TW202112807A - 用於ａｒｓａ基因轉移之腺相關病毒組成物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文中提供一種腺相關病毒（AAV）組成物，其可在細胞中表現芳基硫酸酯酶A（ARSA）多肽，藉此恢復ARSA基因功能。亦提供使用AAV組成物之方法，及用於製備AAV組成物之封裝系統。
Description
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年6月10日提交之美國臨時申請案第62/859,539號、2019年6月25日提交之美國臨時申請案第62/866,374號、2019年10月15日提交之美國臨時申請案第62/915,523號、2020年1月13日提交之美國臨時申請案第62/960,487號、2020年3月10日提交之美國臨時申請案第62/987,858號及2020年4月16日提交之美國臨時申請案第63/010,970號之權益，其各自以全文引用之方式併入本文中。序列表
本申請案含有序列表，其已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用之方式併入本文中（該ASCII複本創建於2020年4月16日，名為「705151_HMW-030-6_ST25.txt」且大小為295,995個位元組）。
異染性白質失養症（MLD）為具有較高的未滿足之醫學需求之致死性溶酶體貯積病。此神經退化性疾病以三種形式（嬰兒晚期、青少年及成年人）存在且係由於溶酶體酶芳基硫酸酯酶-A（ARSA）不足引起。ARSA位於稱為溶酶體之細胞結構中，其在溶酶體中有助於分解髓硫脂。此酶之不足可引起腦部、脊髓及周邊器官中髓硫脂之大量積聚，引起髓鞘之嚴重損傷，髓鞘為神經纖維之主要保護層。髓鞘產生細胞中之髓硫脂積聚引起整個神經系統（包括腦部、脊髓以及連接腦部及脊髓與肌肉及偵測感覺（諸如觸覺、疼痛、熱及聲音）之感覺細胞之神經）中之白質之進行性損壞。因此，MLD之特徵在於中樞神經系統且接著周邊神經系統之進行性軸突髓鞘脫失。此引起獲得性功能及/或技能之喪失、低張症、共濟失調、癲癇、失明、聽力喪失及過早地死亡。
在患有異染性白質失養症之人中，白質損傷引起心智功能及運動技能（諸如行走能力）之進行性退化。受影響之個體亦出現四肢感覺喪失、失禁、癲癇、麻痹、無法說話、失明及聽力喪失。最終，此類個體喪失對其周圍環境之感知且變得無反應。儘管神經問題為異染性白質失養症之主要特徵，但已報導髓硫脂積聚對其他器官及組織之影響，最通常涉及膽囊。
可藉由若干種治療來管理MLD。舉例而言，用於減少MLD之病徵及症狀以及緩解相關疼痛之藥物。已證實造血幹細胞移植可藉由引入健康細胞以幫助置換患病細胞來延緩MLD之進程。其他治療包括用於促進肌肉及關節靈活性以及保持活動範圍之物理、職業及言語療法。然而，尚未能治癒MLD。
大部分患有MLD之個體具有芳基硫酸酯酶A（ARSA）基因之突變，且已鑑別超過110種引起MLD之不同的ARSA突變。每100人中便發現1人具有攜帶者突變，且在美國每40,000名活新生兒中便有1名或在全世界每160,000名活新生兒中便有1名受影響。
基因療法提供治癒MLD之獨特機會。反轉錄病毒載體（包括慢病毒載體）能夠將核酸整合至宿主細胞基因組中，由於其對基因組之非靶向插入而產生安全性問題。舉例而言，存在載體破壞腫瘤抑制基因或活化致癌基因，從而引起惡性疾病之風險。實情為，在藉由用γ反轉錄病毒載體轉導CD34+
骨髓前驅體來進行之用於治療X性聯嚴重複合免疫缺乏症(SCID)之臨床試驗中，十名患者中之四名產生白血病（Hacein-Bey-Abina等人, 《臨床研究雜誌（J Clin Invest.）》 (2008) 118(9):3132-42）。另一方面，非整合載體通常在活體內經歷表現量不足或表現持續時間不足。
因此，本領域中需要經改良之基因療法組成物及方法，其可有效及安全地恢復MLD患者中之ARSA基因功能。
本文中提供可恢復細胞中之ARSA基因功能之腺相關病毒（AAV）組成物，及使用其治療與ARSA基因功能降低相關之疾病（例如MLD）之方法。亦提供用於製備腺相關病毒組成物之封裝系統。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種用於在細胞中表現芳基硫酸酯酶A（ARSA）多肽之方法，該方法包含用重組腺相關病毒（rAAV）轉導細胞，該重組腺相關病毒包含：（a）AAV衣殼，其包含AAV衣殼蛋白質（例如分枝系F (Clade F)衣殼蛋白質）；及（b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。
在某些具體實施例中，細胞為神經元及/或神經膠細胞。在某些具體實施例中，細胞為中樞神經系統及/或周邊神經系統之神經元及/或神經膠細胞。在某些具體實施例中，細胞為選自由以下組成之群組的中樞神經系統區域之細胞：脊髓、運動皮質、感覺皮質、海馬區、殼核、小腦（視情況，小腦核）及其任何組合。在某些具體實施例中，細胞為選自由以下組成之群組之細胞：運動神經元、星形膠質細胞、寡樹突神經膠細胞、中樞神經系統中之大腦皮質之細胞、周邊神經系統之感覺神經元、許旺細胞（Schwann cell）及其任何組合。在某些具體實施例中，細胞在哺乳動物個體中且以可有效轉導個體中之細胞之量向個體投與AAV。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療患有異染性白質失養症（MLD）之個體之方法，該方法包含向個體投與有效量之rAAV，其包含：（a）AAV衣殼，其包含AAV衣殼蛋白質（例如分枝系F衣殼蛋白質）；及（b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。
在某些具體實施例中，以緘默方式改變之ARSA編碼序列編碼SEQ ID NO:23中所示之胺基酸序列。在某些具體實施例中，以緘默方式改變之ARSA編碼序列包含SEQ ID NO: 14、62或72中所示之核苷酸序列。
在某些具體實施例中，轉錄調節元件包含選自由以下組成之群組的元件中之一或多者：細胞巨大病毒（CMV）強化子元件、雞β-肌動蛋白（CBA）啟動子、小型雞β-肌動蛋白（SmCBA）啟動子、鈣調蛋白1（CALM1）啟動子、蛋白脂質蛋白質1（PLP1）啟動子、膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）啟動子、突觸蛋白2（SYN2）啟動子、金屬硫蛋白3（MT3）啟動子及其任何組合。在某些具體實施例中，轉錄調節元件包含與選自由以下組成之群組的序列至少90%一致之核苷酸序列：SEQ ID NO: 25、32、36、54、55及58。在某些具體實施例中，轉錄調節元件包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：SEQ ID NO: 25、32、36、54、55及58。在某些具體實施例中，轉錄調節元件自5'至3'包含SEQ ID NO: 58、25及32中所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，轉錄調節元件包含SEQ ID NO: 36中所示之核苷酸序列。
在某些具體實施例中，轉移基因組進一步包含位於以緘默方式改變之ARSA編碼序列3'之聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，聚腺苷酸化序列為外源聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，外源聚腺苷酸化序列為SV40聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，SV40聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 42中所示之核苷酸序列。
在某些具體實施例中，轉移基因組進一步包含填充序列。在某些具體實施例中，轉移基因組進一步包含位於以緘默方式改變之ARSA編碼序列3'之填充序列。在某些具體實施例中，填充序列位於聚腺苷酸化序列的3'。
在某些具體實施例中，轉移基因組包含選自由以下組成之群組之序列：SEQ ID NO: 41、44、46、65、67及75。
在某些具體實施例中，轉移基因組進一步包含基因組的5'之5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列及基因組的3'之3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。在某些具體實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少95%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少95%序列一致性。在某些具體實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 26具有至少95%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 27具有至少95%序列一致性。在某些具體實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少95%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性。
在某些具體實施例中，轉移基因組包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：SEQ ID NO: 47、48、49、68、69及76。
在某些具體實施例中，異染性白質失養症與芳基硫酸酯酶A（ARSA）基因突變相關。在某些具體實施例中，個體為人類個體。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
在某些具體實施例中，（a）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G；（b）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；（c）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；（d）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或（e）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160之胺基酸為D；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
在某些具體實施例中，（a）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G；（b）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；（c）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；（d）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或（e）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2之胺基酸為T；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸68之胺基酸為V；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119之胺基酸為L；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160之胺基酸為D；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
在某些具體實施例中，（a）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2之胺基酸為T，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；（b）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65之胺基酸為I，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為Y；（c）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸77之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；（d）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119之胺基酸為L，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；（e）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G；（f）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；（g）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；（h）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或（i）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供rAAV，其包含：（a）AAV衣殼，其包含AAV衣殼蛋白質（例如分枝系F衣殼蛋白質）；及（b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。
在某些具體實施例中，以緘默方式改變之ARSA編碼序列編碼SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列。在某些具體實施例中，以緘默方式改變之ARSA編碼序列包含SEQ ID NO: 14中所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，以緘默方式改變之ARSA編碼序列包含SEQ ID NO: 62或72中所示之核苷酸序列。
在某些具體實施例中，轉錄調節元件包含選自由以下組成之群組的元件中之一或多者：細胞巨大病毒（CMV）強化子元件、雞β-肌動蛋白（CBA）啟動子、小型雞β-肌動蛋白（SmCBA）啟動子、鈣調蛋白1（CALM1）啟動子、蛋白脂質蛋白質1（PLP1）啟動子、膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）啟動子、突觸蛋白2（SYN2）啟動子、金屬硫蛋白3（MT3）啟動子及其任何組合。在某些具體實施例中，轉錄調節元件包含與選自由以下組成之群組的序列至少90%一致之核苷酸序列：SEQ ID NO: 25、32、36、54、55及58。在某些具體實施例中，轉錄調節元件包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：SEQ ID NO: 25、32、36、54、55及58。在某些具體實施例中，轉錄調節元件自5'至3'包含SEQ ID NO: 58、25及32中所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，轉錄調節元件包含SEQ ID NO: 36中所示之核苷酸序列。
在某些具體實施例中，轉移基因組進一步包含位於以緘默方式改變之ARSA編碼序列3'之聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，聚腺苷酸化序列為外源聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，外源聚腺苷酸化序列為SV40聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，SV40聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 42中所示之核苷酸序列。
在某些具體實施例中，轉移基因組包含選自由以下組成之群組之序列：SEQ ID NO: 41、44、46、65、67及75。
在某些具體實施例中，轉移基因組進一步包含基因組的5'之5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列及基因組的3'之3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。在某些具體實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少95%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少95%序列一致性。
在某些具體實施例中，轉移基因組包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：SEQ ID NO: 47、48、49、68、69及76。在某些具體實施例中，轉移基因組之核苷酸序列由選自由以下組成之群組之核苷酸序列組成：SEQ ID NO: 47、48、49、68、69及76。在某些具體實施例中，轉移基因組之核苷酸序列由SEQ ID NO: 48中所示之核苷酸序列組成。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
在某些具體實施例中，（a）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G；（b）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；（c）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；（d）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或（e）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160之胺基酸為D；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
在某些具體實施例中，（a）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G；（b）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；（c）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；（d）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或（e）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2之胺基酸為T；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸68之胺基酸為V；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119之胺基酸為L；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160之胺基酸為D；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
