JP2022530126A - 新規アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）バリアント及び遺伝子治療のためのその使用 - Google Patents
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Abstract
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ヒト集団(35～80%)において特有の欠損一本鎖DNAウイルスである。反復性のクローンAAV2の挿入が、正常肝上に発生するまれなヒト肝細胞癌(HCC)の病原性と関連している。本発明者らの目的は、肝臓におけるAAV感染の自然経過を特徴付けることであった。従って、1461名の患者の腫瘍及び非腫瘍肝組織において、ウイルスDNAを定量化した。DNAse/TaqManベースのアッセイ及び定量的RT-PCRを使用して、エピソーム形態の存在及びウイルスのmRNA発現を分析した。ウイルスキャプチャーデータを使用したインシリコ解析により、ウイルスのバリアント及び新規のクローン挿入を探索した。AAVのDNAは患者の21%において検出され、それは、一方がAAV2に類似し他方がAAV2とAAV13の配列間のハイブリッドである2つの主要なウイルスのサブタイプにおいて同等に分布していた。このように、本発明者らは、ウイルスの遺伝子型、分子形態、ヘルパーウイルスの関連性及びウイルスの組込みについての同定を伴う、肝臓における野生型AAV感染の統合解析を提供した。これらの知見は野生型AAVの生物学を理解するために重要であり、肝臓標的化遺伝子治療におけるAAVベクターの大規模な使用を考慮すると特に有意義である。このように、本発明は、新規アデノ随伴ウイルス(AAV)バリアント及び遺伝子治療のためのその使用に関する。
Description
本発明は、新規アデノ随伴ウイルス(AAV)バリアント及び遺伝子治療のためのその使用に関する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、4.7kbの直鎖状の一本鎖ゲノムを含有する正二十面体のカプシドによって構成される小型の非エンベロープDNAウイルスである1、2。AAVゲノムは、非構造タンパク質(Rep78、68、52及び40)、カプシドタンパク質(VP1、VP2、VP3)及びアセンブリー活性化タンパク質(assembly-activating protein)(AAP)をコードする3、4。末端における、逆方向タンデムリピート(ITR)は、宿主ゲノム内への組込みにとって重要である5、6。AAVは、活動性感染のためにヘルパーウイルスの存在を必要とする欠損ウイルスであり、それが存在しないと宿主ゲノムへの組込み又は環状エピソーム形態として存続することにより潜伏感染を確立する7-9。AAVの血清有病率により、感染はヒト集団(35～80%)において特有であり幼児期の間に起こることが示された10-12。12種の異なる血清型及び100を超える天然のバリアントが同定されており、それらの中でAAV2がヒトにおいて最も頻繁に見られる型である13-16。
この小型のウイルスは、同定可能な関連疾患がないこと、並びに高い効率、長期にわたる導入遺伝子の発現、低い免疫原生及び特異的組織指向性を伴う、分裂及び非分裂細胞を形質導入するための組換えAAV(rAAV)ベクターの際立った能力により、遺伝子治療分野から注目されてきた17。AAVは1965年に発見されたが、AAV感染に関する多くの疑問が未解決のままである2、18。ベクターが持続的なRNA発現を伴うエピソーム形態として主に核内に存続することは周知であり、野生型感染におけるエピソーム形態AAVの存在の可能性について疑問を投げかけている8。複数のヘルパーウイルスが同定されてきたが、野生型の肝臓AAV感染とそれらの正確な関連は不明なままである。集団における特定のAAV遺伝子型及び一次感染後のAAV存続頻度に関する利用可能なデータはほとんどない19。
Smith及びWaterman、Adv. Appl. Math.、2:482、1981
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Myers及びMiller、CABIOS 4:11～17頁、1989
Altschulら、J. Mol. Biol.、215:403～410頁、1990
Gish及びStates、Nature Genet.、3:266～272頁、1993
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Altschulら、Nucleic Acids Res.、25:3389～3402頁、1997
Zhang及びMadden、Genome Res.、7:649～656頁、1997
Srivistavaら(1983) J. Virology 45:555
Chioriniら(1998) J. Virology 71:6823
Chioriniら(1999) J. Virology 73:1309
Bantel-Schaalら(1999) J. Virology 73:939
Xiaoら(1999) J. Virology 73:3994
Muramatsuら(1996) Virology 221:208
Shadeら(1986) J. Virol.58:921
Gaoら(2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854
Moriら(2004) Virology 330:375～383頁
Graingerら(2005) Mol. Ther. 11:S337
Zolotukhinら(1999) Gene Ther.6:973
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Martinら、(2013)Human Gene Therapy Methods 24:253～269頁
Xiaoら、(1998) Journal of Virology 72:2224～2232頁
Rohrら、J. Virol. Methods、2002、106、81～88頁
特許請求の範囲によって規定されている通り、本発明は、新規アデノ随伴ウイルス(AAV)バリアント及び遺伝子治療のためのその使用に関する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ヒト集団(35～80%)において特有の欠損一本鎖DNAウイルスである。反復性のクローンAAV2の挿入が、正常肝内に発生するまれなヒト肝細胞癌(HCC)の病原性と関連している。本発明者らの目的は、肝臓におけるAAV感染の自然経過を特徴付けることであった。従って、1461名の患者の腫瘍及び非腫瘍肝組織において、ウイルスDNAを定量化した。DNAse/TaqManベースのアッセイ及び定量的RT-PCRを使用して、エピソーム形態の存在及びウイルスのmRNA発現を分析した。ウイルスキャプチャーデータ(viral capture data)のインシリコ解析により、ウイルスのバリアント及び新規のクローン挿入が同定された。AAVのDNAは患者の21%において検出され、それは、一方がAAV2に類似し他方がAAV2とAAV13の配列間のハイブリッドである2つの主要なウイルスのサブタイプにおいて同等に分布していた。このように、本発明者らは、ウイルスの遺伝子型、分子形態、ヘルパーウイルスの関連性及びウイルスの組込みについての同定を伴う、肝臓における野生型AAV感染の統合解析を提供した。これらの知見は、野生型AAVの生物学を理解するために重要である。本データは、肝臓標的化遺伝子治療におけるこの新規なAAVバリアントの治療可能性を考慮すると特に有意義である。
主な定義
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。従って、この用語には、一本鎖、二本鎖若しくは多重鎖のDNA若しくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、又はプリン塩基及びピリミジン塩基を含むポリマー、或いは他の天然の、化学的若しくは生化学的に改変された、非天然の、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、(一般的にRNA若しくはDNA中に見出すことができるような)糖及びリン酸基、又は修飾若しくは置換されている糖若しくはリン酸基を含み得る。或いは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミド酸等の合成サブユニットのポリマーを含むことができ、従ってオリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミド酸(P-NH2)又は混合ホスホロアミド酸-リン酸ジエステルオリゴマーであり得る。更に、相補鎖を合成して適切な条件下でその鎖をアニールすることによって、又はDNAポリメラーゼを適切なプライマーと共に使用して新規に相補鎖を合成することによって、二本鎖ポリヌクレオチドを化学合成由来の一本鎖ポリヌクレオチド生成物から得ることができる。
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。従って、この用語には、一本鎖、二本鎖若しくは多重鎖のDNA若しくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、又はプリン塩基及びピリミジン塩基を含むポリマー、或いは他の天然の、化学的若しくは生化学的に改変された、非天然の、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、(一般的にRNA若しくはDNA中に見出すことができるような)糖及びリン酸基、又は修飾若しくは置換されている糖若しくはリン酸基を含み得る。或いは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミド酸等の合成サブユニットのポリマーを含むことができ、従ってオリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミド酸(P-NH2)又は混合ホスホロアミド酸-リン酸ジエステルオリゴマーであり得る。更に、相補鎖を合成して適切な条件下でその鎖をアニールすることによって、又はDNAポリメラーゼを適切なプライマーと共に使用して新規に相補鎖を合成することによって、二本鎖ポリヌクレオチドを化学合成由来の一本鎖ポリヌクレオチド生成物から得ることができる。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味するために区別なく使用され、最小の長さに限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然又は非天然のアミノ酸残基を含有していてもよく、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体及び多量体を含むがこれらに限定されない。本定義には、完全長のタンパク質及びその断片の両方が包含される。本用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化等も含まれる。更に、本発明の目的上、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然の配列への修飾、例えば(通常は自然界において保存されている)欠失、付加及び置換等を含むタンパク質を意味する。これらの修飾は、部位特異的変異誘発を介してのような故意のものであってもよく、又はタンパク質を産生する宿主の変異若しくはPCR増幅が原因の誤り等による偶発的なものであってもよい。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがDNA鋳型から(mRNA又は他のRNA転写物等に)転写されるプロセス及び/又は転写されたmRNAがその後にペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。転写物及びコードされているポリペプチドをまとめて「遺伝子産物」と呼んでもよい。
本明細書で使用される場合、用語「野生型」又は「天然の」は、当技術分野の技術者によって理解される当技術分野の用語であり、天然に存在し変異体の形態から区別されるような、生物、株、遺伝子又は特徴の典型的な形態を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「変異」は当技術分野においてその一般的な意味を有し、置換、欠失又は挿入を意味する。具体的には、用語「置換」は、特定の位置の特定のアミノ酸残基を除去して別のアミノ酸残基を同じ位置に挿入することを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、第1の構成物(例えば第1の分子)を意味し、それは第2の構成物(例えば第2の分子、「親」分子とも称される)と関連する。バリアント分子は、親分子に由来し得るか、親分子から単離され得るか、親分子に基づき得るか、或いは親分子と相同であり得る。バリアント分子は、元の親分子に対して完全な配列同一性を有し得るか、或いは親分子に対して100%未満の配列同一性を有し得る。例えば、配列のバリアントは、元の配列と比べて、配列において少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%同一である第2の配列であり得る。配列同一性は、しばしば同一性百分率(又は類似性百分率又は相同性百分率)の観点から評価され、百分率が高いほど、2つの配列はより類似している。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムが、Smith及びWaterman、Adv. Appl. Math.、2:482、1981;Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol.、48:443、1970;Pearson及びLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、85:2444、1988;Higgins及びSharp、Gene、73:237～244頁、1988;Higgins及びSharp、CABIOS、5:151～153頁、1989;Corpetら、Nuc. Acids Res.、16:10881～10890頁、1988;Huangら、Comp. Appls Biosci.、8:155～165頁、1992;並びにPearsonら、Meth. Mol. Biol.、24:307～31頁、1994に記載されている。Altschulら、Nat. Genet.、6:119～129頁、1994は、配列アライメントの方法及び相同性の計算の詳細な考察を提示している。例としては、アライメントツールのALIGN(Myers及びMiller、CABIOS 4:11～17頁、1989)又はLFASTA(Pearson及びLipman、1988)が、配列比較を実施するため使用され得る(Internet Program(登録商標)1996年、W. R. Pearson及びUniversity of Virginia、fasta20u63バージョン2.0u63、発売日1996年12月)。ALIGNでは互いに対して完全配列が比較されるが、LFASTAでは局所的に類似する領域が比較される。これらのアライメントツール及びそれらの個別のチュートリアルは、例えば、NCSAのウェブサイトにおいてインターネット上での入手が可能である。或いは、約30アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較に対しては、Blast 2 sequencesの機能を、デフォルトパラメータに設定したデフォルトのBLOSUM62マトリックス(ギャップ存在コストが11、残基ごとのギャップコストが1)を使用して利用することができる。短いペプチド(およそ30アミノ酸未満)を整合させる場合には、アライメントは、デフォルトパラメータに設定したPAM30マトリックス(開始ギャップが9、伸長ギャップが1のペナルティー)を利用するBlast 2 sequencesの機能を使用して実施しなくてはならない。BLASTの配列比較システムは、例えば、NCBIのウェブサイトから入手可能である。Altschulら、J. Mol. Biol.、215:403～410頁、1990;Gish及びStates、Nature Genet.、3:266～272頁、1993;Maddenら、Meth. Enzymol.、266:131～141頁、1996;Altschulら、Nucleic Acids Res.、25:3389～3402頁、1997;及びZhang及びMadden、Genome Res.、7:649～656頁、1997も参照のこと。
本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」又は「AAV」は当技術分野において一般的な意味を有し、パルボウイルス科パルボウイルス属(parvoviridae genus)のウイルスの中の、ディペンドパルボウイルスを意味する。本用語は、天然に存在する「野生型」ウイルスに由来するAAV、又は天然に存在するcap遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質から得られるカプシド内にパッケージ化されたrAAVゲノムに由来するAAVを意味し得る。用語「AAV」には、AAV1型(AAV-1)、AAV2型(AAV-2)、AAV3型(AAV-3)、AAV4型(AAV-4)、AAV5型(AAV-5)、AAV6型(AAV-6)、AAV7型(AAV-7)、AAV8型(AAV-8)、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ブタAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV、及びヒツジAAVが含まれる。「霊長類AAV」は霊長類を感染させるAAVを意味し、「非霊長類AAV」は非霊長類哺乳動物を感染させるAAVを意味し、「ウシAAV」はウシ哺乳動物を感染させるAAVを意味する等である。様々な血清型のAAVのゲノム配列、並びに天然の逆方向末端リピート(ITR)、Repタンパク質及びカプシドサブユニットの配列が当技術分野において公知である。そのような配列は、文献又はGenBank等の公共データベースにおいて見出すことができる。例えば、GenBankのAccession番号NC-002077(AAV-1)、AF063497(AAV-1)、NC-001401(AAV-2)、AF043303(AAV-2)、NC-001729(AAV-3)、NC-001829(AAV-4)、U89790(AAV-4)、NC-006152(AAV-5)、AF513851(AAV-7)、AF513852(AAV-8)、及びNC-006261(AAV-8)を参照のこと。その開示を、AAVの核酸及びアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書に組み込む。例えば、Srivistavaら(1983) J. Virology 45:555;Chioriniら(1998) J. Virology 71:6823;Chioriniら(1999) J. Virology 73:1309;Bantel-Schaalら(1999) J. Virology 73:939;Xiaoら(1999) J. Virology 73:3994;Muramatsuら(1996) Virology 221:208;Shadeら(1986) J. Virol.58:921;Gaoら(2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854;Moriら(2004) Virology 330:375～383頁;国際特許公開WO00/28061、WO99/61601、WO98/11244;及び米国特許第6,156,303号も参照のこと。AAV2の完全ゲノムは、配列番号1に示される参照配列によって表される。
