CN117897492A - 用于肌肉和cns中的基因表达的杂合启动子 - Google Patents

用于肌肉和cns中的基因表达的杂合启动子 Download PDF

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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

本发明涉及新型杂合启动子。本发明还涉及含有所述杂合启动子的表达盒和载体。本文还公开了实施这些杂合启动子的方法，特别是基因治疗的方法。

Description

用于肌肉和CNS中的基因表达的杂合启动子
技术领域
本发明涉及驱动肌肉和CNS中的基因表达的杂合启动子。本发明还涉及含有所述杂合启动子的表达盒和载体。本文还公开了实施这些杂合启动子的方法，特别是基因治疗的方法。
背景技术
需要同时靶向肌肉和中枢神经系统(CNS)的神经肌肉障碍代表了基于体内的基因治疗的主要挑战之一。具体来说，高效转导这两种组织所需的高剂量载体可能在肝脏中诱导毒性。然而，对于许多疾病而言，转入基因在所需靶组织中的表达不足和抗转入基因免疫仍然代表了实现成功基因治疗的重要障碍。因此，仍然需要提供转入基因在感兴趣的细胞中的强表达，但应在低剂量载体下，以防止载体的潜在毒性和针对载体的免疫应答。
腺相关载体(AAV)是一种为体内基因治疗选择的载体。在AAV基因治疗中使用的转入基因表达盒可以包含不同的元件例如增强子和启动子，从而允许调节感兴趣的基因在靶细胞中表达的功效和特异性。组成型启动子例如CMV或CAG诱导强表达，但缺乏组织特异性，并可能驱动针对转入基因的免疫应答。
在这里，我们描述了杂合启动子的鉴定，所述杂合启动子允许在肌肉和CNS中强烈的特异性表达，并减少对肝脏的靶向，从而降低免疫/毒性反应的风险。因此，本发明的杂合启动子允许减少给药的载体的剂量，或者在同等剂量下获得更强的表达。
发明内容
本发明提供了实施具有肌肉/CNS特异性而不靶向肝脏的新型杂合启动子的遗传工程策略。这些杂合启动子可用于神经肌肉疾病的基因治疗。这些新型杂合启动子是基于一个或多个肝选择性增强子与两个肌肉选择性启动子的组合使用。在特定实施方式中，所述新型杂合启动子是基于下述组合：(i)一个或多个肝选择性增强子，(ii)第一肌肉特异性增强子，第一肌肉特异性增强子是CK6启动子或其功能性变体，和(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
令人吃惊的是，本文中显示此类杂合启动子导致转入基因在肌肉和脊髓中的强表达，而不靶向肝脏。
WO 2020/208032描述了当将肌肉选择性启动子与一种或多种肝选择性增强子融合时其转入基因表达的改善。令人吃惊的是，本文中显示，将肝选择性增强子与第一肌肉选择性启动子和第二肌肉选择性启动子组合在同一个表达盒中产生与下述表达相比的协同效应：
-由肝选择性增强子与所述第一肌肉选择性启动子的组合产生的表达；和
-由肝选择性增强子与所述第二肌肉选择性启动子的组合产生的表达。
因此，本发明的第一方面涉及一种核酸分子，其包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)一个或多个肝选择性增强子；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、Acta1启动子、MCK启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、Acta1启动子或其功能性变体，所述第二肌肉选择性启动子更优选为spC5-12启动子、CK6启动子、或其功能性变体，所述第二肌肉选择性启动子甚至更优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，所述核酸分子以5’至3’的顺序包含：
-所述一个或多个肝选择性增强子、所述第一肌肉选择性启动子和所述第二肌肉选择性启动子；
或
-所述一个或多个肝选择性增强子、所述第二肌肉选择性启动子和所述第一肌肉选择性启动子。
在特定实施方式中，所述第一肌肉选择性启动子(即CK6或其功能性变体)位于所述第二肌肉选择性启动子的5’末端上游。在更特定实施方式中，所述CK6启动子或其功能性变体位于所述spc5.12启动子或其功能性变体的5’末端上游。在更特定实施方式中，所述CK6启动子或其功能性变体位于所述CK8启动子或其功能性变体的5’末端上游。在更特定实施方式中，所述CK6启动子或其功能性变体位于第二CK6启动子或其功能性变体的5’末端上游。在更特定实施方式中，所述CK6启动子或其功能性变体位于所述Acta1启动子或其功能性变体的5’末端上游。
在特定实施方式中，所述核酸分子以5’至3’的顺序包含：
-所述一个或多个肝选择性增强子
-CK6启动子或其功能性变体，和
-spC5-12启动子或其功能性变体、CK8启动子或其功能性变体、CK6启动子或其功能性变体、或Acta1启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，所述核酸分子以5’至3’的顺序包含：
-所述一个或多个肝选择性增强子
-CK6启动子或其功能性变体，和
-spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，所述CK6启动子由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：35、优选为SEQ ID NO：7中示出的序列，或序列与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：35、优选为SEQ ID NO：7具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：35、优选为SEQ ID NO：7具有至少85％同一性，特别是至少90％同一性，更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体组成。
在另一个特定实施方式中，所述spC5-12启动子由SEQ ID NO：4、5或6中示出的序列，或序列与SEQ ID NO：4、5或6具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：4、5或6具有至少85％同一性，特别是至少90％同一性，更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体组成。优选地，所述spC5-12启动子由SEQID NO：6中示出的序列，或序列与SEQ ID NO：6具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：6具有至少85％同一性，特别是至少90％同一性，更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体组成。
在另一个特定实施方式中，所述CK8启动子由SEQ ID NO：33或34中示出的序列，或序列与SEQ ID NO：33或34具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：33或34具有至少85％同一性，特别是至少90％同一性，更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体组成。优选地，所述CK8启动子由SEQ ID NO：33中示出的序列，或序列与SEQ ID NO：33具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：33具有至少85％同一性，特别是至少90％同一性，更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体组成。
在另一个特定实施方式中，所述Acta1启动子由SEQ ID NO：37中示出的序列，或序列与SEQ ID NO：37具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：37具有至少85％同一性，特别是至少90％同一性，更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体组成。
在另一个特定实施方式中，所述核酸分子包含可操作地连接到所述肌肉选择性启动子的一个肝选择性增强子。在另一个实施方式中，所述核酸分子包含可操作地连接到所述肌肉选择性启动子的多个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括至少两个肝选择性增强子。在另一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括三个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述核酸分子包含一个、两个或三个肝选择性增强子，更具体来说为三个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子中的所有肝选择性增强子具有相同序列。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括具有相同序列的三个肝选择性增强子。在另一个特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括具有相同序列的三个肝选择性增强子，其中所述序列包含SEQ ID NO：1或由其组成。
优选地，所述肝选择性增强子包含选自下述的序列或由所述序列组成：SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42和SEQID NO：43，或与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ IDNO：41，SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的序列中的任一者具有80％同一性，例如至少85％、特别是至少90％、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体；或
-所述多个肝选择性增强子包括至少一个肝选择性增强子，所述至少一个肝选择性增强子包含选自下述的序列或由所述序列组成：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：16，SEQ IDNO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43，或与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQID NO：43的序列中的任一者具有80％同一性，例如至少85％、特别是至少90％、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体。
在优选实施方式中，所述肝选择性增强子的序列包含SEQ ID NO：1或由其组成，或者是序列与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性，特别是至少90％同一性，更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体。在更优选实施方式中，所述多个肝选择性增强子由SEQID NO：1的三个重复序列，或序列与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性，特别是至少90％同一性，更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体的三个重复序列组成。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46组成，或者是序列与SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46具有至少80％同一性，例如至少85％同一性，特别是至少90％同一性，更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体。
本发明的杂合启动子可以被可操作地连接到感兴趣的转入基因。因此，本发明还涉及一种表达盒，其包含可操作地连接到感兴趣的转入基因的本文描述的核酸分子。
本发明还涉及一种载体，其包含上述表达盒。在特定实施方式中，所述载体是质粒载体。在另一个实施方式中，所述载体是病毒载体。代表性的病毒载体包括但不限于腺病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体和细小病毒载体，例如AAV载体。在特定实施方式中，所述病毒载体是AAV载体，例如包含AAV8或AAV9衣壳的AAV载体。
本发明还涉及一种分离的重组细胞，其包含根据本发明所述的核酸构建体或表达盒或载体。
本发明还涉及一种药物组合物，其在药学上可接受的载体中包含本发明的载体或分离的细胞。
此外，本发明还涉及本文公开的表达盒、载体或分离的细胞，其用作药物。就此而言，包含在所述表达盒、载体或分离的细胞中的感兴趣的转入基因是治疗性转入基因。
本发明还涉及本文公开的表达盒、载体或分离的细胞，其用于基因治疗。
另一方面，本发明涉及本文公开的表达盒、载体或分离的细胞，其用于治疗神经肌肉障碍。
具体而言，所述神经肌肉障碍可以选自肌营养不良症(例如肌强直性营养不良症(Steinert病)、杜氏肌营养不良症、贝克氏肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、远端型肌营养不良症、Emery-Dreifuss肌营养不良症、运动神经元疾病(例如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩症(婴儿进行性脊髓性肌萎缩症(1型、Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌萎缩症(2型)、青少年脊髓性肌萎缩症(3型、Kugelberg-Welander病)、成人脊髓性肌萎缩症(4型))、脊髓延髓肌萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、神经肌肉接头疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、周围神经疾病(例如Charcot-Marie-Tooth病、弗里德希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)、肌肉代谢疾病(例如磷酸化酶缺乏症(McArdle病)、酸性麦芽糖酶缺乏症(庞贝病)、磷酸果糖激酶缺乏症(Tarui病)、脱支酶缺乏症(科里病或福布斯病)、线粒体肌病、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症)、由内分泌异常引起的肌病(例如甲状腺功能亢进性肌病、甲状腺功能减退性肌病)和其他肌病(例如先天性肌强直症、先天性副肌强直症、中央轴空病、线状体肌病、肌管性肌病、周期性瘫痪)。
在另一个特定实施方式中，所述疾病是科里病，并且所述感兴趣的转入基因是GDE，例如截短形式的GDE。在另一个特定实施方式中，所述疾病是庞贝病。
附图说明
图1.(A)增强子/启动子组合(P1至P5)的示意图。
图2.体内方案的计划图。将小鼠在第0天用编码在P1、P3或P4的转录控制下的鼠分泌型碱性磷酸酶(mSeAP)的AAV载体注射，并在载体注射后1个月处死。
图3.带有增强子/启动子的不同组合(P1、P3或P4)的AAV载体具有相近的体内转导效率。从注射小鼠的组织提取DNA，并通过qPCR定量肝脏和四头肌中的转导效率。数据被表示为每个细胞的载体基因组拷贝数(VGCN)。
图4.A)肝脏、B)肌肉(心肌、膈肌、四头肌和三头肌)和C)脊髓中的mSEAP表达。数据被表示为在组织中定量的mSeAP与总蛋白的比率。统计分析通过ANOVA来进行。*＝与PBS相比p<0.05。
图5.体内方案的计划图。将小鼠在第0天用编码在P1-P5的转录控制下的酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的AAV载体注射，并在载体注射后1个月处死。
图6.带有增强子/启动子的不同组合(P1至P5)的AAV载体具有相近的体内转导效率。从注射小鼠的组织提取DNA，并通过qPCR定量心脏中的转导效率。数据被表示为每个细胞的载体基因组拷贝数(VGCN)。
图7.心脏中的GAA表达(A)、定量(B)和Western印迹(C)。数据被表示为在心脏中定量的GAA与总蛋白的比率。统计分析通过ANOVA来进行。*＝与PBS相比p<0.05。
图8.四头肌中的GAA表达(A)、定量(B)和Western印迹(C)。数据被表示为在四头肌中定量的GAA与总蛋白的比率。统计分析通过ANOVA来进行。*＝与PBS相比p<0.05。
