２に記載される配列を含み、および／またはポリアデニル化配列は、配列番号４２に記載される配列を含む。
特定の実施形態では、ＴＲＥは、配列番号３６に記載される配列を含み、ＡＲＳＡコード配列は、配列番号７２に記載される配列を含み、および／またはポリアデニル化配列は、配列番号４２に記載される配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＥは５’から３’の方向に、配列番号５８に記載される配列、配列番号２５に記載される配列、および配列番号３２に記載される配列を含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、ｈＳＵＭＦ１コード配列をさらに含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは５’から３’の方向に：ＴＲＥ、ＡＲＳＡコード配列、２Ａエレメント、およびｈＳＵＭＦ１コード配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＥは、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および／または５８に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＡＲＳＡコード配列は、配列番号６２に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、２Ａエレメントは、配列番号６３に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ｈＳＵＭＦ１配列は、配列番号６４に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＳＵＭＦ１コード配列をさらに含む移入ゲノムは、５’から３’の方向に、配列番号５４または５５に記載される配列を含むＴＲＥ、配列番号６２に記載される配列を含むｈＡＲＳＡコード配列、配列番号６３に記載される配列を含む２Ａエレメント、および配列番号６４に記載される配列を含むｈＳＵＭＦ１コード配列を含む。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡ－２Ａ－ｈＳＵＭＦ１コード配列は、配列番号３０に記載される配列を含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、ｈＳａｐＢコード配列をさらに含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは５’から３’の方向に：ＴＲＥ、ＡＲＳＡコード配列、２Ａエレメント、およびｈＳａｐＢコード配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＥは、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および／または５８に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＡＲＳＡコード配列は、配列番号７２に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、２Ａエレメントは、配列番号６３に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ｈＳａｐＢ配列は、配列番号７３に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｈＳａｐＢコード配列をさらに含む移入ゲノムは、５’から３’の方向に、配列番号３６に記載される配列を含むＴＲＥ、配列番号７２に記載される配列を含むｈＡＲＳＡコード配列、配列番号６３に記載される配列を含む２Ａエレメント、および配列番号７４に記載される配列を含むｈＳａｐＢコード配列を含む。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡ－２Ａ－ｈＳａｐＢコード配列は、配列番号７４に記載される配列を含む。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４１、４４、４６、６５、６７、または７５に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４１、４４、４６、６５、６７、または７５に記載されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号４１、４４、４６、６５、６７、または７５に記載されるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４４に記載されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号４４に記載されるヌクレオチド配列からなる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される移入ゲノムはさらに、ＴＲＥの５’側の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、ＡＲＳＡコード配列の３’側の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列とを含む。任意のＡＡＶ血清型またはそのバリアントからのＩＴＲ配列を、本明細書に開示される移入ゲノムに使用することができる。５’および３’ＩＴＲは、同じ血清型のＡＡＶ由来であってもよく、または異なる血清型のＡＡＶ由来であってもよい。本明細書に開示される移入ゲノムで使用するための例示的なＩＴＲは、本明細書で配列番号１８～２１、２６、および２７に記載されている。
特定の実施形態では、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。特定の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方は、ＡＡＶ２由来である。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有し、または３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有する。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有し、および３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有する。特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４１、４４、４６、６５、６７、または７５のいずれか一つに記載されるヌクレオチド配列、配列番号１８の配列を有する５’ＩＴＲヌクレオチド配列、および配列番号１９の配列を有する３’ ＩＴＲヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、ＡＡＶ５由来である。特定の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方は、ＡＡＶ５由来である。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号２０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有し、または３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号２１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有する。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号２０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有し、および３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号２１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有する。特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４６～５０のいずれか一つに記載されるヌクレオチド配列、配列番号２０の配列を有する５’ＩＴＲヌクレオチド配列、および配列番号２１の配列を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列および３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、互いに実質的に相補的である（例えば、５’または３’ＩＴＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのヌクレオチド位置でのミスマッチを除いて、互いに相補的である）。
特定の実施形態では、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、Ｒｅｐタンパク質による分解を減少または排除するように改変される（「非分解性ＩＴＲ」）。特定の実施形態では、非分解性ＩＴＲは、末端分解部位のヌクレオチド配列の挿入、欠失、または置換を含む。このような改変により、感染細胞において移入ゲノムが複製された後、ＡＡＶの自己相補的な二本鎖ＤＮＡゲノムの形成が可能となる。例示的な非分解性ＩＴＲ配列は、当技術分野で公知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，７９０，１５４号および第９，７８３，８２４号に提供されるものを参照されたい）。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２６に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２６に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２６に記載されるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号２７に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２７に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号２７に記載されるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２６に記載されるヌクレオチド配列からなり、３’ＩＴＲは、配列番号２７に記載されるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２６に記載されるヌクレオチド配列からなり、３’ＩＴＲは、配列番号１９に記載されるヌクレオチド配列からなる。
特定の実施形態では、３’ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ２ゲノム配列に由来する追加のヌクレオチド配列に隣接している。特定の実施形態では、３’ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接している野生型ＡＡＶ２配列に由来する追加の３７ｂｐ配列に隣接している。例えば、Ｓａｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１７）２８（５）：２７７－２８９を参照のこと（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、追加の３７ｂｐ配列は、３’ＩＴＲの内部である。特定の実施形態では、３７ｂｐ配列は、配列番号５６に記載される配列からなる。特定の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号５７に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号５７に記載されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、３’ＩＴＲのヌクレオチド配列は、配列番号５７に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、３’ＩＴＲのヌクレオチド配列は、配列番号５７に記載されるヌクレオチド配列からなる。
特定の実施形態では、移入ゲノムは５’から３’の方向に、５’ＩＴＲと、５’から３’の方向に、明細書に開示されるように、ＴＲＥ、任意選択で非コードエクソンとイントロン、ＡＲＳＡコード配列、および本ポリアデニル化配列を含む内部エレメントと、非分解性ＩＴＲと、内部エレメントに相補的なヌクレオチド配列と、３’ＩＴＲとを含む。そのような移入ゲノムは、感染後および複製前に、ＡＡＶの自己相補的な二本鎖ＤＮＡゲノムを形成することができる。
特定の実施形態では、移入ゲノムは５’から３’の方向に：５’ＩＴＲ、ＴＲＥ、ＡＲＳＡコード配列、ポリアデニル化配列、および３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１８、２０、または２６に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＴＲＥは、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および／または５８のいずれか一つに対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ＡＲＳＡコード配列は、配列番号１４、２４、６２、または７２に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ポリアデニル化配列は、配列番号４２、４３、および４５のいずれか一つに対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、および／または３’ＩＴＲは、配列番号１９、２１、２７、または５７に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１８、２０、および２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、ＴＲＥは、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および／または５８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、ＡＲＳＡコード配列は、配列番号１４、２４、６２、または７２に記載される配列を含む、ポリアデニル化配列は、配列番号４２、４３、および４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、および／または３’ＩＴＲは、配列番号１９、２１、２７、または５７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１８に記載される配列を含むか、またはそれからなる、ＴＲＥは、配列番号３６に記載される配列を含む、ＡＲＳＡコード配列は、配列番号１４、２４、６２、または７２に記載される配列を含む、ポリアデニル化配列は、配列番号４２に記載される配列を含む、および／または３’ＩＴＲは、配列番号１９に記載される配列を含むか、またはそれからなる。