配列番号1>NCBI参照配列:NC_001401.2
1 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc
61 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg
121 gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag
181 ggttagggag gtcctgtatt agaggtcacg tgagtgtttt gcgacatttt gcgacaccat
241 gtggtcacgc tgggtattta agcccgagtg agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga
301 ggtttgaacg cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg
361 accttgacga gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg
421 aatgggagtt gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga
481 ccgtggccga gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc
541 cggaggccct tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc
601 tcgtggaaac caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg
661 aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg
721 tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc
781 ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac
841 agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga
901 cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc
961 cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca
1021 aggggattac ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca
1081 atgcggcctc caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta
1141 tgagcctgac taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt
1201 ccagcaatcg gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt
1261 ccgtctttct gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg
1321 ggcctgcaac taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct
1381 acgggtgcgt aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg
1441 tgatctggtg ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc
1501 tcggaggaag caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga
1561 ctcccgtgat cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga
1621 ccttcgaaca ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc
1681 tggatcatga ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa
1741 aggatcacgt ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa
1801 gacccgcccc cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc
1861 agccatcgac gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat
1921 gttctcgtca cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga
1981 atcagaattc aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg
2041 tgtcagaatc tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc
2101 atcatatcat gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt
2161 tggatgactg catctttgaa caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat
2221 cttccagatt ggctcgagga cactctctct gaaggaataa gacagtggtg gaagctcaaa
2281 cctggcccac caccaccaaa gcccgcagag cggcataagg acgacagcag gggtcttgtg
2341 cttcctgggt acaagtacct cggacccttc aacggactcg acaagggaga gccggtcaac
2401 gaggcagacg ccgcggccct cgagcacgac aaagcctacg accggcagct cgacagcgga
2461 gacaacccgt acctcaagta caaccacgcc gacgcggagt ttcaggagcg ccttaaagaa
2521 gatacgtctt ttgggggcaa cctcggacga gcagtcttcc aggcgaaaaa gagggttctt
2581 gaacctctgg gcctggttga ggaacctgtt aagacggctc cgggaaaaaa gaggccggta
2641 gagcactctc ctgtggagcc agactcctcc tcgggaaccg gaaaggcggg ccagcagcct
2701 gcaagaaaaa gattgaattt tggtcagact ggagacgcag actcagtacc tgacccccag
2761 cctctcggac agccaccagc agccccctct ggtctgggaa ctaatacgat ggctacaggc
2821 agtggcgcac caatggcaga caataacgag ggcgccgacg gagtgggtaa ttcctcggga
2881 aattggcatt gcgattccac atggatgggc gacagagtca tcaccaccag cacccgaacc
2941 tgggccctgc ccacctacaa caaccacctc tacaaacaaa tttccagcca atcaggagcc
3001 tcgaacgaca atcactactt tggctacagc accccttggg ggtattttga cttcaacaga
3061 ttccactgcc acttttcacc acgtgactgg caaagactca tcaacaacaa ctggggattc
3121 cgacccaaga gactcaactt caagctcttt aacattcaag tcaaagaggt cacgcagaat
3181 gacggtacga cgacgattgc caataacctt accagcacgg ttcaggtgtt tactgactcg
3241 gagtaccagc tcccgtacgt cctcggctcg gcgcatcaag gatgcctccc gccgttccca
3301 gcagacgtct tcatggtgcc acagtatgga tacctcaccc tgaacaacgg gagtcaggca
3361 gtaggacgct cttcatttta ctgcctggag tactttcctt ctcagatgct gcgtaccgga
3421 aacaacttta ccttcagcta cacttttgag gacgttcctt tccacagcag ctacgctcac
3481 agccagagtc tggaccgtct catgaatcct ctcatcgacc agtacctgta ttacttgagc
3541 agaacaaaca ctccaagtgg aaccaccacg cagtcaaggc ttcagttttc tcaggccgga
3601 gcgagtgaca ttcgggacca gtctaggaac tggcttcctg gaccctgtta ccgccagcag
3661 cgagtatcaa agacatctgc ggataacaac aacagtgaat actcgtggac tggagctacc
3721 aagtaccacc tcaatggcag agactctctg gtgaatccgg gcccggccat ggcaagccac
3781 aaggacgatg aagaaaagtt ttttcctcag agcggggttc tcatctttgg gaagcaaggc
3841 tcagagaaaa caaatgtgga cattgaaaag gtcatgatta cagacgaaga ggaaatcagg
3901 acaaccaatc ccgtggctac ggagcagtat ggttctgtat ctaccaacct ccagagaggc
3961 aacagacaag cagctaccgc agatgtcaac acacaaggcg ttcttccagg catggtctgg
4021 caggacagag atgtgtacct tcaggggccc atctgggcaa agattccaca cacggacgga
4081 cattttcacc cctctcccct catgggtgga ttcggactta aacaccctcc tccacagatt
4141 ctcatcaaga acaccccggt acctgcgaat ccttcgacca ccttcagtgc ggcaaagttt
4201 gcttccttca tcacacagta ctccacggga caggtcagcg tggagatcga gtgggagctg
4261 cagaaggaaa acagcaaacg ctggaatccc gaaattcagt acacttccaa ctacaacaag
4321 tctgttaatg tggactttac tgtggacact aatggcgtgt attcagagcc tcgccccatt
4381 ggcaccagat acctgactcg taatctgtaa ttgcttgtta atcaataaac cgtttaattc
4441 gtttcagttg aactttggtc tctgcgtatt tctttcttat ctagtttcca tggctacgta
4501 gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat ggagttggcc
4561 actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc
4621 ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaa
1 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc
61 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg
121 gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag
181 ggttagggag gtcctgtatt agaggtcacg tgagtgtttt gcgacatttt gcgacaccat
241 gtggtcacgc tgggtattta agcccgagtg agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga
301 ggtttgaacg cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg
361 accttgacga gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg
421 aatgggagtt gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga
481 ccgtggccga gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc
541 cggaggccct tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc
601 tcgtggaaac caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg
661 aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg
721 tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc
781 ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac
841 agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga
901 cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc
961 cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca
1021 aggggattac ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca
1081 atgcggcctc caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta
1141 tgagcctgac taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt
1201 ccagcaatcg gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt
1261 ccgtctttct gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg
1321 ggcctgcaac taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct
1381 acgggtgcgt aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg
1441 tgatctggtg ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc
1501 tcggaggaag caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga
1561 ctcccgtgat cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga
1621 ccttcgaaca ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc
1681 tggatcatga ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa
1741 aggatcacgt ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa
1801 gacccgcccc cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc
1861 agccatcgac gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat
1921 gttctcgtca cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga
1981 atcagaattc aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg
2041 tgtcagaatc tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc
2101 atcatatcat gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt
2161 tggatgactg catctttgaa caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat
2221 cttccagatt ggctcgagga cactctctct gaaggaataa gacagtggtg gaagctcaaa
2281 cctggcccac caccaccaaa gcccgcagag cggcataagg acgacagcag gggtcttgtg
2341 cttcctgggt acaagtacct cggacccttc aacggactcg acaagggaga gccggtcaac
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2581 gaacctctgg gcctggttga ggaacctgtt aagacggctc cgggaaaaaa gaggccggta
2641 gagcactctc ctgtggagcc agactcctcc tcgggaaccg gaaaggcggg ccagcagcct
2701 gcaagaaaaa gattgaattt tggtcagact ggagacgcag actcagtacc tgacccccag
2761 cctctcggac agccaccagc agccccctct ggtctgggaa ctaatacgat ggctacaggc
2821 agtggcgcac caatggcaga caataacgag ggcgccgacg gagtgggtaa ttcctcggga
2881 aattggcatt gcgattccac atggatgggc gacagagtca tcaccaccag cacccgaacc
2941 tgggccctgc ccacctacaa caaccacctc tacaaacaaa tttccagcca atcaggagcc
3001 tcgaacgaca atcactactt tggctacagc accccttggg ggtattttga cttcaacaga
3061 ttccactgcc acttttcacc acgtgactgg caaagactca tcaacaacaa ctggggattc
3121 cgacccaaga gactcaactt caagctcttt aacattcaag tcaaagaggt cacgcagaat
3181 gacggtacga cgacgattgc caataacctt accagcacgg ttcaggtgtt tactgactcg
3241 gagtaccagc tcccgtacgt cctcggctcg gcgcatcaag gatgcctccc gccgttccca
3301 gcagacgtct tcatggtgcc acagtatgga tacctcaccc tgaacaacgg gagtcaggca
3361 gtaggacgct cttcatttta ctgcctggag tactttcctt ctcagatgct gcgtaccgga
3421 aacaacttta ccttcagcta cacttttgag gacgttcctt tccacagcag ctacgctcac
3481 agccagagtc tggaccgtct catgaatcct ctcatcgacc agtacctgta ttacttgagc
3541 agaacaaaca ctccaagtgg aaccaccacg cagtcaaggc ttcagttttc tcaggccgga
3601 gcgagtgaca ttcgggacca gtctaggaac tggcttcctg gaccctgtta ccgccagcag
3661 cgagtatcaa agacatctgc ggataacaac aacagtgaat actcgtggac tggagctacc
3721 aagtaccacc tcaatggcag agactctctg gtgaatccgg gcccggccat ggcaagccac
3781 aaggacgatg aagaaaagtt ttttcctcag agcggggttc tcatctttgg gaagcaaggc
3841 tcagagaaaa caaatgtgga cattgaaaag gtcatgatta cagacgaaga ggaaatcagg
3901 acaaccaatc ccgtggctac ggagcagtat ggttctgtat ctaccaacct ccagagaggc
3961 aacagacaag cagctaccgc agatgtcaac acacaaggcg ttcttccagg catggtctgg
4021 caggacagag atgtgtacct tcaggggccc atctgggcaa agattccaca cacggacgga
4081 cattttcacc cctctcccct catgggtgga ttcggactta aacaccctcc tccacagatt
4141 ctcatcaaga acaccccggt acctgcgaat ccttcgacca ccttcagtgc ggcaaagttt
4201 gcttccttca tcacacagta ctccacggga caggtcagcg tggagatcga gtgggagctg
4261 cagaaggaaa acagcaaacg ctggaatccc gaaattcagt acacttccaa ctacaacaag
4321 tctgttaatg tggactttac tgtggacact aatggcgtgt attcagagcc tcgccccatt
4381 ggcaccagat acctgactcg taatctgtaa ttgcttgtta atcaataaac cgtttaattc
4441 gtttcagttg aactttggtc tctgcgtatt tctttcttat ctagtttcca tggctacgta
4501 gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat ggagttggcc
4561 actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc
4621 ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaa
本明細書で使用される場合、用語「cap遺伝子」は、ウイルスのカプシドすなわちタンパク質殻を形成する又はその形成に寄与するカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。AAV2の場合、カプシドタンパク質はVP1、VP2又はVP3であり得る。他のパルボウイルスの場合、カプシドタンパク質の名称及び番号は異なり得る。AAV2のVP1カプシドタンパク質は、配列番号2に示される参照アミノ酸配列によって表される。AAV2のVP2カプシドタンパク質は、配列番号2における位置138のアミノ酸残基から最後のアミノ酸残基までの範囲のアミノ酸配列によって表される。AAV2のVP3カプシドタンパク質は、配列番号2における位置203のアミノ酸残基から最後のアミノ酸残基までの範囲のアミノ酸配列によって表される。
配列番号2>sp|P03135|CAPSD_AAV2S カプシドタンパク質VP1 OS=アデノ随伴ウイルス2 (isolate Srivastava/1982)OX=648242 GN=VP1 PE=1 SV=2
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
本明細書で使用される場合、用語「rep遺伝子」は、ウイルスの複製及び産生に必要な非構造タンパク質(rep78、rep68、rep52及びrep40)をコードする核酸配列を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「パッケージング」は、AAVウイルスのアセンブリー及びカプシド形成をもたらす一連の細胞内の現象を意味する。
AAVの「ヘルパーウイルス」とは、AAV(例えば、野生型AAV)が哺乳動物細胞によって複製されてパッケージ化されることを可能にするウイルスを意味する。様々なそのようなAAVのヘルパーウイルスが当技術分野において公知であり、それにはアデノウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニア等のポックスウイルスが含まれる。サブグループCのアデノウイルス5型が最も一般に使用されるが、アデノウイルスには複数の異なるサブグループが包含される。ヒト、非ヒト哺乳動物及びトリ起源の数々のアデノウイルスが既知であり、ATCC等の寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)及びエプスタイン-バーウイルス(EBV)、並びにサイトメガロウイルス(CMV)及び仮性狂犬病ウイルス(PRV)が含まれ、これらもATCC等の寄託機関から入手可能である。「ヘルパーウイルス機能」とは、(本明細書に記載の複製及びパッケージングのために他の必要物と併せて)AAVの複製及びパッケージングを可能にする、ヘルパーウイルスのゲノム中にコードされている機能を意味する。本明細書に記載されているように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、又は、例えば、必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をin transでプロデューサー細胞に提供することを含む、いくつかの方法で提供され得る。例えば、rAAVを産生させるために、1つ又は複数のアデノウイルスのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド又は他の発現ベクターを、AAVのrep及びcap遺伝子をコードするヌクレオチド配列と、2つのITRが隣接する導入遺伝子発現カセットと共に、プロデューサー細胞にトランスフェクトする。
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスのウイルス粒子」は、適格にアセンブルされたウイルスのカプシドを含むものであり、かつウイルス種が向性である細胞にポリヌクレオチド成分を送達することが可能なものである。本用語は必ずしもウイルスの何らかの複製能力を含意するものではない。感染性のウイルス粒子を計数するためのアッセイが、本開示及び当技術分野において他で記載されている。ウイルスの感染力は、総ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率として表することができる。総ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率を決定する方法が、当技術分野において公知である。例えば、Graingerら(2005) Mol. Ther. 11:S337(TCID50感染力価アッセイを記載);及びZolotukhinら(1999) Gene Ther. 6:973を参照のこと。実施例も参照のこと。
本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、細胞に導入されてRNAに転写されることが可能な、場合により適切な条件下で翻訳されかつ/又は発現するポリヌクレオチドを意味する。複数の態様では、導入遺伝子はそれが導入された細胞に所望の性質を与え、そうでなければ所望の治療結果をもたらす。別の態様では、導入遺伝子は、miRNA、siRNA又はshRNA等のRNA干渉を媒介する分子に転写され得る。
本明細書で使用される場合、用語「調節エレメント」又は「調節配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳又は分解を含むポリヌクレオチドの機能制御に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。本制御は該プロセスの頻度、速度又は特異性に影響を及ぼすことができ、性質として促進的又は阻害的であり得る。当技術分野において公知の調節エレメントには、例えば、プロモーター及びエンハンサー等の転写制御配列が含まれる。プロモーターは、特定の条件下でRNAポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターの下流(3’方向)に位置するコード領域の転写を開始させることが可能なDNA領域である。
本明細書で使用される場合、用語「作動的に連結された」又は「作動可能に連結された」は、遺伝要素の並置を意味し、ここでは要素はそれらが期待通りに作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、プロモーターはコード領域に作動的に連結されている。この機能的な関係が維持される限り、プロモーターとコード領域の間に介在残基が存在していてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「異種の」は、それが比較されている他の実体のものとは遺伝子型的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって、異なる種に由来するプラスミド又はベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種のポリヌクレオチドである。天然のコード配列から除去されたプロモーターであって、その連結が天然には見出されていないコード配列に作動的に連結されたプロモーターは、異種のプロモーターである。従って、例えば、異種の遺伝子産物をコードする異種の核酸を含むrAAVは、天然に存在する野生型のAAVには通常含まれない核酸を含むrAAVであり、コードされた異種の遺伝子産物は、天然に存在する野生型のAAVによっては通常コードされない遺伝子産物である。
本明細書で使用される場合、プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、又は他の物質に対して言及される場合の用語「単離された」は、物質又は類似の物質が天然に存在する場所又はそれらが最初に調製される場所では同様に存在し得る他の成分の少なくとも一部を欠く物質の調製物を意味する。従って、例えば、単離された物質は、精製技術を用いてそれを原料混合物から濃縮することにより調製され得る。濃縮は、溶液の体積当たりの質量等の絶対的な基準において評価することができ、又は原料混合物中に存在する第2の潜在的な干渉物質に関連させて評価することができる。本開示の実施形態の濃縮を向上することは、一段とより単離することである。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞又は他の物質は、いくつかの実施形態では、例えば約80%から約90%の純度、少なくとも約90%の純度、少なくとも約95%の純度、少なくとも約98%の純度、又は少なくとも約99%以上の純度で精製される。
用語「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適切に投与された場合に、拒絶、アレルギー又は他の有害反応を引き起こさない分子実体及び組成物を意味する。
「治療有効量」は、妥当なベネフィット/リスク比で疾患を処置するための、本発明のrAAVの十分な量を意味する。本発明のrAAVの1日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲において主治医によって決定されるであろうことが理解されよう。任意の特定の患者のための特定の治療有効用量のレベルは、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事;使用される特定の化合物の投与時期、投与経路及び排泄率;処置の継続時間;使用される特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物;並びに医学分野において周知の類似の因子を含む種々の因子に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることは当業者内で周知である。従って、ベクターの用量は、疾患の状態、対象(例えば、その体重、代謝等に従って)、処置のスケジュール等に応じて適合させてもよい。本発明の文脈において好ましい有効用量は、錐体視細胞の最適な形質導入を可能にする用量である。典型的には、マウスにおいては、108から1010のウイルスゲノム(vg)が、1回分の用量につき投与される。典型的には、ヒトにおいて投与されるAAVの用量は、109から1012vgの範囲であり得る。
バリアントAAV2カプシドタンパク質:
本発明の一目的は、Table 1(表1)の少なくとも1つの変異を含む、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるバリアントVP1カプシドタンパク質に関する。
本発明の一目的は、Table 1(表1)の少なくとも1つの変異を含む、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるバリアントVP1カプシドタンパク質に関する。
本発明の一目的は、Table 1(表1)の少なくとも1つの変異を含む、配列番号2における位置138のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列からなるバリアントVP2カプシドタンパク質に関する。
本発明の一目的は、Table 1(表1)の少なくとも1つの変異を含む、配列番号2における位置203のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列からなるバリアントVP3カプシドタンパク質に関する。
本発明の一目的は、V151A、Q164N、T200S、N201T、M211V、T233Q、M235L、T410Q、S446N、R447K、N449Q、T450S、P451N、T455L、T456Q、Q461L、A467P、S468T、D469S、I470M、R471S、D472L、S474A、R475K、V488L、T491Q、S492A、A493N、E499N、Y500F、S501P、G504A、Q536M、S537H、V539T、S547T、E548N、K549A、T550N、N551D、V552A、I554L、E555D、K556N、S578Y、T581N、R585N、R585S、G586S、R588T、Q589G、A590P、A591T、A593S、A593G、D594T、T597H、V600A、L647M、S658P、T660N、及びA663Sからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるバリアントVP1カプシドタンパク質に関する。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP1カプシドタンパク質は、配列番号3から配列番号61からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明のさらなる目的は、配列番号26(すなわちカプシド#3013)、配列番号9(すなわちカプシド#2087)、配列番号20(すなわちカプシド#1449)、配列番号10(すなわちカプシド#2206)、配列番号12(すなわちカプシド#1534)、配列番号56(すなわちカプシド#163)、配列番号23(すなわちカプシド#1343)、配列番号53(すなわちカプシド#790)、配列番号6(すなわちカプシド#1017)、配列番号11(すなわちカプシド#877)、配列番号8(すなわちカプシド#1273)、配列番号3(すなわちカプシド#2497)、配列番号60(すなわちカプシド#1055)、配列番号14(すなわちカプシド#1919)、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15から配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号24、配列番号25、配列番号27から配列番号55、配列番号57から配列番号59、配列番号61からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する本発明のバリアントVP1カプシドタンパク質に関する。