图9.(A)增强子/启动子组合(P1至P3)的示意图。(B)体内方案的计划图。将小鼠在第0天用编码在P1-P3的转录控制下的酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的AAV载体注射，并在载体注射后1个月处死。
图10.(A)心脏中的载体基因组拷贝数(VGCN)。通过Western印迹定量的心脏(B-C)和四头肌(D-E)中的GAA表达。数据被表示为在心脏和四头肌中定量的GAA与黏着斑蛋白的比率。统计分析通过ANOVA来进行。*＝与PBS相比p<0.05。
图11.(A)增强子/启动子组合(P1至P4)的示意图。(B)体内方案的计划图。将小鼠在第0天用编码在P1-P4的转录控制下的酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的AAV载体注射，并在载体注射后1个月处死。
图12.(A)心脏中的载体基因组拷贝数(VGCN)。通过Western印迹定量的四头肌中的GAA表达(B)。
具体实施方式
定义
在本发明的上下文中，“转录调控元件”是能够在组织或细胞中驱动或增强转入基因的表达的DNA序列。
在本发明的上下文中，表述“肝选择性增强子”包括天然或合成的肝选择性增强子。此外，表述“肌肉选择性启动子”包括天然或合成的肌肉选择性启动子。
根据本发明，组织选择性意味着与另一种组织中的表达相比，转录调控元件偏好性地驱动(在启动子的情况下)或增强(在增强子的情况下)与所述转录调控元件可操作连接的基因在给定组织或一组组织中的表达。“组织选择性”的这个定义并不排除组织选择性转录调控元件(如肌肉选择性启动子)在某种程度上渗漏的可能性。所谓“渗漏”或其变化形式意味着肌肉选择性启动子在另一个组织中驱动或提高与所述启动子可操作连接的转入基因的表达的可能性，尽管表达水平较低。例如，肌肉选择性启动子可能在肝组织中渗漏，这意味着由该启动子驱动的表达在肌肉组织中比在肝组织中更高。或者，组织选择性转录调控元件可以是“组织特异性”转录调控元件，意味着该转录调控元件不仅以偏好性方式驱动或增强在给定组织或一组组织中的表达，而且该调控元件不驱动或增强或仅仅轻微地驱动或增强在其他组织中的表达。
表述“肝选择性增强子”表示在增强转入基因在肝脏中的表达方面特别有效的增强子。例如，Chua等人描述了一种能够鉴定肝选择性转录模块的全基因组计算机方法(Chua等，2014Molecular Therapy vol.22no.9,1605–1613)。具体而言，肝特异性增强子如Chua等中所定义。具体而言，肝选择性增强子是与高表达的肝特异性启动子相关的顺式调控模块。具体而言，肝特异性增强子是一种顺式调控模块，其包含与稳健的肝细胞特异性表达相关的进化保守的转录因子结合位点基序簇。
根据本发明，“感兴趣的转入基因”是指编码RNA或蛋白质产物的多核苷酸序列，其可以被引入到细胞中用于所寻求的目的，并且能够在适当条件下表达。感兴趣的转入基因可以编码感兴趣的产物，例如感兴趣的治疗或诊断产物。在特定实施方式中，所述感兴趣的转入基因是治疗性转入基因，即编码感兴趣的治疗性产物的转入基因。治疗性转入基因被选择并用于产生所需的治疗结果，特别是实现所述治疗性转入基因在需要表达所述治疗性转入基因的细胞、组织或器官中的表达。治疗可以通过多种方式来实现，包括通过将蛋白质在不表达所述蛋白质的细胞中表达，通过将蛋白质在表达所述蛋白质的突变版本的细胞中表达，通过表达对它在其中表达的靶细胞有毒的蛋白质(用于例如杀死不想要的细胞如癌细胞的策略)，通过表达反义RNA以诱导基因阻遏或外显子跳跃，或通过表达其目的在于抑制蛋白质的表达的沉默RNA例如shRNA或微小RNA。感兴趣的转入基因还可以编码用于靶向基因组工程的核酸酶，例如CRISPR相关蛋白9(Cas9)核酸内切酶、大范围核酸酶或转录激活物样效应核酸酶(TALEN)。感兴趣的转入基因也可以是与CRISPR/Cas9系统一起使用的向导RNA或一组向导RNA，或与如上所述的核酸酶一起用于靶向基因组工程策略的校正矩阵。其他感兴趣的转入基因包括但不限于合成的长非编码RNA(Carrieri等，2012,Nature 491:454-7；Zucchelli等，2015,RNA Biol 12(8):771-9；Indrieri等，2016,Sci Rep 6:27315)和人工微小RNA。下文描述了在本发明的实践中有用的其他感兴趣的特定转入基因。
通常，“可操作连接”意味着将一个核酸序列与另一个核酸序列置于功能关系中，使每个核酸序列都能发挥其预期功能。可操作连接的两个序列可以直接彼此融合，或者可以通过接头序列连接。
术语“功能性变体”是指感兴趣的核酸分子的“功能性衍生物”、“片段”、“类似物”或“同源物”，其至少部分保留了所述感兴趣的核酸分子的生物活性。功能性变体的活性可以是所述感兴趣的核酸分子的活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。例如，感兴趣的肌肉选择性启动子的功能性变体是活性为所述肌肉选择性启动子的活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的变体，其中所述活性对应于增强特定转入基因在肌肉中的转录的能力。
术语“同一性”及其变化形式是指两个核酸分子之间的序列同一性。当两个所比较序列两者中的位置被相同碱基占据时，则所述分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分数是所述两个序列共有的匹配位置的数目除以所比较的位置数目再乘以100的函数。例如，如果两个序列中的10个位置中的6个位置匹配，则所述两个序列的同一性为60％。通常，在将两个序列对齐以给出最大同一性时做出比较。本领域技术人员已知的各种生物信息学工具可用于比对核酸序列，例如BLAST或FASTA。
根据本发明，术语“治疗”包括治愈、缓解或预防效果。因此，治疗性和预防性治疗包括改善障碍的症状或预防或以其他方式降低发展出特定障碍的风险。治疗可以被施用以延迟、减缓或逆转疾病和/或其一种或多种症状的进展。术语“预防”可以被认为是减少特定病症的严重程度或发作。“预防”还包括在以前被诊断为患有特定病症的患者中防止所述病症的复发。“治疗”也可以是指减轻现有病症的严重程度。所谓“治疗量”意味着当给药到患有所述障碍的患者时足以引起所述障碍的症状的定性或定量降低的量。
在本发明的上下文中，治疗的受试者是动物，特别是哺乳动物，更特别是人类受试者。在特定实施方式中，所述哺乳动物可以是婴儿或成年受试者，例如本文所述的人类婴儿或成人。
所谓“治疗上感兴趣的细胞”或“治疗上感兴趣的组织”在本文中意味着所述治疗性转入基因在其中的表达可以治疗障碍的主要细胞或组织。在本发明中，所述感兴趣的组织是肌肉组织和/或CNS组织。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
杂合启动子
本发明人设计了一种转录调控元件的组合，在本文中也被称为“杂合启动子”，用于提高基因治疗在肌肉和CNS中的功效，同时减少在肝脏中的靶向，并遵守基因治疗载体的尺寸限制，例如AAV载体的尺寸限制。
本发明的核酸分子包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：一个或多个肝选择性增强子和两个肌肉特异性启动子。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)一个或多个肝选择性增强子；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或CK6启动子或其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子更优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
所述肝选择性增强子或多个肝选择性增强子可以选自本领域技术人员已知的肝选择性增强子。在特定实施方式中，本发明的核酸分子包含一个且仅仅一个肝选择性增强子。在这个实施方式中，所述肝选择性增强子的尺寸可以是10至500个核苷酸，例如10至175个核苷酸，特别是40至100个核苷酸，特别是50至80个核苷酸，更特别是70至75个核苷酸。在其中实施多个肝选择性增强子的另一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子的组合的尺寸可以是10至500个核苷酸，例如40至400个核苷酸，特别是70至250个核苷酸。在优选实施方式中，对应于所述肝选择性增强子或多个肝选择性增强子的序列的尺寸可以具有50至450pb的长度。在特定实施方式中，对应于所述肝选择性增强子或多个肝选择性增强子的序列的尺寸具有至少50pb，例如至少100pb、至少150pb、至少200pb或至少250pb的长度。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是与在肝细胞中选择性表达的基因呈顺式放置的天然存在的增强子。在另一个特定实施方式中，所述肝选择性增强子可以是人工肝选择性增强子。
在本发明的实践中有用的说明性人工肝选择性增强子包括但不限于在Chuah等，Molecule Therapy,2014,vol.22,no.9,p.1605中公开的那些，特别是HS-CRM1(SEQ ID NO：16)、HS-CRM2(SEQ ID NO：17)、HS-CRM3(SEQ ID NO：18)、HS-CRM4(SEQ ID NO：19)、HS-CRM5(SEQ ID NO：20)、HS-CRM6(SEQ ID NO：21)、HS-CRM7(SEQ ID NO：22)、HS-CRM8(SEQ ID NO：1)、HS-CRM9(SEQ ID NO：23)、HS-CRM10(SEQ ID NO：24)、HS-CRM11(SEQ ID NO：25)、HS-CRM12(SEQ ID NO：26)、HS-CRM13(SEQ ID NO：27)和HS-CRM14(SEQ ID NO：28)。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子可以选自HS-CRM1、HS-CRM2、HS-CRM3、HS-CRM5、HS-CRM6、HS-CRM7、HS-CRM8、HS-CRM9、HS-CRM10、HS-CRM11、HS-CRM13和HS-CRM14。在另一个特定实施方式中，所述肝选择性增强子可以选自HS-CRM2、HS-CRM7、HS-CRM8、HS-CRM11、HS-CRM13和HS-CRM14。
在本发明的实践中有用的其他说明性肝选择性增强子包括载脂蛋白E增强子(ApoE–增强子序列示出在SEQ ID NO：39中)。
在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是由SEQ ID NO：39组成的Apo-E增强子或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：39的功能性变体。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是Apo-E增强子的功能性变体，其与SEQ ID NO：39具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：39具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性，其中所述功能性变体具有肝选择性增强子活性。
在本发明的实践中有用的其他说明性肝选择性增强子包括如WO2009/130208中所述的增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)和增强子S2(SEQ ID NO：43)(参考WO2009/130208的第30页上的表III)。
在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是调控ApoH基因的表达的增强子A3(基因组位置序列：chr17：61597650-61598200)。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是由SEQ ID NO：40组成的增强子A3或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：40的功能性变体。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是增强子A3的功能性变体，其与SEQ ID NO：40具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：40具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性，其中所述功能性变体具有肝选择性增强子活性。
在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是调控FGA基因的表达的增强子F(基因组位置序列：chr4：155869502-155869575)。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是由SEQ ID NO：41组成的增强子F或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：41的功能性变体。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是增强子F的功能性变体，其与SEQ ID NO：41具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：41具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性，其中所述功能性变体具有肝选择性增强子活性。
在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是调控SERPINA1基因的表达的增强子S1(基因组位置序列：chr14：93891375-93891462)。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是由SEQ ID NO：42组成的增强子S1或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：42的功能性变体。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是增强子S1的功能性变体，其与SEQ IDNO：42具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：42具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性，其中所述功能性变体具有肝选择性增强子活性。
在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是调控SERPINA1基因的表达的增强子S2(基因组位置序列：chr14：93897160-93897200)。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是由SEQ ID NO：43组成的增强子S2或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：43的功能性变体。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是增强子S1的功能性变体，其与SEQ IDNO：43具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：43具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性，其中所述功能性变体具有肝选择性增强子活性。
在特定实施方式中，所述肝选择性增强子选自ApoE增强子、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQ ID NO：43)、HS-CRM1、HS-CRM2、HS-CRM3、HS-CRM5、HS-CRM6、HS-CRM7、HS-CRM8、HS-CRM9、HS-CRM10、HS-CRM11、HS-CRM13和HS-CRM14。
在特定实施方式中，所述肝选择性增强子选自ApoE增强子、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQ ID NO：43)和HS-CRM8。
在特定实施方式中，所述肝选择性增强子选自ApoE增强子和HS-CRM8。
在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是HS-CRM8。