在某些具體實施例中，（a）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2之胺基酸為T，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；（b）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65之胺基酸為I，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為Y；（c）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；（d）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119之胺基酸為L，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；（e）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G；（f）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；（g）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；（h）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或（i）衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本文中所描述之rAAV。
在另一態樣中，本發明提供一種聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 14、62及72中所示之核酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種用於製備rAAV之封裝系統，其中該封裝系統包含（a）第一核苷酸序列，其編碼一或多種AAV Rep蛋白質；（b）第二核苷酸序列，其編碼如技術方案41至71中任一項之AAV之衣殼蛋白質；及（c）第三核苷酸序列，其包含如技術方案41至71中任一項之AAV之rAAV基因組序列。
在某些具體實施例中，封裝系統包含有包含第一核苷酸序列及第二核苷酸序列之第一載體，及包含第三核苷酸序列之第二載體。
在某些具體實施例中，封裝系統進一步包含有包含一或多種輔助病毒基因之第四核苷酸序列。在某些具體實施例中，第四核苷酸序列包含於第三載體內。在某些具體實施例中，第四核苷酸序列包含一或多種來自選自由以下組成之群組的病毒之基因：腺病毒、疱疹病毒、痘瘡病毒及細胞巨大病毒（CMV）。
在某些具體實施例中，第一載體、第二載體及/或第三載體為質體。
在另一態樣中，本發明提供一種用於rAAV之重組製備之方法，該方法包含在可產生rAAV之條件下將本文中所描述之封裝系統引入細胞中。
在另一態樣中，本發明提供本文中所描述之rAAV，其係用於如本文中所描述之用於在細胞中表現芳基硫酸酯酶A（ARSA）多肽之方法中。
在另一態樣中，本發明提供本文中所描述之rAAV，其係用於如本文中所描述之用於治療患有異染性白質失養症（MLD）之個體之方法中。
本文中提供可恢復細胞中之ARSA基因功能之腺相關病毒（AAV）組成物，及使用其治療與ARSA基因功能降低相關之疾病（例如MLD）之方法。亦提供用於製備腺相關病毒組成物之封裝系統。I. 定義
如本文中所使用，術語「複製缺陷型腺相關病毒」係指包含缺乏Rep及Cap基因之基因組之AAV。
如本文中所使用，術語「ARSA基因」係指芳基硫酸酯酶A基因。由國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information；NCBI）基因ID 410鑑別人類ARSA基因。ARSA mRNA之例示性核苷酸序列提供為SEQ ID NO: 14。ARSA多肽之例示性胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 23。
如本文中所使用，術語「轉移基因組」係指包含可操作地連接至外源轉錄調節元件之編碼序列之重組AAV基因組，該外源轉錄調節元件在轉移基因組被引入細胞中時介導編碼序列之表現。在某些具體實施例中，轉移基因組未整合在細胞之染色體DNA中。本領域中熟習此項技術者將瞭解，轉移基因組中之包含可操作地連接至ARSA編碼序列之轉錄調節元件之部分相對於ARSA編碼序列之轉錄方向可為有義或反義定向。
如本文中所使用，術語「分枝系F衣殼蛋白質」係指AAV VP1、VP2或VP3衣殼蛋白質，其分別與本文中之SEQ ID NO: 1之胺基酸1-736、138-736及203-736中示之VP1、VP2或VP3胺基酸序列具有至少90%一致性。
如本文中所使用，兩個核苷酸序列之間或兩個胺基酸序列之間的「一致性百分比」係藉由將所比對之序列對之間的匹配數目乘以100且除以所比對之區域之長度（包括內部間隙(gaps)）來計算。一致性評分僅對完美匹配進行計數，且不考慮胺基酸彼此之間的相似性程度。長度中僅包括內部間隙，而不包括序列末端處之間隙。
如本文中所使用，術語「與ARSA基因突變相關之疾病或病症」係指由ARSA基因之突變引起、由ARSA基因之突變加劇或在遺傳學上與ARSA基因之突變相關之任何疾病或病症。在某些具體實施例中，與ARSA基因突變相關之疾病或病症為異染性白質失養症（MLD）。
如本文中所使用，術語「編碼序列」係指互補DNA（cDNA）中之編碼多肽之部分，在起始密碼子處開始且在終止密碼子處終止。基因可由於替代性剪接、替代性轉譯起始及群體內之變化而具有一或多個編碼序列。編碼序列可為野生型或密碼子改變型。例示性野生型ARSA編碼序列示於SEQ ID NO: 24中。
如本文中所使用，術語「以緘默方式改變」係指在不改變由編碼序列或經填充子插入之編碼序列編碼之多肽之胺基酸序列之情況下，基因之編碼序列或經填充子插入之編碼序列之變化（例如藉由核苷酸取代）。此類緘默變化之有利之處在於，其可提高編碼序列之轉譯效率，及/或在編碼序列轉導至細胞中時防止與內源基因之相應序列之重組。
在本發明中，相對於起始密碼子之第一核苷酸指定ARSA基因中之核苷酸位置。起始密碼子之第一核苷酸為位置1；位於起始密碼子之第一核苷酸5'之核苷酸具有負數；位於起始密碼子之第一核苷酸3'之核苷酸具有正數。人類ARSA基因之例示性核苷酸1為NCBI參考序列之核苷酸374：NG_009260.2（區域：5028-10426），且人類ARSA基因之例示性核苷酸3為NCBI參考序列之核苷酸376：NG_009260.2（區域：5028-10426）。與起始密碼子之5'相鄰之核苷酸為核苷酸-1。
在本發明中，相對於涵蓋起始密碼子之第一核苷酸之外顯子指定ARSA基因中之外顯子及內含子，該第一核苷酸為NCBI參考序列之核苷酸374：NG_009260.2（區域：5028-10426）。涵蓋起始密碼子之第一核苷酸之外顯子為外顯子1。外顯子3'至外顯子1為5'至3'：外顯子2、外顯子3等。內含子3'至外顯子1為5'至3'：內含子1、內含子2等。因此，ARSA基因自5'至3'包含：外顯子1、內含子1、外顯子2、內含子2、外顯子3等。人類ARSA基因之例示性外顯子1為NCBI參考序列之核苷酸374-597：NG_009260.2（區域：5028-10426）。人類ARSA基因之例示性內含子1為NCBI參考序列之核苷酸598-746：NG_009260.2（區域：5028-10426）。
如本文中所使用，術語「轉錄調節元件」或「TRE」係指順式作用核苷酸序列，例如DNA序列，其藉由RNA聚合酶調節（例如控制、增加或減少）可操作地連接之核苷酸序列之轉錄以形成RNA分子。TRE依靠一或多種反式作用分子（諸如轉錄因子）來調節轉錄。因此，一個TRE在其與不同的反式作用分子接觸時（例如當其位於不同類型的細胞中時）可以不同方式調節轉錄。TRE可包含一或多種啟動子元件及/或強化子元件。本領域中熟習此項技術者將瞭解，基因中之啟動子及強化子元件可在位置上靠近，且術語「啟動子」可指包含啟動子元件及強化子元件之序列。因此，術語「啟動子」不排除序列中之強化子元件。啟動子及強化子元件無需來源於相同基因或物種，且每個啟動子或強化子元件之序列可與基因組中之相應內源序列一致或實質上一致。
如本文中所使用，術語「可操作地連接」用於描述TRE與待轉錄之編碼序列之間的連接。通常，使基因表現處於包含一或多種啟動子及/或強化子元件之TRE之控制下。若編碼序列之轉錄由TRE控制或影響，則編碼序列「可操作地連接」至TRE。TRE之啟動子及強化子元件可自編碼序列呈任何定向及/或距離，只要獲得所需轉錄活性即可。在某些具體實施例中，TRE位於編碼序列之上游。
如本文中所使用，術語「核糖體跳躍元件(ribosomal skipping element)」係指編碼短肽序列之核苷酸序列，其能夠造成由一個mRNA分子之轉譯產生兩個肽鏈。在某些具體實施例中，核糖體跳躍元件編碼包含X1
X2
EX3
NPGP之共有基元(motif)之肽，其中X1
為D或G，X2
為V或I，且X3
為任何胺基酸（SEQ ID NO:34）。在某些具體實施例中，核糖體跳躍元件編碼明脈扁刺蛾（Thosea asigna）病毒2A肽（T2A）、豬捷申病毒（porcine teschovirus）-1 2A肽（P2A）、口蹄疫病毒2A肽（F2A）、馬鼻炎A病毒2A肽（E2A）、細胞質多角體病毒2A肽（BmCPV 2A）或家蠶（B. mori
）2A肽之軟化病病毒（BmIFV 2A）。T2A肽及P2A肽之例示性胺基酸序列分別示於SEQ ID NO:37及38中。T2A元件及P2A元件之例示性核苷酸序列分別示於SEQ ID NO:66及63中。在某些具體實施例中，核糖體跳躍元件編碼在N端進一步包含Gly-Ser-Gly之序列之肽，視情況其中Gly-Ser-Gly之序列由GGCAGCGGA之核苷酸序列編碼。儘管不希望受理論約束，但假設核糖體跳躍元件藉由以下發揮功能：終止第一肽鏈之轉譯及再起始第二肽鏈之轉譯；或由核糖體跳躍元件編碼之肽序列中之肽鍵藉由經編碼之肽之內源蛋白酶活性進行之裂解，或環境（例如胞溶質）中之另一種蛋白酶。
如本文中所使用，術語「核糖體跳躍肽」係指由核糖體跳躍元件編碼之肽。
如本文中所使用，術語「聚腺苷酸化序列」係指在轉錄至RNA中時組成聚腺苷酸化信號序列之DNA序列。聚腺苷酸化序列可為原生的（例如來自ARSA基因）或外源的。外源聚腺苷酸化序列可為哺乳動物或病毒聚腺苷酸化序列（例如SV40聚腺苷酸化序列）。
如本文中所使用，「外源聚腺苷酸化序列」係指與ARSA基因（例如人類ARSA基因）之內源聚腺苷酸化序列不一致或實質上一致之聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，外源聚腺苷酸化序列為相同物種（例如人類）中之非ARSA基因之聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，外源聚腺苷酸化序列為不同物種（例如病毒）之聚腺苷酸化序列。
如本文中所使用，在向個體投與AAV之情形下，術語「有效量」係指實現所需預防或治療作用之AAV之量。II. 腺相關病毒組成物
在一個態樣中，本文中提供新穎重組AAV（例如複製缺陷型AAV）組成物，其適用於在具有降低的或以其他方式缺乏ARSA基因功能之細胞中表現ARSA多肽。在某些具體實施例中，本文中所揭示之rAAV包含：AAV衣殼，其包含衣殼蛋白質（例如分枝系F衣殼蛋白質）；及轉移基因組，其包含可操作地連接至ARSA編碼序列（例如以緘默方式改變之ARSA編碼序列）之轉錄調節元件，從而實現經AAV轉導之細胞中的ARSA之染色體外表現。
來自本領域中已知的任何衣殼之衣殼蛋白質可用於本文中所揭示之rAAV組成物中，包括（但不限於）來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型之衣殼蛋白質。舉例而言，在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，其中：衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸206之胺基酸為C；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296之胺基酸為H；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸312之胺基酸為Q；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346之胺基酸為A；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464之胺基酸為N；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸468之胺基酸為S；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸590之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681之胺基酸為M；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸690之胺基酸為K；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706之胺基酸為C；或衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718之胺基酸為G。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626之胺基酸為G，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718之胺基酸為G。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296之胺基酸為H，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464之胺基酸為N，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681之胺基酸為M。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687之胺基酸為R。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346之胺基酸為A，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501之胺基酸為I，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706之胺基酸為C。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含SEQ ID NO:2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列。
舉例而言，在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，其中：衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸151之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸160之胺基酸為D；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸206之胺基酸為C；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296之胺基酸為H；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸312之胺基酸為Q；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346之胺基酸為A；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464之胺基酸為N；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸468之胺基酸為S；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸590之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681之胺基酸為M；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸690之胺基酸為K；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706之胺基酸為C；或衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718之胺基酸為G。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626之胺基酸為G，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718之胺基酸為G。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296之胺基酸為H，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464之胺基酸為N，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681之胺基酸為M。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687之胺基酸為R。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346之胺基酸為A，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501之胺基酸為I，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706之胺基酸為C。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列。