特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４７、４８、４９、６８、６９、または７６に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４７、４８、４９、６８、６９、または７６に記載されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号４７、４８、４９、６８、６９、または７６に記載されるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、移入ゲノムは、配列番号４８に記載されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、移入ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号４８に記載されるヌクレオチド配列からなる。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびに５’から３’の方向に以下の遺伝エレメントを含む移入ゲノム：５’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１８の５’ＩＴＲ）、エンハンサーエレメント（例えば、配列番号５８のエンハンサーエレメント）、プロモーター配列（例えば、配列番号２５のプロモーター配列）、キメライントロン配列（例えば、配列番号３２のキメライントロン配列）、サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列（例えば、配列番号１４のｈＡＲＳＡコード配列）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列（例えば、配列番号４２のＳＶ４０ポリアデニル化配列）、および３’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１９の３’ＩＴＲ）；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびに５’から３’の方向に以下の遺伝エレメントを含む移入ゲノム：５’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１８の５’ＩＴＲ）、エンハンサーエレメント（例えば、配列番号５８のエンハンサーエレメント）、プロモーター配列（例えば、配列番号２５のプロモーター配列）、キメライントロン配列（例えば、配列番号３２のキメライントロン配列）、サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列（例えば、配列番号１４のｈＡＲＳＡコード配列）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列（例えば、配列番号４２のＳＶ４０ポリアデニル化配列）、および３’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１９の３’ＩＴＲ）；および／または（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびに５’から３’の方向に以下の遺伝エレメントを含む移入ゲノム：５’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１８の５’ＩＴＲ）、エンハンサーエレメント（例えば、配列番号５８のエンハンサーエレメント）、プロモーター配列（例えば、配列番号２５のプロモーター配列）、キメライントロン配列（例えば、配列番号３２のキメライントロン配列）、サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列（例えば、配列番号１４のｈＡＲＳＡコード配列）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列（例えば、配列番号４２のＳＶ４０ポリアデニル化配列）、および３’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１９の３’ＩＴＲ）、を含む。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、および配列番号４１、４４、４６、４７、４８、４９、６５、６７、６８、６９、７５、または７６のいずれか一つに記載されるヌクレオチド配列を含む移入ゲノム；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、および配列番号４１、４４、４６、４７、４８、４９、６５、６７、６８、６９、７５、または７６のいずれか一つに記載されるヌクレオチド配列を含む移入ゲノム；ならびに／あるいは（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、および配列番号４１、４４、４６、４７、４８、４９、６５、６７、６８、６９、７５、または７６のいずれか一つに記載されるヌクレオチド配列を含む移入ゲノム、を含む。
別の態様では、配列番号４１、４４、４６、４７、４８、４９、６５、６７、６８、６９、７５、または７６に記載される核酸配列に対し少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に提供される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４１、４４、４６、４７、４８、４９、６５、６７、６８、６９、７５、または７６に記載される核酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４１、４４、４６、４７、４８、４９、６５、６７、６８、６９、７５、または７６に記載される核酸配列からなる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４または４８に記載される核酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４または４８に記載される核酸配列からなる。
また、配列番号１４、６２、または７２に記載される核酸配列に対し少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に提供される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、６２、または７２に記載される核酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、６２、または７２に記載される核酸配列からなる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４に記載される核酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４に記載される核酸配列からなる。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶを、薬学的に許容可能な賦形剤、アジュバント、希釈剤、ビヒクルもしくは担体、またはそれらの組み合わせと共に含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容可能な担体」は、組成物の有効成分と組み合わせた場合に、その成分が、意図しない免疫反応などの破壊的生理学的反応を引き起こすことなく、生物学的活性を保持することを可能にする任意の材料を含む。薬学的に許容可能な担体には、水、リン酸緩衝生理食塩水、油／水エマルションなどのエマルション、および湿潤剤が含まれる。かかる担体を含む組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．１８０４２，ＵＳＡ；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ，７ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃに記載されているものなど、周知の従来の方法によって製剤化される。
別の態様では、本開示は、ヒトＡＲＳＡタンパク質またはその断片をコードするコード配列を含むポリヌクレオチドを提供し、コード配列は、野生型ヒトＡＲＳＡ遺伝子に対し１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一を有するようにサイレントに改変されている。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、６２、または７２に記載される配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、６２、または７２に記載される配列からなる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは発現ベクターである。
ＩＩＩ．使用方法
別の態様では、本開示は、細胞内でＡＲＳＡポリペプチドを発現する方法を提供する。方法は概して、本明細書に開示されるｒＡＡＶを細胞に形質導入することを含む。こうした方法は、ＡＲＳＡ発現の復元において非常に効率的である。したがって、特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるｒＡＡＶを細胞に形質導入することを伴う。
別の態様では、本開示は、細胞内でＡＲＳＡポリペプチドを発現する方法を提供する。方法は概して、本明細書に開示されるｒＡＡＶを細胞に形質導入することを含む。こうした方法は、ＡＲＳＡ発現の復元において非常に効率的である。したがって、特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるｒＡＡＶを細胞に形質導入することを伴う。
本明細書に開示される方法は、ＡＲＳＡ遺伝子中に変異を有する任意の細胞に適用することができる。当業者は、活性内因性ＡＲＳＡを必要とする細胞が特に注目されることを理解するであろう。したがって、特定の実施形態では、本方法は、内因性ＡＲＳＡ活性を失った任意の細胞に適用される。特定の実施形態では、方法は、ニューロンおよび／またはグリア細胞に適用される。特定の実施形態では、特に注目すべきは、活性内因性ＡＲＳＡを必要とするニューロンおよび／またはグリア細胞である。特定の実施形態では、本方法は、中枢神経系の細胞、および／または末梢神経系の細胞に適用される。特定の実施形態では、特に注目すべきは、活性内因性ＡＲＳＡを必要とする中枢神経系および／または末梢神経系の細胞である。特定の実施形態では、特に注目すべきは、前脳、中脳、後脳、脊髄、およびそれらの任意の組み合わせの細胞である。特定の実施形態では、特に注目すべきは、脊髄、運動野、感覚野、視床、海馬、被殻、小脳（例えば、小脳核）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される中枢神経系領域の細胞である。特定の実施形態では、特に注目すべきは、脳内の橋および髄質、脊髄の上行束（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ）、およびそれらの任意の組み合わせの細胞である。特定の実施形態では、特に注目すべきは、活性内因性ＡＲＳＡを必要とする、脊髄、運動野、感覚野、視床、海馬、被殻、小脳（例えば、小脳核）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される中枢神経系領域の細胞である。特定の実施形態では、特に注目すべきは、中枢神経系（ＣＮＳ）における運動ニューロンおよび星状細胞プロファイル、ＣＮＳにおけるオリゴデンドロサイト（上行線維）、ＣＮＳにおける大脳皮質の細胞集団、および末梢神経系（ＰＮＳ）の感覚ニューロンである。特定の実施形態では、特に注目すべきは、脊髄の背側束（ｄｏｒｓａｌ ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ）にあるものなどのオリゴデンドロサイトである。特定の実施形態では、特に注目すべきは、限定されないが、星状細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、およびそれらの任意の組み合わせを含む、中枢神経系におけるグリアプロファイルである。特定の実施形態では、特に注目すべきは、運動ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、中枢神経系の大脳皮質の細胞、末梢神経系の感覚ニューロン、末梢神経系のグリア細胞（例えば、シュワン細胞）、およびそれらの任意の組み合わせである。
本明細書に開示される方法は、研究目的のためにインビトロで実施することができ、または治療目的のためにエクスビボまたはインビボで実施することができる。
特定の実施形態では、形質導入される細胞は、哺乳類の対象にあり、ＡＡＶは、対象において細胞を形質導入するのに有効な量で、対象に投与される。したがって、特定の実施形態では、本開示は、ＡＲＳＡ遺伝子変異に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法を提供し、方法は概して、本明細書に開示される有効量のｒＡＡＶを対象に投与することを含む。対象は、ＡＲＳＡ変異を有する、ヒト対象、非ヒト霊長類対象（例えば、カニクイザル）、または齧歯類対象（例えば、マウス）であり得る。ＡＲＳＡ遺伝子変異に関連する任意の疾患または障害は、本明細書に開示される方法を使用して治療することができる。適切な疾患または障害には、限定されないが、異染性白質ジストロフィーが含まれる。