本発明のさらなる目的は、V151A、Q164N、T200S、N201T、M211V、T233Q、M235L、T410Q、S446N、R447K、N449Q、T450S、P451N、T455L、T456Q、Q461L、A467P、S468T、D469S、I470M、R471S、D472L、S474A、R475K、V488L、T491Q、S492A、A493N、E499N、Y500F、S501P、G504A、Q536M、S537H、V539T、S547T、E548N、K549A、T550N、N551D、V552A、I554L、E555D、K556N、S578Y、T581N、R585N、R585S、G586S、R588T、Q589G、A590P、A591T、A593S、A593G、D594T、T597H、V600A、L647M、S658P、T660N、及びA663Sからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む、配列番号2における位置138のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列からなるバリアントVP2カプシドタンパク質に関する。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP2カプシドタンパク質は、配列番号3から配列番号61における位置138のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列を有する。
本発明のさらなる目的は、配列番号26(すなわちカプシド#3013)、配列番号9(すなわちカプシド#2087)、配列番号20(すなわちカプシド#1449)、配列番号10(すなわちカプシド#2206)、配列番号12(すなわちカプシド#1534)、配列番号56(すなわちカプシド#163)、配列番号23(すなわちカプシド#1343)、配列番号53(すなわちカプシド#790)、配列番号6(すなわちカプシド#1017)、配列番号11(すなわちカプシド#877)、配列番号8(すなわちカプシド#1273)、配列番号3(すなわちカプシド#2497)、配列番号60(すなわちカプシド#1055)、配列番号14(すなわちカプシド#1919)、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15から配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号24、配列番号25、配列番号27から配列番号55、配列番号57から配列番号59、配列番号61における、位置138のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列を有する本発明のバリアントVP2カプシドタンパク質に関する。
本発明のさらなる目的は、M211V、T233Q、M235L、T410Q、S446N、R447K、N449Q、T450S、P451N、T455L、T456Q、Q461L、A467P、S468T、D469S、I470M、R471S、D472L、S474A、R475K、V488L、T491Q、S492A、A493N、E499N、Y500F、S501P、G504A、Q536M、S537H、V539T、S547T、E548N、K549A、T550N、N551D、V552A、I554L、E555D、K556N、S578Y、T581N、R585N、R585S、G586S、R588T、Q589G、A590P、A591T、A593S、A593G、D594T、T597H、V600A、L647M、S658P、T660N、及びA663Sからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む、配列番号2における位置203のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列からなるバリアントVP3カプシドタンパク質に関する。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP3カプシドタンパク質は、配列番号3から配列番号61における位置203のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列を有する。
本発明のさらなる目的は、配列番号26(すなわちカプシド#3013)、配列番号9(すなわちカプシド#2087)、配列番号20(すなわちカプシド#1449)、配列番号10(すなわちカプシド#2206)、配列番号12(すなわちカプシド#1534)、配列番号56(すなわちカプシド#163)、配列番号23(すなわちカプシド#1343)、配列番号53(すなわちカプシド#790)、配列番号6(すなわちカプシド#1017)、配列番号11(すなわちカプシド#877)、配列番号8(すなわちカプシド#1273)、配列番号3(すなわちカプシド#2497)、配列番号60(すなわちカプシド#1055)、配列番号14(すなわちカプシド#1919)、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15から配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号24、配列番号25、配列番号27から配列番号55、配列番号57から配列番号59、配列番号61における、位置203のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列を有する本発明のバリアントVP3カプシドタンパク質に関する。
バリアントカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明のさらなる目的は、本発明のバリアントカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
本発明のさらなる目的は、本発明のバリアントカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP1カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1における位置2203のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、Table 1(表1)から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP1カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1における位置2203のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、2433A>G、2511C>T、2654T>C、2685G>A、2692CAG>AAC、2721T>C、2745A>C、2794C>T、2800A>T、2804A>C、2808G>A、2833A>G、2853C>T、2859C>T、2877G>A、2899AC>CA、2905A>C、2946C>T、2967C>T、2970C>G、2976A>G、2979A>G、2982T>C、3003G>A、3012T>C、3036T>C、3123A>G、3129G>A、3165A>G、3297C>T、3303A>G、3318G>C、3360A>G、3375A>C、3411G>T、3417C>T、3430ACC>CAG、3444T>C、3450G>A、3490C>T、3495C>T、3498T>G、3501C>G、3513C>G、3534C>T、3535T>C、3539G>A、3542GA>AG、3547AAC>CAA、3550ACT>TCA、3553CCA>AAT、3558T>C、3564C>T、3565ACC>CTT、3568AC>CA、3576A>C、3576A>T、3577A>C、3582T>A、3584A>T、3589TC>AG、3594G>A、3597C>T、3601GCG>CCC、3605GT>CC、3607GA>AG、3612T>G、3613CGG>TCT、3616GAC>CTT、3621G>A、3622T>G、3626GG>AA、3636T>G、3645C>T、3648T>C、3652CGC>AGA、3663A>T、3664GTA>CTG、3672ACA>CAG、3676TCT>GCA、3679GCG>AAC、3684T>C、3696T>C、3697GAA>AAC、3701AC>TT、3703TCG>CCC、3713GA>CG、3720C>A、3726C>T、3729C>T、3732C>A、3739AGA>CGG、3747T>G、3748C>T、3753G>T、3759G>A、3762C>A、3765G>A、3768C>T、3774A>C、3783G>A、3804T>C、3807T>C、3808CA>AT、3811AGC>CAT、3816G>A、3817GTT>ACC、3822C>G、3825C>A、3831G>A、3834G>A、3840C>A、3841T>A、3844GAG>AAT、3847AAA>GCT、3851CA>AC、3853AAT>GAC、3857T>C、3861C>T、3862ATT>TTG、3867A>C、3870>T、3885C>T、3891G>A、3898AGG>CGC、3903A>C、3930T>C、3933T>A、3935C>A、3939A>G、3942T>A、3944CC>AT、3948C>T、3949CTC>TTG、3954G>A、3956GA>AC、3957A>C、3958GGC>TCA、3963C>T、3965G>C、3967CAA>GGT、3970G>C、3973G>A、3978C>T、3979G>T、3980C>G、3982GA>AC、3990C>T、3991ACA>CAC、3999C>A、4001TT>CG、4003CTT>TTA、4008A>T、4011C>T、4017C>G、4026C>T、4027A>C、4032T>C、4041T>G、4047G>A、4053C>T、4059A>C、4068A>T、4074G>C、4077C>T、4083T>C、4089C>T、4092C>T、4098C>A、4101C>G、4107T>C、4110A>T、4113C>T、4116A>G、4119T>G、4128T>G、4134A>G、4140T>C、4141CTC>ATG、4149G>A、4155C>T、4158G>C、4161A>T、4164T>A、4167G>C、4174TCG>CCC、4179C>A、4181C>A、4189GCG>TCT、4194A>C、4206C>T、4221C>T、4230A>G、4269A>G、4287T>C、4293A>G、4296T>C、4320G>A及び4356C>Tからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP1カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、又は118における位置2203のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP1カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号85(すなわちカプシド#3013)、配列番号68(すなわちカプシド#2087)、配列番号79(すなわちカプシド#1449)、配列番号69(すなわちカプシド#2206)、配列番号71(すなわちカプシド#1534)、配列番号115(すなわちカプシド#163)、配列番号82(すなわちカプシド#1343)、配列番号112(すなわちカプシド#790)、配列番号65(すなわちカプシド#1017)、配列番号70(すなわちカプシド#877)、配列番号67(すなわちカプシド#1273)、配列番号62(すなわちカプシド#2497)、配列番号119(すなわちカプシド#1055)、配列番号73(すなわちカプシド#1919)、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号72、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号120における、位置2203のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP2カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1における位置2614のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、Table 1(表1)から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP2カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1における位置2614のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、2654T>C、2685G>A、2692CAG>AAC、2721T>C、2745A>C、2794C>T、2800A>T、2804A>C、2808G>A、2833A>G、2853C>T、2859C>T、2877G>A、2899AC>CA、2905A>C、2946C>T、2967C>T、2970C>G、2976A>G、2979A>G、2982T>C、3003G>A、3012T>C、3036T>C、3123A>G、3129G>A、3165A>G、3297C>T、3303A>G、3318G>C、3360A>G、3375A>C、3411G>T、3417C>T、3430ACC>CAG、3444T>C、3450G>A、3490C>T、3495C>T、3498T>G、3501C>G、3513C>G、3534C>T、3535T>C、3539G>A、3542GA>AG、3547AAC>CAA、3550ACT>TCA、3553CCA>AAT、3558T>C、3564C>T、3565ACC>CTT、3568AC>CA、3576A>C、3576A>T、3577A>C、3582T>A、3584A>T、3589TC>AG、3594G>A、3597C>T、3601GCG>CCC、3605GT>CC、3607GA>AG、3612T>G、3613CGG>TCT、3616GAC>CTT、3621G>A、3622T>G、3626GG>AA、3636T>G、3645C>T、3648T>C、3652CGC>AGA、3663A>T、3664GTA>CTG、3672ACA>CAG、3676TCT>GCA、3679GCG>AAC、3684T>C、3696T>C、3697GAA>AAC、3701AC>TT、3703TCG>CCC、3713GA>CG、3720C>A、3726C>T、3729C>T、3732C>A、3739AGA>CGG、3747T>G、3748C>T、3753G>T、3759G>A、3762C>A、3765G>A、3768C>T、3774A>C、3783G>A、3804T>C、3807T>C、3808CA>AT、3811AGC>CAT、3816G>A、3817GTT>ACC、3822C>G、3825C>A、3831G>A、3834G>A、3840C>A、3841T>A、3844GAG>AAT、3847AAA>GCT、3851CA>AC、3853AAT>GAC、3857T>C、3861C>T、3862ATT>TTG、3867A>C、3870>T、3885C>T、3891G>A、3898AGG>CGC、3903A>C、3930T>C、3933T>A、3935C>A、3939A>G、3942T>A、3944CC>AT、3948C>T、3949CTC>TTG、3954G>A、3956GA>AC、3957A>C、3958GGC>TCA、3963C>T、3965G>C、3967CAA>GGT、3970G>C、3973G>A、3978C>T、3979G>T、3980C>G、3982GA>AC、3990C>T、3991ACA>CAC、3999C>A、4001TT>CG、4003CTT>TTA、4008A>T、4011C>T、4017C>G、4026C>T、4027A>C、4032T>C、4041T>G、4047G>A、4053C>T、4059A>C、4068A>T、4074G>C、4077C>T、4083T>C、4089C>T、4092C>T、4098C>A、4101C>G、4107T>C、4110A>T、4113C>T、4116A>G、4119T>G、4128T>G、4134A>G、4140T>C、4141CTC>ATG、4149G>A、4155C>T、4158G>C、4161A>T、4164T>A、4167G>C、4174TCG>CCC、4179C>A、4181C>A、4189GCG>TCT、4194A>C、4206C>T、4221C>T、4230A>G、4269A>G、4287T>C、4293A>G、4296T>C、4320G>A及び4356C>Tからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP2カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、又は118における位置2614のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP2カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号85(すなわちカプシド#3013)、配列番号68(すなわちカプシド#2087)、配列番号79(すなわちカプシド#1449)、配列番号69(すなわちカプシド#2206)、配列番号71(すなわちカプシド#1534)、配列番号115(すなわちカプシド#163)、配列番号82(すなわちカプシド#1343)、配列番号112(すなわちカプシド#790)、配列番号65(すなわちカプシド#1017)、配列番号70(すなわちカプシド#877)、配列番号67(すなわちカプシド#1273)、配列番号62(すなわちカプシド#2497)、配列番号119(すなわちカプシド#1055)、配列番号73(すなわちカプシド#1919)、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号72、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号120における、位置2614のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP3カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1における位置2809のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、Table 