舉例而言，在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，其中：衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸2之胺基酸為T；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸65之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸68之胺基酸為V；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸77之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸119之胺基酸為L；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸151之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸160之胺基酸為D；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸206之胺基酸為C；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296之胺基酸為H；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸312之胺基酸為Q；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346之胺基酸為A；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464之胺基酸為N；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸468之胺基酸為S；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501之胺基酸為I；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸590之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681之胺基酸為M；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687之胺基酸為R；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸690之胺基酸為K；衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706之胺基酸為C；或衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718之胺基酸為G。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸2之胺基酸為T，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸312之胺基酸為Q。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸65之胺基酸為I，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626之胺基酸為Y。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸77之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸690之胺基酸為K。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸119之胺基酸為L，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸468之胺基酸為S。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸626之胺基酸為G，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸718之胺基酸為G。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296之胺基酸為H，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸464之胺基酸為N，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸681之胺基酸為M。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸687之胺基酸為R。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸346之胺基酸為A，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501之胺基酸為I，衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸505之胺基酸為R，且衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸706之胺基酸為C。在某些具體實施例中，衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列。
在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之兩者或更多者：（a）包含SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含：（a）具有由SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）具有由SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）具有由SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質。
在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含與SEQ ID NO:8之胺基酸序列203-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含與SEQ ID NO:8之胺基酸序列138-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含與SEQ ID NO:8之胺基酸序列1-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含SEQ ID NO:8之胺基酸203-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含SEQ ID NO:8之胺基酸138-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含SEQ ID NO:8之胺基酸1-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之兩者或更多者：（a）包含SEQ ID NO:8之胺基酸203-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含SEQ ID NO:8之胺基酸138-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含SEQ ID NO:8之胺基酸1-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含：（a）具有由SEQ ID NO:8之胺基酸203-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）具有由SEQ ID NO:8之胺基酸138-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）具有由SEQ ID NO:8之胺基酸1-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質。
在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含與SEQ ID NO:11之胺基酸序列203-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含與SEQ ID NO:11之胺基酸序列138-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含與SEQ ID NO:11之胺基酸序列1-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含SEQ ID NO:11之胺基酸203-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含SEQ ID NO:11之胺基酸138-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含SEQ ID NO:11之胺基酸1-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之兩者或更多者：（a）包含SEQ ID NO:11之胺基酸203-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含SEQ ID NO:11之胺基酸138-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含SEQ ID NO:11之胺基酸1-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含：（a）具有由SEQ ID NO:11之胺基酸203-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）具有由SEQ ID NO:11之胺基酸138-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）具有由SEQ ID NO:11之胺基酸1-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質。
在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含與SEQ ID NO:13之胺基酸序列203-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含與SEQ ID NO:13之胺基酸序列138-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含與SEQ ID NO:13之胺基酸序列1-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含SEQ ID NO:13之胺基酸203-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含SEQ ID NO:13之胺基酸138-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含SEQ ID NO:13之胺基酸1-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之兩者或更多者：（a）包含SEQ ID NO:13之胺基酸203-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含SEQ ID NO:13之胺基酸138-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含SEQ ID NO:13之胺基酸1-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含：（a）具有由SEQ ID NO:13之胺基酸203-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）具有由SEQ ID NO:13之胺基酸138-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）具有由SEQ ID NO:13之胺基酸1-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質。
在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含與SEQ ID NO:16之胺基酸序列203-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含與SEQ ID NO:16之胺基酸序列138-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含與SEQ ID NO:16之胺基酸序列1-736具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含SEQ ID NO:16之胺基酸203-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含SEQ ID NO:16之胺基酸138-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含SEQ ID NO:16之胺基酸1-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含以下中之兩者或更多者：（a）包含SEQ ID NO:16之胺基酸203-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）包含SEQ ID NO:16之胺基酸138-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）包含SEQ ID NO:16之胺基酸1-736之胺基酸序列之衣殼蛋白質。在某些具體實施例中，AAV衣殼包含：（a）具有由SEQ ID NO:16之胺基酸203-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質；（b）具有由SEQ ID NO:16之胺基酸138-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質；及（c）具有由SEQ ID NO:16之胺基酸1-736組成之胺基酸序列之衣殼蛋白質。
適用於本文中所揭示之AAV組成物中之轉移基因組通常包含可操作地連接至ARSA編碼序列之轉錄調節元件（TRE）。在某些具體實施例中，轉移基因組包含TRE及ARSA編碼序列的5'之5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列，及TRE及ARSA編碼序列的3'之3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。
在某些具體實施例中，ARSA編碼序列包含ARSA基因之全部或實質上全部編碼序列。在某些具體實施例中，轉移基因組包含編碼SEQ ID NO:23之核苷酸序列且可視情況進一步包含位於ARSA編碼序列3'之外源聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，編碼SEQ ID NO:23之核苷酸序列為野生型的（例如具有SEQ ID NO:24中所示之序列）。在某些具體實施例中，編碼SEQ ID NO:23之核苷酸序列係以緘默方式改變（例如具有SEQ ID NO:14、62或72中所示之序列）。
在某些具體實施例中，ARSA編碼序列編碼包含ARSA蛋白質之全部或實質上全部胺基酸序列之多肽。在某些具體實施例中，ARSA編碼序列編碼野生型ARSA蛋白質（例如人類ARSA蛋白質）之胺基酸序列。在某些具體實施例中，ARSA編碼序列編碼突變型ARSA蛋白質（例如人類ARSA蛋白質）之胺基酸序列，其中突變型ARSA多肽為野生型ARSA多肽之功能等效物，亦即，可充當野生型ARSA多肽。在某些具體實施例中，功能上等效的ARSA多肽進一步包含至少一種未在野生型ARSA多肽中發現之特徵，例如抵抗蛋白質降解之能力。
在某些具體實施例中，適用於本文中所揭示之AAV組成物中之轉移基因組通常包含轉錄調節元件（TRE），其可操作地連接至編碼ARSA及/或SUMF1之編碼序列。硫酸酯酶修飾因子1（SUMF1）基因編碼一種酶，該酶藉由使受質硫酸酯酶中之半胱胺酸殘基氧化成活性位點3-側氧基丙胺酸殘基（其亦稱為C-α-甲醯基甘胺酸）來催化硫酸酯之水解。與SUMF1相關之疾病包括多種硫酸酯酶不足及異染性白質失養症。
在某些具體實施例中，SUMF1編碼序列包含SUMF1基因之全部或實質上全部編碼序列。在某些具體實施例中，轉移基因組包含編碼SEQ ID NO:29之核苷酸序列且可視情況進一步包含位於SUMF1編碼序列3'之外源聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，編碼SEQ ID NO:29之核苷酸序列為野生型（例如具有SEQ ID NO:64中所示之序列）。在某些具體實施例中，編碼SEQ ID NO:29之核苷酸序列係以緘默方式改變。
在某些具體實施例中，SUMF1編碼序列編碼包含SUMF1蛋白質之全部或實質上全部胺基酸序列之多肽。在某些具體實施例中，SUMF1編碼序列編碼野生型SUMF1蛋白質（例如人類SUMF1蛋白質（hSUMF1））之胺基酸序列。在某些具體實施例中，SUMF1編碼序列編碼突變型SUMF1蛋白質（例如人類SUMF1蛋白質）之胺基酸序列，其中突變型SUMF1多肽為野生型SUMF1多肽之功能等效物，亦即，可充當野生型SUMF1多肽。在某些具體實施例中，功能上等效的SUMF1多肽進一步包含至少一種未在野生型SUMF1多肽中發現之特徵，例如抵抗蛋白質降解之能力。
在某些具體實施例中，轉移基因組經設計以表現hARSA及hSUMF1且包含核苷酸序列，該核苷酸序列包含編碼hARSA之第一編碼序列及編碼hSUMF1之第二編碼序列。在某些具體實施例中，編碼hARSA之第一編碼序列及編碼hSUMF1之第二編碼序列係由核糖體跳躍元件分離。可使用本領域中已知的任何核糖體跳躍元件，例如本文中其他地方描述之核糖體跳躍元件。在某些具體實施例中，包含編碼hARSA之第一編碼序列及編碼hSUMF1之第二編碼序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO:30中所示之核苷酸序列。
在某些具體實施例中，適用於本文中所揭示之AAV組成物中之轉移基因組通常包含轉錄調節元件（TRE），其可操作地連接至編碼ARSA及/或SapB之編碼序列。鞘脂激活蛋白原（PSAP）基因編碼高保守性前原蛋白(preproprotein)，該前原蛋白經蛋白水解處理以產生四種主要裂解產物，包括鞘脂激活蛋白A、B、C及D。前驅蛋白質之每個結構域之長度為約80個胺基酸殘基，且具有幾乎相同的半胱胺酸殘基及糖基化位點之佈置。鞘脂激活蛋白A-D主要位於溶酶體隔室，其在溶酶體隔室中促進具有短寡醣基團之鞘醣脂之分解代謝。前驅蛋白質以分泌蛋白質及整合膜蛋白質兩者之形式存在且具有神經營養活性。此基因中之突變與高歇氏病（Gaucher disease）及異染性白質失養症相關。已證實鞘脂激活蛋白B（SapB）可刺激半乳糖-腦甘脂硫酸酯由ARSA進行之水解、GM1神經節苷脂由β-半乳糖苷酶進行之水解及球形三醯神經醯胺由α-半乳糖A進行之水解。已證實SapB與鞘脂水解酶之受質形成溶解複合物。
在某些具體實施例中，SapB編碼序列包含SapB基因之全部或實質上全部編碼序列。在某些具體實施例中，轉移基因組包含編碼SEQ ID NO:33之核苷酸序列且可視情況進一步包含位於SapB編碼序列3'之外源聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，編碼SEQ ID NO:33之核苷酸序列為野生型（例如具有SEQ ID NO:73中所示之序列）。在某些具體實施例中，編碼SEQ ID NO:33之核苷酸序列係以緘默方式改變。
在某些具體實施例中，SapB編碼序列編碼包含SapB蛋白質之全部或實質上全部胺基酸序列之多肽。在某些具體實施例中，SapB編碼序列編碼野生型SapB蛋白質（例如人類SapB蛋白質（hSapB））之胺基酸序列。在某些具體實施例中，SapB編碼序列編碼突變型SapB蛋白質（例如人類SapB蛋白質）之胺基酸序列，其中突變型SapB多肽為野生型SapB多肽之功能等效物，亦即，可充當野生型SapB多肽。在某些具體實施例中，功能上等效的SapB多肽進一步包含至少一種未在野生型SapB多肽中發現之特徵，例如抵抗蛋白質降解之能力。
在某些具體實施例中，轉移基因組經設計以表現hARSA及hSapB且包含核苷酸序列，該核苷酸序列包含編碼hARSA之第一編碼序列及編碼hSapB之第二編碼序列。在某些具體實施例中，編碼hARSA之第一編碼序列及編碼hSapB之第二編碼序列係由核糖體跳躍元件分離。可使用本領域中已知的任何核糖體跳躍元件，例如本文中其他地方描述之核糖體跳躍元件。在某些具體實施例中，包含編碼hARSA之第一編碼序列及編碼hSapB之第二編碼序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO:74中所示之核苷酸序列。