特定の実施形態では、前述の方法は、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびに５’から３’の方向に以下の遺伝エレメントを含む移入ゲノム：５’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１８の５’ＩＴＲ）、エンハンサーエレメント（例えば、配列番号５８のエンハンサーエレメント）、プロモーター配列（例えば、配列番号２５のプロモーター配列）、キメライントロン配列（例えば、配列番号３２のキメライントロン配列）、サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列（例えば、配列番号１４のｈＡＲＳＡコード配列）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列（例えば、配列番号４２のＳＶ４０ポリアデニル化配列）、および３’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１９の３’ＩＴＲ）；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびに５’から３’の方向に以下の遺伝エレメントを含む移入ゲノム：５’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１８の５’ＩＴＲ）、エンハンサーエレメント（例えば、配列番号５８のエンハンサーエレメント）、プロモーター配列（例えば、配列番号２５のプロモーター配列）、キメライントロン配列（例えば、配列番号３２のキメライントロン配列）、サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列（例えば、配列番号１４のｈＡＲＳＡコード配列）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列（例えば、配列番号４２のＳＶ４０ポリアデニル化配列）、および３’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１９の３’ＩＴＲ）；および／または（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびに５’から３’の方向に以下の遺伝エレメントを含む移入ゲノム：５’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１８の５’ＩＴＲ）、エンハンサーエレメント（例えば、配列番号５８のエンハンサーエレメント）、プロモーター配列（例えば、配列番号２５のプロモーター配列）、キメライントロン配列（例えば、配列番号３２のキメライントロン配列）、サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列（例えば、配列番号１４のｈＡＲＳＡコード配列）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列（例えば、配列番号４２のＳＶ４０ポリアデニル化配列）、および３’ＩＴＲエレメント（例えば、配列番号１９の３’ＩＴＲ）、を含むｒＡＡＶを用いる。
特定の実施形態では、前述の方法は、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、および配列番号４１、４４、４６、４７、４８、４９、６５、６７、６８、６９、７５、または７６のいずれか一つに記載されるヌクレオチド配列を含む移入ゲノム；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、および配列番号４１、４４、４６、４７、４８、４９、６５、６７、６８、６９、７５、または７６のいずれか一つに記載されるヌクレオチド配列を含む移入ゲノム；および／または（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、および配列番号４１、４４、４６、４７、４８、４９、６５、６７、６８、６９、７５、または７６のいずれか一つに記載されるヌクレオチド配列を含む移入ゲノム、を含むｒＡＡＶを用いる。
本明細書に開示される方法は、特に、ＡＲＳＡタンパク質を、インビボおよびインビトロの両方で、高効率に細胞内で発現することができるという点で有利である。特定の実施形態では、ＡＲＳＡタンパク質の発現レベルは、ＡＲＳＡ遺伝子に変異を有しない同じタイプの細胞における内因性ＡＲＳＡタンパク質の発現レベルの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である。特定の実施形態では、ＡＲＳＡタンパク質の発現レベルは、ＡＲＳＡ遺伝子に変異を有しない同じタイプの細胞における内因性ＡＲＳＡタンパク質の発現レベルよりも少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い。ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫染色、および質量分析を含むがこれらに限定されない、ＡＲＳＡタンパク質の発現レベルを決定する任意の方法を採用することができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ組成物の細胞への形質導入は、本明細書に提供されるように、または当業者に公知の任意の形質導入方法によって実施され得る。特定の実施形態では、細胞は、感染多重度（ＭＯＩ）が５０，０００；１００，０００；１５０，０００；２００，０００；２５０，０００；３００，０００；３５０，０００；４００，０００；４５０，０００；または５００，０００で、あるいは細胞の最適な形質導入を提供する任意のＭＯＩで、ＡＡＶと接触され得る。
本明細書に開示されるＡＡＶ組成物は、限定されないが、静脈内、くも膜下腔内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、局所的または皮内経路を含む任意の適切な経路によって、対象に投与することができる。特定の実施形態では、組成物は、静脈内注射または皮下注射を介した投与のために製剤化される。
ＩＶ．ＡＡＶパッケージングシステム
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の組換え調製のためのパッケージングシステムを提供する。かかるパッケージングシステムは、概して、一つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第一のヌクレオチド、本明細書に開示されるＡＡＶのいずれかのキャプシドタンパク質をコードする第二のヌクレオチド、および本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムのいずれかを含む第三のヌクレオチド配列を含み、パッケージングシステムは、キャプシド中に移入ゲノムを封入してＡＡＶを形成するために、細胞内で操作可能である。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の組換え調製のためのパッケージングシステムを提供する。かかるパッケージングシステムは、概して、一つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第一のヌクレオチド、本明細書に開示されるＡＡＶのいずれかのキャプシドタンパク質をコードする第二のヌクレオチド、および本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムのいずれかを含む第三のヌクレオチド配列を含み、パッケージングシステムは、キャプシド中に移入ゲノムを封入してＡＡＶを形成するために、細胞内で操作可能である。
特定の実施形態では、パッケージングシステムは、一つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列とＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む第一のベクター、およびｒＡＡＶゲノムを含む第三のヌクレオチド配列を含む第二のベクターを含む。本明細書に記載のパッケージングシステムの文脈において使用される場合、「ベクター」は、核酸を細胞内に導入するためのビヒクルである核酸分子を指す（例えば、プラスミド、ウイルス、コスミド、人工染色体など）。
任意のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を、本明細書に開示されるパッケージングシステムに採用することができる。パッケージングシステムの特定の実施形態では、Ｒｅｐヌクレオチド配列は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質をコードする。適切なＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質には、限定されるものではないが、Ｒｅｐ ７８／６８またはＲｅｐ ６８／５２が含まれる。パッケージングシステムの特定の実施形態では、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２のＡＡＶ２ Ｒｅｐアミノ酸配列に対し最小配列同一性パーセントを有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、最小配列同一性パーセントは、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質のアミノ酸配列の長さにわたって、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）である。パッケージングシステムの特定の実施形態では、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質は、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を有する。
パッケージングシステムの特定の実施形態では、パッケージングシステムは、一つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第四のヌクレオチド配列をさらに含む。パッケージングシステムの特定の実施形態では、パッケージングシステムは、一つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第四のヌクレオチド配列を含む、第三のベクター、例えば、ヘルパーウイルスベクターをさらに含む。第三のベクターは、独立した第三のベクターであってもよく、第一のベクターと一体型であってもよく、または第二のベクターと一体型であってもよい。
パッケージングシステムの特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスなど）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびバキュロウイルスからなる群から選択される。パッケージングシステムの特定の実施形態で、ヘルパーウイルスがアデノウイルスである場合、アデノウイルスゲノムは、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ４、およびＶＡからなる群から選択される一つ以上のアデノウイルスＲＮＡ遺伝子を含む。パッケージングシステムの特定の実施形態で、ヘルパーウイルスがＨＳＶである場合、ＨＳＶゲノムは、ＵＬ５／８／５２、ＩＣＰＯ、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、およびＵＬ３０／ＵＬ４２からなる群から選択されるＨＳＶ遺伝子のうちの一つ以上を含む。
パッケージングシステムの特定の実施形態では、第一、第二、および／または第三のベクターは、一つ以上のプラスミド内に含有される）。特定の実施形態では、第一のベクターおよび第三のベクターは、第一のプラスミド内に含有される。特定の実施形態では、第二のベクターおよび第三のベクターは、第二のプラスミド内に含有される。
パッケージングシステムの特定の実施形態では、第一、第二、および／または第三のベクターは、一つ以上の組換えヘルパーウイルス内に含有される。特定の実施形態では、第一のベクターおよび第三のベクターは、組換えヘルパーウイルス内に含有される。特定の実施形態では、第二のベクターおよび第三のベクターは、組換えヘルパーウイルス内に含有される。
さらなる態様では、本開示は、本明細書に記載のＡＡＶの組換え調製のための方法を提供し、方法は、ｒＡＡＶゲノムをキャプシドに封入して、本明細書に記載のｒＡＡＶを形成するために操作可能な条件下で、本明細書に記載のパッケージングシステムで細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含む。ｒＡＡＶの組換え調製のための例示的な方法は、一過性トランスフェクション（例えば、本明細書に記載される第一の、および第二の、および任意選択で第三のベクターを含有する一つ以上のトランスフェクションプラスミドでの）、ウイルス感染（例えば、（本明細書に記載される第一の、および第二の、および任意選択で第三のベクターを含有する、ＨＳＶ、サイトメガロウイルス、またはバキュロウイルスを含む）アデノウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスなど）、ヘルペスウイルスなど、一つ以上の組換えヘルパーウイルスでの、ならびに安定的なプロデューサー細胞系トランスフェクションまたは感染（例えば、本明細書に記載の、一つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするＲｅｐヌクレオチド配列、および／または一つ以上のキャプシドタンパク質をコードするＣａｐヌクレオチド配列を含有する、哺乳類または昆虫細胞などの、安定的なプロデューサー細胞での、ならびにプラスミド、または組換えヘルパーウイルスの形態で送達される本明細書に記載の移入ゲノムでの）を含む。
したがって、本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の調製のためのパッケージングシステムを提供し、ここで、パッケージングシステムは、一つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、本明細書に記載のＡＡＶのいずれか一つのキャプシドタンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列、本明細書に記載のＡＡＶのいずれか一つのｒＡＡＶゲノム配列を含む第三のヌクレオチド配列、および任意選択的に、一つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第四のヌクレオチド配列を含む。
Ｖ．実施例
本明細書に開示される組換えＡＡＶベクターは、インビトロおよびインビボで、非常に効率的な遺伝子移入を媒介する。以下の実施例は、本明細書に開示されるＡＡＶベースのベクターを使用した、ＡＲＳＡ遺伝子（これは異染性白質ジストロフィーなどの特定のヒト疾患において変異される）の発現の効率的な回復を示す。これらの実施例は、限定としてではなく、例示として提供されている。
本明細書に開示される組換えＡＡＶベクターは、インビトロおよびインビボで、非常に効率的な遺伝子移入を媒介する。以下の実施例は、本明細書に開示されるＡＡＶベースのベクターを使用した、ＡＲＳＡ遺伝子（これは異染性白質ジストロフィーなどの特定のヒト疾患において変異される）の発現の効率的な回復を示す。これらの実施例は、限定としてではなく、例示として提供されている。
実施例１：ヒトＡＲＳＡ移入ベクター
本実施例は、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）におけるヒトＡＲＳＡ（ｈＡＲＳＡ）の発現のための、ヒトＡＲＳＡ移入ベクターＴ－００１、ｐＨＭＩ－５０００、ｐＨＭＩ－５００３、およびｐＨＭＩ－ｈＡＲＳＡ１－ＴＣ－００２を提供する。
本実施例は、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）におけるヒトＡＲＳＡ（ｈＡＲＳＡ）の発現のための、ヒトＡＲＳＡ移入ベクターＴ－００１、ｐＨＭＩ－５０００、ｐＨＭＩ－５００３、およびｐＨＭＩ－ｈＡＲＳＡ１－ＴＣ－００２を提供する。
ａ）Ｔ－００１