在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是由SEQ ID NO：1组成的HS-CRM8增强子或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：1的功能性变体。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是HS-CRM8增强子的功能性变体，其与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性，其中所述功能性变体具有肝选择性增强子活性。在多个肝选择性增强子的情况下，所述增强子可以直接融合或被接头(相同或不同的接头)隔开。直接融合意味着增强子的第一个核苷酸紧接在上游增强子的最后一个核苷酸之后。在通过接头连接的情况下，在上游增强子的最后一个核苷酸与后面的下游增强子的第一个核苷酸之间存在核苷酸序列。例如，所述接头的长度可以包括1至50个核苷酸，例如1至40个核苷酸，例如1至30个核苷酸，例如1至20个核苷酸，例如1至10个核苷酸。在本发明中，核酸分子的设计可能将上面提到的尺寸限制考虑在内，因此此类接头(如果存在的话)优选是短的。代表性的短接头包括由少于15个核苷酸、特别是少于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3个或少于2个核苷酸组成的核酸序列，例如1个核苷酸的接头。在特定实施方式中，所述接头是限制性位点。在特定实施方式中，所述接头是AAGCTT。
在特定实施方式中，所述核酸分子包含多个肝选择性增强子，即至少两个肝选择性增强子或至少三个肝选择性增强子。肝选择性增强子的数目可以由专业技术人员根据其表达由本发明的核酸分子控制的转入基因的尺寸来确定。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括至少两个肝选择性增强子和至多十个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括至少两个肝选择性增强子和至多六个肝选择性增强子。在又一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括两个肝选择性增强子。在另一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括三个肝选择性增强子。在另一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括四个肝选择性增强子。在又一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括五个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述核酸分子包含一个、两个或三个肝选择性增强子，更特别地一个或三个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子中的所有肝选择性增强子具有相同序列。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子中的至少两个肝选择性增强子具有不同的序列。
在特定实施方式中，所述核酸分子包含如上所述由SEQ ID NO：42组成的S1增强子或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：42的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列。
在特定实施方式中，所述核酸分子包含如上所述由SEQ ID NO：43组成的S2增强子或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：43的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列。
在特定实施方式中，所述核酸分子包含如上所述由SEQ ID NO：41组成的增强子F或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：41的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列。在特定实施方式中，所述核酸分子包含如上所述由SEQ ID NO：41组成的增强子F或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：41的功能性变体的3个重复序列。
在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子中的所有肝选择性增强子具有相同序列。在优选实施方式中，所述多个肝选择性增强子中的所有肝选择性增强子具有相同序列，其是如上所述SEQ ID NO：1的序列或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：1的功能性变体。
在特定实施方式中，所述核酸分子包含如上所述由SEQ ID NO：1组成的HS-CRM8增强子或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：1的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列。在特定实施方式中，本发明的核酸分子包含由SEQ ID NO：1组成的HS-CRM8增强子或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：1的功能性变体的3个重复序列。在另一个实施方式中，本发明的核酸分子包含HS-CRM8增强子的功能性变体的3个重复序列，所述功能性变体与SEQID NO：1具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性，其中所述功能性变体具有肝选择性增强子活性。所述肝选择性增强子活性可以如Chua等(Chua等，2014Molecular Therapy vol.22no.9,1605–1613)中所述来确定。
在特定实施方式中，对应于所述多个肝选择性增强子的序列是SEQ ID NO：2或SEQID NO：3，或与SEQ ID NO：2或3具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：2或3具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的功能性变体。SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3包含SEQ ID NO：1的HS-CRM8增强子的3个重复序列。
此外但任选地，所述核酸分子可以包含其他肝选择性增强子或其他多个肝选择性增强子。根据这个实施方式，所述核酸分子可以以5’至3’的顺序包含：
-第一肝选择性增强子或第一组多个肝选择性增强子，例如两个或三个肝选择性增强子；
-如上所定义的第一肌肉选择性启动子(即CK6启动子或其功能性变体)；
-第二肝选择性增强子或第二组多个肝选择性增强子，例如两个或三个肝选择性增强子；和
-如上所定义的第二肌肉选择性启动子。
根据这个实施方式的另一种变化形式，所述核酸分子可以以5’至3’的顺序包含：
-第一肝选择性增强子或第一组多个肝选择性增强子，例如两个或三个肝选择性增强子；
-如上所定义的第二肌肉选择性启动子(即选自下述的肌肉选择性启动子：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12或其功能性变体)；
-第二肝选择性增强子或第二组多个肝选择性增强子，例如两个或三个肝选择性增强子；和
-如上所定义的第一肌肉选择性启动子(即CK6启动子或其功能性变体)。
根据这个实施方式，所述第一肝选择性增强子或第一组多个肝选择性增强子和所述第二肝选择性增强子或第二组多个肝选择性增强子可以是任何如上所述的肝选择性增强子或多个肝选择性增强子。
在特定实施方式中，所述核酸分子可以以5’至3’的顺序包含：
-第一肝选择性增强子或第一组多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子选自ApoE增强子(SEQ ID NO：39)、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQ ID NO：43)、HS-CRM1(SEQ ID NO：16)、HS-CRM2(SEQID NO：17)、HS-CRM3(SEQ ID NO：18)、HS-CRM4(SEQ ID NO：19)、HS-CRM5(SEQ ID NO：20)、HS-CRM6(SEQ ID NO：21)、HS-CRM7(SEQ ID NO：22)、HS-CRM8(SEQ ID NO：1)、HS-CRM9(SEQID NO：23)、HS-CRM10(SEQ ID NO：24)、HS-CRM11(SEQ ID NO：25)、HS-CRM12(SEQ ID NO：26)、HS-CRM13(SEQ ID NO：27)和HS-CRM14(SEQ ID NO：28)，特别是HS-CRM8(SEQ ID NO：1)；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；
-第二肝选择性增强子或第二组多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子选自ApoE增强子(SEQ ID NO：39)、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQ ID NO：43)、HS-CRM1(SEQ ID NO：16)、HS-CRM2(SEQID NO：17)、HS-CRM3(SEQ ID NO：18)、HS-CRM4(SEQ ID NO：19)、HS-CRM5(SEQ ID NO：20)、HS-CRM6(SEQ ID NO：21)、HS-CRM7(SEQ ID NO：22)、HS-CRM8(SEQ ID NO：1)、HS-CRM9(SEQID NO：23)、HS-CRM10(SEQ ID NO：24)、HS-CRM11(SEQ ID NO：25)、HS-CRM12(SEQ ID NO：26)、HS-CRM13(SEQ ID NO：27)和HS-CRM14(SEQ ID NO：28)，特别是HS-CRM8(SEQ ID NO：1)；和
-选自下述的肌肉选择性启动子：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12或其功能性变体。
根据这个实施方式的另一种变化形式，所述核酸分子可以以5’至3’的顺序包含：
-第一肝选择性增强子或第一组多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子选自ApoE增强子(SEQ ID NO：39)、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQ ID NO：43)、HS-CRM1(SEQ ID NO：16)、HS-CRM2(SEQID NO：17)、HS-CRM3(SEQ ID NO：18)、HS-CRM4(SEQ ID NO：19)、HS-CRM5(SEQ ID NO：20)、HS-CRM6(SEQ ID NO：21)、HS-CRM7(SEQ ID NO：22)、HS-CRM8(SEQ ID NO：1)、HS-CRM9(SEQID NO：23)、HS-CRM10(SEQ ID NO：24)、HS-CRM11(SEQ ID NO：25)、HS-CRM12(SEQ ID NO：26)、HS-CRM13(SEQ ID NO：27)和HS-CRM14(SEQ ID NO：28)，特别是HS-CRM8(SEQ ID NO：1)；
-选自下述的肌肉选择性启动子：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12或其功能性变体；
-第二肝选择性增强子或第二组多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子选自ApoE增强子(SEQ ID NO：39)、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQ ID NO：43)、HS-CRM1(SEQ ID NO：16)、HS-CRM2(SEQID NO：17)、HS-CRM3(SEQ ID NO：18)、HS-CRM4(SEQ ID NO：19)、HS-CRM5(SEQ ID NO：20)、HS-CRM6(SEQ ID NO：21)、HS-CRM7(SEQ ID NO：22)、HS-CRM8(SEQ ID NO：1)、HS-CRM9(SEQID NO：23)、HS-CRM10(SEQ ID NO：24)、HS-CRM11(SEQ ID NO：25)、HS-CRM12(SEQ ID NO：26)、HS-CRM13(SEQ ID NO：27)和HS-CRM14(SEQ ID NO：28)，特别是HS-CRM8(SEQ ID NO：1)；和
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：39的Apo-E增强子或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子、CK6启动子或其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子更优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：39的Apo-E增强子或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子、CK6启动子或其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子更优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：39的Apo-E增强子或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是SEQ ID NO：7的CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子是SEQ ID NO：4、5或6的spC5-12启动子，特别是SEQ ID NO：6中示出的序列或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：40的增强子A3或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：40的增强子A3或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是SEQ ID NO：7的CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子是SEQ ID NO：4、5或6的spC5-12启动子，特别是SEQ ID NO：6中示出的序列或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：41的增强子F或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：41的增强子F或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是SEQ ID NO：7的CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子是SEQ ID NO：4、5或6的spC5-12启动子，特别是SEQ ID NO：6中示出的序列或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
-第一组多个肝选择性增强子，所述第一组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：41的增强子F或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列组成；
-(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
-(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
-第一组多个肝选择性增强子，所述第一组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：41的增强子F或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的3个重复序列组成；
-(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