轉移基因組可用於表現任何哺乳動物細胞（例如人類細胞）中之ARSA、SUMF1及/或SapB。因此，TRE可在任何哺乳動物細胞（例如人類細胞）中具有活性。在某些具體實施例中，TRE在廣泛的人類細胞中具有活性。此類TRE可包含組成性啟動子及/或強化子元件，包括細胞巨大病毒（CMV）啟動子/強化子（例如包含與SEQ ID NO:58至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、SV40啟動子、雞β肌動蛋白（CBA）啟動子（例如包含與SEQ ID NO:59或25至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、smCBA啟動子（例如包含與SEQ ID NO:55至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、人類延長因子1α（EF1α）啟動子（例如包含與SEQ ID NO:40至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、包含轉錄因子結合位點之小鼠微小病毒（MVM）內含子（例如包含與SEQ ID NO:35至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、人類磷酸甘油酸激酶（PGK1）啟動子、人類泛蛋白C（Ubc）啟動子、人類β肌動蛋白啟動子、人類神經元特異性烯醇酶（ENO2）啟動子、人類β-葡糖苷酸酶（GUSB）啟動子、兔β-球蛋白元件（例如包含與SEQ ID NO:60至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、人類鈣調蛋白1（CALM1）啟動子（例如包含與SEQ ID NO:54至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）及/或人類甲基-CpG結合蛋白質2（MeCP2）啟動子。此等TRE中之任一者可以任何順序組合以驅動有效轉錄。舉例而言，轉移基因組可包含CMV強化子、CBA啟動子及來自兔β-球蛋白基因之外顯子3之剪接受體，統稱為CAG啟動子（例如包含與SEQ ID NO:28至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）。舉例而言，轉移基因組可包含CMV強化子及CBA啟動子之雜交物，接著為剪接供體及剪接受體，統稱為CASI啟動子區域（例如包含與SEQ ID NO:63至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）。
或者，TRE可為組織特異性TRE，亦即，其在特定組織及/或器官中具有活性。組織特異性TRE包含一或多種組織特異性啟動子及/或強化子元件，及視情況選用之一或多種組成性啟動子及/或強化子元件。本領域中熟習此項技術者將理解，可藉由本領域中熟知之方法自組織中特異性表現之基因分離組織特異性啟動子及/或強化子元件。
在某些具體實施例中，TRE為腦部特異性（例如神經元特異性、神經膠細胞特異性、星形膠質細胞特異性、寡樹突神經膠細胞特異性、微神經膠質細胞特異性及/或中樞神經系統特異性）。例示性腦部特異性TRE可包含一或多個來自（但不限於）人類膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）啟動子、人類突觸蛋白1（SYN1）啟動子、人類突觸蛋白2（SYN2）啟動子、人類金屬硫蛋白3（MT3）啟動子及/或人類蛋白脂質蛋白質1（PLP1）啟動子之元件。更多的腦部特異性啟動子元件揭示於WO 2016/100575A1中，其以全文引用之方式併入本文中。
在某些具體實施例中，轉移基因組包含兩個或更多個TRE，視情況包含以上揭示之TRE中之至少一者。本領域中熟習此項技術者將理解，此等TRE中之任一者可以任何順序組合，且組成性TRE及組織特異性TRE之組合可驅動有效及組織特異性轉錄。
在某些具體實施例中，轉移載體進一步包含非編碼填充序列（例如包含與SEQ ID NO:39至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）。非編碼填充序列可用於將載體之尺寸保持在適合的限制內以用於有效DNA封裝，且因此可用於提高DNA封裝之功效。本領域中熟習此項技術者將認識到，填充序列之性質可對載體之功能具有影響，且因此將選擇最適合的填充序列來使用。
在某些具體實施例中，轉移載體進一步包含相對於ARSA編碼序列位於5'或插入ARSA編碼序列中之內含子。此類內含子可增加轉基因表現，例如藉由減少轉錄沉默及增強自細胞核至細胞質之mRNA輸出。在某些具體實施例中，轉移基因組自5'至3'包含：非編碼外顯子、內含子及ARSA編碼序列。在某些具體實施例中，將內含子序列插入ARSA編碼序列中，視情況其中在連接兩個原生外顯子之核苷酸間鍵處插入內含子。在某些具體實施例中，在連接原生外顯子1與外顯子2之核苷酸間鍵處插入內含子。
內含子可包含ARSA基因之原生內含子序列、來自不同物種之內含子序列或來自相同物種之不同基因及/或合成內含子序列。本領域中熟悉此項技術者將瞭解，合成內含子序列可經設計以藉由引入本領域中已知的任何共有剪接基元來介導RNA剪接（例如Sibley等人, (2016) 《自然綜述遺傳學（Nature Reviews Genetics）》, 17, 407-21，其以全文引用之方式併入本文中）。例示性內含子序列提供於Lu等人 (2013) 《分子療法（Molecular Therapy）》 21(5): 954-63及Lu等人 (2017) 《人類基因療法（Hum. Gene Ther.）》 28(1): 125-34中，其以全文引用之方式併入本文中。在某些具體實施例中，轉移基因組包含SV40內含子（例如包含與SEQ ID NO:31至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列）或小鼠微小病毒（MVM）內含子（例如包含與SEQ ID NO:35至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列）。在某些具體實施例中，轉移基因組包含SV40內含子（例如包含SEQ ID NO:31中所示之核苷酸序列）或小鼠微小病毒（MVM）內含子（例如包含SEQ ID NO:35中所示之核苷酸序列）。在某些具體實施例中，轉移基因組包含嵌合內含子序列，其包含雞及兔序列之組合，部分包含未經轉錄之雞ACTB（cACTB）啟動子、全部cACTB外顯子1、部分cACTB內含子1、部分兔HBB2（rHBB2）內含子2及部分rHBB2外顯子3（例如SEQ ID NO:32）。在某些具體實施例中，轉移基因組包含嵌合內含子序列（例如包含與SEQ ID NO:32至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列）。在某些具體實施例中，轉移基因組包含嵌合內含子序列（例如包含SEQ ID NO:32中所示之核苷酸序列）。
在某些具體實施例中，轉移基因組包含TRE，其包含CMV強化子、CBA啟動子及嵌合內含子序列（例如包含與SEQ ID NO:36至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列）。在某些具體實施例中，轉移基因組包含有包含SEQ ID NO:36之TRE。
在某些具體實施例中，本文中所揭示之轉移基因組進一步包含轉錄終止子（例如聚腺苷酸化序列）。在某些具體實施例中，轉錄終止子位於ARSA編碼序列的3'。轉錄終止子可為任何有效終止轉錄之序列且本領域中熟習此項技術者將理解，可自任何表現於需要ARSA編碼序列之轉錄的細胞中之基因分離此類序列。在某些具體實施例中，轉錄終止子包含聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，聚腺苷酸化序列與人類ARSA基因之內源聚腺苷酸化序列一致或實質上一致。在某些具體實施例中，聚腺苷酸化序列為外源聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，聚腺苷酸化序列為SV40聚腺苷酸化序列（例如包含SEQ ID NO:31、42、43或45中所示之核苷酸序列，或與其互補之核苷酸序列）。在某些具體實施例中，聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:42中所示之序列。
在某些具體實施例中，轉移基因組自5'至3'包含：TRE、ARSA編碼序列及聚腺苷酸化序列。在某些具體實施例中，TRE與SEQ ID NO:25、32、36、54、55及/或58中之任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；ARSA編碼序列與SEQ ID NO:14、24、62或72具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；及/或聚腺苷酸化序列與SEQ ID NO:42、43及45中之任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在某些具體實施例中，TRE包含SEQ ID NO:36中所示之序列；ARSA編碼序列包含SEQ ID NO:14中所示之序列；及/或聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:42中所示之序列。在某些具體實施例中，TRE自5'至3'包含SEQ ID NO:58中所示之序列、SEQ ID NO:25中所示之序列及SEQ ID NO:32中所示之序列。
在某些具體實施例中，TRE包含SEQ ID NO:54中所示之序列；ARSA編碼序列包含SEQ ID NO:62中所示之序列；及/或聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:42中所示之序列。在某些具體實施例中，TRE包含SEQ ID NO:55中所示之序列；ARSA編碼序列包含SEQ ID NO:62中所示之序列；及/或聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:42中所示之序列。
在某些具體實施例中，TRE包含SEQ ID NO:36中所示之序列；ARSA編碼序列包含SEQ ID NO:72中所示之序列；及/或聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:42中所示之序列。在某些具體實施例中，TRE自5'至3'包含SEQ ID NO:58中所示之序列、SEQ ID NO:25中所示之序列及SEQ ID NO:32中所示之序列。
在某些具體實施例中，轉移基因組進一步包含hSUMF1編碼序列。在某些具體實施例中，轉移基因組自5'至3'包含：TRE、ARSA編碼序列、2A元件及hSUMF1編碼序列。在某些具體實施例中，TRE與SEQ ID NO:25、32、36、54、55及/或58具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；ARSA編碼序列與SEQ ID NO:62具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；2A元件與SEQ ID NO:63具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；及hSUMF1序列與SEQ ID NO:64具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些具體實施例中，進一步包含hSUMF1編碼序列之轉移基因組自5'至3'包含：包含SEQ ID NO:54或55中所示之序列之TRE、包含SEQ ID NO:62中所示之序列之hARSA編碼序列、包含SEQ ID NO:63中所示之序列之2A元件及包含SEQ ID NO:64中所示之序列之hSUMF1編碼序列。在某些具體實施例中，hARSA-2A-hSUMF1編碼序列包含SEQ ID NO:30中所示之序列。
在某些具體實施例中，轉移基因組進一步包含hSapB編碼序列。在某些具體實施例中，轉移基因組自5'至3'包含：TRE、ARSA編碼序列、2A元件及hSapB編碼序列。在某些具體實施例中，TRE與SEQ ID NO: 25、32、36、54、55及/或58具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；ARSA編碼序列與SEQ ID NO:72具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；2A元件與SEQ ID NO:63具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；及hSapB序列與SEQ ID NO:73具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些具體實施例中，進一步包含hSapB編碼序列之轉移基因組自5'至3'包含：包含SEQ ID NO:36中所示之序列之TRE、包含SEQ ID NO:72中所示之序列之hARSA編碼序列、包含SEQ ID NO:63中所示之序列之2A元件及包含SEQ ID NO:74中所示之序列之hSapB編碼序列。在某些具體實施例中，hARSA-2A-hSapB編碼序列包含SEQ ID NO:74中所示之序列。
在某些具體實施例中，轉移基因組包含與SEQ ID NO: 41、44、46、65、67或75至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。在某些具體實施例中，轉移基因組包含SEQ ID NO:41、44、46、65、67或75中所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，轉移基因組之核苷酸序列由SEQ ID NO: 41、44、46、65、67或75中所示之核苷酸序列組成。在某些具體實施例中，轉移基因組包含SEQ ID NO:44中所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，轉移基因組之核苷酸序列由SEQ ID NO:44中所示之核苷酸序列組成。
在某些具體實施例中，本文中所揭示之轉移基因組進一步包含TRE的5'之5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列，及ARSA編碼序列的3'之3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。來自任何AAV血清型或其變異體之ITR序列皆可用於本文中所揭示之轉移基因組中。5'及3' ITR可來自相同血清型之AAV或不同血清型之AAV。用於本文中所揭示之轉移基因組中之例示性ITR示於本文中之SEQ ID NO: 18-21、26及27中。
在某些具體實施例中，5' ITR或3' ITR係來自AAV2。在某些具體實施例中，5' ITR及3' ITR皆來自AAV2。在某些具體實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO:18具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性，或3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO:19具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性。在某些具體實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO:18具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO:19具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性。在某些具體實施例中，轉移基因組包含SEQ ID NO: 41、44、46、65、67或75中之任一者中所示之核苷酸序列，5' ITR核苷酸序列具有SEQ ID NO:18之序列，且3' ITR核苷酸序列具有SEQ ID NO:19之序列。
在某些具體實施例中，5' ITR或3' ITR係來自AAV5。在某些具體實施例中，5' ITR及3' ITR皆來自AAV5。在某些具體實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO:20具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性，或3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO:21具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性。在某些具體實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO:20具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO:21具有至少90%（例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）序列一致性。在某些具體實施例中，轉移基因組包含SEQ ID NO:46-50中之任一者中所示之核苷酸序列、具有SEQ ID NO:20之序列之5' ITR核苷酸序列及具有SEQ ID NO:21之序列之3' ITR核苷酸序列。
在某些具體實施例中，5' ITR核苷酸序列及3' ITR核苷酸序列彼此實質上互補（例如除在5'或3' ITR中之1、2、3、4或5個核苷酸位置處之失配以外彼此互補）。
在某些具體實施例中，5' ITR或3' ITR經修飾以減少或消除由Rep蛋白質進行之解析（「不可解析的ITR」）。在某些具體實施例中，不可解析的ITR包含末端解析位點之核苷酸序列中之插入、缺失或取代。此類修飾使得能夠在被感染之細胞中複製轉移基因組之後形成AAV之自互補、雙股DNA基因組。例示性不可解析的ITR序列為本領域中已知的（參見例如美國專利案第7,790,154號及第9,783,824號中提供之序列，其以全文引用之方式併入本文中）。在某些具體實施例中，5' ITR包含與SEQ ID NO:26至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些具體實施例中，5' ITR由與SEQ ID NO:26至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列組成。在某些具體實施例中，5' ITR由SEQ ID NO:26中所示之核苷酸序列組成。在某些具體實施例中，3' ITR包含與SEQ ID NO:27至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些具體實施例中，5' ITR由與SEQ ID NO:27至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列組成。在某些具體實施例中，3' ITR由SEQ ID NO:27中所示之核苷酸序列組成。在某些具體實施例中，5' ITR由SEQ ID NO:26中所示之核苷酸序列組成，且3' ITR由SEQ ID NO:27中所示之核苷酸序列組成。在某些具體實施例中，5' ITR由SEQ ID NO:26中所示之核苷酸序列組成，且3' ITR由SEQ ID NO:19中所示之核苷酸序列組成。
在某些具體實施例中，3' ITR由來源於野生型AAV2基因組序列之其他核苷酸序列側接。在某些具體實施例中，3' ITR由源自於與野生型AAV2 ITR相鄰之野生型AAV2序列之另一個37 bp序列側接。參見例如Savy
等人, 《人類基因療法方法（Human Gene Therapy Methods
）》(2017) 28(5): 277-289
（其以全文引用之方式併入本文中）。在某些具體實施例中，該另一個37 bp序列位於3' ITR內部。在某些具體實施例中，37 bp序列由SEQ ID NO:56中所示之序列組成。在某些具體實施例中，3' ITR包含與SEQ ID NO:57至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些具體實施例中，3' ITR包含SEQ ID NO:57中所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，3' ITR之核苷酸序列由與SEQ ID NO:57至少95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列組成。在某些具體實施例中，3' ITR之核苷酸序列由SEQ ID NO:57中所示之核苷酸序列組成。
在某些具體實施例中，轉移基因組自5'至3'包含：5' ITR；內部元件，其自5'至3'包含：TRE、視情況選用之非編碼外顯子及內含子、ARSA編碼序列及聚腺苷酸化序列，如本文中所揭示；不可解析的ITR；與內部元件互補之核苷酸序列；及3' ITR。此類轉移基因組可在感染之後及複製之前形成AAV之自互補、雙股DNA基因組。