ＡＲＳＡ移入ベクターＴＣ－００１は、図１Ａに示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメントと、ＣＭＶエンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチンプロモーター、およびキメライントロン配列を含む転写調節エレメントと；野生型ヒトＡＲＳＡコード配列と；ＳＶ４０ポリアデニル化配列と；３’ＩＴＲエレメントと、を含む。これらのエレメントの配列を表１に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）においてヒトＡＲＳＡタンパク質を発現することができる。
ＡＲＳＡ移入ベクターＴＣ－００１は、図１Ａに示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメントと、ＣＭＶエンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチンプロモーター、およびキメライントロン配列を含む転写調節エレメントと；野生型ヒトＡＲＳＡコード配列と；ＳＶ４０ポリアデニル化配列と；３’ＩＴＲエレメントと、を含む。これらのエレメントの配列を表１に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）においてヒトＡＲＳＡタンパク質を発現することができる。
ｂ）ｐＨＭＩ－５０００
ＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－５０００は、図１Ｂに示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメントと、ＣＭＶエンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチンプロモーター、およびキメライントロン配列を含む転写調節エレメントと；サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列と；ＳＶ４０ポリアデニル化配列と；３’ＩＴＲエレメントと、を含む。これらのエレメントの配列を表１に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）においてヒトＡＲＳＡタンパク質を発現することができる。
ＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－５０００は、図１Ｂに示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメントと、ＣＭＶエンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチンプロモーター、およびキメライントロン配列を含む転写調節エレメントと；サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列と；ＳＶ４０ポリアデニル化配列と；３’ＩＴＲエレメントと、を含む。これらのエレメントの配列を表１に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）においてヒトＡＲＳＡタンパク質を発現することができる。
ｃ）ｐＨＭＩ－５００３
ＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－５００３は、図１Ｃに示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメントと、ＣＭＶエンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチンプロモーター、およびキメライントロン配列を含む転写調節エレメントと；サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列と；ＳＶ４０ポリアデニル化配列と；非コードスタッファー配列と、３’ＩＴＲエレメントと、を含む。これらのエレメントの配列を表１に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）においてヒトＡＲＳＡタンパク質を発現することができる。
ＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－５００３は、図１Ｃに示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメントと、ＣＭＶエンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチンプロモーター、およびキメライントロン配列を含む転写調節エレメントと；サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列と；ＳＶ４０ポリアデニル化配列と；非コードスタッファー配列と、３’ＩＴＲエレメントと、を含む。これらのエレメントの配列を表１に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）においてヒトＡＲＳＡタンパク質を発現することができる。
ｄ）ｐＨＭＩ－ｈＡＲＳＡ１－ＴＣ－００２
ＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－ｈＡＲＳＡ１－ＴＣ－００２は、図１Ｄに示すように、５’から３’の方向にｐＨＭＩ－５０００と同じ遺伝エレメントを含む。これらのエレメントの配列を表１に記載する。ｐＨＭＩ－ｈＡＲＳＡ１－ＴＣ－００２とｐＨＭＩ－５０００との違いは、ベクター骨格配列にある。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）においてヒトＡＲＳＡタンパク質を発現することができる。
ＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－ｈＡＲＳＡ１－ＴＣ－００２は、図１Ｄに示すように、５’から３’の方向にｐＨＭＩ－５０００と同じ遺伝エレメントを含む。これらのエレメントの配列を表１に記載する。ｐＨＭＩ－ｈＡＲＳＡ１－ＴＣ－００２とｐＨＭＩ－５０００との違いは、ベクター骨格配列にある。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）においてヒトＡＲＳＡタンパク質を発現することができる。
本明細書に開示されるベクターは、限定されないが、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ１５、またはＡＡＶＨＳＣ１７キャプシドなどの、ＡＡＶキャプシド中にパッケージングされ得る。パッケージングされたウイルス粒子は、野生型動物、またはＡＲＳＡ欠損動物に投与することができる。
実施例２：ＡＲＳＡ（－／－）マウスモデルにおけるＡＲＳＡ遺伝子移入
マウスにおけるＡＲＳＡ遺伝子移入の効果を研究するために、ＡＲＳＡ（－／－）マウスモデルを作製した。ＡＲＳＡ（－／－）マウスモデルは、マウスＡＲＳＡ遺伝子のエクソン４へのネオマイシンカセットの挿入によって産生されるＡＲＳＡノックアウトマウスである（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３（２５）：１４８２１－１４８２６を参照のこと。当該文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。） ＡＲＳＡ（－／－）マウスは、ヒトと比較して類似しているが、より軽度の異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を発生する。ＡＲＳＡ（－／－）マウスは、広範な脱髄の証拠を示さない。
マウスにおけるＡＲＳＡ遺伝子移入の効果を研究するために、ＡＲＳＡ（－／－）マウスモデルを作製した。ＡＲＳＡ（－／－）マウスモデルは、マウスＡＲＳＡ遺伝子のエクソン４へのネオマイシンカセットの挿入によって産生されるＡＲＳＡノックアウトマウスである（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３（２５）：１４８２１－１４８２６を参照のこと。当該文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。） ＡＲＳＡ（－／－）マウスは、ヒトと比較して類似しているが、より軽度の異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を発生する。ＡＲＳＡ（－／－）マウスは、広範な脱髄の証拠を示さない。
様々なバイオマーカーを使用して、ＭＬＤを調査することができる。例えば、脳内のスルファチドのレベルを測定することができる。オリゴデンドロサイト（Ｃ２４：０）および神経細胞（Ｃ１８：０）スルファチドの増加は、動物が年齢を重ねるにつれて蓄積が増加すると報告されている。ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）ｍＲＮＡ転写物のレベルを測定することができる。ＭＡＬは、オリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞によって発現され、グリア軸索接合部を安定化し、ＭＬＤの病態に関与しているとされてきた。ＭＡＬ転写物のレベルは、ＡＲＳＡ（－／－）マウスにおいて低減されることが報告されている。リソソーム膜タンパク質（ＬＡＭＰ－１）は、ＭＬＤを調査するために使用できる別のバイオマーカーである。ＬＡＭＰ－１免疫反応性は、抗ＬＡＭＰ－１抗体を使用する、ＡＲＳＡ（－／－）マウスおよび野生型マウスの脊髄組織に対する免疫組織化学により調査されてきており、ＡＲＳＡ（－／－）マウスにおけるＬＡＭＰ－１免疫反応性の増加を示している。図２Ａは、ＡＲＳＡ（－／－）マウス由来の脊髄組織に対して免疫組織化学（ＩＨＣ）により調査されたＬＡＭＰ－１免疫反応性に由来する総画素強度の定量化を示す。ビヒクル対照で処置された、またはＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００で処置されたＡＲＳＡ（－／－）マウスにおける抗ＬＡＭＰ－１抗体を使用してＩＨＣを実施した。図２Ａに示すように、投与後１２週で（４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇのＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００）、ビヒクル対照を投与されたＡＲＳＡ（－／－）動物と比較して、ＬＡＭＰ－１のレベルにおける有意な低下を検出した。
脳組織を計量し、プリセリーズ（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ）ビーズホモジナイザー中の２５０ｕＬの水中でホモジナイズし、１０ｕＬのホモジネートのアリコートをピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡタンパク質アッセイ定量化のために除去した。各ホモジネートに７６０ｕＬのアセトニトリルを添加し、混合物を二回ホモジナイズした。ホモジネートを１４，０００×ｇで１５分間遠心分離し、遠心分離で清澄化された上澄液を除去し、ＲａｐｉｄＦｉｒｅ－ＭＳ分析のために７５％アセトニトリル中、５×希釈した。Ｃ１９：０スルファチド（マトレヤ（Ｍａｔｒｅｙａ）ｃａｔ＃１８８８）を内部標準として使用し、サイエックス（Ｓｃｉｅｘ）ＡＰＩ４０００三連四重極型質量分析計上のＭＲＭモードでＣ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ２４：０、およびＣ２４：１スルファチドと共に監視した。各試料に、８つの異なる濃度のＣ１９：０スルファチドＩＳを８回注入し、各試料に対して固有の標準曲線を生成し、これを各分析物の濃度を計算するために使用した。図２Ｂは、対照群マウス（ＷＴ／Ｈｅｔ）およびＡＲＳＡ（－／－）マウスの脳における、経時的なＣ１８：０スルファチドのレベルを示す。対照群は、野生型動物（ＡＲＳＡ（＋／＋））とヘテロ接合型動物（ＡＲＳＡ（＋／－））の混合であった。図２Ｂに示すように、ＡＲＳＡ（－／－）マウスの脳におけるＣ１８：０スルファチドのレベルが経時的に蓄積する一方で、対照群マウスの脳におけるＣ１８：０スルファチドのレベルは経時的にほぼ変化しない。図２Ｂのデータは、２匹の対照群マウスおよび２匹のＡＲＳＡ（－／－）マウスの分析から生成された。ＡＲＳＡ欠損マウスにおけるスルファチド蓄積に対するＡＲＳＡ遺伝子送達の効果を調査するために、ＡＲＳＡ（－／－）マウスをＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇのｐＨＭＩ－ｈＡＲＳＡ１－ＴＣ－００２で処置した。（図２Ｃ）図２Ｃに示すように、ビヒクル対照で処置されたＡＲＳＡ（－／－）マウスと比較して、処置されたＡＲＳＡ（－／－）マウスにおいて、投与後七ヵ月で脳スルファチドレベルの有意な低下が観察された。
ＡＲＳＡ（－／－）マウスの前脳、中脳、および後脳におけるＣ１８：０およびＣ１８：１スルファチドアイソフォームレベルを、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇおよび６ｅ１３ ｖｇ／ｋｇのｐＨＭＩ－５０００で、またはビヒクル対照で、処置後七ヵ月に決定した（図２Ｄ）。スルファチドアイソフォームレベルは、同齢の野生型対照動物に対する倍率として提示される。図２Ｄに示すように、ビヒクル対照で処置されたＡＲＳＡ（－／－）マウスと比較して、処置されたＡＲＳＡ（－／－）マウスの脳の三つの領域すべてにおいて、投与後七ヵ月で脳スルファチドレベルの有意な低下が観察された。使用した方法および材料は上記と同じであった。データは、独立Ｔ検定を使用して分析された。
ＡＲＳＡ（－／－）マウスの前脳、中脳、および後脳における、Ｃ１８：０およびＣ１８：１スルファチドアイソフォームレベル（図２Ｅ）、Ｃ２４：０およびＣ２４：１スルファチドアイソフォームレベル（図２Ｆ）、および総スルファチドアイソフォームレベル（図２Ｇ）を、ＡＡＶＨＳ１５キャプシドにパッケージングされた４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇのｐＨＭＩ－５０００で、またはビヒクル対照で、処置後５２週に決定した。使用した方法および材料は上記と同じであった。データは、独立Ｔ検定を使用して分析された。