1(表1)から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP3カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1における位置2809のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、2833A>G、2853C>T、2859C>T、2877G>A、2899AC>CA、2905A>C、2946C>T、2967C>T、2970C>G、2976A>G、2979A>G、2982T>C、3003G>A、3012T>C、3036T>C、3123A>G、3129G>A、3165A>G、3297C>T、3303A>G、3318G>C、3360A>G、3375A>C、3411G>T、3417C>T、3430ACC>CAG、3444T>C、3450G>A、3490C>T、3495C>T、3498T>G、3501C>G、3513C>G、3534C>T、3535T>C、3539G>A、3542GA>AG、3547AAC>CAA、3550ACT>TCA、3553CCA>AAT、3558T>C、3564C>T、3565ACC>CTT、3568AC>CA、3576A>C、3576A>T、3577A>C、3582T>A、3584A>T、3589TC>AG、3594G>A、3597C>T、3601GCG>CCC、3605GT>CC、3607GA>AG、3612T>G、3613CGG>TCT、3616GAC>CTT、3621G>A、3622T>G、3626GG>AA、3636T>G、3645C>T、3648T>C、3652CGC>AGA、3663A>T、3664GTA>CTG、3672ACA>CAG、3676TCT>GCA、3679GCG>AAC、3684T>C、3696T>C、3697GAA>AAC、3701AC>TT、3703TCG>CCC、3713GA>CG、3720C>A、3726C>T、3729C>T、3732C>A、3739AGA>CGG、3747T>G、3748C>T、3753G>T、3759G>A、3762C>A、3765G>A、3768C>T、3774A>C、3783G>A、3804T>C、3807T>C、3808CA>AT、3811AGC>CAT、3816G>A、3817GTT>ACC、3822C>G、3825C>A、3831G>A、3834G>A、3840C>A、3841T>A、3844GAG>AAT、3847AAA>GCT、3851CA>AC、3853AAT>GAC、3857T>C、3861C>T、3862ATT>TTG、3867A>C、3870>T、3885C>T、3891G>A、3898AGG>CGC、3903A>C、3930T>C、3933T>A、3935C>A、3939A>G、3942T>A、3944CC>AT、3948C>T、3949CTC>TTG、3954G>A、3956GA>AC、3957A>C、3958GGC>TCA、3963C>T、3965G>C、3967CAA>GGT、3970G>C、3973G>A、3978C>T、3979G>T、3980C>G、3982GA>AC、3990C>T、3991ACA>CAC、3999C>A、4001TT>CG、4003CTT>TTA、4008A>T、4011C>T、4017C>G、4026C>T、4027A>C、4032T>C、4041T>G、4047G>A、4053C>T、4059A>C、4068A>T、4074G>C、4077C>T、4083T>C、4089C>T、4092C>T、4098C>A、4101C>G、4107T>C、4110A>T、4113C>T、4116A>G、4119T>G、4128T>G、4134A>G、4140T>C、4141CTC>ATG、4149G>A、4155C>T、4158G>C、4161A>T、4164T>A、4167G>C、4174TCG>CCC、4179C>A、4181C>A、4189GCG>TCT、4194A>C、4206C>T、4221C>T、4230A>G、4269A>G、4287T>C、4293A>G、4296T>C、4320G>A及び4356C>Tからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP3カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、又は118における位置2809のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントVP3カプシドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号112、配列番号115、配列番号101、配列番号105、配列番号111、配列番号98、配列番号107、配列番号109、配列番号108、配列番号103、配列番号116.、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号110、配列番号113、配列番号114、配列番号117、配列番号118、配列番号119又は配列番号120、配列番号85(すなわちカプシド#3013)、配列番号68(すなわちカプシド#2087)、配列番号79(すなわちカプシド#1449)、配列番号69(すなわちカプシド#2206)、配列番号71(すなわちカプシド#1534)、配列番号115(すなわちカプシド#163)、配列番号82(すなわちカプシド#1343)、配列番号112(すなわちカプシド#790)、配列番号65(すなわちカプシド#1017)、配列番号70(すなわちカプシド#877)、配列番号67(すなわちカプシド#1273)、配列番号62(すなわちカプシド#2497)、配列番号119(すなわちカプシド#1055)、配列番号73(すなわちカプシド#1919)、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号72、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号120における、位置2809のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の核酸配列からなる。
本発明のカプシドタンパク質を含むAAV
本発明のさらなる目的は、少なくとも1つの本発明のカプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)に関する。
本発明のさらなる目的は、少なくとも1つの本発明のカプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)に関する。
いくつかの実施形態では、AAVは野生型のAAVである。いくつかの実施形態では、AAVは、配列番号62から120に示されるゲノム配列を含む。
本発明のさらなる目的は、VP1カプシドタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号85(すなわちカプシド#3013)、配列番号68(すなわちカプシド#2087)、配列番号79(すなわちカプシド#1449)、配列番号69(すなわちカプシド#2206)、配列番号71(すなわちカプシド#1534)、配列番号115(すなわちカプシド#163)、配列番号82(すなわちカプシド#1343)、配列番号112(すなわちカプシド#790)、配列番号65(すなわちカプシド#1017)、配列番号70(すなわちカプシド#877)、配列番号67(すなわちカプシド#1273)、配列番号62(すなわちカプシド#2497)、配列番号119(すなわちカプシド#1055)、配列番号73(すなわちカプシド#1919)、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号72、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号120におけるヌクレオチド2203～4410によってコードされている、又はVP2カプシドタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号85(すなわちカプシド#3013)、配列番号68(すなわちカプシド#2087)、配列番号79(すなわちカプシド#1449)、配列番号69(すなわちカプシド#2206)、配列番号71(すなわちカプシド#1534)、配列番号115(すなわちカプシド#163)、配列番号82(すなわちカプシド#1343)、配列番号112(すなわちカプシド#790)、配列番号65(すなわちカプシド#1017)、配列番号70(すなわちカプシド#877)、配列番号67(すなわちカプシド#1273)、配列番号62(すなわちカプシド#2497)、配列番号119(すなわちカプシド#1055)、配列番号73(すなわちカプシド#1919)、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号72、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号120におけるヌクレオチド2614～4410によってコードされている、及びVP3カプシドタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号85(すなわちカプシド#3013)、配列番号68(すなわちカプシド#2087)、配列番号79(すなわちカプシド#1449)、配列番号69(すなわちカプシド#2206)、配列番号71(すなわちカプシド#1534)、配列番号115(すなわちカプシド#163)、配列番号82(すなわちカプシド#1343)、配列番号112(すなわちカプシド#790)、配列番号65(すなわちカプシド#1017)、配列番号70(すなわちカプシド#877)、配列番号67(すなわちカプシド#1273)、配列番号62(すなわちカプシド#2497)、配列番号119(すなわちカプシド#1055)、配列番号73(すなわちカプシド#1919)、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号72、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号120におけるヌクレオチド2809～4410によってコードされている、AAVに関する。
いくつかの実施形態では、本発明のAAVは、導入遺伝子を含めた異種の核酸を含むrAAVである。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は治療用タンパク質をコードする。用語「治療用タンパク質」は、欠陥のある若しくは目的の対象から失われていているために該対象中に病状若しくは障害をもたらすタンパク質、又は目的の対象に、抗ウイルス機能、抗菌機能又は抗腫瘍機能等のベネフィットを与えるタンパク質を意味する。治療用タンパク質はまた、内分泌機能、免疫学的機能及び代謝機能等の多種多様な生物学的機能のいずれか1つを修飾するものであってもよい。典型的には、導入遺伝子は、免疫反応、造血、炎症、細胞成長及び増殖、細胞系統の分化又はストレス応答に関与するポリペプチドをコードしていてもよい。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンをもたらす部位特異的エンドヌクレアーゼであって、例えばそのエンドヌクレアーゼが疾患に関連するアレルをノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする。例えば、優性アレルが遺伝子の欠損コピーをコードする場合には、部位特異的エンドヌクレアーゼが該欠損アレルに対して標的化されて該欠損アレルをノックアウトし得る。いくつかの実施形態では、本発明のrAAVは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド;及び欠損アレルの機能性コピーをコードするポリヌクレオチドであって、前記機能性コピーが機能性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。使用に適した部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えばZnフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)及びCRISPR関連エンドヌクレアーゼが含まれる。本明細書で使用される場合、用語「CRISPR関連エンドヌクレアーゼ」は当技術分野においてその一般的な意味を有し、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連を意味し、それは塩基配列の短い反復を含有する原核生物のDNAセグメントである。具体的には、CRISPR関連エンドヌクレアーゼはCas9又はその誘導体である。Cas9ヌクレアーゼは、野生型の化膿性レンサ球菌(Streptococcus pyrogenes)の配列と同一のヌクレオチド配列を有し得る。或いは、野生型の化膿性レンサ球菌Cas9配列は改変することができる。例えば、Cas9ヌクレアーゼ配列は、例えばAddgene(Cambridge、MA)からのPX330又はPX260等の市販のベクター内に含有される配列であってもよい。いくつかの実施形態では、Cas9エンドヌクレアーゼは、GenBankのAccession番号KM099231.1 GL669193757、KM099232.1 GL669193761若しくはKM099233.1 GL669193765のいずれかのCas9エンドヌクレアーゼ配列のバリアント若しくは断片であるアミノ酸配列、又はPX330若しくはPX260(Addgene、Cambridge、MA)のCas9アミノ酸配列を有し得る。Cas9のヌクレオチド配列は、Cas9の生物学的に活性なバリアントをコードするように改変することができ、これらのバリアントは、例えば、1つ又は複数の変異(例えば、付加、欠失若しくは置換変異又はそのような変異の組み合わせ)を含有することによって野生型のCas9とは異なるアミノ酸配列を有すること又は含むことができる。例えば、Cas9ヌクレアーゼは、鎖特異的な切断に関係する保存されたFiNH及びRuvCドメイン中に変異を起こしていてもよい。例えば、RuvC触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニン(D10A)への変異により、そのCas9ニッカーゼ変異体(Cas9n)がDNAを切断するよりも切れ目を入れることで一本鎖の切断をもたらすことが可能となり、それに続くHDRによる優先的な修復によって非特異的な二本鎖切断に由来する望まれないインデル変異の頻度が減少する可能性があり得る。いくつかの実施形態では、本発明のrAAVは1つ又は複数のガイドRNAを含む。本明細書で使用される場合、用語「1つ又は複数のガイドRNA」は、残基の挿入又は欠失を誘導するRNAを意味する。本発明の文脈においては、ガイドRNAはCas9を特定のゲノム遺伝子座に導くために使用される。いくつかの実施形態では、ガイドRNAはコード又は非コード配列に対して相補的な配列であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする1つのポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのベクターと、ガイドRNAを含む少なくとも1つのベクターとの併用で投与される。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、干渉RNA(RNAi)、特にsiRNAをコードする。「低分子干渉」又は「短鎖干渉RNA」又はsiRNAは、目的遺伝子(「標的遺伝子」)に対して標的化されたRNA二重鎖のヌクレオチドである。「RNA二重鎖」は、RNA分子の2領域間の相補対形成によって形成される構造を意味する。siRNAの二重鎖部分のヌクレオチド配列が標的化遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、siRNAは遺伝子に対して「標的化」されている。いくつかの実施形態では、siRNAの二重鎖の長さは、30ヌクレオチド未満である。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子はアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする。本明細書で使用される場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、mRNA前駆体分子、hnRNA(ヘテロ核RNA)又はmRNA分子中の標的ヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を意味すると理解される。アンチセンス配列の相補性(又は実質的な相補性)の程度は、好ましくは、アンチセンス配列を含む分子が、生理的条件下で、RNA分子中の標的ヌクレオチド配列と安定なハイブリッドを形成することができるようなものである。
他の目的の導入遺伝子には、合成長鎖非コードRNA(SINEUP;Carrieriら、2012、Nature 491:454～7頁;Zucchelliら、2015、RNA Biol 12(8):771～9頁;Indrieriら、2016、Sci Rep 6:27315)及び人工マイクロRNAが含まれるがこれらに限定されない。本発明の実施において有用な、他の特定の目的の導入遺伝子は、以下に記載されている。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、組織特異的又は細胞型特異的な制御エレメントに作動可能に連結されている。