在某些具體實施例中，轉移基因組自5'至3'包含：5' ITR、TRE、ARSA編碼序列、聚腺苷酸化序列及3' ITR。在某些具體實施例中，5' ITR與SEQ ID:18、20或26具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；TRE與SEQ ID NO:25、32、36、54、55及/或58中之任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；ARSA編碼序列與SEQ ID NO:14、24、62或72具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；聚腺苷酸化序列與SEQ ID NO:42、43及45中之任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；及/或3' ITR與SEQ ID:19、21、27或57具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些具體實施例中，5' ITR包含選自由SEQ ID NO:18、20及26組成之群組之核苷酸序列或由其組成；TRE包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：SEQ ID NO:25、32、36、54、55及/或58；ARSA編碼序列包含SEQ ID NO:14、24、62或72中所示之序列；聚腺苷酸化序列包含選自由SEQ ID NO:42、43及45組成之群組之核苷酸序列；及/或3' ITR包含選自由SEQ ID NO:19、21、27或57組成之群組之核苷酸序列或由其組成。
在某些具體實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO:18中所示之序列或由其組成；TRE包含SEQ ID NO:36中所示之序列；ARSA編碼序列包含SEQ ID NO:14、24、62或72中所示之序列；聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:42中所示之序列；及/或3' ITR包含SEQ ID NO:19中所示之序列或由其組成。
在某些具體實施例中，轉移基因組包含與SEQ ID NO:47、48、49、68、69或76至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。在某些具體實施例中，轉移基因組包含SEQ ID NO:47、48、49、68、69或76中所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，轉移基因組之核苷酸序列由SEQ ID NO:47、48、49、68、69或76中所示之核苷酸序列組成。在某些具體實施例中，轉移基因組包含SEQ ID NO:48中所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，轉移基因組之核苷酸序列由SEQ ID NO:48中所示之核苷酸序列組成。
在某些具體實施例中，rAAV包含： （a）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸203-736之胺基酸序列，及轉移基因組，其自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO:18之5' ITR）、強化子元件（例如SEQ ID NO:58之強化子元件）、啟動子序列（例如SEQ ID NO:25之啟動子序列）、嵌合內含子序列（例如SEQ ID NO:32之嵌合內含子序列）、以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列（例如SEQ ID NO:14之hARSA編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO:42之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO:19之3' ITR）；（b）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸138-736之胺基酸序列，及轉移基因組，其自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO:18之5' ITR）、強化子元件（例如SEQ ID NO:58之強化子元件）、啟動子序列（例如SEQ ID NO:25之啟動子序列）、嵌合內含子序列（例如SEQ ID NO:32之嵌合內含子序列）、以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列（例如SEQ ID NO:14之hARSA編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO:42之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO:19之3' ITR）；及/或（c）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列，及轉移基因組，其自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO:18之5' ITR）、強化子元件（例如SEQ ID NO:58之強化子元件）、啟動子序列（例如SEQ ID NO:25之啟動子序列）、嵌合內含子序列（例如SEQ ID NO:32之嵌合內含子序列）、以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列（例如SEQ ID NO:14之hARSA編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO:42之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO:19之3' ITR）。
在某些具體實施例中，rAAV包含：（a）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸203-736之胺基酸序列，及轉移基因組，其包含SEQ ID NO:41、44、46、47、48、49、65、67、68、69、75或76中之任一者中所示之核苷酸序列；（b）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸138-736之胺基酸序列，及轉移基因組，其包含SEQ ID NO:41、44、46、47、48、49、65、67、68、69、75或76中之任一者中所示之核苷酸序列；及/或（c）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列，及轉移基因組，其包含SEQ ID NO:41、44、46、47、48、49、65、67、68、69、75或76中之任一者中所示之核苷酸序列。
在另一態樣中，本文中提供聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO:41、44、46、47、48、49、65、67、68、69、75或76中所示之核酸序列至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）一致之核酸序列。在某些具體實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:41、44、46、47、48、49、65、67、68、69、75或76中所示之核酸序列。在某些具體實施例中，聚核苷酸由SEQ ID NO:41、44、46、47、48、49、65、67、68、69、75或76中所示之核酸序列組成。在某些具體實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:44或48中所示之核酸序列。在某些具體實施例中，聚核苷酸由SEQ ID NO:44或48中所示之核酸序列組成。
本文中亦提供聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO:14、62或72中所示之核酸序列至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）一致之核酸序列。在某些具體實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:14、62或72中所示之核酸序列。在某些具體實施例中，聚核苷酸由SEQ ID NO:14、62或72中所示之核酸序列組成。在某些具體實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:14中所示之核酸序列。在某些具體實施例中，聚核苷酸由SEQ ID NO:14中所示之核酸序列組成。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含如本文中所揭示之AAV及醫藥學上可接受之賦形劑、佐劑、稀釋劑、媒劑或載體或其組合。「醫藥學上可接受之載劑」包括任何在與組成物之活性成分組合時使該成分保留生物活性且不引起破壞性生理學反應（諸如不希望的免疫反應）之物質。醫藥學上可接受之載劑包括水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、乳液（諸如油/水乳液）及濕潤劑。包含此類載劑之組成物係藉由熟知的習知方法方法調配，諸如《雷明頓氏醫藥科學（Remington's Pharmaceutical Sciences）》, 最新版, Mack Publishing Co., Easton Pa. 18042, USA；A. Gennaro (2000) 《雷明頓：藥劑學之科學及實踐（Remington: The Science and Practice of Pharmacy）》, 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins；《醫藥劑型及藥物遞送系統（Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems）》 (1999) H. C. Ansel等人, 第7版, Lippincott, Williams, & Wilkins；及《醫藥賦形劑手冊（Handbook of Pharmaceutical Excipients）》 (2000) A. H. Kibbe等人, 第3版, Amer. Pharmaceutical Assoc中所闡述之方法。
在另一態樣中，本發明提供聚核苷酸，其包含編碼人類ARSA蛋白質或其片段之編碼序列，其中該編碼序列已以緘默方式改變以與野生型人類ARSA基因具有小於100%（例如小於95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%）一致性。在某些具體實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:14、62或72中所示之序列。在某些具體實施例中，聚核苷酸由SEQ ID NO:14、62或72中所示之序列組成。聚核苷酸可包含DNA、RNA、經修飾之DNA、經修飾之RNA或其組合。在某些具體實施例中，聚核苷酸為表現載體。III. 使用方法
在另一態樣中，本發明提供用於在細胞中表現ARSA多肽之方法。該等方法通常包含用如本文中所揭示之rAAV轉導細胞。此類方法在恢復ARSA表現方面為高效的。因此，在某些具體實施例中，本文中所揭示之方法涉及用如本文中所揭示之rAAV轉導細胞。
本文中所揭示之方法可應用於任何在ARSA基因中具有突變之細胞。本領域中熟習此項技術者將瞭解，對需要活性內源ARSA之細胞尤其感興趣。因此，在某些具體實施例中，將該等方法應用於任何損失內源ARSA活性之細胞。在某些具體實施例中，將該方法應用於神經元及/或神經膠細胞。在某些具體實施例中，尤其感興趣的是需要活性內源ARSA之神經元及/或神經膠細胞。在某些具體實施例中，將該方法應用於中樞神經系統之細胞及/或周邊神經系統之細胞。在某些具體實施例中，尤其感興趣的是需要活性內源ARSA之中樞神經系統及/或周邊神經系統之細胞。在某些具體實施例中，尤其感興趣的是前腦、中腦、後腦、脊髓及其任何組合中之細胞。在某些具體實施例中，尤其感興趣的是選自由以下組成之群組之中樞神經系統區域之細胞：脊髓、運動皮質、感覺皮質、丘腦、海馬區、殼核、小腦（例如小腦核）及其任何組合。在某些具體實施例中，尤其感興趣的是腦中之腦橋及髓質、脊髓之上升束及其任何組合中之細胞。在某些具體實施例中，尤其感興趣的是選自由以下組成之群組之中樞神經系統區域中的需要活性內源ARSA之細胞：脊髓、運動皮質、感覺皮質、丘腦、海馬區、殼核、小腦（例如小腦核）及其任何組合。在某些具體實施例中，尤其感興趣的是中樞神經系統（CNS）中之運動神經元及星形膠質細胞分佈、CNS中之寡樹突神經膠質細胞（上升纖維）、CNS中之大腦皮質之細胞群體以及周邊神經系統（PNS）中之感覺神經元。在某些具體實施例中，尤其感興趣的是寡樹突神經膠質細胞，諸如脊髓之背束中之細胞。在某些具體實施例中，尤其感興趣的是中樞神經系統中之神經膠質分佈，包括（但不限於）星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、許旺細胞及其任何組合。在某些具體實施例中，尤其感興趣的是運動神經元、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、中樞神經系統中之大腦皮質之細胞、周邊神經系統中之感覺神經元、周邊神經系統中之神經膠細胞（例如許旺細胞）及其任何組合。
本文中所揭示之方法可活體外進行以用於研究目的或可離體或活體內進行以用於治療目的。
在某些具體實施例中，待轉導之細胞在哺乳動物個體中且以可有效轉導個體中之細胞之量向個體投與AAV。因此，在某些具體實施例中，本發明提供一種用於治療患有與ARSA基因突變相關之疾病或病症的個體之方法，該方法通常包含向個體投與有效量之如本文中所揭示之rAAV。個體可為具有ARSA突變之人類個體、非人類靈長類動物個體（例如食蟹獼猴）或嚙齒動物個體（例如小鼠）。可使用本文中所揭示之方法治療任何與ARSA基因突變相關之疾病或病症。適合的疾病或病症包括（但不限於）異染性白質失養症。
在某些具體實施例中，前述方法使用包含以下之rAAV： （a）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸203-736之胺基酸序列，及轉移基因組，其自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO:18之5' ITR）、強化子元件（例如SEQ ID NO:58之強化子元件）、啟動子序列（例如SEQ ID NO:25之啟動子序列）、嵌合內含子序列（例如SEQ ID NO:32之嵌合內含子序列）、以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列（例如SEQ ID NO:14之hARSA編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO:42之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO:19之3' ITR）；（b）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸138-736之胺基酸序列，及轉移基因組，其自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO:18之5' ITR）、強化子元件（例如SEQ ID NO:58之強化子元件）、啟動子序列（例如SEQ ID NO:25之啟動子序列）、嵌合內含子序列（例如SEQ ID NO:32之嵌合內含子序列）、以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列（例如SEQ ID NO:14之hARSA編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO:42之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO:19之3' ITR）；及/或（c）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列，及轉移基因組，其自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件（例如SEQ ID NO:18之5' ITR）、強化子元件（例如SEQ ID NO:58之強化子元件）、啟動子序列（例如SEQ ID NO:25之啟動子序列）、嵌合內含子序列（例如SEQ ID NO:32之嵌合內含子序列）、以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列（例如SEQ ID NO:14之hARSA編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如SEQ ID NO:42之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如SEQ ID NO:19之3' ITR）。
在某些具體實施例中，前述方法使用包含以下之rAAV：（a）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸203-736之胺基酸序列，及轉移基因組，其包含SEQ ID NO:41、44、46、47、48、49、65、67、68、69、75或76中之任一者中所示之核苷酸序列；（b）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸138-736之胺基酸序列，及轉移基因組，其包含SEQ ID NO:41、44、46、47、48、49、65、67、68、69、75或76中之任一者中所示之核苷酸序列；及/或（c）AAV衣殼蛋白質，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列，及轉移基因組，其包含SEQ ID NO:41、44、46、47、48、49、65、67、68、69、75或76中之任一者中所示之核苷酸序列。
本文中所揭示之方法的有利之處尤其在於其能夠活體內及活體外在細胞中以高效率表現ARSA蛋白質。在某些具體實施例中，ARSA蛋白質之表現量為在ARSA基因中不具有突變之相同類型的細胞中之內源ARSA蛋白質之表現量之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在某些具體實施例中，ARSA蛋白質之表現量比在ARSA基因中不具有突變之相同類型的細胞中之內源ARSA蛋白質之表現量高至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。可使用任何用於測定ARSA蛋白質之表現量之方法，包括（但不限於）ELISA、西方墨點法（Western blotting）、免疫染色及質譜。
在某些具體實施例中，用本文中所揭示之AAV組成物轉導細胞可如本文所提供來進行或藉由本領域中一般熟習此項技術者已知的任何轉導方法來進行。在某些具體實施例中，可使細胞在以下感染倍率（MOI）下與AAV接觸：50,000；100,000；150,000；200,000；250,000；300,000；350,000；400,000；450,000；或500,000，或任何提供細胞之最佳轉導之MOI。
可藉由任何適合的途徑向個體投與本文中所揭示之AAV組成物，包括（但不限於）靜脈內、鞘內、腹膜內、皮下、肌肉內、鼻內、局部或皮內途徑。在某些具體實施例中，組成物經調配以用於經由靜脈內注射或皮下注射來投藥。IV. AAV 封裝系統
在另一態樣中，本發明提供用於本文中所揭示之重組腺相關病毒（rAAV）之重組製備之封裝系統。此類封裝系統通常包含：第一核苷酸，其編碼一或多種AAV Rep蛋白質；第二核苷酸，其編碼如本文中所揭示之AAV中之任一者之衣殼蛋白質；及第三核苷酸序列，其包含如本文中所揭示之rAAV基因組中之任一者，其中封裝系統在細胞中具有操作性以用於將轉移基因組包裹在衣殼中以形成AAV。
在某些具體實施例中，封裝系統包含第一載體，其包含編碼一或多種AAV Rep蛋白質之第一核苷酸序列及編碼AAV衣殼蛋白質之第二核苷酸序列，及第二載體，其包含有包含rAAV基因組之第三核苷酸序列。如在如本文中所描述之封裝系統之情形中所使用，「載體」係指一種核酸分子，其為用於將核酸引入細胞之媒劑（例如質體、病毒、黏質體、人工染色體等）。