図３Ａは、対照群マウス（ＷＴ／Ｈｅｔ）およびＡＲＳＡ（－／－）マウスにおける４週でのＭＡＬ転写物のレベルを示す。対照群は、野生型動物（ＡＲＳＡ（＋／＋））とヘテロ接合型動物（ＡＲＳＡ（＋／－））の混合であった。マウス総ＲＮＡを、トリゾール抽出、続いてキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮＥａｓｙカラム精製で調製した。サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ キットを使用したｃＤＮＡ合成の鋳型としてＲＮＡを使用して、転写物を作製した。ＭＡＬ転写物を、マウスミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）に特異的な液滴デジタルＰＣＲおよびプライマー／プローブセットを使用して評価した、マウスＨＰＲＴ１に対してコピー数を正規化した。示されるように、４週で、ＭＡＬ転写物のレベルは、ヘテロ接合型マウスと比較して、ＡＲＳＡ（－／－）マウスで低下する。図３のデータは、５匹の対照群マウスおよび６匹のＡＲＳＡ（－／－）マウスの分析から生成された。ＡＲＳＡ欠損マウスにおけるＭＡＬ転写物のレベルへのＡＲＳＡ遺伝子送達の影響を調査するために、ＡＲＳＡ（－／－）マウスをＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇのｐＨＭＩ－５０００で処置した。（図３Ｂ）図３Ｂに示すように、野生型マウスおよびビヒクルで処置されたＡＲＳＡ（－／－）マウスと比較して、処置されたＡＲＳＡ（－／－）マウスにおけるＭＡＬ転写物レベルの有意な増加が、投与後三ヵ月で観察された。
ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた４ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｐＨＭＩ－５０００で処置されたＡＲＳＡ（－／－）マウスにおけるＭＡＬ転写物コピー数のレベルを決定した（図３Ｃ）。図３Ｃは、野生型マウスで、あるいはビヒクル対照、またはＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた４ｅ１３ｖｇ／ｋｇのｐＨＭＩ－５０００を投与されたＡＲＳＡ（－／－）マウスの投与後１２または５２週で検出されたＭＡＬ転写物コピー数を示す。使用した方法および材料は上記と同じであった。データは、独立Ｔ検定を使用して分析された。図３Ｃで、動物群間の統計的有意性は、以下のようである：１２週の、ビヒクルを投与された動物対処置された動物、ｐ＝０．００１２；１２週の、処置された動物対野生型動物、ｐ＜０．０００１；５２週の、ビヒクルを投与された動物対処置された動物、ｐ＝０．０００４；および５２週の、処置された動物対野生型動物、有意ではない。
ｈＡＲＳＡ活性の治療レベルを達成できるかを調査するために、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージングされた移入ベクターＴ－００１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２００２／０５２０５２号を参照）を、ＡＲＳＡ（－／－）マウスに投与した。未処理対照ＡＲＳＡ（－／－）マウス、およびＡＡＶ９キャプシドにパッケージングされた移入ベクターＴ－００１を投与されたＡＲＳＡ（－／－）マウスから得た脳切片の抗ＡＲＳＡ免疫反応性は、治療レベルのｈＡＲＳＡ酵素活性（１０％）が、体重１キログラム当たり２ｅ１３ベクターゲノムの用量（ｖｇ／ｋｇ）で達成されたことを示す。処置されたＡＲＳＡ（－／－）マウスから得た脳切片の抗ＡＲＳＡ免疫反応性はまた、脳におけるＡＲＳＡ酵素活性の用量依存性の増加も示す。
実施例３：ＡＲＳＡ（－／－）マウスモデルにおけるＡＲＳＡ遺伝子移入
本実施例は、ヒトＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－５０００の使用に関する実験データを提供する。本明細書に記載されるように、移入ベクターｐＨＭＩ－５０００は、サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列を含み、これは、ＡＲＳＡタンパク質の発現の有意な改善を示すことが示された。
本実施例は、ヒトＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－５０００の使用に関する実験データを提供する。本明細書に記載されるように、移入ベクターｐＨＭＩ－５０００は、サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列を含み、これは、ＡＲＳＡタンパク質の発現の有意な改善を示すことが示された。
図４は、脳内の形質導入細胞当たりのベクターゲノム数と、ｃＤＮＡのｎｇ当たりのｈＡＲＳＡのコピー数との相関を示すプロットである。マウスゲノムＤＮＡを、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社のＱＩＡａｍｐ Ｆａｓｔ ＤＮＡ組織キットを使用して調製した。ＶＧカウントを、コドン最適化ヒトＡＲＳＡベクターゲノムのコード領域に特異的な液滴デジタルＰＣＲおよびプライマー／プローブセットにより決定した、内因性マウスゲノム配列に対して正規化した。マウス総ＲＮＡを本明細書に記載されるように調製し、液滴デジタルＰＣＲおよびＶＧカウントを決定するために使用された同じプライマー／プローブセットを使用して、ＡＲＳＡ転写物を評価した。コピー数をマウスＧＵＳＢに対して正規化した。示されるように、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた移入ベクターｐＨＭＩ－５０００を使用して形質導入された細胞については、形質導入細胞当たりで検出されたベクターゲノムの数が、ｃＤＮＡのｎｇ当たりのｈＡＲＳＡのコピーの数と強く相関する（Ｒ２＝０．９３３２）。
ＡＡＶＨＳＣ１５およびＡＡＶ９キャプシド媒介送達間の比較において、ＡＡＶＨＳＣ１５は脳内でＡＡＶ９より有意に優れていることが見出された。図５は、ＡＡＶ９またはＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドのいずれかにパッケージングされた移入ベクターｐＨＭＩ－５０００について、２ｅ１３ ｖｇ／ｋｇの用量での、脳内の形質導入細胞当たりのベクターゲノム数を示す。示されるように、移入ベクターｐＨＭＩ－５０００をＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングした場合、ＡＡＶ９キャプシドと比較して、細胞当たりのベクターゲノム数が１０倍高いことが観察された。図６は、指示された用量で投与されたＡＡＶ９またはＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドのいずれかにパッケージングされた移入ベクターｐＨＭＩ－５０００について測定された正常なヒトＡＲＳＡ酵素活性レベルのパーセントを示す。図７は、４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇで、ＡＡＶ９またはＡＡＶＨＳＣ１５のいずれかにパッケージングされた移入ベクターｐＨＭＩ－５０００を投与されたマウスにおける、形質導入脳細胞当たりのベクターゲノム数を示す。
ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００は、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００と比較して、より強力でより広範な脳および脊髄発現プロファイルを示した。抗ＡＲＳＡ免疫反応性実験は、それぞれ３ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００を静脈内投与したマウスの脳切片では、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００を静脈内投与したマウスと比較して、はるかに高いレベルが検出されたことを示す。
脳内のｈＡＲＳＡの生体分布に対する投与経路の効果を評価するために、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた移入ベクターｐＨＭＩ－５０００を、それぞれ４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇおよび４ｅ１２ ｖｇ／ｋｇの用量で、静脈内（ＩＶ）経路およびくも膜下腔内（ＩＴ）経路を介して投与した。抗ＡＲＳＡ免疫反応性は、ＡＲＳＡ（－／－）マウスにおいて、ＡＡＶＨＳＣ１５にパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００のＩＶ投与の後、主要な中枢神経系領域に存在した。抗マウスＡＲＳＡ（ｍＡＲＳＡ）またはヒトＡＲＳＡ（ｈＡＲＳＡ）は、運動および感覚皮質、海馬（ＣＡ３領域）、被殻、および小脳を含むがこれに限定されず、広く検出された。ＡＡＶＨＳＣ１５にパッケージングされた移入ベクターｐＨＭＩ－５０００のＩＶ投与またはＩＴ投与後の、後脳および中脳における正常なヒトＡＲＳＡ酵素活性のパーセントの定量化を図８に示す。
ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇのｐＨＭＩ－５０００を４週間投与されたＡＲＳＡ（－／－）マウスにおいて、ｈＡＲＳＡの生物学的に関連する分布が、脳の重要な生理学的領域、ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）の体軸全体にわたって検出された。ｈＡＲＳＡは、抗ｈＡＲＳＡ抗体を使用して検出され、脊髄、運動野、視床、海馬、および小脳核で検出された。ｈＡＲＳＡはまた、以下でも検出された：ＣＮＳ中の運動ニューロンおよび星状細胞プロファイル；ＣＮＳ中のオリゴデンドロサイト（上行線維において高い検出を有する）；ＣＮＳ中の大脳皮質の細胞集団、ならびに末梢神経系（ＰＮＳ）の感覚ニューロンおよびシュワン細胞。類似の生物学的分布は、処置後２週という早期に検出され得る。
ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００を２ｅ１３ ｖｇ／ｋｇで投与されたマウスでは、４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇ以上の用量で投与されたマウスに見られるのと同じ組織学的分布が観察された。これらの実験において、ｈＡＲＳＡは、リソソームのそれ特有の点状パターンで、細胞細胞質内で検出された。
図９Ａおよび９Ｂに示すように、ヒトＡＲＳＡ酵素活性の生理学的レベルが、投与後４週で、処置されたＡＲＳＡ（－／－）マウスの脳内で回復した。ＡＲＳＡ（－／－）マウス由来の脳ライセートを使用して、ｈＡＲＳＡ酵素活性を評価した。用量範囲設定治験により、ｈＡＲＳＡ酵素活性が、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた移入ベクターｐＨＭＩ－５０００のＩＶ投与の用量と相関することが示された。酵素活性は、処置された動物では検出されたが、ビヒクル対照動物では検出されなかった。試験された用量については、酵素活性レベル（約４０～１４５％）は、臨床で以前に決定されたように、約１０～１５％である治療標的をはるかに超えていた（Ｐａｔｉｌ ａｎｄ Ｍａｅｇａｗａ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３，７：７２９－７４５を参照されたい）。図９Ａは、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた移入ベクターｐＨＭＩ－５０００を、ＡＲＳＡ（－／－）マウスに指示された用量で投与することによって達成される、正常なｈＡＲＳＡ活性のパーセンテージを示す。示されるように、ｈＡＲＳＡ活性の用量依存的応答が達成された。図９Ｂは、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされた移入ベクターｐＨＭＩ－５０００を指示された用量で投与されたＡＲＳＡ（－／－）マウスの脳内における、細胞当たりのベクターゲノム数を示す。１ｅ１３ ｖｇ／ｋｇ、４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇ、および６ｅ１３ ｖｇ／ｋｇの用量について、ｎ＝５マウス。２ｅ１３ ｖｇ／ｋｇ用量について、ｎ＝４マウス。すべてのマウスは５週齢で、すべてのオスであった。図９Ｃにおいて、ＡＲＳＡ酵素活性を、可溶性基質ｐ－ニトロカテコール－硫酸（ｐＮＣＳ）からの硫酸の切断を測定する比色分析アリールスルファターゼＡ特異的アッセイを使用して評価した。競合する酵素からの硫酸の非特異的切断は、アリールスルファターゼ（Ａｒｌｙｓｕｌｆａｔａｓｅ）Ａ特異的免疫沈降ステップの使用によって除去される。脳における正常なヒトＡＲＳＡ酵素活性は、それぞれ２人の正常なヒトオスおよびメスの前頭皮質におけるＡＲＳＡ酵素活性の分析によって決定される。ヒト前頭皮質試料をＢｉｏｉＶＴから購入し、各ＡＲＳＡ酵素活性アッセイプレート上で試験試料と共に三回同じ方法で実行する。データは、一時間当たりの１ｍｇのタンパク質当たりの脱硫酸化ｐＮＣＳの平均量（ｎｇ）のパーセントとして表される。図９Ｃは、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００の単回静脈内４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇ投与が、処置後１週という早期に、および処置後１２週まで、確立されたヒト治療標的である１０～１５％（破線で示される）を超えるレベルで、新生児ＡＲＳＡ（－／－）マウスの脳におけるｈＡＲＳＡ酵素活性の検出をもたらしたことを示す。投与後１、２、３、４、および１２週で材料を収集した。各時点でｎ＝６マウス、８週齢でオス３匹およびメス３匹。
図９Ｄにおいて、マウス総ＲＮＡを、トリゾール抽出、続いてキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮＥａｓｙカラム精製で調製した。サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡキットを使用したｃＤＮＡ合成の鋳型としてＲＮＡを使用して、転写物を作製した。ＡＲＳＡ転写物を、コドン最適化ヒトＡＲＳＡ転写物に特異的な液滴デジタルＰＣＲおよびプライマー／プローブセットを使用して評価した。マウスＧＵＳＢに対してコピー数を正規化した。図９Ｄは、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００の単回静脈内４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇ投与が、処置後１週という早期に、成体ＡＲＳＡ（－／－）マウスの脳におけるｈＡＲＳＡ酵素活性の正常レベルの検出（ｈＡＲＳＡ転写物解析による）をもたらしたことを示す。ｈＡＲＳＡ酵素活性のピークレベルは、投与後２～３週の間に観察され、その後、確立されたヒト治療標的である１０～１５％を超えるレベルで、処置後５２週まで定常状態のプラトーが持続した。投与後１、２、３、４、８、１２、２６、および５２週で材料を収集した。図９Ｅは、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００の単回静脈内４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇ用量を投与されたＡＲＳＡ（－／－）マウスの脳内における、ゲノムＤＮＡのｕｇ当たりのベクターゲノムの数を示す。投与後１、２、３、８、１２、２６、および５２週で材料を収集した。図９Ｆは、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５０００の単回静脈内４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇ用量を投与されたＡＲＳＡ（－／－）マウスの脳内における、ＲＮＡのｎｇ当たりのＡＲＳＡ転写物のコピーの数を示す。投与後４、８、１２、２６、および５２週で材料を収集した。