-(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：42的增强子S1或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、Acta1启动子、MCK启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：42的增强子S1或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是SEQ ID NO：7的CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子是SEQ ID NO：4、5或6的spC5-12启动子，特别是SEQ ID NO：6中示出的序列或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
-第一组多个肝选择性增强子，所述第一组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：42的增强子S1或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列组成；
-(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
-(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：43的增强子S2或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
(i)SEQ ID NO：43的增强子S2或其功能性变体；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是SEQ ID NO：7的CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子是SEQ ID NO：4、5或6的spC5-12启动子，特别是SEQ ID NO：6中示出的序列或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子优选地以5’至3’的顺序包含彼此可操作连接的下述转录调控元件：
-第一组多个肝选择性增强子，所述第一组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：43的增强子S2或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列组成；
-(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
-(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，所述核酸分子可以以5’至3’的顺序包含：
-第一组多个肝选择性增强子，所述第一组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列组成；
-第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；
-第二组多个肝选择性增强子，所述第二组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列组成；和
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，所述核酸分子可以以5’至3’的顺序包含：
-第一组多个肝选择性增强子，所述第一组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列组成；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体；
-第二组多个肝选择性增强子，所述第二组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的1、2、3、4或5个重复序列组成；和
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，所述核酸分子可以以5’至3’的顺序包含：
-第一组多个肝选择性增强子，所述第一组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的3个重复序列组成；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；
-第二组多个肝选择性增强子，所述第二组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的3个重复序列组成；和
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，所述核酸分子可以以5’至3’的顺序包含：
-第一组多个肝选择性增强子，所述第一组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的3个重复序列组成；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自：spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体；
-第二组多个肝选择性增强子，所述第二组多个肝选择性增强子由如上所述SEQID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其具有肝选择性增强子活性的功能性变体的3个重复序列组成；和
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，所述CK6启动子或其功能性变体的序列选自：
-由SEQ ID NO：7中示出的序列组成的序列；
-当与SEQ ID NO：7相比时具有至多10个额外的核苷酸或至多10个缺失的核苷酸的功能性片段，其中所述片段具有肌肉选择性启动子活性；
-作为SEQ ID NO：7中示出的序列的功能性变体的序列，其由与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：7具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列组成。
所谓CK6的“功能性变体”意味着至少部分保留了CK6启动子的生物活性的变体。所述功能性变体可以具有所述CK6启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性。例如，CK6启动子的功能性变体是具有CK6启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性的变体，其中所述活性对应于CK6增强特定转入基因在肌肉中的转录的能力。在特定实施方式中，所述CK6启动子的序列由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：35或其功能性变体组成，所述功能性变体的序列与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：35具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：35具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性。
在特定实施方式中，所述第二肌肉选择性启动子是合成启动子C5.12(spC5.12，在本文中也被称为“C5.12”)，例如在SEQ ID NO：4、5或6中示出的spC5.12或在Wang等，GeneTherapy，第15卷，第1489–1499页(2008)中公开的spC5.12启动子。在特定实施方式中，所述spC5-12启动子或其功能性变体的序列选自：
-由SEQ ID NO：4、5或6中示出的序列、特别是SEQ ID NO：6中示出的序列组成的序列；
-当与SEQ ID NO：4、5或6相比时，特别是当与SEQ ID NO：6相比时具有至多10个额外的核苷酸或至多10个缺失的核苷酸的功能性片段，其中所述片段具有肌肉选择性启动子活性；
-作为SEQ ID NO：4、5或6中示出的序列、特别是SEQ ID NO：6中示出的序列的功能性变体的序列，其由与SEQ ID NO：4、5或6中的任一者、特别是SEQ ID NO：6具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：4、5或6中的任一者、特别是SEQ ID NO：6具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列组成。
所谓spC5-12的“功能性变体”意味着至少部分保留了spC5-12启动子的生物活性的变体。所述功能性变体可以具有所述spC5-12启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性。例如，spC5-12启动子的功能性变体是具有spC5-12启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性的变体，其中所述活性对应于spC5-12增强特定转入基因在肌肉中的转录的能力。
在特定实施方式中，所述第二肌肉选择性启动子是CK8启动子。在特定实施方式中，所述CK8启动子或其功能性变体的序列选自：
-由SEQ ID NO：33中示出的序列组成的序列；
-当与SEQ ID NO：33相比时具有至多10个额外的核苷酸或至多10个缺失的核苷酸的功能性片段，其中所述片段具有肌肉选择性启动子活性；
-作为SEQ ID NO：33中示出的序列的功能性变体的序列，其由与SEQ ID NO：33具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：33具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列组成。
所谓CK8的“功能性变体”意味着至少部分保留了CK8启动子的生物活性的变体。所述功能性变体可以具有所述CK8启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性。例如，CK8启动子的功能性变体是具有CK8启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性的变体，其中所述活性对应于CK8增强特定转入基因在肌肉中的转录的能力。在特定实施方式中，所述CK8启动子的序列由SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34或其功能性变体组成，所述功能性变体的序列与SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性。
在特定实施方式中，所述第二肌肉选择性启动子是MCK启动子。在特定实施方式中，所述MCK启动子或其功能性变体的序列选自：
-由SEQ ID NO：36中示出的序列组成的序列；
-当与SEQ ID NO：36相比时具有至多10个额外的核苷酸或至多10个缺失的核苷酸的功能性片段，其中所述片段具有肌肉选择性启动子活性；
-作为SEQ ID NO：36中示出的序列的功能性变体的序列，其由与SEQ ID NO：36具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：36具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列组成。
所谓MCK的“功能性变体”意味着至少部分保留了MCK启动子的生物活性的变体。所述功能性变体可以具有所述MCK启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性。例如，MCK启动子的功能性变体是具有MCK启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性的变体，其中所述活性对应于MCK增强特定转入基因在肌肉中的转录的能力。
在特定实施方式中，所述第二肌肉选择性启动子是Acta1启动子。在特定实施方式中，所述Acta1启动子或其功能性变体的序列选自：
-由SEQ ID NO：37中示出的序列组成的序列；
-当与SEQ ID NO：37相比时具有至多10个额外的核苷酸或至多10个缺失的核苷酸的功能性片段，其中所述片段具有肌肉选择性启动子活性；
-作为SEQ ID NO：37中示出的序列的功能性变体的序列，其由与SEQ ID NO：37具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：37具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列组成。
所谓Acta1的“功能性变体”意味着至少部分保留了Acta1启动子的生物活性的变体。所述功能性变体可以具有所述Acta1启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性。例如，Acta1启动子的功能性变体是具有Acta1启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性的变体，其中所述活性对应于Acta1增强特定转入基因在肌肉中的转录的能力。
在特定实施方式中，所述第二肌肉选择性启动子是结蛋白启动子。在特定实施方式中，所述结蛋白启动子或其功能性变体的序列选自：
-由SEQ ID NO：38中示出的序列组成的序列；
-当与SEQ ID NO：38相比时具有至多10个额外的核苷酸或至多10个缺失的核苷酸的功能性片段，其中所述片段具有肌肉选择性启动子活性；
-作为SEQ ID NO：38中示出的序列的功能性变体的序列，其由与SEQ ID NO：38具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：38具有至少85％同一性、特别是至少90％同一性、更特别是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列组成。
所谓结蛋白的“功能性变体”意味着至少部分保留了结蛋白启动子的生物活性的变体。所述功能性变体可以具有所述结蛋白启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性。例如，结蛋白启动子的功能性变体是具有结蛋白启动子活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性的变体，其中所述活性对应于结蛋白增强特定转入基因在肌肉中的转录的能力。
在本发明的上下文中，引入到本发明的核酸分子中的转录调控元件(即(i)所述肝选择性增强子或多个增强子；(ii)所述任选的其他肝选择性增强子或多个增强子；(iv)所述第一肌肉选择性启动子(即CK6启动子)；和(v)所述第二肌肉选择性启动子，其优选为spC5-12启动子)可以直接融合或通过接头连接。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子包含(i)如上所述的一个或多个肝选择性增强子，其通过接头、特别是序列ACTAGT或CGCGCC的接头连接到(ii)CK6启动子或其功能性变体；所述CK6启动子通过接头、特别是序列TTAATGACCC(SEQ ID NO：8)或TTCC的接头连接到(iii)第二启动子，所述第二启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
优选地，本发明的核酸分子包含(i)如上所述的一个或多个肝选择性增强子，其通过接头、特别是序列CGCGCC的接头连接到(ii)CK6启动子或其功能性变体；所述CK6启动子通过接头、特别是序列TTCC的接头连接到(iii)第二启动子，所述第二启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
例如，在一个肝选择性增强子直接融合到CK6启动子的情况下，直接融合意味着所述CK6启动子的第一个核苷酸紧接在所述肝选择性增强子的最后一个核苷酸之后。此外，在具有多个肝选择性增强子直接融合到CK6启动子的设计的情况下，直接融合意味着所述CK6启动子的第一个核苷酸紧接在最靠3’端的肝选择性增强子的最后一个核苷酸之后。
例如，在一个肝选择性增强子直接融合到spC5-12启动子的情况下，直接融合意味着所述spC5-12启动子的第一个核苷酸紧接在所述肝选择性增强子的最后一个核苷酸之后。此外，在具有多个肝选择性增强子直接融合到spC5-12启动子的设计的情况下，直接融合意味着所述spC5-12启动子的第一个核苷酸紧接在最靠3’端的肝选择性增强子的最后一个核苷酸之后。
在通过接头连接两个转录调控元件的情况下，在下述核苷酸之间存在核苷酸序列：
-所述第一转录调控元件的最后一个核苷酸；和
-所述第二转录调控元件的第一个核苷酸。
例如，在通过接头连接肝选择性增强子和CK6启动子的情况下，在下述核苷酸之间存在核苷酸序列：
-所述肝选择性增强子的最后一个核苷酸；和
-所述CK6启动子的第一个核苷酸。
例如，在通过接头连接肝选择性增强子和spC5-12启动子的情况下，在下述核苷酸之间存在核苷酸序列：