任何AAV Rep蛋白質皆可用於本文中所揭示之封裝系統中。在封裝系統之某些具體實施例中，Rep核苷酸序列編碼AAV2 Rep蛋白質。適合的AAV2 Rep蛋白質包括（但不限於）Rep 78/68或Rep 68/52。在封裝系統之某些具體實施例中，編碼AAV2 Rep蛋白質之核苷酸序列包含編碼與SEQ ID NO:22之AAV2 Rep胺基酸序列具有最小序列一致性百分比之蛋白質之核苷酸序列，其中跨越AAV2 Rep蛋白質之胺基酸序列之長度，最小序列一致性百分比為至少70%（例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%）。在封裝系統之某些具體實施例中，AAV2 Rep蛋白質具有SEQ ID NO:22中所示之胺基酸序列。
在封裝系統之某些具體實施例中，封裝系統進一步包含第四核苷酸序列，其包含一或多種輔助病毒基因。在封裝系統之某些具體實施例中，封裝系統進一步包含第三載體，例如輔助病毒載體，其包含有包含一或多種輔助病毒基因之第四核苷酸序列。第三載體可為獨立的第三載體、與第一載體整合在一起或與第二載體整合在一起。
在封裝系統之某些具體實施例中，輔助病毒係選自由以下組成之群組：腺病毒、疱疹病毒（包括單純疱疹病毒（HSV））、痘病毒（諸如痘瘡病毒）、細胞巨大病毒（CMV）及桿狀病毒。在封裝系統之某些具體實施例中，其中輔助病毒為腺病毒，腺病毒基因組包含一或多種選自由以下組成之群組之腺病毒RNA基因：El、E2、E4及VA。在封裝系統之某些具體實施例中，其中輔助病毒為HSV，HSV基因組包含選自由以下組成之群組之HSV基因中之一或多者：UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及UL30/UL42。
在封裝系統之某些具體實施例中，第一、第二及/或第三載體包含於一或多種質體內。在某些具體實施例中，第一載體及第三載體包含於第一質體內。在某些具體實施例中，第二載體及第三載體包含於第二質體內。
在封裝系統之某些具體實施例中，第一、第二及/或第三載體包含於一或多種重組輔助病毒內。在某些具體實施例中，第一載體及第三載體包含於重組輔助病毒內。在某些具體實施例中，第二載體及第三載體包含於重組輔助病毒內。
在另一態樣中，本發明提供一種用於如本文中所描述之AAV之重組製備之方法，其中該方法包含在可操作以將rAAV基因組包裹於衣殼中以形成如本文中所描述之rAAV之條件下，用如本文中所描述之封裝系統轉染或轉導細胞。用於rAAV之重組製備之例示性方法包括短暫轉染（例如用一或多種含有如本文中所描述之第一及第二以及視情況選用之第三載體之轉染質體）、病毒感染（例如用一或多種重組輔助病毒，諸如腺病毒、痘病毒（諸如痘瘡病毒）、疱疹病毒（包括HSV、細胞巨大病毒或桿狀病毒，其含有如本文中所描述之第一及第二以及視情況選用之第三載體）及穩定的生產者細胞株轉染或感染（例如用穩定的生產者細胞，諸如哺乳動物或昆蟲細胞，其含有如本文中所描述之編碼一或多種AAV Rep蛋白質之Rep核苷酸序列及/或編碼一或多種衣殼蛋白質之Cap核苷酸序列，且其中以質體或重組輔助病毒形式遞送如本文中所描述之轉移基因組）。
因此，本發明提供用於製備重組AAV（rAAV）之封裝系統，其中該封裝系統包含第一核苷酸序列，其編碼一或多種AAV Rep蛋白質；第二核苷酸序列，其編碼本文中所描述之AAV中之任一者之衣殼蛋白質；第三核苷酸序列，其包含本文中所描述之AAV中之任一者之rAAV基因組序列；及視情況之第四核苷酸序列，其包含一或多種輔助病毒基因。V. 實例
本文中所揭示之重組AAV載體活體外及活體內介導高效基因轉移。以下實例說明使用如本文中所揭示之基於AAV之載體進行之ARSA基因（其在某些人類疾病（諸如異染性白質失養症）中突變）之表現之有效恢復。提供此等實例作為說明，而非作為限制。實例 1 ：人類 ARSA 轉移載體
此實例提供用於經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中之人類ARSA（hARSA）之表現之人類ARSA轉移載體T-001、pHMI-5000、pHMI-5003及pHMI-hARSA1-TC-002 。 a ） T-001
如圖1A中所示，ARSA轉移載體TC-001自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件、轉錄調節元件（其包含CMV強化子元件、雞β-肌動蛋白啟動子及嵌合內含子序列）；野生型人類ARSA編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表1中。此載體能夠在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類ARSA蛋白質。b ） pHMI-5000
如圖1B中所示，ARSA轉移載體pHMI-5000自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件；轉錄調節元件，其包含CMV強化子元件、雞β-肌動蛋白啟動子及嵌合內含子序列；以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表1中。此載體能夠在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類ARSA蛋白質。c ） pHMI-5003
如圖1C中所示，ARSA轉移載體pHMI-5003自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件；轉錄調節元件，其包含CMV強化子元件、雞β-肌動蛋白啟動子及嵌合內含子序列；以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；非編碼填充序列，及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表1中。此載體能夠在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類ARSA蛋白質。d ） pHMI-hARSA1-TC-002
如圖1D中所示，ARSA轉移載體pHMI-hARSA1-TC-002自5'至3'包含與pHMI-5000相同之基因元件。此等元件之序列闡述於表1中。pHMI-hARSA1-TC-002與pHMI-5000之間的差異位於載體主鏈序列中。此載體能夠在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類ARSA蛋白質。表 1 ：人類 ARSA 轉移載體 T-001 、 pHMI-5000 、 pHMI-5003 及 pHMI-hARSA1-TC-002 中之基因元件
| 基因元件 | T-001 | pHMI-5000 | pHMI-5003 | pHMI-hARSA1-TC-002 |
| SEQ ID NO: | ||||
| 5' ITR元件 | 18 | 18 | 18 | 18 |
| 強化子元件 | 58 | 58 | 58 | 58 |
| 啟動子序列 | 25 | 25 | 25 | 25 |
| 內含子序列 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| 轉錄調節元件 | 36 | 36 | 36 | 36 |
| 人類ARSA編碼序列 | 24 | 14 | 14 | 14 |
| SV40聚腺苷酸化序列 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| 填充序列 | N/A | N/A | 39 | N/A |
| 3' ITR元件 | 19 | 19 | 19 | 19 |
| 轉移基因組（自啟動子至聚腺苷酸化序列） | 41 | 44 | 46 | 44 |
| 轉移基因組（自5' ITR至3' ITR） | 47 | 48 | 49 | 48 |
| 完全載體序列 | 50 | 51 | 52 | 53 |
本文中所揭示之載體可封裝於AAV衣殼中，諸如（但不限於）AAVHSC5、AAVHSC7、AAVHSC15或AAVHSC17衣殼。可將經封裝之病毒顆粒投與野生型動物或ARSA缺失型動物。實例 2 ： ARSA （ -/- ）小鼠模型中之 ARSA 基因轉移
為了研究小鼠中ARSA基因轉移之作用，產生ARSA（-/-）小鼠模型。ARSA（-/-）小鼠模型為藉由將新黴素卡匣插入小鼠ARSA基因之外顯子4而產生之ARSA基因剔除小鼠（參見Hess等人, 《美國國家科學院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
）》 1996, 93(25):14821-14826，其以全文引用之方式併入本文中）。與人類相比，ARSA（-/-）小鼠發展類似的但程度較輕的異染性白質失養症（MLD）。ARSA（-/-）小鼠未顯示廣泛的髓鞘脫失之證據。
可使用各種生物標記研究MLD。舉例而言，可量測腦中髓硫脂之含量。已報導寡樹突神經膠細胞（C24:0）及神經元（C18:0）髓硫脂之增加，其中積聚隨動物年齡而增加。可量測髓鞘及淋巴細胞蛋白質（MAL）mRNA轉錄物之含量。MAL由寡樹突神經膠質細胞及許旺細胞表現，使神經膠質-軸突接合區穩定且與MLD之病變有關。已報導ARSA（-/-）小鼠中之MAL轉錄物之含量降低。溶酶體相關膜蛋白質（LAMP-1）為另一種可用於研究MLD之生物標記。已使用抗LAMP-1抗體，藉由對ARSA（-/-）及野生型小鼠中之脊髓組織進行免疫組織化學來研究LAMP-1免疫反應性，證實ARSA（-/-）小鼠中之LAMP-1免疫反應性提高。圖2A顯示來源於藉由對來自ARSA（-/-）小鼠之脊髓組織進行免疫組織化學（IHC）而研究的LAMP-1免疫反應性之總像素強度之定量。在用媒劑對照物或封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000處理的ARSA（-/-）小鼠中使用抗LAMP-1抗體進行IHC。如圖2A中所示，在給藥（4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000）後第12週時，偵測到與投與媒劑對照物之ARSA（-/-）動物相比顯著降低之LAMP-1含量。
將腦組織稱重且在Precellys珠粒均質器中，在250 μL水中均質化，且移出均質物之10 μL等分試樣以用於Pierce BCA蛋白質分析法定量。將760 μL乙腈將添加至各均質物中且將混合物第二次均質化。均質物在14,000 x g下離心15分鐘且移出離心機澄清之上清液且在75%乙腈中稀釋5倍以用於RapidFire-MS分析。使用C19:0髓硫脂（Matreya目錄號1888）作為內標且用Sciex API4000三重四極質譜儀以MRM模式與C18:0、C18:1、C24:0及C24:1髓硫脂一起監測。各樣品與8種不同濃度之C19:0髓硫脂IS一起注射8次以產生各樣品之獨特標準曲線，使用其計算各分析物之濃度。圖2B顯示隨時間推移，對照組小鼠（WT/Het）及ARSA（-/-）小鼠之大腦中之C18:0髓硫脂含量。對照組為野生型動物（ARSA（+/+））與雜合動物（ARSA（+/-））之混合。如圖2B中所示，ARSA（-/-）小鼠之腦中之C18:0髓硫脂含量隨時間推移而增加，而對照組小鼠之腦中之C18:0髓硫脂含量隨時間推移而保持基本不變。由兩隻對照組小鼠及兩隻ARSA（-/-）小鼠之分析產生圖2B中之資料。為了研究ARSA缺失型小鼠中ARSA基因遞送對髓硫脂積聚之作用，用4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hARSA1-TC-002處理ARSA（-/-）小鼠（圖2C）。如圖2C中所示，與用媒劑對照物處理之ARSA（-/-）小鼠相比，在給藥後七個月時觀測到經處理之ARSA（-/-）小鼠中之腦部髓硫脂含量之顯著降低。
在用4e13 vg/kg及6e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000或媒劑對照物處理後七個月時測定ARSA（-/-）小鼠之前腦、中腦及後腦中之C18:0及C18:1髓硫脂同功異型物含量（圖2D）。髓硫脂同功異型物含量呈現為與相同年齡之野生型對照動物相比之倍數。如圖2D中所示，與用媒劑對照物處理之ARSA（-/-）小鼠相比，在給藥後七個月時觀測到經處理之ARSA（-/-）小鼠之所有三個腦部區域中之腦部髓硫脂含量之顯著降低。所使用之方法及材料與上述相同。使用非配對T測試（unpaired T-test）分析資料。
在用4e13 vg/kg之封裝於AAVHS15衣殼中之pHMI-5000或媒劑對照物處理後第52週測定ARSA（-/-）小鼠之前腦、中腦及後腦中之C18:0及C18:1髓硫脂同功異型物含量（圖2E）、C24:0及C24:1髓硫脂同功異型物含量（圖2F）及總髓硫脂同功異型物含量（圖2G）。所使用之方法及材料與上述相同。使用非配對T測試分析資料。
圖3A顯示對照組小鼠（WT/Het）及ARSA（-/-）小鼠中，在四週時MAL轉錄物之含量。對照組為野生型動物（ARSA（+/+））與雜合動物（ARSA（+/-））之混合。藉由Trizol提取，接著進行Qiagen RNEasy管柱純化來製備小鼠總RNA。RNA用作使用ThermoFisher High Capacity cDNA套組進行之cDNA合成之模板以產生轉錄物。使用液滴式數位PCR及對小鼠髓鞘及淋巴細胞蛋白質（MAL）具有特異性之引子/探針集合評估MAL轉錄物，其中針對小鼠HPRT1標準化複本數。如所顯示，在四週時，與雜合小鼠相比，ARSA（-/-）小鼠中之MAL轉錄物之含量降低。由五隻對照組小鼠及六隻ARSA（-/-）小鼠之分析產生圖3中之資料。為了研究ARSA缺失型小鼠中ARSA基因遞送對MAL轉錄物含量之影響，用4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000處理ARSA（-/-）小鼠（圖3B）。如圖3B中所示，與野生型小鼠及用媒劑處理之ARSA（-/-）小鼠相比，在給藥後三個月時觀測到經處理之ARSA（-/-）小鼠中之MAL轉錄物含量之顯著增加。
測定用4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000處理的ARSA（-/-）小鼠中之MAL轉錄物複本數之水準（圖3C）。圖3C顯示在野生型小鼠中或在被投與媒劑對照物或4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠中，在給藥後第12或52週時偵測到的MAL轉錄物之複本數。所使用之方法及材料與上述相同。使用非配對T測試分析資料。在圖3C中，各動物組之間的統計顯著性如下：12週媒劑對比經處理之動物，p=0.0012；12週處理對比野生型動物，p＜0.0001；52週媒劑對比經處理之動物，p=0.0004；及52週處理對比野生型動物，不顯著。
為了研究是否可獲得hARSA活性之治療水準，向ARSA（-/-）小鼠投與封裝於AAV9衣殼中之轉移載體T-001（參見PCT公開案第WO2002/052052號，其以全文引用之方式併入本文中）。自未經處理之對照性ARSA（-/-）小鼠及被投與封裝於AAV9衣殼中之轉移載體T-001之ARSA（-/-）小鼠獲得之腦薄片之抗ARSA免疫反應性表明，在2e13載體基因組/公斤體重（vg/kg）之劑量下獲得達到治療水準（10%）之hARSA酶活性。自經處理之ARSA（-/-）小鼠獲得之腦薄片之抗ARSA免疫反應性亦顯示腦中之ARSA酶活性之劑量依賴性增加。實例 3 ： ARSA （ -/- ）小鼠模型中之 ARSA 基因轉移
此實例提供與人類ARSA轉移載體pHMI-5000之用途相關之實驗資料。如本文中所描述，轉移載體pHMI-5000包含以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列，證實其呈現顯著改良之ARSA蛋白質之表現。
圖4為顯示腦部中以每個經轉導之細胞計的載體基因組之數目與以每奈克cDNA計的hARSA之複本數目之間的相關性之作圖。使用來自Qiagen之QIAamp Fast DNA Tissue套組製備小鼠基因組DNA。藉由液滴式數位PCR及對經密碼子最佳化之人類ARSA載體基因組之編碼區具有特異性之引子/探針集合測定VG計數，其中針對內源小鼠基因組序列進行標準化。如本文中所描述製備小鼠總RNA且使用液滴式數位PCR及用於測定VG計數之相同引子/探針集合評估ARSA轉錄物，其中針對小鼠GUSB標準化複本數。如所顯示，對於使用封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000轉導之細胞，所偵測到的以每個經轉導之細胞計的載體基因組之數目與以每奈克cDNA計的hARSA之複本數目強相關（R2
=0.9332）。
發現在AAVHSC15與AAV9衣殼介導之遞送之間的比較中，AAVHSC15在腦部中顯著優於AAV9。圖5顯示在2e13 vg/kg之封裝於AAV9或AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000的劑量下，腦部中之以每個經轉導之細胞計的載體基因組之數目。如所顯示，與AAV9衣殼相比，當轉移載體pHMI-5000封裝於AAVHSC15衣殼中時，觀測到高十倍的以每個細胞計的載體基因組計數。圖6顯示對於以所指示之劑量投與之封裝於AAV9或AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000，所量測的正常人類ARSA酶活性水準之百分比。圖7顯示在以4e13 vg/kg投與封裝於AAV9或AAVHSC15中之轉移載體pHMI-5000之小鼠中，以每個經轉導之腦細胞計的載體基因組之數目。
與封裝於AAV9衣殼中之pHMI-5000相比，封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000顯示更強且更廣泛的腦部及脊髓表現概況。抗ARSA免疫反應性實驗表明，在3e13 vg/kg之劑量下，在各種情況下，與靜脈內投與封裝於AAV9衣殼中之pHMI-5000之小鼠相比，在靜脈內投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之小鼠的腦薄片中偵測到顯著更高的量。
為了評估投藥途徑對腦部中hARSA之生物分佈之影響，分別在4e13 vg/kg及4e12 vg/kg之劑量下經由靜脈內（IV）及鞘內（IT）途徑投與封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000。在向ARSA（-/-）小鼠靜脈內投與封裝於AAVHSC15中之pHMI-5000之後，在重要的中樞神經系統區域中存在抗ARSA免疫反應性。廣泛偵測到抗小鼠ARSA（mARSA）或人類ARSA（hARSA），包括（但不限於）運動及感覺皮質、海馬區（CA3區域）、殼核及小腦。在封裝於AAVHSC15中之轉移載體pHMI-5000之IV或IT投藥之後，後腦及中腦中之正常人類ARSA酶活性之百分比之定量顯示於圖8中。
在持續4週以4e13 vg/kg投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠中，在腦部之重要生理學區域以及中樞神經系統（CNS）之整個後尾軸中偵測到hARSA之生物相關分佈。使用抗hARSA抗體偵測hARSA，且在脊髓、運動皮質、丘腦、海馬區及小腦核中偵測到。亦在以下中偵測到hARSA：CNS中之運動神經元及星形膠質細胞分佈；CNS中之寡樹突神經膠質細胞（在上升纖維中大量偵測到）；CNS中之大腦皮質之細胞群；以及周邊神經系統（PNS）中之感覺神經元及許旺細胞。最早可在處理後第2週便偵測到類似的生物學分佈。
在以2e13 vg/kg投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之小鼠中，觀測到與在以4e13 vg/kg或更高的劑量進行投藥之小鼠中所發現相同的組織學分佈。在此等實驗中，以溶酶體特有之點狀模式在細胞質中偵測到hARSA。
如圖9A及9B中所示，在給藥後第4週，經處理之ARSA（-/-）小鼠之大腦中的人類ARSA酶活性之生理學水準得到恢復。使用來自ARSA（-/-）小鼠之腦溶解物評估hARSA酶活性。劑量範圍發現研究表明，hARSA酶活性與封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000的靜脈內投藥之劑量相關。在經處理之動物中，但未在媒劑對照性動物中偵測到酶活性。對於所測試之劑量，酶活性水準（約40-145%）顯著高於治療目標（約10-15%），如先前在臨床上測定（參見Patil及Maegawa, 《藥物設計及發展及療法（Drug Des. Devel. Ther.