実施例４：ヒトＡＲＳＡ移入ベクター
本実施例は、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）におけるｈＡＲＳＡの発現のためのヒトＡＲＳＡ移入ベクターＴＣ－０１３．ｐＨＭＩＡ２およびＴＣ－０１５．ｐＫＩＴＲを提供する。ｈＡＲＳＡを発現することに加えて、これらのベクターはヒトＳＵＭＦ１も発現するように設計されている。ｈＡＲＳＡおよびｈＳＵＭＦ１のコード配列は、２Ａエレメントによって分離される。特定の実施形態では、リボソームスキッピングエレメント（例えば、２Ａエレメント）は、Ｎ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙの配列をさらに含むペプチドをコードし、任意選択的にＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙの配列は、ＧＧＣＡＧＣＧＧＡのヌクレオチド配列によってコードされる。理論に拘束されるものではないが、リボソームスキッピングエレメントは、第一のペプチド鎖の翻訳を終了し、第二のペプチド鎖の翻訳を再開始することによって、あるいはコードされるペプチドの内因性プロテアーゼ活性による、または環境（例えば、サイトゾル）中の別のプロテアーゼによる、リボソームスキッピングエレメントによってコードされるペプチド配列中のペプチド結合の開裂によって、機能すると仮定される。
本実施例は、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）におけるｈＡＲＳＡの発現のためのヒトＡＲＳＡ移入ベクターＴＣ－０１３．ｐＨＭＩＡ２およびＴＣ－０１５．ｐＫＩＴＲを提供する。ｈＡＲＳＡを発現することに加えて、これらのベクターはヒトＳＵＭＦ１も発現するように設計されている。ｈＡＲＳＡおよびｈＳＵＭＦ１のコード配列は、２Ａエレメントによって分離される。特定の実施形態では、リボソームスキッピングエレメント（例えば、２Ａエレメント）は、Ｎ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙの配列をさらに含むペプチドをコードし、任意選択的にＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙの配列は、ＧＧＣＡＧＣＧＧＡのヌクレオチド配列によってコードされる。理論に拘束されるものではないが、リボソームスキッピングエレメントは、第一のペプチド鎖の翻訳を終了し、第二のペプチド鎖の翻訳を再開始することによって、あるいはコードされるペプチドの内因性プロテアーゼ活性による、または環境（例えば、サイトゾル）中の別のプロテアーゼによる、リボソームスキッピングエレメントによってコードされるペプチド配列中のペプチド結合の開裂によって、機能すると仮定される。
ａ）ＴＣ－０１３．ｐＨＭＩＡ２
ＡＲＳＡ移入ベクターＴＣ－０１３．ｐＨＭＩＡ２は、図１０Ａに示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメント、ＣＡＬＭ１プロモーターを含む転写調節エレメント；サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列；２Ａエレメント；サイレントに改変されたヒトＳＵＭＦ１コード配列；および３’ＩＴＲエレメント、を含む。これらのエレメントの配列を表２に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）中にヒトＡＲＳＡタンパク質およびヒトＳＵＭＦ１タンパク質を発現することができる。
ＡＲＳＡ移入ベクターＴＣ－０１３．ｐＨＭＩＡ２は、図１０Ａに示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメント、ＣＡＬＭ１プロモーターを含む転写調節エレメント；サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列；２Ａエレメント；サイレントに改変されたヒトＳＵＭＦ１コード配列；および３’ＩＴＲエレメント、を含む。これらのエレメントの配列を表２に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）中にヒトＡＲＳＡタンパク質およびヒトＳＵＭＦ１タンパク質を発現することができる。
ｂ）ＴＣ－０１５．ｐＫＩＴＲ
ＡＲＳＡ移入ベクターＴＣ－０１５．ｐＫＩＴＲは、図１０Ｂに示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメント、ｓｍＣＢＡプロモーターを含む転写調節エレメント；サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列；２Ａエレメント；サイレントに改変されたヒトＳＵＭＦ１コード配列；および３’ＩＴＲエレメント、を含む。これらのエレメントの配列を表２に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）中にヒトＡＲＳＡタンパク質およびヒトＳＵＭＦ１タンパク質を発現することができる。
ＡＲＳＡ移入ベクターＴＣ－０１５．ｐＫＩＴＲは、図１０Ｂに示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメント、ｓｍＣＢＡプロモーターを含む転写調節エレメント；サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列；２Ａエレメント；サイレントに改変されたヒトＳＵＭＦ１コード配列；および３’ＩＴＲエレメント、を含む。これらのエレメントの配列を表２に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）中にヒトＡＲＳＡタンパク質およびヒトＳＵＭＦ１タンパク質を発現することができる。
本明細書に開示されるベクターは、限定されないが、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ１５、またはＡＡＶＨＳＣ１７キャプシドなどの、ＡＡＶキャプシド中にパッケージングされ得る。パッケージングされたウイルス粒子は、野生型動物、またはＡＲＳＡ欠損動物に投与することができる。
脳内のｈＡＲＳＡ発現に対するプロモーターの効果を評価するために、移入ベクターｐＨＭＩ－５０００、ＴＣ－０１３．ｐＨＭＩＡ２、およびＴＣ－０１５．ｐＫＩＴＲをＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングし、ＡＲＳＡ（－／－）マウスに静脈内投与した。ｈＡＲＳＡ発現および酵素活性を、４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与されたｐＨＭＩ－５０００ベクター（ニワトリ－β－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター）、および８ｅ１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与されたＴＣ－０１５．ｐＫＩＴＲ（ｓｍＣＢＡプロモーター）で、細胞カウント当たり同じウイルスゲノムで、脳内で検出した。ＣＢＡプロモーターは、試験された他のプロモーターと比較して、最低用量でのｈＡＲＳＡの最も高い発現をもたらす。図１１は、ｐＨＭＩ－５０００（ＣＢＡプロモーター）、ＴＣ－０１３．ｐＨＭＩＡ２（ＣＡＬＭ１プロモーター）、およびＴＣ－０１５．ｐＫＩＴＲ（ｓｍＣＢＡプロモーター）について、細胞当たりで形質導入されたウイルスゲノムの数を示し、いずれの場合もＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされ、４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与された（各ベクターにつき、ｎ＝５マウス）。図１２は、ｐＨＭＩ－５０００（ＣＢＡプロモーター）、およびＴＣ－０１５．ｐＫＩＴＲ（ｓｍＣＢＡプロモーター）について検出された正常なヒトＡＲＳＡ酵素活性のパーセントを示し、いずれの場合もＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされ、４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与された（各ベクターにつき、ｎ＝５マウス）。図１３は、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされ、４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与されたｐＨＭＩ－５０００（ＣＢＡプロモーター）、およびＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされ、８ｅ１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与されたＴＣ－０１５．ｐＫＩＴＲ（ｓｍＣＢＡプロモーター）について、ウェスタンブロット中の抗ｈＡＲＳＡ抗体を使用して、マウスの脳においてｈＡＲＳＡの発現を検出できることを示す（各ベクターにつき、ｎ＝５マウス）。
実施例５：ヒトＡＲＳＡ移入ベクター
本実施例は、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）中のｈＡＲＳＡの発現のための、ヒトＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－５００４を提供する。ｈＡＲＳＡを発現することに加えて、このベクターは、ヒトサポシンＢ（ＳａｐＢ）も発現するように設計されている。ｈＡＲＳＡおよびＳａｐＢのコード配列は、２Ａエレメントによって分離される。
本実施例は、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）中のｈＡＲＳＡの発現のための、ヒトＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－５００４を提供する。ｈＡＲＳＡを発現することに加えて、このベクターは、ヒトサポシンＢ（ＳａｐＢ）も発現するように設計されている。ｈＡＲＳＡおよびＳａｐＢのコード配列は、２Ａエレメントによって分離される。
ＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－５００４は、図１４に示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメントと；ＣＭＶエンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチンプロモーター、およびキメライントロン配列を含む転写調節エレメントと；サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列と；２Ａエレメントと；野生型ヒトＳａｐＢコード配列と；３’ＩＴＲエレメントと、を含む。これらのエレメントの配列を表３に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）中にヒトＡＲＳＡおよび／またはＳａｐＢタンパク質を発現することができる。
実施例６：非ヒト霊長類におけるＡＲＳＡ遺伝子移入
非ヒト霊長類におけるＡＡＶＨＳＣ介在性ＡＲＳＡ遺伝子送達の単回投与の効果を調査するために、表４および５に記載される実験設計に従って、６匹のオス未処置の若いカニクイザルに投与した。
非ヒト霊長類におけるＡＡＶＨＳＣ介在性ＡＲＳＡ遺伝子送達の単回投与の効果を調査するために、表４および５に記載される実験設計に従って、６匹のオス未処置の若いカニクイザルに投与した。
ＡＲＳＡ移入ベクターｐＨＭＩ－５００５は、図１５に示すように、５’から３’の方向に以下の遺伝エレメント：５’ＩＴＲエレメントと；ＣＭＶエンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチンプロモーター、およびキメライントロン配列を含む転写調節エレメントと；サイレントに改変されたヒトＡＲＳＡコード配列と；Ｖ５タグと；３’ＩＴＲエレメントと、を含む。これらのエレメントの配列を表６に記載する。このベクターは、ベクターが形質導入される細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）においてヒトＡＲＳＡタンパク質を発現することができる。
ｐＨＭＩ－５００５は、Ｖ５タグ付きＡＲＳＡ移入ベクターである。ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５００５は、表４および５に記載される実験設計に従って、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に投与された。投与は、０日目に、橈側皮静脈／伏在静脈を介した１～２分の緩徐なボーラス静脈内注射（ＩＶ）を介して、または大槽（ＣＭ）への直接注射によって実施された。死亡および瀕死の徴候について生存確認を一日二回行った。臨床観察は、毎朝、および投与日の投与終了後（１５分）および投与後４時間に実施された。血液学および臨床化学用の血液を、投与の直前に、投与後１、２、および４週目に取得した。２８日目および２９日目の剖検で、脳脊髄液（ＣＳＦ）および血液の採取後、動物を１．０Ｌの低温生理食塩水で灌流し、血球を除去した。脳、肝臓、脊髄（頸部および腰部）、頸部および腰部の背根神経節（ＤＲＧ）、三叉神経節、腎臓、座骨神経、末梢リンパ節、脾臓、心臓、肺、および精巣を剖検時に採取した。
生物学的分析解析については、投与の直前に、ならびに１、２、および４週目に、Ｖ５ Ｅｌｉｓａについて血清が収集される（血清に処理された／二つのアリコートに分割された０．５ｍＬの全血）。０．５ｍＬのＣＳＦを投与前（第三群ＣＭ投与動物から）に、１～２ｍＬを剖検時に（全動物について）採取した。１５ｍＬの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、剖検前に全血から採取した。
図１６は、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドにパッケージングされたｐＨＭＩ－５００５を投与されたＮＨＰにおけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルの上昇を示す。ＡＬＴ上昇は、投与後１４日目までにベースラインレベルに戻った。
ＡＡＶＨＳＣ１５にパッケージングされた４ｅ１３ ｖｇ／ｋｇのｐＨＭＩ－５００５の単回ＩＶ投与を受けたＮＨＰ（第二群動物）は、投与後２８および２９日に犠牲にした。ヒトＡＲＳＡ酵素活性レベルは、犠牲とされた第二群動物の中枢神経系（ＣＮＳ）および脳脊髄液（ＣＳＦ）で検出された（図１７）。図１７に示されるように、ｈＡＲＳＡ活性は、点線によって示されるように、治療閾値（野生型ヒト脳レベルの１５％）を超えるレベルで検出された。動物１８Ｃ２７（第二群）のＣＮＳおよび末梢神経系（ＰＮＳ）における免疫蛍光染色により、ｈＡＲＳＡの存在を（Ｖ５タグ検出を介して）確認し、背根神経節、脊髄運動ニューロン、および小脳を含む特定の領域において確認している。