トランスフェクション、安定細胞株作製、並びにアデノウイルス-AAVハイブリッド、ヘルペスウイルス-AAVハイブリッド(Conway、J Eら、(1997) J. Virology 71(11):8780～8789頁)及びバキュロウイルス-AAVハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生システム、を含むrAAVベクター産生のための多数の方法が、当技術分野において公知である。rAAVウイルス粒子を産生するためのrAAV産生培養物はすべて、1)例えば、HeLa、A549若しくは293細胞等のヒト由来細胞株、又はバキュロウイルス産生システムの場合のSF-9等の昆虫由来細胞株を含む適した宿主細胞、2)野生型若しくは変異体アデノウイルス(温度感受性アデノウイルス等)、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、又はヘルパー機能をもたらすプラスミドコンストラクトによって与えられる適したヘルパーウイルス機能、3)AAVのrep及びcapの遺伝子及び遺伝子産物、4)少なくとも1つのAAVのITR配列が隣接する導入遺伝子(治療用導入遺伝子等)、並びに5)rAAVの産生をサポートするための適した培地及び培地成分、を必要とする。当技術分野において公知の適した培地を、rAAVベクターの産生のために使用してもよい。これらの培地には、改変イーグル培地(MEM)を含むHyclone Laboratories社及びJRH社によって作製された培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、米国特許第6,566,118号に記載されているもの等のカスタム配合物、並びに米国特許第6,723,551号に記載されているSf-900 II SFM培地が含まれるがこれらに限定されず、そのそれぞれが、特に組換えAAVベクター産生における使用のためのカスタム培地配合物に関して、参照により本明細書に完全に組み込まれている。rAAV粒子は、当技術分野において公知の方法を使用して産生することができる。例えば、米国特許第6,566,118号、第6,989,264号、及び第6,995,006号を参照のこと。本発明の実施においては、rAAV粒子を産生するための宿主細胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物及び酵母が含まれる。宿主細胞はまた、宿主細胞中でAAVのrep及びcap遺伝子が安定的に維持されているパッケージング細胞、又はAAVベクターゲノムが安定的に維持されているプロデューサー細胞であってもよい。例示的なパッケージング及びプロデューサー細胞は、293細胞、A549細胞又はHeLa細胞に由来する。AAVベクターは、当技術分野において公知の標準的な技術を使用して精製及び製剤化される。
いくつかの実施形態では、rAAV粒子は、以下で提供される例示的なトリプルトランスフェクション法等のトリプルトランスフェクション法によって産生することができる。簡潔に述べると、アデノウイルスヘルパープラスミドと共にrep遺伝子及びカプシド遺伝子を含有するプラスミドを細胞株(例えばHEK-293細胞)にトランスフェクトしてもよく(例えばリン酸カルシウム法を使用して)、ウイルスは集めてもよく、場合によって精製してもよい。
いくつかの実施形態では、rAAV粒子は、以下で提供される例示的なプロデューサー細胞株の方法等の、プロデューサー細胞株の方法によって産生することができる(Martinら、(2013) Human Gene Therapy Methods 24:253～269頁においての参照も参照のこと)。簡潔に述べると、細胞株(例えばHeLa細胞株)は、rep遺伝子、カプシド遺伝子及びプロモーター-導入遺伝子配列を含有するプラスミドで安定的にトランスフェクトされ得る。rAAV産生のためのリードクローン(lead clone)を選択するために細胞株をスクリーニングしてもよく、次いでそれを産生バイオリアクターへと拡張してrAAVの産生を開始させるヘルパーとしてのアデノウイルス(例えば野生型のアデノウイルス)に感染させてもよい。その後にウイルスを回収してもよく、アデノウイルスを不活化(例えば加熱によって)及び/又は除去してもよく、rAAV粒子を精製してもよい。
いくつかの実施形態では、(a)(i)1つ又は複数のAAVパッケージ遺伝子であって、前記AAVパッケージング遺伝子のそれぞれがAAVの複製タンパク質及び/又はカプシド形成タンパク質をコードするAAVパッケージ遺伝子と、(ii)少なくとも1つのAAVのITRが隣接する導入遺伝子を含むrAAVプロベクターと、(iii)AAVヘルパー機能とを含む宿主細胞をrAAV粒子が産生される条件下で培養する工程、並びに(b)宿主細胞によって産生されたrAAV粒子を回収する工程を含む、本明細書に開示されている任意のrAAV粒子を産生するための方法が提供される。米国特許第6,566,118号においてより完全に記載されているように、産生培養物中の宿主細胞を溶解することによって、又はAAV粒子をインタクトな細胞から培地に放出させるための当技術分野において公知の条件下で細胞を培養した場合には産生培養物から使用済みの培地を回収することによって、本発明のrAAVベクター粒子をrAAV産生培養物から回収してもよい。細胞を溶解する適した方法も当技術分野において公知であり、例えば複数回の凍結/融解サイクル、超音波処理、顕微溶液化並びに界面活性剤等の化学物質及び/又はプロテアーゼを用いた処理が含まれる。
いくつかの実施形態では、rAAV粒子は精製される。本明細書で使用される場合の用語「精製された」には、rAAV粒子が天然に存在する場所又は最初に調製される場所では同様に存在し得る他の成分の少なくとも一部を欠くrAAV粒子の調製物が含まれる。従って、例えば、単離されたrAAV粒子は、精製技術を用いてそれを培養物ライセート又は産生培養物上清等の原料混合物から濃縮することにより調製され得る。濃縮は種々の方法において評価することができ、その方法は例えば溶液中に存在するDNase耐性粒子(DRP)若しくはゲノムコピー(gc)の比率による方法、又は感染性による方法等であり、或いは濃縮はヘルパーウイルス、培地成分等を含めた産生培養物夾雑物若しくは工程内夾雑物を含む夾雑物等の、原料混合物中に存在する第2の潜在的な干渉物質に関連させて評価することができる。rAAV粒子を、1つ又は複数の以下の精製工程を使用して単離又は精製してもよい:平衡遠心分離;素通り画分の陰イオン交換ろ過;rAAV粒子を濃縮するためのタンジェンシャルフローろ過(TFF);アパタイトクロマトグラフィーによるrAAVの捕捉;ヘルパーウイルスの熱失活;疎水性相互作用クロマトグラフィーによるrAAVの捕捉;サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によるバッファー交換;ナノろ過;及び陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーによるrAAVの捕捉。これらの工程を、単独で、様々な組み合わせで、又は異なる順序で使用してもよい。いくつかの実施形態では、方法には、以下に記載されている順序ですべての工程が含まれる。rAAV粒子を精製するための方法は、例えば、Xiaoら、(1998) Journal of Virology 72:2224～2232頁、米国特許第6,989,264号及び第8,137,948号、並びにWO2010/148143において見出される。
治療のための使用及び薬学的組成物
本発明のrAAVは、目的の細胞に導入遺伝子を送達するのに特に適している。従って、本発明のさらなる目的は、細胞をある量の本発明のrAAVと接触させる工程を含む、細胞に導入遺伝子を送達する方法に関する。
本発明のrAAVは、目的の細胞に導入遺伝子を送達するのに特に適している。従って、本発明のさらなる目的は、細胞をある量の本発明のrAAVと接触させる工程を含む、細胞に導入遺伝子を送達する方法に関する。
具体的には、本発明のrAAVは遺伝子治療に特に適している。遺伝子治療は、目的の組織内に、その中で欠損している導入遺伝子の機能性コピー(例えば遺伝子)を導入すること(遺伝子置換療法)において、又は処置すべき疾患に対して有益な効果を有するであろう導入遺伝子を組織に送達すること(対症療法)によって成立する。いくつかの実施形態では、本発明のrAAVは、肝臓内に導入遺伝子を送達するのに特に適している。
従って、本発明のさらなる目的は、対象に有効量の本発明のrAAVを投与する工程を含む、対象内の組織に導入遺伝子を送達するための方法に関する。
より具体的には、本発明は、患者に治療有効量の本発明のrAAVを投与する工程を含む、それを必要とする患者における治療方法を提供する。
本発明のさらなる目的は、薬学的に許容される賦形剤及び場合により生分解性ポリマー等の徐放性マトリックスと共に、本発明のrAAVを含む薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は、従って、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤又は当業者に周知の他の物質を含む。薬学的に許容される担体又は賦形剤とは、無毒な固体、半固体若しくは液体フィラー、希釈剤、封入材料又は任意の種類の配合補助剤のことを意味する。そのような材料は無毒でなくてはならず、有効成分(すなわち、本発明のrAAV)の効果を妨げてはならない。担体又は他の材料の厳密な性質は、投与経路、すなわちここでは網膜下注射に応じて、当業者が決定することができる。薬学的組成物は、典型的には液体形態にある。液体の薬学的組成物には、一般的に、水、石油、動物若しくは植物油、鉱物油又は合成油等の液体担体が含まれる。生理食塩水、塩化マグネシウム、ブドウ糖若しくは他の糖類溶液又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール等のグリコールが含まれていてもよい。注射の場合、有効成分は、発熱物質を含まない、適したpH、等張性及び安定性を有する水溶液の形態ということになる。関連する当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液等の等張性媒体を使用して、適した溶液をうまく調製することができる。必要に応じて防腐剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤及び/又は他の添加剤が含まれてもよい。遅延放出の場合は、本発明のrAAVは、徐放用に製剤化された薬学的組成物、例えば、当技術分野において公知の方法に従って生体適合性ポリマーで形成されたマイクロカプセル又はリポソーム担体システム等の中に含まれていてもよい。典型的には、本発明の薬学的組成物は、充填済みシリンジにおいて供給される。「すぐに使用できるシリンジ」又は「充填済みシリンジ」は、充填状態で供給されるシリンジであり、すなわち、投与される薬学的組成物が既にシリンジの中にあり、いつでも投与できる状態になっている。充填済みシリンジは、別々に提供されるシリンジとバイアルと比較して多くのベネフィット、例えば、改善された利便性、価格の手頃さ、正確性、無菌性及び安全性を有している。充填済みのシリンジを使用することにより、用量精度が高くなり、バイアルから薬品を吸引する間に起こる恐れのある針刺し障害の可能性が低減し、プレ測定された投与量により再構成及び/又はシリンジ内への薬物の吸引の必要性が原因の投薬エラーが低減し、シリンジの過剰充填が少なくなることで薬剤の無駄が最小化されコスト削減が促進される。いくつかの実施形態では、本発明の液体薬学的組成物のpHは、5.0から7.0、5.1から6.9、5.2から6.8、5.3から6.7又は5.4から6.6の範囲内にある。
本発明は、以下の図及び実施例によって更に例示されるであろう。しかしこれらの実施例及び図は、本発明の範囲を制限するものとして決して解釈されるべきではない。
肝臓におけるアデノ随伴ウイルス:自然経過
結果:
肝臓における2つの主要なAAV遺伝子型の同定
我々は、ゲノムに沿って分布させた、既知のAAV遺伝子型1から13のすべてをまとめて認識する6個のTaqmanプローブを使用して、1,319名の患者由来の凍結肝組織を、AAVウイルスDNAの存在に対してスクリーニングした。我々は、非腫瘍肝組織(n=233)の18%においてAAV DNAを同定し、すべての既知のAAV遺伝子型のゲノム全体をカバーする120塩基長のオリゴヌクレオチドプローブ(350プローブ/遺伝子型)を用いたウイルスキャプチャーによって、そのうちの82個を更に分析した。シークエンシング後に57試料においてウイルスゲノムの完全なカバレッジが得られことで、完全長AAV配列の再構築が可能となった(図1A)。これらの配列によって、2つの主要なAAVサブタイプが明らかとなった。最初のサブタイプ(n=25)は、ヒトにおいて単離されたVP1のクレードB遺伝子型14、43にも相当するAAV2参照配列(NC_001401)に高度に類似している(データは示さない)。ここでAAV2/13と名付ける第2のサブタイプ(n=32)は、AAV13カプシドの様々な部分及びAAV2の5'部分に関係するc末端が含まれるハイブリッド配列を示した(図1B)。このサブタイプのVP1配列は様々なAAV13の断片と一致し、かつてはクレードCと称されるものであった(データは示さない)14、43。我々は、両AAVサブタイプによって共有されるが、AAV2参照NC_001401とは異なり、主にAAV2、AAV3又はAAV13で共通の位置に相当し、タンパク質レベルではサイレントであり(n=42、87.5%)、ウイルスゲノムに沿って分布する複数のバリアントを同定した(図1B)。対照的に、AAV2/13配列中にアミノ酸置換を生じさせる複数のヌクレオチドバリアントは、高頻度可変領域(HVR)5、6、7及び10に位置し、AAV13配列に由来するものであった(図1B)。AAV2/13サブタイプに特異的であり、CAP2領域に位置する2つのプローブを用いて一連の全1,319試料をスクリーニングすることにより(データは示さない)、我々は143試料においてAAV遺伝子型を決定し、同等の数の2つのAAVサブタイプ(AAV2遺伝子型が47.6%及びAAV2/13遺伝子型が52.4%)を同定した。
結果:
肝臓における2つの主要なAAV遺伝子型の同定
我々は、ゲノムに沿って分布させた、既知のAAV遺伝子型1から13のすべてをまとめて認識する6個のTaqmanプローブを使用して、1,319名の患者由来の凍結肝組織を、AAVウイルスDNAの存在に対してスクリーニングした。我々は、非腫瘍肝組織(n=233)の18%においてAAV DNAを同定し、すべての既知のAAV遺伝子型のゲノム全体をカバーする120塩基長のオリゴヌクレオチドプローブ(350プローブ/遺伝子型)を用いたウイルスキャプチャーによって、そのうちの82個を更に分析した。シークエンシング後に57試料においてウイルスゲノムの完全なカバレッジが得られことで、完全長AAV配列の再構築が可能となった(図1A)。これらの配列によって、2つの主要なAAVサブタイプが明らかとなった。最初のサブタイプ(n=25)は、ヒトにおいて単離されたVP1のクレードB遺伝子型14、43にも相当するAAV2参照配列(NC_001401)に高度に類似している(データは示さない)。ここでAAV2/13と名付ける第2のサブタイプ(n=32)は、AAV13カプシドの様々な部分及びAAV2の5'部分に関係するc末端が含まれるハイブリッド配列を示した(図1B)。このサブタイプのVP1配列は様々なAAV13の断片と一致し、かつてはクレードCと称されるものであった(データは示さない)14、43。我々は、両AAVサブタイプによって共有されるが、AAV2参照NC_001401とは異なり、主にAAV2、AAV3又はAAV13で共通の位置に相当し、タンパク質レベルではサイレントであり(n=42、87.5%)、ウイルスゲノムに沿って分布する複数のバリアントを同定した(図1B)。対照的に、AAV2/13配列中にアミノ酸置換を生じさせる複数のヌクレオチドバリアントは、高頻度可変領域(HVR)5、6、7及び10に位置し、AAV13配列に由来するものであった(図1B)。AAV2/13サブタイプに特異的であり、CAP2領域に位置する2つのプローブを用いて一連の全1,319試料をスクリーニングすることにより(データは示さない)、我々は143試料においてAAV遺伝子型を決定し、同等の数の2つのAAVサブタイプ(AAV2遺伝子型が47.6%及びAAV2/13遺伝子型が52.4%)を同定した。
AAV感染及びエピソーム形態
AAV DNAに対して陽性の233個の肝臓試料において、AAVの定量化は二峰性分布に従い、97%の組織が低コピー数/細胞(4.6e-05から0.04の範囲)を示し、より多くの量のAAVを有する8患者のみが0.07から0.18コピー/細胞の範囲を示した(データは示さない)。AAVの検出、患者の臨床的及び組織学的特徴の間の関係により、AAVは女性(p<0.001)、若年患者(p=0.016)において顕著に濃縮されており、線維化していない肝臓環境においてより高頻度に存在している(p<0.001、データは示さない)ことが示された。
AAV DNAに対して陽性の233個の肝臓試料において、AAVの定量化は二峰性分布に従い、97%の組織が低コピー数/細胞(4.6e-05から0.04の範囲)を示し、より多くの量のAAVを有する8患者のみが0.07から0.18コピー/細胞の範囲を示した(データは示さない)。AAVの検出、患者の臨床的及び組織学的特徴の間の関係により、AAVは女性(p<0.001)、若年患者(p=0.016)において顕著に濃縮されており、線維化していない肝臓環境においてより高頻度に存在している(p<0.001、データは示さない)ことが示された。
AAVに対して陽性の組織のうちの64/233(27.5%)において全AAVゲノム領域が増幅され、ウイルスゲノム全体が存在していることが示唆された。AAVエピソーム形態を実験的に探索するために、我々はDNAse/TaqManベースのアッセイをデザインし(データは示さない)、それによってAAV陽性試料の26%及び全患者の4.5%に相当する60名の患者において、エピソーム形態AAVを検出することができた。完全な再構成されたAAVゲノム配列を有する57症例間のAAVキャプチャーシークエンシングのインシリコ解析を使用して、我々は、クローン挿入のない、3'ITR-5'ITR接合部を有する14症例を同定した。3'ITR-5'ITR接合部は、サンガーシークエンシングによって確認された、125bpの欠失を有する、フリップ又はフロップ形状(flip or flop configuration)の、二重D ITR構造を呈する様々な配列を示した(データは示さない)。
AAV転写は、エピソーム形態と関連している
次いで我々は、AAVに対して陽性の101個の非腫瘍肝組織中でのAAVのRNA発現を、qRT-PCRによってスクリーニングした。試験した肝組織の64%においてAAV転写物が同定された。我々は、AAVのREP又はCAPのいずれかの発現が、エピソーム形態を有する肝組織中に濃縮されており(p<0.001)、AAVの非エピソーム形態よりもエピソーム形態の存在下で両転写物がより高頻度に関連付けられることを示し(p=0.022)、「エピソーム発現AAV」を有する患者の集団を規定した(データは示さない)。エピソーム発現AAVを有する肝組織中で細胞あたりのAAVコピーがより多いことが明らかとなり、これらの肝臓試料におけるウイルスの活動性感染の仮説が支持された(データは示さない)。エピソームAAVはまた、女性(p<0.001)及び非肝硬変患者(p<0.001;データは示さない)においてより高頻度に見られた。AAV陽性率(AAV positivity)を年齢の関数において分析したところ、30～40歳クラスにおいて25%での頻度のピークが示された。AAVエピソーム形態は、若年患者(<40歳)においてより高頻度に見られ、20代で最高頻度のレベルに達していた(データは示さない)。これらの結果により、AAV活動性感染は生涯の第2及び第3の10年間においてより高頻度に起こり、一方で非活動性の非エピソーム形態が一次感染後に存続することが示唆される。