）》 2013, 7:729-745）。圖9A顯示藉由以所指示之劑量向ARSA（-/-）小鼠投與封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000而實現的正常hARSA活性之百分比。如所顯示，獲得hARSA活性之劑量依賴性反應。圖9B顯示以所指示之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000的ARSA（-/-）小鼠之腦部中以每個細胞計的載體基因組之數目。對於1e13 vg/kg、4e13 vg/kg及6e13 vg/kg劑量，n=5隻小鼠。對於2e13 vg/kg劑量，n=4隻小鼠。所有小鼠為5週齡且皆為雄性。在圖9C中，使用比色芳基硫酸酯酶A特異性分析法評估ARSA酶活性，該分析法量測由可溶性受質對硝基兒茶酚-硫酸酯（pNCS）引起之硫酸酯之裂解。使用芳基硫酸酯酶A特異性免疫沈澱步驟消除由競爭酶引起之硫酸酯之非特異性裂解。藉由各兩位正常人類男性及女性之額葉皮質中的ARSA酶活性之分析來測定腦部中之正常人類ARSA酶活性。人類額葉皮質樣品係自BioiVT購得且在每個ARSA酶活性分析盤上與測試樣品一起一式三份地操作。資料表示為以每小時每毫克蛋白質計的脫硫酸化pNCS之平均量（ng）之百分比。圖9C顯示最早在處理後第1週且直至處理後第12週，單次靜脈內4e13 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000引起在新生ARSA（-/-）小鼠之大腦中偵測到hARSA酶活性，其水準超過既定人類治療目標（10-15%）（如虛線所指示）。在給藥後第1、2、3、4及12週收集材料。對於每個時間點，n=6隻小鼠，3隻雄性及3隻雌性，8週齡。
在圖9D中，藉由Trizol提取，接著進行Qiagen RNEasy管柱純化來製備小鼠總RNA。RNA用作使用ThermoFisher High Capacity cDNA套組進行之cDNA合成之模板以產生轉錄物。使用液滴式數位PCR及對經密碼子最佳化之人類ARSA轉錄物具有特異性之引子/探針集合評估ARSA轉錄物，其中針對小鼠GUSB標準化複本數。圖9D顯示最早在處理後第1週，單次靜脈內4e13 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000引起在成年ARSA（-/-）小鼠之大腦中偵測到正常水準之hARSA酶活性（經由hARSA轉錄物分析）。在給藥後第2至3週觀測到hARSA酶活性之峰值水準，接著穩定的平線區持續至處理後第52週（以超過既定人類治療目標（10-15%）之水準）。在給藥後第1、2、3、4、8、12、26及52週收集材料。圖9E顯示在投與單次靜脈內4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每微克基因組DNA計的載體基因組之數目。在給藥後第1、2、3、8、12、26及52週收集材料。圖9F顯示在投與單次靜脈內4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每奈克RNA計的ARSA轉錄物之複本數目。在給藥後第4、8、12、26及52週收集材料。實例 4 ：人類 ARSA 轉移載體
此實例提供用於在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中的hARSA之表現之人類ARSA轉移載體TC-013.pHMIA2及TC-015.pKITR。除表現hARSA以外，此等載體經設計以亦表現人類SUMF1。hARSA及hSUMF1之編碼序列由2A元件分離。在某些具體實施例中，核糖體跳躍元件（例如2A元件）編碼在N端進一步包含Gly-Ser-Gly之序列之肽，視情況其中Gly-Ser-Gly之序列由GGCAGCGGA之核苷酸序列編碼。儘管不希望受理論約束，但假設核糖體跳躍元件藉由以下發揮功能：終止第一肽鏈之轉譯及再起始第二肽鏈之轉譯；或由核糖體跳躍元件編碼之肽序列中之肽鍵藉由經編碼之肽之內源蛋白酶活性進行之裂解，或環境（例如胞溶質）中之另一種蛋白酶。a ） TC-013.pHMIA2
如圖10A中所示，ARSA轉移載體TC-013.pHMIA2自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件、包含CALM1啟動子之轉錄調節元件；以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列；2A元件；以緘默方式改變之人類SUMF1編碼序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表2中。此載體能夠在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類ARSA蛋白質及人類SUMF1蛋白質。b ） TC-015.pKITR
如圖10B中所示，ARSA轉移載體TC-015.pKITR自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件、包含smCBA啟動子之轉錄調節元件；以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列；2A元件；以緘默方式改變之人類SUMF1編碼序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表2中。此載體能夠在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類ARSA蛋白質及人類SUMF1蛋白質。表 2 ：人類 ARSA 轉移載體 TC-013.pHMIA2 及 TC-015.pKITR 中之基因元件
| 基因元件 | TC-013.pHMIA2 | TC-015.pKITR |
| SEQ ID NO: | ||
| 5' ITR元件 | 18 | 18 |
| 啟動子序列 | 54 | 55 |
| 轉錄調節元件 | 54 | 55 |
| 人類ARSA編碼序列 | 62 | 62 |
| 2A元件 | 63 | 63 |
| 人類SUMF1編碼序列 | 64 | 64 |
| hARSA-2A-hSUMF1序列 | 30 | 30 |
| 3' ITR元件 | 19 | 19 |
| 轉移基因組（自啟動子至SUMF1編碼序列） | 65 | 67 |
| 轉移基因組（自5' ITR至3' ITR） | 68 | 69 |
| 完全載體序列 | 70 | 71 |
本文中所揭示之載體可封裝於AAV衣殼中，諸如（但不限於）AAVHSC5、AAVHSC7、AAVHSC15或AAVHSC17衣殼。可將經封裝之病毒顆粒投與野生型動物或ARSA缺失型動物。
為了評估腦部中啟動子對hARSA表現之影響，將轉移載體pHMI-5000、TC-013.pHMIA2及TC-015.pKITR封裝於AAVHSC15衣殼中且靜脈內投與ARSA（-/-）小鼠。在以4e13 vg/kg之劑量投與pHMI-5000載體（雞β-肌動蛋白（CBA）啟動子）及以8e13 vg/kg之劑量投與TC-015.pKITR（smCBA啟動子）之情況下在腦部中偵測到hARSA表現及酶活性，其中以每個細胞計數計的病毒基因組類似。與所測試之其他啟動子相比，CBA啟動子在最低劑量下引起hARSA之最高表現。圖11顯示pHMI-5000（CBA啟動子）、TC-013.pHMIA2（CALM1啟動子）及TC-015.pKITR（smCBA啟動子）之以每個細胞計的經轉導之病毒基因組之數目，在每種情況下封裝於AAVHSC15衣殼中且以4e13 vg/kg之劑量投與（對於每種載體，n=5隻小鼠）。圖12顯示所偵測之pHMI-5000（CBA啟動子）及TC-015.pKITR（smCBA啟動子）之正常人類ARSA酶活性之百分比，在每種情況下封裝於AAVHSC15衣殼中且以4e13 vg/kg之劑量投與（對於每種載體，n=5隻小鼠）。圖13顯示對於封裝於AAVHSC15衣殼中且以4e13 vg/kg之劑量投與之pHMI-5000（CBA啟動子）及封裝於AAVHSC15衣殼中且以8e13 vg/kg之劑量投與之TC-015.pKITR（smCBA啟動子），在西方墨點法中，可在使用抗hARSA抗體之小鼠之大腦中偵測到hARSA之表現（對於每種載體，n=5隻小鼠）。實例 5 ：人類 ARSA 轉移載體
此實例提供用於在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中的hARSA之表現之人類ARSA轉移載體pHMI-5004。除表現hARSA以外，此載體經設計以亦表現人類鞘脂激活蛋白B（SapB）。hARSA及SapB之編碼序列由2A元件分離。
如圖14中所示，ARSA轉移載體pHMI-5004自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件；轉錄調節元件，其包含CMV強化子元件、雞β-肌動蛋白啟動子及嵌合內含子序列；以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列；2A元件；野生型人類SapB編碼序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表3中。此載體能夠在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類ARSA及/或SapB蛋白質。表 3 ：人類 ARSA 轉移載體 pHMI-5004 中之基因元件
實例 6 ：非人類靈長類動物中之 ARSA 基因轉移
| 基因元件 | SEQ ID NO: |
| 5' ITR元件 | 18 |
| 強化子元件 | 58 |
| 啟動子序列 | 25 |
| 內含子序列 | 32 |
| 轉錄調節元件 | 36 |
| 人類ARSA編碼序列 | 72 |
| 2A元件 | 63 |
| 人類SapB編碼序列 | 73 |
| hARSA-2A-hSapB序列 | 74 |
| SV40聚腺苷酸化序列 | 42 |
| 3' ITR元件 | 19 |
| 轉移基因組（自啟動子至聚腺苷酸化序列） | 75 |
| 轉移基因組（自5' ITR至3' ITR） | 76 |
| 完全載體序列 | 77 |
為了研究非人類靈長類動物中單次劑量之AAVHSC介導之ARSA基因遞送之作用，根據表4及5中所闡述之實驗設計向六隻雄性未經處理之幼年食蟹獼猴給藥。表 4 ：用於非人類靈長類動物研究之實驗設計
表 5 ：用於非人類靈長類動物研究之實驗設計
| 組 | 路徑 | 動物 / 組 | 給藥天數 | 劑量（ vg/kg ） | 體積（ mL/kg ） | 濃度（ vg/mL ） | 屍檢 |
| 1 | IV | 2隻雄性 | 1 | 0 | 5.0 | - | 第28/29天 |
| 2 | IV | 2隻雄性 | 1 | 4e13 | 5.0 | 1.2e13 | |
| 3 | CM | 2隻雄性 | 1 | 靜脈內劑量之約10%，基於動物體重以固定劑量形式提供（約6e12 vg/kg） | 0.5 mL | 儲備溶液為1.98 vg/mL |
| 動物 | 體重（ kg ） | 治療 | 路徑 | 劑量（ vg/kg ） | Vg/ 動物 |
| 18C42 | 1.38 | 媒劑 | IV | 0 | 0 |
| 18C17 | 1.55 | 媒劑 | IV | 0 | 0 |
| 18C21 | 1.28 | AAVHSC15-pHMI-5005 | IV | 4e13 | 5.12e13 |
| 18C27 | 1.28 | AAVHSC15-pHMI-5005 | IV | 4e13 | 5.12e13 |
| 18C13 | 1.9 | AAVHSC15-pHMI-5005 | CM | 4e12 | 7.6e12 |
| 18C7 | 1.74 | AAVHSC15-pHMI-5005 | CM | 4e12 | 6.96e12 |
如圖15中所示，ARSA轉移載體pHMI-5005自5'至3'包含以下基因元件：5' ITR元件；轉錄調節元件，其包含CMV強化子元件、雞β-肌動蛋白啟動子及嵌合內含子序列；以緘默方式改變之人類ARSA編碼序列；V5標籤；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表6中。此載體能夠在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類ARSA蛋白質。表 6 ：人類 ARSA 轉移載體 pHMI-5005 中之基因元件
| 基因元件 | SEQ ID NO: |
| 5' ITR元件 | 18 |
| 強化子元件 | 58 |
| 啟動子序列 | 25 |
| 內含子序列 | 32 |
| 轉錄調節元件 | 36 |
| 人類ARSA編碼序列 | 14 |
| V5標籤 | 78 |
| SV40聚腺苷酸化序列 | 42 |
| 3' ITR元件 | 19 |
| 轉移基因組（自啟動子至聚腺苷酸化序列） | 79 |
| 轉移基因組（自5' ITR至3' ITR） | 80 |
| 完全載體序列 | 81 |
pHMI-5005為經V5標記之ARSA轉移載體。根據表4及5中所闡述之實驗設計向非人類靈長類動物（NHP）投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5005。在第0天，經由經頭部/隱靜脈進行1-2分鐘緩慢推注靜脈內注射（IV）或直接注射至大池（CM）中來進行投藥。每天兩次針對死亡及瀕死跡象來進行存活率檢驗。在每天上午以及在給藥當天在完成給藥之後（15分鐘）及給藥後4小時進行臨床觀測。在即將給藥之前以及在給藥後第1、2及4週獲得用於血液學及臨床化學之血液。在第28及29天之屍檢時，在腦脊髓液（CSF）及血液收集之後，向動物灌注1.0 L低溫生理食鹽水以移除血球。在屍檢時收集腦部、肝臟、脊髓（子宮頸及腰）、子宮頸及腰背根神經節（DRG）、三叉神經節、腎臟、坐骨神經、周邊淋巴結、脾、心臟、肺及睪丸。
對於生物分析，在即將給藥之前以及在第1、2及4週收集血清以用於V5 Elisa（0.5 mL全血，處理成血清/分成兩個等分試樣）。在給藥前收集0.5 mL CSF（來自第3組CM給藥組動物）及在屍檢時收集1-2 mL（對於所有動物）。在屍檢之前，自全血收集15 mL周邊血液單核細胞（PBMC）。
圖16顯示在投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5005的NHP中，丙胺酸轉胺酶（ALT）之含量上升。升高之ALT在給藥後第14天恢復至基線水準。
在給藥後第28及29天處死接受單次靜脈內劑量之4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15中之pHMI-5005之NHP（第2組動物）。在經處死之第2組動物之中樞神經系統（CNS）及腦脊髓液（CSF）中偵測人類ARSA酶活性水準（圖17）。如圖17中所示，偵測到高於治療閾值（野生型人類腦部含量之15%）之hARSA活性水準，如由虛線指示。動物18C27（第2組）之CNS及周邊神經系統（PNS）中之免疫螢光染色證實存在hARSA（經由V5標籤偵測）且存在於包括背根神經節、脊椎運動神經元及小腦之特定區域中。
本發明之範疇不受本文中所描述之特定實施例限制。實際上，根據先前描述及附圖，除所描述之修改以外，本發明之各種修改對本領域中熟習此項技術者而言將變得顯而易見。此類修改意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇內。
本文中所引用之所有參考文獻（例如公開案或專利案或專利申請案）皆以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其併入程度如同各個別參考文獻（例如公開案或專利案或專利申請案）具體且個別地指示為出於所有目的以全文引用之方式併入一般。其他實施例屬於以下申請專利範圍內。
無
圖 1A 、 1B 、 1C
及1D
分別為T-001、pHMI-5000、pHMI-5003及pHMI-hARSA1-TC-002載體之載體圖。
圖 2A 、 2B 及 2C 。圖 2A
為顯示在用媒劑對照物或封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000處理之ARSA（-/-）小鼠中，使用抗LAMP-1抗體藉由免疫組織化學研究之來源於LAMP-1免疫反應性之總像素強度之定量之圖（dWM：背部白質；vWM：腹部白質；及vGM：腹部灰質）。圖 2B
為顯示隨時間推移，在對照組小鼠（WT/Het）及ARSA（-/-）小鼠之大腦中量測到的C18:0髓硫脂含量之圖。圖 2C
為顯示在用4e13 vg/kg之劑量（劑量-4）之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-hARSA1-TC-002或媒劑對照物處理之ARSA（-/-）小鼠中的髓硫脂含量之變化（以與年齡匹配野生型對照物相比之倍數形式）之圖。圖 2D
為圖之集合，其顯示在用4e13 vg/kg或6e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000或媒劑對照物處理之ARSA（-/-）小鼠之前腦、中腦及後腦中的C18:0及C18:1髓硫脂異構體含量之變化（以與年齡匹配野生型對照物相比之倍數形式）。圖 2E
為圖之集合，其顯示在用4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000或媒劑對照物處理之ARSA（-/-）小鼠之前腦、中腦及後腦中的C18:0及C18:1髓硫脂異構體含量之變化（以與年齡匹配野生型對照物相比之倍數形式）。圖 2F
為圖之集合，其顯示在用4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000或媒劑對照物處理之ARSA（-/-）小鼠之前腦、中腦及後腦中的C24:0及C24:1髓硫脂異構體含量之變化（以與年齡匹配野生型對照物相比之倍數形式）。圖 2G
為圖之集合，其顯示在用4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000或媒劑對照物處理之ARSA（-/-）小鼠之前腦、中腦及後腦中的總髓硫脂異構體含量之變化（以與年齡匹配野生型對照物相比之倍數形式）。
圖 3A 及 3B 。圖 3A
為顯示在對照組小鼠（WT/Het）及ARSA（-/-）小鼠中，在四週時量測之髓鞘及淋巴細胞蛋白質（MAL）mRNA轉錄物之含量之圖。圖 3B
為顯示與年齡匹配野生型小鼠及用媒劑處理之ARSA（-/-）小鼠相比，在用4e13 vg/kg之劑量（劑量-4）之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000處理之ARSA（-/-）小鼠中偵測到的MAL轉錄物之含量之圖。圖 3C
為顯示在投與4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000或媒劑對照物之後第12或52週，在野生型小鼠或ARSA（-/-）小鼠中偵測到的MAL轉錄物複本數之圖。
圖 4
為顯示ARSA（-/-）小鼠之大腦中的以每個經轉導之細胞計的載體基因組之數目與以每奈克cDNA計的hARSA之複本之數目之間的相關性之作圖。
圖 5
為顯示在靜脈內投與封裝於AAV9或AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000（在每種情況下以2e13 vg/kg之劑量投與）之後，ARSA（-/-）小鼠之大腦中的以每個經轉導之細胞計的載體基因組之數目之圖。
圖 6
為顯示在靜脈內投與封裝於AAV9或AAVHSC15衣殼中且以所指示之劑量投與之轉移載體pHMI-5000之後，在ARSA（-/-）小鼠之腦部中量測到的正常人類ARSA酶活性水準之百分比之圖。
圖 7
為顯示在靜脈內投與封裝於AAV9或AAVHSC15中之轉移載體pHMI-5000（在每種情況下以4e13 vg/kg之劑量）之後，ARSA（-/-）小鼠之腦部中以每個細胞計的載體基因組之數目之圖。
圖 8
為顯示在靜脈內（IV）或鞘內（IT）投與封裝於AAVHSC15中之轉移載體pHMI-5000之後，後腦及中腦中之正常人類ARSA酶活性之百分比之圖。
圖 9A 、 9B 、 9C 及 9D 。圖 9A
為顯示在以所指示之劑量向ARSA（-/-）小鼠靜脈內投與封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000之後，在腦部中實現之正常hARSA活性之百分比之圖。圖 9B
為顯示在以所指示之劑量靜脈內投與封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000之後，ARSA（-/-）小鼠之大腦中之以每個細胞計的載體基因組之數目之圖。圖 9C
為顯示在給藥後12週之過程中，投與4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000的新生ARSA（-/-）小鼠中之hARSA酶活性水準之圖。圖 9D
為顯示投與4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000的成年ARSA（-/-）小鼠之大腦中之ARSA酶活性水準（經由hARSA轉錄物分析）之圖。圖 9E
為顯示在投與單次靜脈內4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每微克基因組DNA計的載體基因組之數目之圖。圖 9F
為顯示在投與單次靜脈內4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每奈克RNA計的ARSA轉錄物之複本之數目之圖。
圖 10A
及10B
分別為TC-013.pHMIA2及TC-015.pKITR載體之載體圖。
圖 11
為顯示在投與轉移載體pHMI-5000（CBA啟動子）、TC-013.pHMIA2（CALM1啟動子）及TC-015.pKITR（smCBA啟動子）（在每種情況下封裝於AAVHSC15衣殼中且以4e13 vg/kg之劑量靜脈內投與）之小鼠ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每個細胞計的經轉導之病毒基因組之數目之圖。
圖 12
為顯示在投與轉移載體pHMI-5000（CBA啟動子）及TC 015.pKITR（smCBA啟動子）（在每種情況下封裝於AAVHSC15衣殼中且以4e13 vg/kg之劑量靜脈內投與）之小鼠ARSA（-/-）小鼠之大腦中偵測到的正常人類ARSA酶活性之百分比之圖。
圖 13
為免疫墨點之照片，其顯示使用抗hARSA抗體之小鼠的大腦中hARSA之表現。向ARSA（-/-）小鼠投與轉移載體pHMI-5000（CBA啟動子）及TC-015.pKITR（smCBA啟動子），在每種情況下封裝於AAVHSC15衣殼中且分別以4e13 vg/kg及8e13 vg/kg之劑量靜脈內投與（對於每種載體，n=5隻小鼠）。
圖 14
為轉移載體pHMI-5004之載體圖。
圖 15
為轉移載體pHMI-5005之載體圖。
圖 16
為顯示用所指示之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5005處理或用媒劑對照物處理之非人類靈長類動物中之丙胺酸轉胺酶（ALT）含量之圖。
圖 17
為顯示投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5005的非人類靈長類動物之中樞神經系統（CNS）及腦脊髓液（CSF）中之ARSA活性之圖。
Claims (83)
- 一種用於在細胞中表現芳基硫酸酯酶A（ARSA）多肽之方法，該方法包含用重組腺相關病毒（rAAV）轉導該細胞，該重組腺相關病毒包含： （a）AAV衣殼，其包含AAV衣殼蛋白質；及 （b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。
- 如請求項1之方法，其中該細胞為神經元及/或神經膠細胞，視情況其中該細胞為中樞神經系統及/或周邊神經系統之神經元及/或神經膠細胞。