-所述肝选择性增强子的最后一个核苷酸；和
-所述spC5-12启动子的第一个核苷酸。
根据另一个实例，在通过接头连接多个肝选择性增强子和CK6启动子的情况下，在下述核苷酸之间存在核苷酸序列：
-最靠3’端的肝选择性增强子的最后一个核苷酸；和
-所述CK6启动子的第一个核苷酸。
根据另一个实例，在通过接头连接多个肝选择性增强子和spC5-12启动子的情况下，在下述核苷酸之间存在核苷酸序列：
-最靠3’端的肝选择性增强子的最后一个核苷酸；和
-所述spC5-12启动子的第一个核苷酸。
所述增强子或多个增强子与所述第一启动子之间的接头的长度可以包括1至1500个核苷酸，例如1至1000个核苷酸(例如101、300、500或1000个核苷酸)，例如1至500个核苷酸，例如1至300个核苷酸，例如1至100个核苷酸，例如1至50个核苷酸，例如1至40个核苷酸，例如1至30个核苷酸，例如1至20个核苷酸，例如1至10个核苷酸。在本发明中，所述核酸分子的设计可以将所述载体、特别是AAV载体的尺寸限制考虑在内，因此此类接头(如果存在的话)优选是短的。代表性的短接头包含由少于15个核苷酸、特别是少于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3个或少于2个核苷酸组成的核酸序列，例如1个核苷酸的接头。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；
-CK6启动子或其功能性变体；和
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体；和
-CK6启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；和
-CK6启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；
-CK6启动子或其功能性变体；
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；和
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
根据这个实施方式的特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：31中示出的序列或其功能性变体组成，所述功能性变体的序列与SEQ ID NO：31具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：31具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；
-肌肉选择性启动子(c)，所述肌肉选择性启动子(c)选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体；
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；和
-CK6启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-CK6启动子或其功能性变体；
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；和
-肌肉选择性启动子(c)，所述肌肉选择性启动子(c)选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
根据这个实施方式的特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：32中示出的序列或其功能性变体组成，所述功能性变体的序列与SEQ ID NO：32具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：32具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子或其功能性变体；
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；和
-CK6启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-一个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自spC5-12 CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含
-一个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体；和
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-一个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；和
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-两个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的两个重复序列；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-两个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的两个重复序列；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体；和
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-两个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的两个重复序列；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；和
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-三个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的三个重复序列；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-三个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的三个重复序列；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体。
根据这个实施方式的特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：29中示出的序列或其功能性变体组成，所述功能性变体的序列与SEQ ID NO：29具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：29具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性。
根据另一个特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：30中示出的序列或其功能性变体组成，所述功能性变体的序列与SEQ ID NO：30具有至少80％同一性，例如与SEQID NO：30具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-三个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的三个重复序列；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体，优选为spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体；和
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-三个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的三个重复序列；
-肌肉选择性启动子，所述肌肉选择性启动子选自CK6启动子、CK8启动子、MCK启动子、Acta1启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；和
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-一个或多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子选自ApoE增强子、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQ IDNO：43)、HS-CRM1、HS-CRM2、HS-CRM3、HS-CRM5、HS-CRM6、HS-CRM7、HS-CRM8、HS-CRM9、HS-CRM10、HS-CRM11、HS-CRM13和HS-CRM14，优选地所述肝选择性增强子选自ApoE增强子、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQID NO：43)和HS-CRM8；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-一个或多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子是HS-CRM8，
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-三个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的三个重复序列；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-spC5-12启动子，特别是如SEQ ID NO：4、5或6中所示、特别是如SEQ ID NO：6中所示的spC5-12启动子或其功能性变体。
根据特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：30中示出的序列或其功能性变体组成，所述功能性变体的序列与SEQ ID NO：30具有至少80％同一性，例如与SEQ IDNO：30具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性。SEQ ID NO：30的序列包含彼此可操作连接的：HS-CRM8增强子的三个重复序列、SEQID NO：7的CK6启动子和SEQ ID NO：6的spC5-12启动子。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-CK8启动子，特别是如SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34中所示的CK8启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含
-一个或多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子选自ApoE增强子、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQ IDNO：43)、HS-CRM1、HS-CRM2、HS-CRM3、HS-CRM5、HS-CRM6、HS-CRM7、HS-CRM8、HS-CRM9、HS-CRM10、HS-CRM11、HS-CRM13和HS-CRM14，优选地所述肝选择性增强子选自ApoE增强子、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQID NO：43)和HS-CRM8；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-CK8启动子，特别是如SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34中所示的CK8启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-一个或多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子是HS-CRM8，
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-CK8启动子，特别是如SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34中所示的CK8启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-三个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的三个重复序列；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-CK8启动子，特别是如SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34中所示的CK8启动子或其功能性变体。
根据特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：44中示出的序列或其功能性变体组成，所述功能性变体的序列与SEQ ID NO：44具有至少80％同一性，例如与SEQ IDNO：44具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性。SEQ ID NO：44的序列包含彼此可操作连接的：HS-CRM8增强子的三个重复序列、SEQID NO：7的CK6启动子和SEQ ID NO：33的CK8启动子。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；
-第一CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-第二CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含
-一个或多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子选自ApoE增强子、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQ IDNO：43)、HS-CRM1、HS-CRM2、HS-CRM3、HS-CRM5、HS-CRM6、HS-CRM7、HS-CRM8、HS-CRM9、HS-CRM10、HS-CRM11、HS-CRM13和HS-CRM14，优选地所述肝选择性增强子选自ApoE增强子、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQID NO：43)和HS-CRM8；
-第一CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-第二CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-一个或多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子是HS-CRM8，
-第一CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-第二CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-三个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的三个重复序列；
-第一CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-第二CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体。
根据特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：45中示出的序列或其功能性变体组成，所述功能性变体的序列与SEQ ID NO：45具有至少80％同一性，例如与SEQ IDNO：45具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性。SEQ ID NO：45的序列包含彼此可操作连接的：HS-CRM8增强子的三个重复序列、SEQID NO：7的第一CK6启动子和SEQ ID NO：7的第二CK6启动子。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-如上所述的一个或多个肝选择性增强子；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-Acta1启动子，特别是如SEQ ID NO：37中所示的Acta1启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含