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本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際に、記載されるものに加えて本発明の様々な改変は、前述の説明および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。かかる改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
本明細書に引用されるすべての参考文献（例えば、刊行物または特許または特許出願）は、個々の参考文献（例えば、刊行物または特許または特許出願）が、すべての目的に対してその全体が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示唆された場合と同じ程度で、すべての目的に対してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の実施形態は、以下の請求項の範囲内である。
Claims (83)
- 細胞内でアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）ポリペプチドを発現する方法であって、前記細胞に、
（ａ）ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶキャプシドと、
（ｂ）サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列に操作可能に連結された転写調節エレメントを含む移入ゲノムと、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を形質導入することを含む、方法。 - 前記細胞が、ニューロンおよび／またはグリア細胞であり、任意選択的に、前記細胞が、中枢神経系および／または末梢神経系のニューロンおよび／またはグリア細胞である、請求項１に記載の方法。0
- 前記細胞が、脊髄、運動野、感覚野、海馬、被殻、小脳、任意選択で小脳核、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される中枢神経系領域の細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記細胞が、運動ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、中枢神経系の大脳皮質の細胞、末梢神経系の感覚ニューロン、シュワン細胞、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳類の対象にあり、前記ＡＡＶが、前記対象において前記細胞を形質導入するのに有効な量で前記対象に投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を有する対象を治療する方法であって、前記方法が、
（ａ）キャプシドタンパク質を含むＡＡＶキャプシドと、
（ｂ）サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列に操作可能に連結された転写調節エレメントを含む移入ゲノムと、を含む、有効量のｒＡＡＶを、前記対象に投与することを含む、方法。 - 前記サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列が、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列をコードする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列が、配列番号１４、６２、または７２に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の方法。
- 前記転写調節エレメントが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、小型ニワトリ－β－アクチン（ＳｍＣＢＡ）プロモーター、カルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）プロモーター、プロテオ脂質タンパク質１（ＰＬＰ１）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、シナプシン２（ＳＹＮ２）プロモーター、メタロチオネイン３（ＭＴ３）プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される一つ以上のエレメントを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記転写調節エレメントが、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および５８からなる群から選択される配列に対し、少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記転写調節エレメントが、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および５８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記転写調節エレメントが、５’から３’の方向へ、配列番号５８、２５、および３２に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記転写調節エレメントが、配列番号３６に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移入ゲノムがさらに、ポリアデニル化配列を前記サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列の３’側に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリアデニル化配列が、外因性ポリアデニル化配列である、請求項１４に記載の方法。
- 前記外因性ポリアデニル化配列がＳＶ４０ポリアデニル化配列である、請求項１５に記載の方法。
- 前記ＳＶ４０ポリアデニル化配列が、配列番号４２に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
- 前記移入ゲノムがさらに、スタッファー配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移入ゲノムがさらに、スタッファー配列を前記サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列の３’側に含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スタッファー配列が、前記ポリアデニル化配列の３’側である、請求項１８または１９に記載の方法。
- 前記移入ゲノムが、配列番号４１、４４、４６、６５、６７、７５、および７９からなる群から選択される配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移入ゲノムがさらに、前記ゲノムの５’側の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、前記ゲノムの３’側の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列とを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１９に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２２に記載の方法。
- 前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号２６に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号２７に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２２に記載の方法。
- 前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号５７に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２２に記載の方法。
- 前記移入ゲノムが、配列番号４７、４８、４９、６８、６９、７６、および８０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
- 異染性白質ジストロフィーが、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異と関連している、請求項５～２５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒト対象である、請求項６～２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号１６のアミノ酸２０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧである、請求項２９に記載の方法。
- （ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；または
（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣである、請求項３０に記載の方法。 - 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
- 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号１６のアミノ酸１５１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸１６０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＤであり、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧである、請求項３３に記載の方法。
- （ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；または
（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣである、請求項３４に記載の方法。 - 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
- 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号１６のアミノ酸２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＴであり、配列番号１６のアミノ酸６５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸６８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＶであり、配列番号１６のアミノ酸７７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸１１９に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＬであり、配列番号１６のアミノ酸１５１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸１６０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＤであり、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧである、請求項３７に記載の方法。
- （ａ）配列番号１６のアミノ酸２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＴであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＱであり；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸６５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＹであり；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸７７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＫであり；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸１１９に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＬであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＳであり；
（ｅ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり；
（ｆ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり；
（ｇ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；
（ｈ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；または
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣである、請求項３８に記載の方法。 - 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
- ｒＡＡＶであって、
（ａ）ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶキャプシドと、
（ｂ）サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列に操作可能に連結された転写調節エレメントを含む、移入ゲノムと、を含む、ｒＡＡＶ。 - 前記サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列が、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列をコードする、請求項４１に記載のｒＡＡＶ。
- 前記サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列が、配列番号１４に記載されるヌクレオチドを含む、請求項４２に記載のｒＡＡＶ。