- 如請求項1之方法，其中該細胞為選自由以下組成之群組的中樞神經系統區域之細胞：脊髓、運動皮質、感覺皮質、海馬區、殼核、小腦，視情況，小腦核，及其任何組合。
- 如請求項1之方法，其中該細胞為選自由以下組成之群組之細胞：運動神經元、星形膠質細胞、寡樹突神經膠細胞、中樞神經系統中之大腦皮質之細胞、周邊神經系統之感覺神經元、許旺細胞（Schwann cell）及其任何組合。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該細胞在哺乳動物個體中且以可有效轉導該個體中之該細胞之量向該個體投與該AAV。
- 一種用於治療患有異染性白質失養症（MLD）之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之rAAV，該rAAV包含： （a）AAV衣殼，其包含衣殼蛋白質；及 （b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該以緘默方式改變之ARSA編碼序列編碼SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列。
- 如請求項7之方法，其中該以緘默方式改變之ARSA編碼序列包含SEQ ID NO: 14、62或72中所示之核苷酸序列。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉錄調節元件包含選自由以下組成之群組的元件中之一或多者：細胞巨大病毒（CMV）強化子元件、雞β-肌動蛋白（CBA）啟動子、小型雞β-肌動蛋白（SmCBA）啟動子、鈣調蛋白1（CALM1）啟動子、蛋白脂質蛋白質1（PLP1）啟動子、膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）啟動子、突觸蛋白2（SYN2）啟動子、金屬硫蛋白3（MT3）啟動子及其任何組合。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉錄調節元件包含與選自由以下組成之群組的序列至少90%一致之核苷酸序列：SEQ ID NO: 25、32、36、54、55及58。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉錄調節元件包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：SEQ ID NO: 25、32、36、54、55及58。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉錄調節元件自5'至3'包含SEQ ID NO: 58、25及32中所示之核苷酸序列。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉錄調節元件包含SEQ ID NO: 36中所示之核苷酸序列。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組進一步包含位於該以緘默方式改變之ARSA編碼序列3'之聚腺苷酸化序列。
- 如請求項14之方法，其中該聚腺苷酸化序列為外源聚腺苷酸化序列。
- 如請求項15之方法，其中該外源聚腺苷酸化序列為SV40聚腺苷酸化序列。
- 如請求項16之方法，其中該SV40聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 42中所示之核苷酸序列。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組進一步包含填充序列。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組進一步包含位於該以緘默方式改變之ARSA編碼序列3'之填充序列。
- 如請求項18或19之方法，其中該填充序列位於該聚腺苷酸化序列的3'。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組包含選自由以下組成之群組之序列：SEQ ID NO: 41、44、46、65、67、75及79。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組進一步包含該基因組的5'之5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列，及該基因組的3'之3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。
- 如請求項22之方法，其中該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少95%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少95%序列一致性。
- 如請求項22之方法，其中該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 26具有至少95%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 27具有至少95%序列一致性。
- 如請求項22之方法，其中該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少95%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：SEQ ID NO: 47、48、49、68、69、76及80。
- 如請求項5至25中任一項之方法，其中異染性白質失養症與芳基硫酸酯酶A（ARSA）基因突變相關。
- 如請求項6至27中任一項之方法，其中該個體為人類個體。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項29之方法，其中：該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
- 如請求項30之方法，其中： （a）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G； （b）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M； （c）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R； （d）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或 （e）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
- 如請求項30之方法，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項33之方法，其中：該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160之胺基酸為D；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
- 如請求項34之方法，其中： （a）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G； （b）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M； （c）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R； （d）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或 （e）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
- 如請求項34之方法，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項37之方法，其中：該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2之胺基酸為T；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65之胺基酸為I；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸68之胺基酸為V；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119之胺基酸為L；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160之胺基酸為D；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501之胺基酸為I；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
- 如請求項38之方法，其中： （a）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2之胺基酸為T，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q； （b）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65之胺基酸為I，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為Y； （c）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K； （d）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119之胺基酸為L，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S； （e）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G； （f）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸296之胺基酸為H，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M； （g）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R； （h）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或 （i）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
- 如請求項38之方法，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列。
- 一種rAAV，其包含： （a）AAV衣殼，其包含AAV衣殼蛋白質；及 （b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。
- 如請求項41之rAAV，其中該以緘默方式改變之ARSA編碼序列編碼SEQ ID NO:23中所示之胺基酸序列。
- 如請求項42之rAAV，其中該以緘默方式改變之ARSA編碼序列包含SEQ ID NO:14中所示之核苷酸序列。
- 如請求項42之rAAV，其中該以緘默方式改變之ARSA編碼序列包含SEQ ID NO:62或72中所示之核苷酸序列。
- 如請求項41至44中任一項之rAAV，其中該轉錄調節元件包含選自由以下組成之群組的元件中之一或多者：細胞巨大病毒（CMV）強化子元件、雞β-肌動蛋白（CBA）啟動子、小型雞β-肌動蛋白（SmCBA）啟動子、鈣調蛋白1（CALM1）啟動子、蛋白脂質蛋白質1（PLP1）啟動子、膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）啟動子、突觸蛋白2（SYN2）啟動子、金屬硫蛋白3（MT3）啟動子及其任何組合。
- 如請求項45之rAAV，其中該轉錄調節元件包含與選自由以下組成之群組的序列至少90%一致之核苷酸序列：SEQ ID NO: 25、32、36、54、55及58。
- 如請求項45之rAAV，其中該轉錄調節元件包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：SEQ ID NO: 25、32、36、54、55及58。
- 如請求項45之rAAV，其中該轉錄調節元件自5'至3'包含SEQ ID NO: 58、25及32中所示之核苷酸序列。
- 如請求項45之rAAV，其中該轉錄調節元件包含SEQ ID NO: 36中所示之核苷酸序列。
- 如請求項41至49中任一項之rAAV，其中該轉移基因組進一步包含位於該以緘默方式改變之ARSA編碼序列3'之聚腺苷酸化序列。
- 如請求項50之rAAV，其中該聚腺苷酸化序列為外源聚腺苷酸化序列。
- 如請求項51之rAAV，其中該外源聚腺苷酸化序列為SV40聚腺苷酸化序列。
- 如請求項52之rAAV，其中該SV40聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 42中所示之核苷酸序列。
- 如請求項41至53中任一項之rAAV，其中該轉移基因組包含選自由以下組成之群組之序列：SEQ ID NO: 41、44、46、65、67、75及79。
- 如請求項41至54中任一項之rAAV，其中該轉移基因組進一步包含該基因組的5'之5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列，及該基因組的3'之3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。
- 如請求項55之rAAV，其中該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少95%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少95%序列一致性。
- 如請求項41至55中任一項之rAAV，其中該轉移基因組包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：SEQ ID NO: 47、48、49、68、69、76及80。
- 如請求項41至55中任一項之rAAV，其中該轉移基因組之核苷酸序列由選自由以下組成之群組之核苷酸序列組成：SEQ ID NO: 47、48、49、68、69、76及80。
- 如請求項41至58中任一項之rAAV，其中該轉移基因組之核苷酸序列由SEQ ID NO: 48中所闡述之核苷酸序列組成。
- 如請求項41至59中任一項之rAAV，其中該衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項60之rAAV，其中：該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸501之胺基酸為I；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO:16之胺基酸690之胺基酸為K；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
- 如請求項61之rAAV，其中： （a）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G； （b）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M； （c）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R； （d）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或 （e）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
- 如請求項61之rAAV，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736之胺基酸序列。
- 如請求項41至63中任一項之rAAV，其中該衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項64之rAAV，其中：該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160之胺基酸為D；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
- 如請求項65之rAAV，其中： （a）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G； （b）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M； （c）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R； （d）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或 （e）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
- 如請求項65之rAAV，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736之胺基酸序列。
- 如請求項41至67中任一項之rAAV，其中該衣殼蛋白質包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項68之rAAV，其中：該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2之胺基酸為T；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65之胺基酸為I；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸68之胺基酸為V；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119之胺基酸為L；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160之胺基酸為D；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206之胺基酸為C；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K；該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C；或該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G。
- 如請求項69之rAAV，其中： （a）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2之胺基酸為T，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312之胺基酸為Q； （b）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65之胺基酸為I，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為Y； （c）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690之胺基酸為K； （d）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119之胺基酸為L，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468之胺基酸為S； （e）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626之胺基酸為G，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718之胺基酸為G； （f）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296之胺基酸為H，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464之胺基酸為N，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681之胺基酸為M； （g）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687之胺基酸為R； （h）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346之胺基酸為A，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R；或 （i）該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501之胺基酸為I，該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505之胺基酸為R，且該衣殼蛋白質中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706之胺基酸為C。
- 如請求項69之rAAV，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736之胺基酸序列。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項41至71中任一項之rAAV。
- 一種聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 14、62及72中所示之核酸序列。
- 一種用於製備rAAV之封裝系統，其中該封裝系統包含 （a）第一核苷酸序列，其編碼一或多種AAV Rep蛋白質； （b）第二核苷酸序列，其編碼如請求項41至71中任一項之AAV之衣殼蛋白質；及 （c）第三核苷酸序列，其包含如請求項41至71中任一項之AAV之rAAV基因組序列。
- 如請求項74之封裝系統，其中該封裝系統包含有包含該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列之第一載體，及包含該第三核苷酸序列之第二載體。
- 如請求項74或75之封裝系統，其進一步包含第四核苷酸序列，該第四核苷酸序列包含一或多種輔助病毒基因。
- 如請求項76之封裝系統，其中該第四核苷酸序列包含於第三載體內。
- 如請求項74至77中任一項之封裝系統，其中該第四核苷酸序列包含一或多種來自選自由以下組成之群組的病毒之基因：腺病毒、疱疹病毒、痘瘡病毒及細胞巨大病毒（CMV）。
- 如請求項74至78中任一項之封裝系統，其中該第一載體、第二載體及/或該第三載體為質體。
- 一種用於rAAV之重組製備之方法，該方法包含在可產生該rAAV之條件下將如請求項74至79中任一項之封裝系統引入細胞中。
- 如請求項41至71中任一項之rAAV、如請求項72之醫藥組成物或如請求項73之聚核苷酸，其適用作藥劑。
- 如請求項41至71中任一項之rAAV、如請求項72之醫藥組成物或如請求項73之聚核苷酸，其係用於治療MLD。
- 如請求項41至71中任一項之rAAV、如請求項72之醫藥組成物或如請求項73之聚核苷酸，其係用於用以治療患有MLD之個體之方法中，該方法包含向該個體投與有效量之該rAAV、該醫藥組成物或該聚核苷酸。
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