-一个或多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子选自ApoE增强子、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQ IDNO：43)、HS-CRM1、HS-CRM2、HS-CRM3、HS-CRM5、HS-CRM6、HS-CRM7、HS-CRM8、HS-CRM9、HS-CRM10、HS-CRM11、HS-CRM13和HS-CRM14，优选地所述肝选择性增强子选自ApoE增强子、增强子A3(SEQ ID NO：40)、增强子F(SEQ ID NO：41)、增强子S1(SEQ ID NO：42)、增强子S2(SEQID NO：43)和HS-CRM8；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-Acta1启动子，特别是如SEQ ID NO：37中所示的Acta1启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-一个或多个肝选择性增强子，其中所述肝选择性增强子是HS-CRM8，
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-Acta1启动子，特别是如SEQ ID NO：37中所示的Acta1启动子或其功能性变体。
在另一个特定实施方式中，本发明的核酸分子具体来说以5’至3’的顺序包含：
-三个肝选择性增强子，特别是如SEQ ID NO：1中所示的HS-CRM8增强子或其功能性变体的三个重复序列；
-CK6启动子，特别是如SEQ ID NO：7中所示的CK6启动子或其功能性变体；和
-Acta1启动子，特别是如SEQ ID NO：37中所示的Acta1启动子或其功能性变体。
根据特定变化形式，本发明的核酸分子由SEQ ID NO：46中示出的序列或其功能性变体组成，所述功能性变体的序列与SEQ ID NO：46具有至少80％同一性，例如与SEQ IDNO：46具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性。SEQ ID NO：46的序列包含彼此可操作连接的：HS-CRM8增强子的三个重复序列、SEQID NO：7的CK6启动子和SEQ ID NO：37的Acta1启动子。
在本文具体公开的本发明的核酸分子的所有实施方式中，所述核酸分子可以包括位于两个转录调控元件之间的接头。
此外，在本文具体公开的本发明的核酸分子的所有实施方式中，所述核酸分子可以包括位于多个肝选择性增强子内的两个肝选择性增强子之间的接头。例如，在包含由两个肝选择性增强子组成的多个肝选择性增强子的实施方式中，接头可以位于或不位于这两个肝选择性增强子之间。此外，在其中所述多个肝选择性增强子包含三个肝选择性增强子的实施方式中，接头可以被包含在第一与第二肝选择性增强子之间和/或第二与第三肝选择性增强子之间。例如，在其中所述多个肝选择性增强子包含三个肝选择性增强子的实施方式中，接头位于第一与第二肝选择性增强子之间，并且没有接头位于第二与第三肝选择性增强子之间。在另一个变化形式中，在具有三个肝选择性增强子的实施方式中，没有接头位于第一与第二肝选择性增强子之间，并且接头位于第二与第三肝选择性增强子之间。
表达盒
可以将本发明的核酸分子引入到表达盒中，所述表达盒被设计用于提供感兴趣的转入基因在感兴趣的组织中的表达。
因此，本发明的表达盒包括如上所述的核酸分子和感兴趣的转入基因。
所述表达盒可以包含至少一个另外的调控序列，其能够通过降低或抑制感兴趣的治疗性转入基因在某些不感兴趣的组织中的表达，或者通过使编码感兴趣的蛋白质例如由感兴趣的转入基因编码的治疗性蛋白的mRNA稳定，进一步控制所述感兴趣的治疗性转入基因的表达。这些序列包括例如沉默子(例如组织特异性沉默子)、微小RNA靶序列、内含子和多腺苷酸化信号。
在特定实施方式中，本发明的表达盒以5’至3’的顺序包含：
-本发明的核酸分子；
-所述感兴趣的转入基因；和
-多腺苷酸化信号。
在这个实施方式的特定变化形式中，可以将内含子引入到本发明的核酸分子与感兴趣的转入基因之间。或者，内含子可以位于所述感兴趣的转入基因内。在特定实施方式中，所述内含子可以是SV40内含子，例如由SEQ ID NO：9组成的SV40内含子。在特定实施方式中，所述核酸构建体包含人β珠蛋白b2(或HBB2)内含子，例如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的HBB2内含子；凝血因子IX(FIX)内含子，例如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的FIX内含子；或鸡β-珠蛋白内含子，例如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的鸡β珠蛋白内含子。
当然，从本文公开的教导和分子生物学和基因治疗领域的一般知识，本领域技术人员能够根据并入到表达盒中的感兴趣的转入基因的尺寸，选择和改编增强子数量、增强子尺寸、启动子尺寸、接头尺寸以及任何其他元件例如其他增强子和内含子。
所述感兴趣的转入基因可以是在上述“定义”部分中所描述的任何转入基因。此外，具体的说明性感兴趣的转入基因提供在下表中，其中转入基因按照它们可以治疗的神经肌肉障碍的家族重新分组：肌营养不良症
先天性肌营养不良症
先天性肌病
远端肌病
其他肌病
肌强直性综合征
离子通道肌肉病
恶性高热
基因 蛋白质
RYR1 兰尼碱受体1(骨骼肌)
CACNA1S 钙通道，电压依赖性，L型，α1S亚基
代谢性肌病
遗传性心肌病
先天性肌无力综合征
运动神经元疾病
遗传性运动和感觉神经病
遗传性截瘫
其他神经肌肉障碍
在特定实施方式中，所述感兴趣的转入基因是α-L-艾杜糖醛酸酶、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、糖原脱支酶(GDE)或缩短形式的GDE、G6P、α-肌聚糖(SGCA)、肌营养不良蛋白或其缩短的形式或SMN1。
在特定实施方式中，所述转入基因具有至多3500bp的长度。
载体、细胞和药物组合物
可以将本发明的表达盒引入到载体中。因此，本发明还涉及一种载体，其包含上述表达盒。在本发明中使用的载体是适合于RNA/蛋白质表达并特别是适合于基因治疗的载体。
在一个实施方式中，所述载体是质粒载体。
在另一个实施方式中，所述载体是非病毒载体，例如含有本发明的表达盒的纳米粒子、脂质纳米粒子(LNP)或脂质体。
在另一个实施方式中，所述载体是允许将本发明的表达盒整合到靶细胞的基因组中的基于转座子的系统，例如极度活跃的睡美人(SB100X)转座子系统(Mates等，2009)。
在另一个实施方式中，所述感兴趣的转入基因是可用于靶向基因组工程的修复矩阵，例如如上所述适合于与内切核酸酶一起校正基因的修复矩阵。更具体而言，所述载体包括含有与感兴趣的基因同源的臂的修复矩阵，用于同源驱动的整合。
在另一个实施方式中，所述载体是适合于基因治疗，靶向肌肉和/或CNS的病毒载体。在这种情况下，正如本领域中公知的，向本发明的表达盒添加适合于产生高效病毒载体的其他序列。在特定实施方式中，所述病毒载体源自整合型病毒。具体而言，所述病毒载体可以源自腺病毒、反转录病毒或或慢病毒(例如整合缺陷型慢病毒)。在特定实施方式中，所述慢病毒是假型慢病毒，其具有能够靶向感兴趣的细胞/组织例如肌肉细胞的包膜(如专利申请EP17306448.6和EP17306447.8中所述)。在病毒载体源自反转录病毒或慢病毒的情况下，所述其他序列是位于所述表达盒两侧的反转录病毒或慢病毒LTR序列。在另一个特定实施方式中，所述病毒载体是细小病毒载体例如AAV载体，例如适合于转导肌肉和/或CNS的AAV载体。在这个实施方式中，所述其他序列是位于所述表达盒两侧的AAV ITR序列。
在优选实施方式中，所述载体是AAV载体。人细小病毒腺相关病毒(AAV)是一种天然具有复制缺陷的依赖性病毒，其能够整合到受感染细胞的基因组中以建立潜伏感染。最后一种特性在哺乳动物病毒中似乎是独一无二的，因为整合发生在人类基因组中被称为AAVS1的特定位点处，所述位点位于19号染色体上(19q13.3-qter)。
因此，AAV载体作为人类基因治疗的潜在载体引起了相当大的兴趣。所述病毒的有利特性包括它与任何人类疾病都没有关联，它能够感染分裂细胞和非分裂细胞，以及可以感染源自不同组织的广泛细胞系。
在从人类或非人类灵长动物(NHP)分离并充分表征的AAV的血清型中，人血清型2是被开发作为基因转移载体的第一种AAV。其他目前使用的AAV血清型包括AAV-1、AAV-2变体(例如包含具有Y44+500+730F+T491V变化的衣壳的四重突变体衣壳优化的AAV-2，其公开在Ling等，2016Jul 18,Hum Gene Ther Methods.中)、-3和AAV-3变体(例如包含具有两个氨基酸变化S663V+T492V的工程化AAV3衣壳的AAV3-ST变体，其公开在Vercauteren等，2016,Mol.Ther.Vol.24(6),p.1042中)、-3B和AAV-3B变体、-4、-5、-6和AAV-6变体(例如包含三重突变的AAV6衣壳Y731F/Y705F/T492V形式的AAV6变体，其公开在Rosario等，2016,Mol Ther Methods Clin Dev.3,p.16026中)、-7、-8、-9、-2G9、-10例如cy10和-rh10、-rh74、EP18305399中所公开的-rh74-9(例如在EP18305399的实施例中描述的杂合Caprh74-9血清型；在本文中也被称为“-rh74-9”、“AAVrh74-9”或“AAV-rh74-9”的rh74-9血清型)、EP18305399中所公开的-9-rh74(例如在EP18305399的实施例中描述的杂合Cap 9-rh74血清型；在本文中也被称为“-9-rh74”、“AAV9-rh74”、“AAV-9-rh74”或“rh74-AAV9”的-9-rh74血清型)、-dj、Anc80、LK03、AAV2i8、猪AAV血清型例如AAVpo4和AAVpo6，以及AAV血清型的酪氨酸、赖氨酸和丝氨酸衣壳突变体等。此外，其他非天然的工程化变体和嵌合AAV也可能是有用的。
AAV病毒可以使用常规的分子生物学技术进行工程化，从而有可能优化这些粒子以用于核酸序列的细胞特异性递送，用于使免疫原性最小化，用于调节稳定性和粒子寿命，用于高效降解，用于精确递送到细胞核。
用于组装成载体的所需AAV片段包括cap蛋白(包括VP1、VP2、VP3和高变区)、rep蛋白(包括rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)以及编码这些蛋白质的序列。这些片段可以容易地用于各种载体系统和宿主细胞中。
缺少Rep蛋白的基于AAV的重组载体以低效率整合到宿主的基因组中，并且主要作为稳定的环状游离体存在，其可以在靶细胞中维持数年。
替代使用AAV天然血清型，可以在本发明的上下文中使用人工AAV血清型，包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。这种人工衣壳可以通过任何适合的技术，使用选定的AAV序列(例如vp1衣壳蛋白的片段)与异源序列相结合来产生，所述异源序列可以从不同的选定AAV血清型、同一AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒源或非病毒源获得。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。
在本发明的上下文中，所述AAV载体包含能够转导感兴趣的靶细胞即肌肉细胞和CNS细胞的AAV衣壳。“CNS”意指大脑和脊髓的所有细胞和组织。因此，所述术语包括但不限于神经元细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、脑脊液(CSF)、间质间隙、骨、软骨等。
根据特定实施方式，所述AAV载体选自AAV-1、-2、AAV-2变体(例如包含具有Y44+500+730F+T491V变化的工程化衣壳的四重突变体衣壳优化的AAV-2，其公开在Ling等，2016Jul 18,Hum Gene Ther Methods.[印刷前的电子版]中)、-3和AAV-3变体(例如包含具有两个氨基酸变化S663V+T492V的工程化AAV3衣壳的AAV3-ST变体，其公开在Vercauteren等，2016,Mol.Ther.Vol.24(6),p.1042中)、-3B和AAV-3B变体、-4、-5、-6和AAV-6变体(例如包含三重突变的AAV6衣壳Y731F/Y705F/T492V形式的AAV6变体，其公开在Rosario等，2016,Mol Ther Methods Clin Dev.3,p.16026中)、-7、-8、-9、-2G9、-10例如cy10和-rh10、-rh39、-rh43、-rh74、-rh74-9、-dj、Anc80、LK03、AAV.PHP、AAV2i8、猪AAV例如AAVpo4和AAVpo6，以及AAV血清型的酪氨酸、赖氨酸和丝氨酸衣壳突变体。在特定实施方式中，所述AAV载体是AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh74-9或AAV2i8血清型的载体(即所述AAV载体具有AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh74-9或AAV2i8血清型的衣壳)。在另一个特定实施方式中，所述AAV载体是假型载体，即其基因组和衣壳源自不同血清型的AAV。例如，所述假型AAV载体可以是基因组源自上述AAV血清型之一、特别是AAV2血清型并且衣壳源自另一种血清型的载体。例如，所述假型载体的基因组可以具有源自AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh74-9或AAV2i8血清型的衣壳，并且其基因组可以源自不同的血清型。在特定实施方式中，所述AAV载体具有AAV8、AAV9、AAVrh74或AAVrh74-9血清型、特别是AAV8或AAV9血清型、更特别是AAV8血清型的衣壳。
在另一个实施方式中，所述衣壳是修饰的衣壳。在本发明的上下文中，“修饰的衣壳”可以是嵌合衣壳或包含源自一种或多种野生型AAV VP衣壳蛋白的一种或多种变体VP衣壳蛋白的衣壳。
在特定实施方式中，所述AAV载体是嵌合载体，即其衣壳包含源自至少两种不同AAV血清型的VP衣壳蛋白，或包含至少一种组合了源自至少两种AAV血清型的VP蛋白质区域或结构域的嵌合VP蛋白。例如，嵌合AAV载体可以源自AAV8衣壳序列与不同于AAV8血清型的AAV血清型例如上文具体提到的任何血清型的序列的组合。
在另一个实施方式中，所述修饰的衣壳也可以源自通过易错PCR和/或肽插入而插入的衣壳修饰(例如在Bartel等，2011中所述)。此外，衣壳变体可以包括单个氨基酸变化例如酪氨酸突变体(例如在Zhong等，2008中所述)。在特定实施方式中，所述AAV载体的衣壳是在AAV血清型9(AAV9)与AAV血清型74(AAVrh74)衣壳蛋白之间的肽修饰的杂合体，正如在WO2019/193119或WO2020/200499或WO2022053630中所述，例如用P1肽修饰的AAV9-rh74杂合体衣壳或AAVrh74-9杂合体衣壳。在特定实施方式中，所述AAV的衣壳是如WO2019/193119中所述的AAV9-rh74衣壳、如WO2020/200499中所述的AAV9-rh74-P1衣壳或如WO2022053630中所述的AAV9-rh74-HB-P1衣壳。
在另一个实施方式中，所述AAV载体是如WO2020/216861中所述的AAV载体或如WO2022/003211中所述的AAV载体。具体而言，所述AAV载体可以具有如WO2020/216861中所述的变体AAV2衣壳或如WO2022/003211中所述的在AAV8与AAV2/13之间的杂合体衣壳。
在另一个实施方式中，所述AAV载体包含猪AAV血清型1(AAVpo1)衣壳野生型(或如WO2021/219762中所述的用A1肽修饰的(AAVpo1-A1))。
此外，所述AAV载体的基因组可以是单链或自互补的双链基因组(McCarty等，GeneTherapy,2003)。自互补双链AAV载体通过从AAV末端重复序列之一中缺失末端解链位点而产生。这些修饰的载体的复制基因组是野生型AAV基因组长度的一半，具有包装DNA二聚体的倾向。在优选实施方式中，在本发明的实践中实施的AAV载体具有单链基因组，并且进一步优选地包括AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh74-9或AAV2i8衣壳，特别是AAV8、AAC9、AAVrh74或AAVrh74-9衣壳，例如AAV8或AAV9衣壳，更特别是AAV8衣壳。正如本领域中已知的，可以在本发明的核酸构建体中引入额外的适合序列以获得功能性病毒载体。适合的序列包括AAVITR。