次いで我々は、AAVに対して陽性の101個の非腫瘍肝組織中でのAAVのRNA発現を、qRT-PCRによってスクリーニングした。試験した肝組織の64%においてAAV転写物が同定された。我々は、AAVのREP又はCAPのいずれかの発現が、エピソーム形態を有する肝組織中に濃縮されており(p<0.001)、AAVの非エピソーム形態よりもエピソーム形態の存在下で両転写物がより高頻度に関連付けられることを示し(p=0.022)、「エピソーム発現AAV」を有する患者の集団を規定した(データは示さない)。エピソーム発現AAVを有する肝組織中で細胞あたりのAAVコピーがより多いことが明らかとなり、これらの肝臓試料におけるウイルスの活動性感染の仮説が支持された(データは示さない)。エピソームAAVはまた、女性(p<0.001)及び非肝硬変患者(p<0.001;データは示さない)においてより高頻度に見られた。AAV陽性率(AAV positivity)を年齢の関数において分析したところ、30～40歳クラスにおいて25%での頻度のピークが示された。AAVエピソーム形態は、若年患者(<40歳)においてより高頻度に見られ、20代で最高頻度のレベルに達していた(データは示さない)。これらの結果により、AAV活動性感染は生涯の第2及び第3の10年間においてより高頻度に起こり、一方で非活動性の非エピソーム形態が一次感染後に存続することが示唆される。
考察
本研究において、我々は大規模に、肝臓における野生型AAV感染及びヒトにおけるその発癌の因果関係に関する包括的説明を提供した。組換えAAVベクター(rAAV)に関して多数の研究が入手可能であるにもかかわらず、野生型AAV感染の自然経過はまだ十分に理解されていない。ここに、我々は、ヒトにおけるAAV感染をよりよく理解するために、腫瘍及び非腫瘍肝組織の最大のシリーズにおける異なるAAVウイルス形態の広範な特徴付けを提供した。
本研究において、我々は大規模に、肝臓における野生型AAV感染及びヒトにおけるその発癌の因果関係に関する包括的説明を提供した。組換えAAVベクター(rAAV)に関して多数の研究が入手可能であるにもかかわらず、野生型AAV感染の自然経過はまだ十分に理解されていない。ここに、我々は、ヒトにおけるAAV感染をよりよく理解するために、腫瘍及び非腫瘍肝組織の最大のシリーズにおける異なるAAVウイルス形態の広範な特徴付けを提供した。
非腫瘍肝及び/又は腫瘍肝である患者の21%でAAVの有病率が観察され、一般的な集団の40から80%において同定されたAAVに対する抗体の血清有病率と一致した10-12。我々の結果は、半数の患者が、生涯にわたり肝臓における持続的なAAV DNAを、主には肝線維症を伴わない若年及び女性患者の集団において、実証することを示した。しかし、我々の肝組織のほとんどは肝疾患を有する患者から採取されたため、健康な個体の肝臓中の正確なAAV DNAの有病率はまだ評価されていない。
2つの主要なAAV遺伝子型、AAV2及びハイブリッドAAV2/13が、我々のコホートにおいて同定された。AAVウイルスの分類は現在、それらの血清学的応答及びGao及び同僚によって規定されたVP1領域のアミノ酸配列に基づく14。しかし、ウイルスのクレードにおけるこの分類には、全AAV血清型が含まれているわけではなく、ごく最近非ヒト霊長類から単離されたウイルスのクローン16、46も含まれていない。更に、ヒト組織から単離された配列のほとんどはVP1領域に限定されたものであり、具体的にはクレードC由来のただ1つの完全長AAV配列のみが公的に利用可能であった43。ここに、我々は、57個のヒトクローンのAAVゲノム配列全体を提供したが、そのうちの半分は参照AAV2配列に属すると分類された一方で、それ以外は以前のVP1分類のクレードCに相当する、5'末端部位におけるAAV2と3'末端部位におけるAAV13との間のハイブリッドであった。我々の研究は、肝臓に対する効率的なAAV自然感染に関連する遺伝子型及びゲノムバリアントを教えてくれる、公的に利用可能なヒトAAV完全長配列の数を劇的に増加させた。
結論として、これらの知見は、野生型AAVの生物学を理解するために重要である。我々のデータは、肝臓標的化遺伝子治療におけるAAVベクターの大規模な使用を考慮すると特に有意義である。
同定された天然のバリアントの産生、インビトロ及びインビボ試験
材料と方法
新規血清型のプラスミド構築
AAV2のRep配列及び新規Cap遺伝子を含有するプラスミドを構築するために、カプシド配列を合成した(GENEWIZ社)。AAV2のCapを対応する新規Cap配列で置き換えるために、AAV2のRep及びAAV2のCapを含有するプラスミドpAAV2中に断片を挿入した。
材料と方法
新規血清型のプラスミド構築
AAV2のRep配列及び新規Cap遺伝子を含有するプラスミドを構築するために、カプシド配列を合成した(GENEWIZ社)。AAV2のCapを対応する新規Cap配列で置き換えるために、AAV2のRep及びAAV2のCapを含有するプラスミドpAAV2中に断片を挿入した。
AAVの産生
HEK293T細胞を、50mLの無血清培地中に懸濁して増殖させた。i)発現カセットの両端に位置するAAV2のITRを含有する導入遺伝子プラスミド、ii)AAV産生に必要なアデノウイルス配列を含有するヘルパープラスミドpXX6、及びiii)AAVの血清型を規定する、AAVのRep及びCap遺伝子を含有するプラスミドの3つのプラスミドで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、細胞を溶解してAAV粒子を遊離させた。
HEK293T細胞を、50mLの無血清培地中に懸濁して増殖させた。i)発現カセットの両端に位置するAAV2のITRを含有する導入遺伝子プラスミド、ii)AAV産生に必要なアデノウイルス配列を含有するヘルパープラスミドpXX6、及びiii)AAVの血清型を規定する、AAVのRep及びCap遺伝子を含有するプラスミドの3つのプラスミドで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、細胞を溶解してAAV粒子を遊離させた。
ウイルスのライセートを、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。TaqManリアルタイムPCRアッセイにより、AAVベクターゲノムのITRと一致するプライマー及びプローブを使用してウイルスゲノムを定量化した(Rohrら、J. Virol. Methods、2002、106、81～88頁)。
インビボ試験
マウスのすべての試験は、動物愛護及び動物実験に関するフランス及びヨーロッパの法律(2010/63/EU)に従って実施し、倫理委員会の地方組織によって承認された(プロトコール番号2016-002C)。AAVベクターを、6週齢の雄のC57Bl6/Jマウスに、尾静脈を介して静脈内投与した。PBSを注射した同腹子を対照として使用した。ベクター注射の15日後、組織を回収し、Fastprepチューブを使用してDNAse/RNAseフリー水中でホモジナイズした(6.5m/s、60秒)。
マウスのすべての試験は、動物愛護及び動物実験に関するフランス及びヨーロッパの法律(2010/63/EU)に従って実施し、倫理委員会の地方組織によって承認された(プロトコール番号2016-002C)。AAVベクターを、6週齢の雄のC57Bl6/Jマウスに、尾静脈を介して静脈内投与した。PBSを注射した同腹子を対照として使用した。ベクター注射の15日後、組織を回収し、Fastprepチューブを使用してDNAse/RNAseフリー水中でホモジナイズした(6.5m/s、60秒)。
ルシフェラーゼ活性
導入遺伝子として使用したレポーター遺伝子の発現を測定するためにルシフェラーゼアッセイを使用した。組織のライセートを10000rpmで10分間遠心分離し、上清を白色不透明96ウェルプレート内の溶解バッファー中に希釈した。EnSpire(PerkinElmer社)を使用して、ATP及びルシフェリンを含有するアッセイバッファーの逐次注入によりルシフェラーゼ活性を測定した。
導入遺伝子として使用したレポーター遺伝子の発現を測定するためにルシフェラーゼアッセイを使用した。組織のライセートを10000rpmで10分間遠心分離し、上清を白色不透明96ウェルプレート内の溶解バッファー中に希釈した。EnSpire(PerkinElmer社)を使用して、ATP及びルシフェリンを含有するアッセイバッファーの逐次注入によりルシフェラーゼ活性を測定した。
タンパク質の量に対してRLU(相対発光単位)を正規化するために、BCAアッセイを使用して、試料に対するタンパク質の定量化を実施した。最終的に得られた結果をタンパク質のRLU/mgとして表し、AAV2対照に対する倍率変化として正規化した。
結果:
ベクター産生に適したプラスミド中に実施例1において同定されたCap遺伝子をクローニングすることにより、組換えAAVベクターを産生した。AAV2のITRが隣接し、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子を発現する導入遺伝子発現カセットを、そのようにして得られたAAVベクター内にカプシド化した。HEK293細胞のトリプルトランスフェクションを使用してベクターを産生した後、免疫親和性カラム精製を行った。rAAVベクターとして効果的に産生されないカプシド配列は除いた。1x1011vg/マウスの用量で異なるベクターを静脈内注射することにより、野生型のC57Bl6/Jマウス内でベクターを試験した。注射後15日で動物を屠殺し、摘出組織中で導入遺伝子の発現レベルを測定した。新規カプシドのすべてが肝臓を脱標的化し(図2)、試験した組織:心臓、四頭筋及び横隔膜に対して顕著な指向性を示した。試験した3つの組織における導入遺伝子発現の平均の倍率変化を、カプシドの効率に応じてカプシドをランク付けするために使用した。図3A～図3Cに表されているカプシドは、筋肉の標的化においてトップのスコアである。
(参考文献)
ベクター産生に適したプラスミド中に実施例1において同定されたCap遺伝子をクローニングすることにより、組換えAAVベクターを産生した。AAV2のITRが隣接し、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子を発現する導入遺伝子発現カセットを、そのようにして得られたAAVベクター内にカプシド化した。HEK293細胞のトリプルトランスフェクションを使用してベクターを産生した後、免疫親和性カラム精製を行った。rAAVベクターとして効果的に産生されないカプシド配列は除いた。1x1011vg/マウスの用量で異なるベクターを静脈内注射することにより、野生型のC57Bl6/Jマウス内でベクターを試験した。注射後15日で動物を屠殺し、摘出組織中で導入遺伝子の発現レベルを測定した。新規カプシドのすべてが肝臓を脱標的化し(図2)、試験した組織:心臓、四頭筋及び横隔膜に対して顕著な指向性を示した。試験した3つの組織における導入遺伝子発現の平均の倍率変化を、カプシドの効率に応じてカプシドをランク付けするために使用した。図3A～図3Cに表されているカプシドは、筋肉の標的化においてトップのスコアである。
(参考文献)
Claims (25)
- 配列番号26(すなわちカプシド#3013)、配列番号9(すなわちカプシド#2087)、配列番号20(すなわちカプシド#1449)、配列番号10(すなわちカプシド#2206)、配列番号12(すなわちカプシド#1534)、配列番号56(すなわちカプシド#163)、配列番号23(すなわちカプシド#1343)、配列番号53(すなわちカプシド#790)、配列番号6(すなわちカプシド#1017)、配列番号11(すなわちカプシド#877)、配列番号8(すなわちカプシド#1273)、配列番号3(すなわちカプシド#2497)、配列番号60(すなわちカプシド#1055)、配列番号14(すなわちカプシド#1919)、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15から配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号24、配列番号25、配列番号27から配列番号55、配列番号57から配列番号59、配列番号61からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するバリアントVP1カプシドタンパク質。
- 配列番号26(すなわちカプシド#3013)、配列番号9(すなわちカプシド#2087)、配列番号20(すなわちカプシド#1449)、配列番号10(すなわちカプシド#2206)、配列番号12(すなわちカプシド#1534)、配列番号56(すなわちカプシド#163)、配列番号23(すなわちカプシド#1343)、配列番号53(すなわちカプシド#790)、配列番号6(すなわちカプシド#1017)、配列番号11(すなわちカプシド#877)、配列番号8(すなわちカプシド#1273)、配列番号3(すなわちカプシド#2497)、配列番号60(すなわちカプシド#1055)、配列番号14(すなわちカプシド#1919)、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15から配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号24、配列番号25、配列番号27から配列番号55、配列番号57から配列番号59、配列番号61における、位置138のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列を有するバリアントVP2カプシドタンパク質。
- 配列番号26(すなわちカプシド#3013)、配列番号9(すなわちカプシド#2087)、配列番号20(すなわちカプシド#1449)、配列番号10(すなわちカプシド#2206)、配列番号12(すなわちカプシド#1534)、配列番号56(すなわちカプシド#163)、配列番号23(すなわちカプシド#1343)、配列番号53(すなわちカプシド#790)、配列番号6(すなわちカプシド#1017)、配列番号11(すなわちカプシド#877)、配列番号8(すなわちカプシド#1273)、配列番号3(すなわちカプシド#2497)、配列番号60(すなわちカプシド#1055)、配列番号14(すなわちカプシド#1919)、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号13、配列番号15から配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号24、配列番号25、配列番号27から配列番号55、配列番号57から配列番号59、配列番号61における、位置203のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列を有するバリアントVP3カプシドタンパク質。
- Table 1(表1)の少なくとも1つの変異を含む、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるバリアントVP1カプシドタンパク質。
- Table 1(表1)の少なくとも1つの変異を含む、配列番号2における位置138のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列からなるバリアントVP2カプシドタンパク質。
- Table 1(表1)の少なくとも1つの変異を含む、配列番号2における位置203のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列からなるバリアントVP3カプシドタンパク質。
- V151A、Q164N、T200S、N201T、M211V、T233Q、M235L、T410Q、S446N、R447K、N449Q、T450S、P451N、T455L、T456Q、Q461L、A467P、S468T、D469S、I470M、R471S、D472L、S474A、R475K、V488L、T491Q、S492A、A493N、E499N、Y500F、S501P、G504A、Q536M、S537H、V539T、S547T、E548N、K549A、T550N、N551D、V552A、I554L、E555D、K556N、S578Y、T581N、R585N、R585S、G586S、R588T、Q589G、A590P、A591T、A593S、A593G、D594T、T597H、V600A、L647M、S658P、T660N、及びA663Sからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるバリアントVP1カプシドタンパク質。
- V151A、Q164N、T200S、N201T、M211V、T233Q、M235L、T410Q、S446N、R447K、N449Q、T450S、P451N、T455L、T456Q、Q461L、A467P、S468T、D469S、I470M、R471S、D472L、S474A、R475K、V488L、T491Q、S492A、A493N、E499N、Y500F、S501P、G504A、Q536M、S537H、V539T、S547T、E548N、K549A、T550N、N551D、V552A、I554L、E555D、K556N、S578Y、T581N、R585N、R585S、G586S、R588T、Q589G、A590P、A591T、A593S、A593G、D594T、T597H、V600A、L647M、S658P、T660N、及びA663Sからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む、配列番号2における位置138のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列からなるバリアントVP2カプシドタンパク質。