- 前記サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列が、配列番号６２または７２に記載される前記ヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載のｒＡＡＶ。
- 前記転写調節エレメントが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメント、ニワトリ－β－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、小型ニワトリ－β－アクチン（ＳｍＣＢＡ）プロモーター、カルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）プロモーター、プロテオ脂質タンパク質１（ＰＬＰ１）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、シナプシン２（ＳＹＮ２）プロモーター、メタロチオネイン３（ＭＴ３）プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される一つ以上のエレメントを含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記転写調節エレメントが、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および５８からなる群から選択される配列に対し、少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載のｒＡＡＶ。
- 前記転写調節エレメントが、配列番号２５、３２、３６、５４、５５、および５８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載のｒＡＡＶ。
- 前記転写調節エレメントが５’から３’の方向に、配列番号５８、２５、および３２に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載のｒＡＡＶ
- 前記転写調節エレメントが、配列番号３６に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載のｒＡＡＶ。
- 前記移入ゲノムがさらに、ポリアデニル化配列を前記サイレントに改変されたＡＲＳＡコード配列の３’側に含む、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ポリアデニル化配列が、外因性ポリアデニル化配列である、請求項５０に記載のｒＡＡＶ。
- 前記外因性ポリアデニル化配列がＳＶ４０ポリアデニル化配列である、請求項５１に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＳＶ４０ポリアデニル化配列が、配列番号４２に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項５２に記載のｒＡＡＶ。
- 前記移入ゲノムが、配列番号４１、４４、４６、６５、６７、７５、および７９からなる群から選択される配列を含む、請求項４１～５３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記移入ゲノムがさらに、前記ゲノムの５’側の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、前記ゲノムの３’側の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列とを含む、請求項４１～５４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１９に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項５５に記載のｒＡＡＶ。
- 前記移入ゲノムが、配列番号４７、４８、４９、６８、６９、７６、および８０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４１～５５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記移入ゲノムのヌクレオチド配列が、配列番号４７、４８、４９、６８、６９、７６、および８０からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項４１～５５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記移入ゲノムのヌクレオチド配列が、配列番号４８に記載される前記ヌクレオチド配列からなる、請求項４１～５８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４１～５９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
- 配列番号１６のアミノ酸２０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧである、請求項６０に記載のｒＡＡＶ。
- （ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、または
（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣである、請求項６１に記載のｒＡＡＶ。 - 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載のｒＡＡＶ。
- 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４１～６３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
- 配列番号１６のアミノ酸１５１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸１６０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＤであり、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧである、請求項６４に記載のｒＡＡＶ。
- （ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；または
（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣである、請求項６５に記載のｒＡＡＶ。 - 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載のｒＡＡＶ。
- 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４１～６７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
- 配列番号１６のアミノ酸２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＴであり、配列番号１６のアミノ酸６５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸６８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＶであり、配列番号１６のアミノ酸７７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸１１９に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＬであり、配列番号１６のアミノ酸１５１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸１６０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＤであり、配列番号１６のアミノ酸２０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＱであり、配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＳであり、配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸５９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＫであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣであり、あるいは配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧである、請求項６８に記載のｒＡＡＶ。
- （ａ）配列番号１６のアミノ酸２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＴであり、配列番号１６のアミノ酸３１２に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＱであり；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸６５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＹであり；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸７７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６９０に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＫであり；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸１１９に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＬであり、配列番号１６のアミノ酸４６８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＳであり；
（ｅ）配列番号１６のアミノ酸６２６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＧであり；
（ｆ）配列番号１６のアミノ酸２９６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＭであり；
（ｇ）配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８７に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；
（ｈ）配列番号１６のアミノ酸３４６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＡであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり；または
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸５０１に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸７０６に対応する前記キャプシドタンパク質中の前記アミノ酸がＣである、請求項６９に記載のｒＡＡＶ。 - 前記キャプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載のｒＡＡＶ。
- 請求項４１～７１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物。
- 配列番号１４、６２、および７２に記載される核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- ｒＡＡＶを調製するためのパッケージングシステムであって、
（ａ）一つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列と、
（ｂ）請求項４１～７１のいずれか一項に記載のＡＡＶのキャプシドタンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列と、
（ｃ）請求項４１～７１のいずれか一項に記載のＡＡＶのｒＡＡＶゲノム配列を含む第三のヌクレオチド配列と、を含む、パッケージングシステム。 - 前記第一のヌクレオチド配列および前記第二のヌクレオチド配列を含む第一のベクターと、前記第三のヌクレオチド配列を含む第二のベクターと、を含む、請求項７４に記載のパッケージングシステム。
- 一つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第四のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項７４または７５に記載のパッケージングシステム。
- 前記第四のヌクレオチド配列が、第三のベクター内に含まれる、請求項７６に記載のパッケージングシステム。
- 前記第四のヌクレオチド配列が、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からなる群から選択されるウイルス由来の一つ以上の遺伝子を含む、請求項７４～７７のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
- 前記第一のベクター、第二のベクター、および／または前記第三のベクターがプラスミドである、請求項７４～７８のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
- ｒＡＡＶの組換え調製のための方法であって、前記ｒＡＡＶが産生される条件下で、請求項７４～７９のいずれか一項に記載のパッケージングシステムを細胞内に導入することを含む、方法。
- 薬剤として使用するための、請求項４１～７１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項７２に記載の医薬組成物、または請求項７３に記載のポリヌクレオチド。
- ＭＬＤの治療に使用するための、請求項４１～７１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項７２に記載の医薬組成物、または請求項７３に記載のポリヌクレオチド。
- ＭＬＤを有する対象を治療する方法において使用するための、請求項４１～７１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項７２に記載の医薬組成物、または請求項７３に記載のポリヌクレオチドであって、前記方法が、前記ｒＡＡＶ、前記医薬組成物、または前記ポリヌクレオチドの有効量を前記対象に投与することを含む、前記ｒＡＡＶ、前記医薬組成物、または前記ポリヌクレオチド。
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