当然，在设计本发明的核酸序列和本发明的表达盒时，本领域技术人员将注意考虑用于将所述构建体递送到细胞或器官的载体的尺寸限制。具体而言，如上所述，在载体是AAV载体的情况下，本领域技术人员知道AAV载体的主要限制是其运载能力，其可能因AAV血清型而异，但被认为限制在亲代病毒基因组的尺寸左右。例如，5kb是通常认为被包装到AAV8衣壳中的最大尺寸(Wu Z.等，Mol Ther.,2010,18(1):80-86；Lai Y.等，Mol Ther.,2010,18(1):75-79；Wang Y.等，Hum Gene Ther Methods,2012,23(4):225-33)。因此，本领域技术人员在实践本发明时将注意选择本发明的核酸构建体的组分，使得得到的包括编码AAV 5’-和3’-ITR的序列在内的核酸序列优选不超过所实施的AAV载体的运载能力的110％，具体来说优选不超过5.5kb。
本发明还涉及用本发明的核酸序列或本发明的表达盒转化的分离的细胞，例如肌肉细胞或CNS细胞。本发明的分离的细胞可以通过注射到感兴趣的组织中或受试者的血流中而递送到有需要的受试者。在特定实施方式中，本发明涉及将本发明的核酸分子或表达盒引入到待治疗的受试者的分离的细胞中，并将所述引入有核酸或表达盒的细胞给药回所述受试者。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明的核酸分子、载体或分离的细胞。此类组合物包含治疗有效量的本发明的核酸序列、载体或分离的细胞以及药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”意味着被联邦或州政府监管机构批准或在美国或欧洲药典或其他公认药典中列出可用于动物和人类。术语“载体”是指与治疗剂一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或介质。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
如果需要，所述组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等形式。口服制剂可以包括标准载体，例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的实例描述在E.W.Martin的《Remington制药学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)中。此类组合物将含有治疗有效量的治疗剂，优选为纯化的形式，以及适合量的载体，以便为受试者提供适当给药的形式。在特定实施方式中，本发明的核酸序列、表达盒、载体或分离的细胞被配制在包含磷酸盐缓冲盐水并补充有0.25％人血清白蛋白的组合物中。在另一个特定实施方式中，本发明的载体被配制在包含林格氏乳酸盐和非离子表面活性剂例如pluronic F68的组合物中，最终浓度为总组合物重量的0.01-0.0001％，例如浓度为0.001％。所述制剂可以进一步包含血清白蛋白，特别是人血清白蛋白，例如0.25％的人血清白蛋白。用于储存或给药的其他适合的制剂在本领域中是已知的，特别是WO 2005/118792或Allay等，2011。
在优选实施方式中，所述组合物按照常规程序配制为适于对人进行静脉内或肌肉内给药，优选为静脉内给药的药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以缓解注射部位处的疼痛。
在实施方式中，本发明的核酸序列、表达盒或载体可以在囊泡、特别是脂质体中递送。在另一个实施方式中，本发明的核酸序列、表达盒或载体可以在受控释放系统中递送。
使用方法
由于本发明，可以将感兴趣的转入基因在肌肉和CNS细胞中表达。
本发明的核酸分子、表达盒或载体可用于将基因在肌肉内和/或CNS细胞中表达。因此，本发明提供了一种在肌肉细胞或CNS细胞中表达感兴趣的转入基因的方法，其中将本发明的表达盒引入到所述细胞中，并表达所述感兴趣的转入基因。所述方法可以是用于在肌肉或CNS细胞中表达感兴趣的转入基因的体外、离体或体内方法。
在一个特定方面，本发明涉及本发明的核酸分子、表达盒或载体，其用于在细胞中表达感兴趣的转入基因的离体方法中，其中将本发明的表达盒引入到所述细胞中，并表达所述感兴趣的转入基因。
本发明的核酸分子、表达盒或载体也可用于基因治疗。因此，在一个方面，本发明涉及如上所述的核酸分子、表达盒、载体、分离的细胞或药物组合物，其用作药物。因此，在一个方面，本发明涉及本文公开的核酸分子、表达盒或载体，其用于治疗、特别是基因治疗中。同样，本发明的分离的细胞可用于治疗、特别是细胞治疗中。
在另一个方面，本发明涉及如上所述的核酸分子、表达盒、载体、分离的细胞或药物组合物，其用于治疗神经肌肉障碍的方法中。
在另一方面，本发明涉及如上所述的核酸分子、表达盒、载体、分离的细胞或药物组合物在制备用于治疗神经肌肉障碍的药物中的用途。
在另一个方面，本发明涉及一种治疗神经肌肉障碍的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文所述的核酸分子、表达盒、载体、分离的细胞或药物组合物给药到有需要的受试者。
所述神经肌肉障碍具体来说是遗传性或获得性障碍，例如遗传性或获得性神经肌肉疾病。当然，所述治疗性转入基因和驱动在治疗上感兴趣的组织中表达的启动子将根据待治疗的障碍来选择。
术语“神经肌肉障碍”涵盖了作为自主肌肉的病理直接地或作为神经或神经肌肉接头的病理间接地损害肌肉功能的疾病和病症。说明性的神经肌肉障碍包括但不限于肌营养不良症(例如肌强直性营养不良症(Steinert病)、杜氏肌营养不良症、贝克氏肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、远端型肌营养不良症、Emery-Dreifuss肌营养不良症)、运动神经元疾病(例如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩症(婴儿进行性脊髓性肌萎缩症(1型、Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌萎缩症(2型)、青少年脊髓性肌萎缩症(3型、Kugelberg-Welander病)、成人脊髓性肌萎缩症(4型))、脊髓延髓肌萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、神经肌肉接头疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、周围神经疾病(例如Charcot-Marie-Tooth病、弗里德希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)、肌肉代谢疾病(例如磷酸化酶缺乏症(McArdle病)、酸性麦芽糖酶缺乏症(庞贝病)、磷酸果糖激酶缺乏症(Tarui病)、脱支酶缺乏症(科里病或福布斯病)、线粒体肌病、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症)、由内分泌异常引起的肌病(例如甲状腺功能亢进性肌病、甲状腺功能减退性肌病)和其他肌病(例如先天性肌强直症l、先天性副肌强直症l、中央轴空病、线状体肌病、肌管性肌病、周期性瘫痪)。在这个实施方式中，本发明的核酸序列包含肝选择性、肌肉选择性和/或神经元选择性转录调控元件，例如肝选择性和肌肉选择性转录调控元件、肝选择性和神经元选择性转录调控元件以及肝选择性、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件。
在特定实施方式中，所述障碍是糖原贮积病。表述“糖原贮积病”表示一组涉及负责糖原合成和降解的酶的遗传性代谢障碍。在更特定实施方式中，所述糖原贮积病可以是GSDI(von Gierke's病)、GSDII(庞贝病)、GSMDIII(科里病)、GSCIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII或心脏的致死性先天性糖原贮积病。更具体而言，所述糖原贮积病选自GSDI、GSDII和GSDIII，甚至更特别地选自GSDII、GSDIII。在甚至更特定实施方式中，所述糖原贮积病是GSDII。具体而言，本发明的核酸分子可用于基因治疗，以治疗缺乏GAA的病症或伴有糖原积累的其他病症，例如GSDI(von Gierke's病)、GSDII(庞贝病)、GSMDIII(科里病)、GSCIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII和心脏的致死性先天性糖原贮积病，更特别是GSDI、GSDII或GSDIII，甚至更特别是是GSDII和GSDIII。在另一个特定实施方式中，所述障碍是庞贝病，并且所述治疗性转入基因是编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)或其变体的基因。此类GAA的变体具体来说公开在申请PCT/2017/072942、PCT/EP2017/072945和PCT/EP2017/072944中，所述申请整体通过引用并入本文。在这个实施方式中，本发明的核酸序列包含肝选择性、肌肉选择性和/或神经元选择性转录调控元件，例如肝选择性和肌肉选择性转录调控元件、肝选择性和神经元选择性转录调控元件、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件以及肝选择性、肌肉选择性和神经元选择性转录调控元件。在特定实施方式中，所述障碍是婴儿发作型庞贝病(IOPD)或晚期发作型庞贝病(LOPD)。优选地，所述障碍是IOPD。
本领域技术人员知道在通过基因治疗方法治疗这些和其他障碍中有用的感兴趣的转入基因。例如，所述治疗性转入基因是：用于MPSI的溶酶体酶α-L-艾杜糖醛酸酶[IDUA(α-L-艾杜糖醛酸酶)]，用于庞贝病的酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)，用于科里病(GSDIII)的糖原脱支酶(GDE)或缩短形式的GDE(也被称为GDE的截短形式或小型GDE)，用于GSDI的G6P，用于LGMD2D的α-肌聚糖(SGCA)，用于DMD的肌营养不良蛋白或其缩短形式，用于SMA的SMN1。所述感兴趣的转入基因也可以是提供除了提供缺失的蛋白质或抑制给定蛋白质表达的RNA之外的其他治疗特性的转入基因。例如，感兴趣的转入基因可以包括但不限于可以增加肌肉力量的转入基因。
下面提供了用于特定疾病的可以可操作地连接到本发明的杂合启动子的感兴趣的治疗性转入基因的具体实例。
在特定实施方式中，所述疾病是科里病，并且所述感兴趣的转入基因编码GDE或缩短形式的GDE。适合用于本发明的缩短形式的GDE可以包括但不限于在EP18306088中描述的那些。或者，本发明用于表达GDE的双AAV载体系统中，例如在WO2018162748中公开的双AAV载体系统。在这个实施方式中，本发明的载体可以对应于所述双AAV载体系统的第一AAV载体，其在5’与3’AAV ITR之间包含编码在本发明的核酸分子控制之下的GDE的N-端部分的第一核酸序列。
在另一个特定实施方式中，所述疾病是庞贝病，并且所述感兴趣的转入基因编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)或修饰的GAA。适合用于本发明的修饰的GAA包括但不限于在WO2018046772、WO2018046774和WO2018046775中公开的那些。
在另一个特定实施方式中，所述障碍选自杜氏肌营养不良症、肌管性肌病、脊髓性肌萎缩症、肢带型肌营养不良症2I、2A、2B、2C或2D型和肌强直性营养不良症1型。
本发明载体的给药方法包括但不限于WO2015158924中所述的真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、局部给药和口服途径。在特定实施方式中，所述给药通过静脉内或肌肉内途径进行。本发明的载体可以通过任何方便的途径给药，例如通过输注或推注，通过经上皮或黏膜皮肤衬(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)的吸收，并且可以与其他生物活性剂一起给药。给药可以是全身性或局部的。
在特定实施方式中，可能希望将本发明的药物组合物局部给药到需要治疗的区域，例如肝脏或肌肉。这可以通过例如植入物来实现，所述植入物是多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜例如硅橡胶膜或纤维。
有效治疗待治疗病症的本发明的载体的量可以通过标准临床技术来确定。此外，可以任选地使用体内和/或体外测定来帮助预测最佳剂量范围。制剂中使用的确切剂量也将取决于给药途径和疾病的严重性，并应根据从业人员的判断和每位患者的情况来决定。给药到有需要的受试者的本发明的载体的剂量将随着几个因素而变，包括但不限于给药途径、所治疗的具体疾病、受试者年龄或获得治疗效果所需的表达水平。本领域技术人员可以基于该领域的知识，在这些因素和其他因素的基础上容易地确定所需的剂量范围。在包括向受试者给药AAV载体的治疗的情况下，载体的典型剂量为至少1x108个载体基因组/千克体重(vg/kg)，例如至少1x109vg/kg、至少1x1010vg/kg、至少1x1011vg/kg、至少1x1012vg/kg至少1x1013vg/kg、至少1x1014vg/kg或至少1x1015vg/kg。
在特定实施方式中，本发明的载体可以以低于基因治疗中使用的典型剂量的剂量给药。具体而言，在包括向有需要的受试者给药AAV载体的治疗中，所述载体可以以比上述典型剂量低至少2倍的剂量，特别是以比在基因治疗中通常使用的典型AAV剂量低至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍或甚至至少50倍的剂量给药。
实施例
材料和方法
AAV载体生产
在本研究中使用的AAV载体使用HEK293细胞的无腺病毒瞬时转染方法产生，并通过Akta纯化。使用qPCR确定AAV载体储用物的滴度。本研究中使用的所有载体制备物在使用前都进行了并排滴定。用于对AAV基因组进行qPCR的引物退火到ITRSEQ或密码子优化的hGAA转入基因序列：正向：5’-agatacgccggacattggactg-3’；反向，5’-agatacgccggacattggactg-3’。
体内研究
小鼠研究根据法国和欧洲关于动物护理和实验的立法(2010/63/EU)进行，并得到当地机构伦理委员会批准。野生型雄性C57BL/6小鼠购自Charles River Laboratories。Gaa敲除小鼠(Gaa-/-)购自The Jackson Laboratory(B6；129-Gaatm1Rabn/J，库存编号004154，6neo)，最初由Raben等人产生。使用95只受影响(Gaa-/-)或健康(Gaa+/+)的同窝出生的雄性小鼠。将AAV载体以0.2mL的体积通过尾静脉递送到成年小鼠。注射后一个月，将小鼠处死以收获血液和组织。基于先前研究中产生的数据，小鼠实验组的大小为n＝4；所有分析的样品和动物都包括在数据中，没有任何异常值被排除在外。
GAA活性测定
将快速冷冻的组织在不含DNA酶和RNA酶的超纯蒸馏水(Thermo FisherScientific)中匀浆。将组织称重，匀浆，并以10,000g离心10min以收集上清液。使用适当稀释的10μL样品(血浆或组织匀浆液)和20μL底物4-甲基伞形酮(4MU)a-D-葡萄糖苷，在黑色96孔板(PerkinElmer)中建立酶促反应。将反应混合物在37℃下温育1小时，然后通过添加150μL碳酸钠缓冲液(pH 10.5)终止反应。使用标准曲线(0–2,500pmol/mL的4MU)，使用EnSpire Alpha读板器(PerkinElmer)在449nm(发射)和360nm(激发)下测量从各个反应混合物释放的荧光4MU。通过BCA(Thermo Fisher Scientific)定量澄清的上清液的蛋白质浓度。为了计算组织中的GAA活性，将释放的4MU浓度除以样品蛋白质浓度，并将活性报告为每毫克蛋白质或每毫升血清每小时的纳摩尔数。
Western印迹分析
对小鼠血浆的Western印迹在用蒸馏水以1:4稀释的样品上进行。按照对GAA活性所述制备小鼠组织的匀浆液。使用BCA蛋白质测定法(Thermo Fisher Scientific)测定蛋白质浓度。SDS-PAGE电泳在4％–12％聚丙烯酰胺凝胶中进行。在转移后，将膜用Odyssey缓冲液(LI-COR Biosciences)阻断，并与抗GAA抗体(兔单克隆，克隆EPR4716(2)，Abcam)和抗Gapdh抗体(兔多克隆，PA1-988，Thermo Fisher Scientific)温育。将膜清洗，与适合的第二抗体(LI-COR Biosciences)温育，并用Odyssey成像系统(LI-CER Bioscience)可视化。对于western印迹定量而言，我们使用ImageJ或Image Studio Lite 4.0。小鼠组织中hGAA蛋白质条带的定量使用任一Gapdh条带进行归一化。血浆中hGAA蛋白质条带的定量使用小鼠血浆(用作载样对照)中通过抗hGAA抗体检测到的非特异性条带进行归一化。