- M211V、T233Q、M235L、T410Q、S446N、R447K、N449Q、T450S、P451N、T455L、T456Q、Q461L、A467P、S468T、D469S、I470M、R471S、D472L、S474A、R475K、V488L、T491Q、S492A、A493N、E499N、Y500F、S501P、G504A、Q536M、S537H、V539T、S547T、E548N、K549A、T550N、N551D、V552A、I554L、E555D、K556N、S578Y、T581N、R585N、R585S、G586S、R588T、Q589G、A590P、A591T、A593S、A593G、D594T、T597H、V600A、L647M、S658P、T660N、及びA663Sからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む、配列番号2における位置203のアミノ酸から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸配列からなるバリアントVP3カプシドタンパク質。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載のバリアントカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号1における位置2203のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、Table 1(表1)から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる、バリアントVP1をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号1における位置2614のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、Table 1(表1)から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる、バリアントVP2カプシドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号1における位置2809のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、Table 1(表1)から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる、バリアントVP3カプシドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号1における位置2203のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、2433A>G、2511C>T、2654T>C、2685G>A、2692CAG>AAC、2721T>C、2745A>C、2794C>T、2800A>T、2804A>C、2808G>A、2833A>G、2853C>T、2859C>T、2877G>A、2899AC>CA、2905A>C、2946C>T、2967C>T、2970C>G、2976A>G、2979A>G、2982T>C、3003G>A、3012T>C、3036T>C、3123A>G、3129G>A、3165A>G、3297C>T、3303A>G、3318G>C、3360A>G、3375A>C、3411G>T、3417C>T、3430ACC>CAG、3444T>C、3450G>A、3490C>T、3495C>T、3498T>G、3501C>G、3513C>G、3534C>T、3535T>C、3539G>A、3542GA>AG、3547AAC>CAA、3550ACT>TCA、3553CCA>AAT、3558T>C、3564C>T、3565ACC>CTT、3568AC>CA、3576A>C、3576A>T、3577A>C、3582T>A、3584A>T、3589TC>AG、3594G>A、3597C>T、3601GCG>CCC、3605GT>CC、3607GA>AG、3612T>G、3613CGG>TCT、3616GAC>CTT、3621G>A、3622T>G、3626GG>AA、3636T>G、3645C>T、3648T>C、3652CGC>AGA、3663A>T、3664GTA>CTG、3672ACA>CAG、3676TCT>GCA、3679GCG>AAC、3684T>C、3696T>C、3697GAA>AAC、3701AC>TT、3703TCG>CCC、3713GA>CG、3720C>A、3726C>T、3729C>T、3732C>A、3739AGA>CGG、3747T>G、3748C>T、3753G>T、3759G>A、3762C>A、3765G>A、3768C>T、3774A>C、3783G>A、3804T>C、3807T>C、3808CA>AT、3811AGC>CAT、3816G>A、3817GTT>ACC、3822C>G、3825C>A、3831G>A、3834G>A、3840C>A、3841T>A、3844GAG>AAT、3847AAA>GCT、3851CA>AC、3853AAT>GAC、3857T>C、3861C>T、3862ATT>TTG、3867A>C、3870>T、3885C>T、3891G>A、3898AGG>CGC、3903A>C、3930T>C、3933T>A、3935C>A、3939A>G、3942T>A、3944CC>AT、3948C>T、3949CTC>TTG、3954G>A、3956GA>AC、3957A>C、3958GGC>TCA、3963C>T、3965G>C、3967CAA>GGT、3970G>C、3973G>A、3978C>T、3979G>T、3980C>G、3982GA>AC、3990C>T、3991ACA>CAC、3999C>A、4001TT>CG、4003CTT>TTA、4008A>T、4011C>T、4017C>G、4026C>T、4027A>C、4032T>C、4041T>G、4047G>A、4053C>T、4059A>C、4068A>T、4074G>C、4077C>T、4083T>C、4089C>T、4092C>T、4098C>A、4101C>G、4107T>C、4110A>T、4113C>T、4116A>G、4119T>G、4128T>G、4134A>G、4140T>C、4141CTC>ATG、4149G>A、4155C>T、4158G>C、4161A>T、4164T>A、4167G>C、4174TCG>CCC、4179C>A、4181C>A、4189GCG>TCT、4194A>C、4206C>T、4221C>T、4230A>G、4269A>G、4287T>C、4293A>G、4296T>C、4320G>A及び4356C>Tからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる、バリアントVP1カプシドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号85(すなわちカプシド#3013)、配列番号68(すなわちカプシド#2087)、配列番号79(すなわちカプシド#1449)、配列番号69(すなわちカプシド#2206)、配列番号71(すなわちカプシド#1534)、配列番号115(すなわちカプシド#163)、配列番号82(すなわちカプシド#1343)、配列番号112(すなわちカプシド#790)、配列番号65(すなわちカプシド#1017)、配列番号70(すなわちカプシド#877)、配列番号67(すなわちカプシド#1273)、配列番号62(すなわちカプシド#2497)、配列番号119(すなわちカプシド#1055)、配列番号73(すなわちカプシド#1919)、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号72、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号120における、位置2203のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の核酸配列からなるポリヌクレオチド。
- 配列番号1における位置2614のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、2654T>C、2685G>A、2692CAG>AAC、2721T>C、2745A>C、2794C>T、2800A>T、2804A>C、2808G>A、2833A>G、2853C>T、2859C>T、2877G>A、2899AC>CA、2905A>C、2946C>T、2967C>T、2970C>G、2976A>G、2979A>G、2982T>C、3003G>A、3012T>C、3036T>C、3123A>G、3129G>A、3165A>G、3297C>T、3303A>G、3318G>C、3360A>G、3375A>C、3411G>T、3417C>T、3430ACC>CAG、3444T>C、3450G>A、3490C>T、3495C>T、3498T>G、3501C>G、3513C>G、3534C>T、3535T>C、3539G>A、3542GA>AG、3547AAC>CAA、3550ACT>TCA、3553CCA>AAT、3558T>C、3564C>T、3565ACC>CTT、3568AC>CA、3576A>C、3576A>T、3577A>C、3582T>A、3584A>T、3589TC>AG、3594G>A、3597C>T、3601GCG>CCC、3605GT>CC、3607GA>AG、3612T>G、3613CGG>TCT、3616GAC>CTT、3621G>A、3622T>G、3626GG>AA、3636T>G、3645C>T、3648T>C、3652CGC>AGA、3663A>T、3664GTA>CTG、3672ACA>CAG、3676TCT>GCA、3679GCG>AAC、3684T>C、3696T>C、3697GAA>AAC、3701AC>TT、3703TCG>CCC、3713GA>CG、3720C>A、3726C>T、3729C>T、3732C>A、3739AGA>CGG、3747T>G、3748C>T、3753G>T、3759G>A、3762C>A、3765G>A、3768C>T、3774A>C、3783G>A、3804T>C、3807T>C、3808CA>AT、3811AGC>CAT、3816G>A、3817GTT>ACC、3822C>G、3825C>A、3831G>A、3834G>A、3840C>A、3841T>A、3844GAG>AAT、3847AAA>GCT、3851CA>AC、3853AAT>GAC、3857T>C、3861C>T、3862ATT>TTG、3867A>C、3870>T、3885C>T、3891G>A、3898AGG>CGC、3903A>C、3930T>C、3933T>A、3935C>A、3939A>G、3942T>A、3944CC>AT、3948C>T、3949CTC>TTG、3954G>A、3956GA>AC、3957A>C、3958GGC>TCA、3963C>T、3965G>C、3967CAA>GGT、3970G>C、3973G>A、3978C>T、3979G>T、3980C>G、3982GA>AC、3990C>T、3991ACA>CAC、3999C>A、4001TT>CG、4003CTT>TTA、4008A>T、4011C>T、4017C>G、4026C>T、4027A>C、4032T>C、4041T>G、4047G>A、4053C>T、4059A>C、4068A>T、4074G>C、4077C>T、4083T>C、4089C>T、4092C>T、4098C>A、4101C>G、4107T>C、4110A>T、4113C>T、4116A>G、4119T>G、4128T>G、4134A>G、4140T>C、4141CTC>ATG、4149G>A、4155C>T、4158G>C、4161A>T、4164T>A、4167G>C、4174TCG>CCC、4179C>A、4181C>A、4189GCG>TCT、4194A>C、4206C>T、4221C>T、4230A>G、4269A>G、4287T>C、4293A>G、4296T>C、4320G>A及び4356C>Tからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる、バリアントVP2カプシドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号85(すなわちカプシド#3013)、配列番号68(すなわちカプシド#2087)、配列番号79(すなわちカプシド#1449)、配列番号69(すなわちカプシド#2206)、配列番号71(すなわちカプシド#1534)、配列番号115(すなわちカプシド#163)、配列番号82(すなわちカプシド#1343)、配列番号112(すなわちカプシド#790)、配列番号65(すなわちカプシド#1017)、配列番号70(すなわちカプシド#877)、配列番号67(すなわちカプシド#1273)、配列番号62(すなわちカプシド#2497)、配列番号119(すなわちカプシド#1055)、配列番号73(すなわちカプシド#1919)、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号72、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号120における、位置2614のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の核酸配列からなるポリヌクレオチド。
- 配列番号1における位置2809のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の、2833A>G、2853C>T、2859C>T、2877G>A、2899AC>CA、2905A>C、2946C>T、2967C>T、2970C>G、2976A>G、2979A>G、2982T>C、3003G>A、3012T>C、3036T>C、3123A>G、3129G>A、3165A>G、3297C>T、3303A>G、3318G>C、3360A>G、3375A>C、3411G>T、3417C>T、3430ACC>CAG、3444T>C、3450G>A、3490C>T、3495C>T、3498T>G、3501C>G、3513C>G、3534C>T、3535T>C、3539G>A、3542GA>AG、3547AAC>CAA、3550ACT>TCA、3553CCA>AAT、3558T>C、3564C>T、3565ACC>CTT、3568AC>CA、3576A>C、3576A>T、3577A>C、3582T>A、3584A>T、3589TC>AG、3594G>A、3597C>T、3601GCG>CCC、3605GT>CC、3607GA>AG、3612T>G、3613CGG>TCT、3616GAC>CTT、3621G>A、3622T>G、3626GG>AA、3636T>G、3645C>T、3648T>C、3652CGC>AGA、3663A>T、3664GTA>CTG、3672ACA>CAG、3676TCT>GCA、3679GCG>AAC、3684T>C、3696T>C、3697GAA>AAC、3701AC>TT、3703TCG>CCC、3713GA>CG、3720C>A、3726C>T、3729C>T、3732C>A、3739AGA>CGG、3747T>G、3748C>T、3753G>T、3759G>A、3762C>A、3765G>A、3768C>T、3774A>C、3783G>A、3804T>C、3807T>C、3808CA>AT、3811AGC>CAT、3816G>A、3817GTT>ACC、3822C>G、3825C>A、3831G>A、3834G>A、3840C>A、3841T>A、3844GAG>AAT、3847AAA>GCT、3851CA>AC、3853AAT>GAC、3857T>C、3861C>T、3862ATT>TTG、3867A>C、3870>T、3885C>T、3891G>A、3898AGG>CGC、3903A>C、3930T>C、3933T>A、3935C>A、3939A>G、3942T>A、3944CC>AT、3948C>T、3949CTC>TTG、3954G>A、3956GA>AC、3957A>C、3958GGC>TCA、3963C>T、3965G>C、3967CAA>GGT、3970G>C、3973G>A、3978C>T、3979G>T、3980C>G、3982GA>AC、3990C>T、3991ACA>CAC、3999C>A、4001TT>CG、4003CTT>TTA、4008A>T、4011C>T、4017C>G、4026C>T、4027A>C、4032T>C、4041T>G、4047G>A、4053C>T、4059A>C、4068A>T、4074G>C、4077C>T、4083T>C、4089C>T、4092C>T、4098C>A、4101C>G、4107T>C、4110A>T、4113C>T、4116A>G、4119T>G、4128T>G、4134A>G、4140T>C、4141CTC>ATG、4149G>A、4155C>T、4158G>C、4161A>T、4164T>A、4167G>C、4174TCG>CCC、4179C>A、4181C>A、4189GCG>TCT、4194A>C、4206C>T、4221C>T、4230A>G、4269A>G、4287T>C、4293A>G、4296T>C、4320G>A及び4356C>Tからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む核酸配列からなる、バリアントVP3カプシドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号85(すなわちカプシド#3013)、配列番号68(すなわちカプシド#2087)、配列番号79(すなわちカプシド#1449)、配列番号69(すなわちカプシド#2206)、配列番号71(すなわちカプシド#1534)、配列番号115(すなわちカプシド#163)、配列番号82(すなわちカプシド#1343)、配列番号112(すなわちカプシド#790)、配列番号65(すなわちカプシド#1017)、配列番号70(すなわちカプシド#877)、配列番号67(すなわちカプシド#1273)、配列番号62(すなわちカプシド#2497)、配列番号119(すなわちカプシド#1055)、配列番号73(すなわちカプシド#1919)、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号72、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号120における、位置2809のヌクレオチドから位置4410のヌクレオチドまでの範囲の核酸配列からなるポリヌクレオチド。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の少なくとも1つのカプシドタンパク質を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)。
- 配列番号85(すなわちカプシド#3013)、配列番号68(すなわちカプシド#2087)、配列番号79(すなわちカプシド#1449)、配列番号69(すなわちカプシド#2206)、配列番号71(すなわちカプシド#1534)、配列番号115(すなわちカプシド#163)、配列番号82(すなわちカプシド#1343)、配列番号112(すなわちカプシド#790)、配列番号65(すなわちカプシド#1017)、配列番号70(すなわちカプシド#877)、配列番号67(すなわちカプシド#1273)、配列番号62(すなわちカプシド#2497)、配列番号119(すなわちカプシド#1055)、配列番号73(すなわちカプシド#1919)、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号72、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号120に示されるゲノム配列を含むAAV。
- 導入遺伝子を含む異種の核酸を含むrAAVである、AAV。
- 細胞をある量の請求項22に記載のrAAVと接触させる工程を含む、細胞に導入遺伝子を送達する方法。
- 患者に治療有効量の請求項22に記載のrAAVを投与する工程を含む、それを必要とする患者における治療方法。
- 薬学的に許容される賦形剤及び場合により生分解性ポリマー等の徐放性マトリックスと共に請求項22に記載のrAAVを含む、薬学的組成物。
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