抗GAA和抗衣壳抗体检测
抗hGAA IgG捕获测定在用2mg/mL rhGAA包被的Maxisorp 96孔板(Thermo FisherScientific)中进行。通过一式两份直接包被在孔上的商品化小鼠重组IgG(Sigma-Aldrich)的1至2倍连续稀释(从1mg/mL至0.15mg/mL)来制备IgG标准曲线。一式两份分析在含有2％BSA的10mM PBS(pH 7.4)中适当稀释的血浆样品。使用HRP偶联的抗小鼠IgG抗体(人ads-HRP，Southern Biotech)作为第二抗体。使用OPD底物(邻苯二胺二盐酸盐，Sigma)使板显色。使用3M H2SO4溶液终止反应，并使用微孔板读板器(ENSPIRE,PerkinElmer,Waltham,USA)在492nm处进行光密度(OD)测量。针对标准曲线确定抗AAV IgG浓度。
mSeAP定量
将快速冷冻的组织在不含DNA酶和RNA酶的超纯蒸馏水(Thermo FisherScientific)中进行匀浆。将组织称重，匀浆，并以10,000g离心10min以收集上清液。使用LifeTech T1015 mseap试剂盒建立酶促反应。简而言之，将10μL加热的样品(血浆或组织匀浆液)与10μL测定缓冲液温育5分钟，然后与10μL反应缓冲液温育20分钟。使用EnSpireAlpha读板器(PerkinElmer)，使用标准曲线(0–6ng/μL的mSEAP)测量从各个反应混合物释放的发光。通过BCA(Thermo Fisher Scientific)定量澄清的上清液的蛋白质浓度。计算组织中的mSeAP表达。
载体基因组拷贝数分析
使用NucleoMag Pathogen(Macherey-Nagel,France)从组织匀浆液提取DNA并定量。载体基因组拷贝数通过qPCR，使用500ng DNA、引物和在ITR或密码子优化的hGAA上退火的探针(正向，5’-agatacgccggacattggactg-3’；反向，5’-agatacgccggacattggactg-3’；探针，5’-gtgtggtcctcttgggagc-3’)来确定，并使用小鼠肌巨蛋白作为参比基因(正向：5’-aaaacgagcagtgacgtgagc-3’；反向：5’-ttcagtcatgctgctagcgc-3’；探针：5’-tgcacggaagcgtctcgtctcagt-3’)。使用TaqMan方法进行qPCR。
统计分析
本文中示出的所有数据均被报告为平均值±SD。我们报告统计数据的采样单位数n对于体内实验来说是单个小鼠(一只小鼠是n＝1)。使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。我们使用Shapiro-Wilk检验评估了从不同测量获得的数据(血浆中的抗hGAA-IgG量、血浆和组织中的hGAA蛋白表达、组织中的GAA酶活性)的正态分布。使用的统计检验对于两组比较来说是非配对Student’s t检验，对于超过两组的比较来说是单向ANOVA和Tukeypost hoc。对于通过参数检验分析的所有数据集来说，alpha＝0.05。所有统计检验均双侧进行。p<0.05被认为是显著的。对每个数据集进行的统计分析如图例中所示。对于所有图来说，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，####p<0.0001。
结果
图1A中表示了遍在CAG启动子(被称为“P1”)和4种不同组合：(i)H3增强子和spC5-12启动子(P2)，(ii)H3增强子和CK6启动子(P3)，(iii)H3增强子、CK6启动子和spC5-12启动子(P4)，和(iv)CK6启动子和spC5-12启动子(P5)。H3增强子对应于HS-CRM8增强子的三次重复。P4的序列如SEQ ID NO：30中所示。
图2中描述了体内方案。将6周龄C57BL/6野生型(WT)小鼠用4E11 vg/小鼠的AAV-MT载体(AAV9-rh74-P1载体)静脉内注射，所述载体编码在P1、P3或P4的转录控制之下的鼠分泌型碱性磷酸酶(mSeAP)。在注射后一个月，将小鼠处死并对组织进行分析。
图3表示肝脏和四头肌中每个细胞的转入基因拷贝数。数据显示，三种AAV载体以相近的功效转导两种组织。
图4中示出了用载体注射的小鼠的肝脏、四种不同肌肉(心肌、膈肌、四头肌和三头肌)和脊髓中测量的mSEAP活性。在用在P1和P4的控制下表达mSEAP的AAV-MT载体转导后，在不同的肌肉和脊髓中观察到改善的mSEAP活性。只有P1(遍在启动子)在肝脏中表达mSEAP。
图5中描述了体内方案。将6周龄C57BL/6野生型(WT)小鼠用5E10 vg/小鼠的AAV-MT载体(AAV9-rh74-P1载体)静脉内注射，所述载体编码在P1至P5的转录控制之下的人密码子优化的GAA(hGAAco)。在注射后一个月，将小鼠处死并对组织进行分析。
图6中报告了载体基因组拷贝数(VGCN)，其通过在处死时从心脏组织提取的DNA的肌巨蛋白定量进行归一化。每个组的VGCN没有显著差异。
图7对应于在来自小鼠的心脏中测量到的GAA，所述小鼠用编码在P1至P5的转录控制下的GAA的载体注射。图7A表示通过酶测定法测量并通过总蛋白进行归一化的GAA活性。图7B和7C对应于通过Western印迹测定的GAA定量。图7B示出了通过从图7C获得的黏着斑蛋白强度条带进行归一化的GAA强度条带的定量。使用这两种方法，与其他组相比，在用载体P4(H3-CK6-C512)注射的小鼠中GAA的表达更多。
图8对应于在来自小鼠的四头肌中测量到的GAA，所述小鼠用编码在P1至P5的转录控制下的GAA的载体注射。图8A表示通过酶测定法测量并通过总蛋白进行归一化的GAA活性。图8B和8C对应于通过Western印迹测定的GAA定量。图8B示出了通过从图8C获得的黏着斑蛋白强度条带进行归一化的GAA强度条带的定量。使用这两种方法，与其他组相比，在用载体P4(H3-CK6-C512)注射的小鼠中GAA的表达更多。
图9A代表了3种不同组合：H3增强子和575bp的接头(P1)，其被用作阴性对照以显示所述接头没有影响。P2由H3增强子、P1中使用的接头组成。P3对应于H3增强子、CK6和spC5-12启动子，它被用作阳性对照。P3的序列示出在SEQ ID NO：30中。图11B描述了体内方案。将6周龄C57BL/6野生型(WT)小鼠用1E11 vg/小鼠的AAV-MT(AAV9-rh74-P1)载体静脉内注射，所述载体编码在P1至P3的转录控制之下的人密码子优化的GAA(hGAAco)。在注射后一个月，将小鼠处死并对组织进行分析。
图10A报告了载体基因组拷贝数(VGCN)，其通过在处死时从心脏组织提取的DNA的肌巨蛋白定量进行归一化。每个组的VGCN没有显著差异。图10B至10E对应于在来自小鼠的心肌(B-C)和四头肌(D-E)中通过western印迹测量的GAA，所述小鼠用编码在P1至P3的转录控制之下的GAA的载体注射。图10B和10D示出了通过从图10C和120获得的黏着斑蛋白强度条带进行归一化的GAA强度条带的定量。与其他组相比，在用载体P3(H3-CK6-C512)注射的小鼠中GAA的表达更多。这些结果证实了H3-CK6-spC5-12组合的协同效应不是由于H3与spC5-12之间的距离增加，而是由于在H3与spC5-12之间添加CK6启动子。
图11A代表了4种不同组合：(i)H3增强子、CK6启动子和spC5-12启动子(P1)；(ii)H3增强子、CK6启动子和Acta1启动子(P2)；(iii)H3增强子、CK6启动子和CK6启动子(P3)；(iv)H3增强子、CK6启动子和CK8启动子(P4)。H3增强子对应于HS-CRM8增强子的三次重复。P1的序列如SEQ ID NO：30中所示。图11B描述了体内方案。将6周龄C57BL/6野生型(WT)小鼠用3.8E11 vg/小鼠的AAV-MT(AAV9-rh74-P1)载体静脉内注射，所述载体编码在P1至P4的转录控制之下的人密码子优化的GAA(hGAAco)。在注射后一个月，将小鼠处死并对组织进行分析。
图12A报告了载体基因组拷贝数(VGCN)，其通过在处死时从心脏组织提取的DNA的肌巨蛋白定量进行归一化。每个组的VGCN没有显著差异。图12B对应于在来自小鼠的四头肌中通过western印迹测量的GAA，所述小鼠用编码在P1至P4的转录控制之下的GAA的载体注射。结果显示，在使用P1(H3-CK6-C5.12)、P2(H3-CK6-Acta1)或P3(H3-CK6-CK8)时获得了相近的GAA表达水平。P4(H3-CK6-CK6)也是非常有效的，因为它在与P1相比时似乎显示出甚至更强的表达。因此，所述结果显示spC5.12可以被其他肌肉特异性启动子代替，而不影响转入基因在肌肉中的表达水平。
这些数据表明，令人吃惊地，肝选择性增强子(H3)与两个肌肉选择性启动子(CK6+第二肌肉启动子)的组合极大提高了蛋白质在肌肉和脊髓中的表达(与强遍在启动子相比相近的表达)，而不靶向肝脏。

Claims (15)

1.一种核酸分子，其包含彼此可操作连接的：
(i)一个或多个肝选择性增强子；
(ii)第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
(iii)第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子选自spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、Acta1启动子、MCK启动子、结蛋白启动子及其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、Acta1启动子或其功能性变体；所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述第一肌肉选择性启动子位于所述第二肌肉选择性启动子的5’末端上游。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其以5’至3’的顺序包含：
-所述一个或多个肝选择性增强子；
-所述第一肌肉选择性启动子，所述第一肌肉选择性启动子是CK6启动子或其功能性变体；和
-所述第二肌肉选择性启动子，所述第二肌肉选择性启动子优选为spC5-12启动子、CK6启动子、CK8启动子、Acta1启动子或其功能性变体；所述第二肌肉选择性增强子优选为spC5-12启动子或其功能性变体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的核酸分子，其中所述CK6启动子由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：35、优选为SEQ ID NO：7中示出的序列，或序列与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：35、优选为SEQ ID NO：7具有至少80％同一性的功能性变体组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述第二肌肉选择性启动子是：
-spC5-12启动子，其由SEQ ID NO：4、5或6、优选为SEQ ID NO：6中示出的序列，或序列与SEQ ID NO：4、5或6、优选为SEQ ID NO：6具有至少80％同一性的功能性变体组成；
-CK8启动子，其由SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34、优选为SEQ ID NO：33中示出的序列，或序列与SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34、优选为SEQ ID NO：33具有至少80％同一性的功能性变体组成；
-CK6启动子，其由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：35、优选为SEQ ID NO：7中示出的序列，或序列与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：35、优选为SEQ ID NO：7具有至少80％同一性的功能性变体组成；或
-Acta1启动子，其由SEQ ID NO：37中示出的序列或序列与SEQ ID NO：37具有至少80％同一性的功能性变体组成。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的核酸分子，其中所述肝选择性增强子包含选自下述的序列或由所述序列组成：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43，与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ IDNO：28的序列中的任一者具有80％同一性的功能性变体；或
-所述多个肝选择性增强子包括至少一个肝选择性增强子，所述至少一个肝选择性增强子包含选自下述的序列或由所述序列组成：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43，与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQID NO：43的序列中的任一者具有80％同一性的功能性变体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的核酸分子，其中所述多个肝选择性增强子中的所有肝选择性增强子具有相同序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的核酸分子，其中所述多个肝选择性增强子包括至少两个肝选择性增强子，其中所述多个肝选择性增强子优选地包括三个肝选择性增强子。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子，其中所述肝选择性增强子的序列由SEQ ID NO：1组成，或者是序列与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的功能性变体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子由SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46组成，或者是序列与SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46具有至少80％同一性的功能性变体。
11.一种表达盒，其包含可操作地连接到感兴趣的转入基因的根据权利要求1至10中任一项所述的核酸分子。
12.一种载体，其包含根据权利要求11所述的表达盒，特别是其中所述载体是质粒或病毒载体，所述载体优选为腺相关病毒(AAV)载体。
13.一种分离的重组细胞，其包含根据权利要求11所述的表达盒或根据权利要求12所述的载体。
14.根据权利要求11所述的表达盒、根据权利要求12所述的载体或根据权利要求13所述的细胞，其用作药物。
15.根据权利要求11所述的表达盒、根据权利要求12所述的载体或根据权利要求13所述的细胞，其用于治疗神经肌肉障碍，其中所述神经肌肉障碍优选地选自肌营养不良症(例如肌强直性营养不良症(Steinert病)、杜氏肌营养不良症、贝克氏肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、远端型肌营养不良症、Emery-Dreifuss肌营养不良症、运动神经元疾病(例如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩症(婴儿进行性脊髓性肌萎缩症(1型、Werdnig-Hoffmann病)、中间型脊髓性肌萎缩症(2型)、青少年脊髓性肌萎缩症(3型、Kugelberg-Welander病)、成人脊髓性肌萎缩症(4型))、脊髓延髓肌萎缩症(肯尼迪病))、炎性肌病(例如多发性肌炎皮肌炎、包涵体肌炎)、神经肌肉接头疾病(例如重症肌无力、Lambert-Eaton(肌无力)综合征、先天性肌无力综合征)、周围神经疾病(例如Charcot-Marie-Tooth病、弗里德希氏共济失调、Dejerine-Sottas病)、肌肉代谢疾病(例如磷酸化酶缺乏症(McArdle病)、酸性麦芽糖酶缺乏症(庞贝病)、磷酸果糖激酶缺乏症(Tarui病)、脱支酶缺乏症(科里病或福布斯病)、线粒体肌病、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症)、由内分泌异常引起的肌病(例如甲状腺功能亢进性肌病、甲状腺功能减退性肌病)和其他肌病(例如先天性肌强直症、先天性副肌强直症、中央轴空病、线状体肌病、肌管性肌病、周期性瘫痪)。
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