JP2023537625A

JP2023537625A - 新規ａａｖカプシド及びそれを含む組成物

Info

Publication number: JP2023537625A
Application number: JP2023511556A
Authority: JP
Inventors: ウイルソン，ジェームス・エム; ナンビアー，カリヤニ; ワン，チャン; シドレーン，ジェニー・エイ; マルティーノ，リチャード・アレキサンダー
Original assignee: ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2021-08-13
Publication date: 2023-09-04
Also published as: IL300410A; CA3188956A1; TW202221127A; WO2022036220A1; AU2021325954A1; EP4196170A1; KR20230051208A; CN116209769A; MX2023001863A; US20230287451A1

Abstract

本明細書において、新規ＡＡＶカプシド及びそれを含む組換えＡＡＶが提供される。一実施形態では、新規のＡＡＶカプシドを用いるベクターは、従来技術のＡＡＶと比較して、選択された標的組織の形質導入の増加を示す。【選択図】なし

Description

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、いくつかの臨床適応症に使用される安全かつ効果的な遺伝子導入ビヒクルである。ＡＡＶベクターに基づく治療アプローチは、レーバー先天黒内障、リポタンパク質リパーゼ欠乏症、及び脊髄性筋萎縮症の治療のために、米国食品医薬品局及び他の世界中の規制当局によって承認されている。これらの承認された遺伝子治療製品は、天然源から単離されたＡＡＶカプシドを送達ビヒクルとして利用する。ＡＡＶカプシド遺伝子の配列及び構造的多様性は、ウイルスクレード間で観察されるウイルスの向性、抗原性、及びパッケージング効率の変動に寄与する。遺伝子療法プラットフォームを進歩及び拡張させるには、一連の組織向性を有する新規のカプシドを発見することが必要である。

過去２０年間、カプシドタンパク質の修飾を介して特定の組織型への向性の増加を付与するか、又は抗ＡＡＶ中和抗体を回避するＡＡＶ操作は、カプシド開発の主な手段であった。しかしながら、異なる動物から培養された組織、血液、又はウイルス調製物などの天然源からのＡＡＶの単離は、臨床応用に好適である新規のＡＡＶを同定するための主要な方法であり続けている。抗ＡＡＶ抗体は、ＡＡＶリザーバが広大であることを示す様々な哺乳類源において見出されている。

ＡＡＶは、免疫原性が低く、かつ非病原性の性質であるため、遺伝子療法のための最も効果的なベクター候補のうちの１つである。しかしながら、効率的な遺伝子導入を可能にするにもかかわらず、現在診療所で使用されているＡＡＶベクターは、ウイルスに対する既存の免疫及び制限された組織向性によって妨げられ得る。新しいより効果的なＡＡＶベクターが必要とされている。

一態様では、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）の１つ以上の標的細胞に導入遺伝子を送達する方法が本明細書に提供され、対象に、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、ＣＮＳの標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することを含む。特定の実施形態では、ＣＮＳの標的細胞は、実質細胞、脈絡叢の細胞、上衣細胞、星状細胞、及び／又はニューロン、任意選択的に、皮質、海馬、及び／又は線条体のニューロンである。特定の実施形態では、導入遺伝子は、分泌型の遺伝子産物をコードする。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、任意選択的に、大槽内（ＩＣＭ）注射を介して、髄腔内に送達される。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、実質内投与を介して送達される。

一態様では、導入遺伝子を含むＡＡＶベクターを髄腔内投与した後、対象の肝臓への導入遺伝子の送達を改善するための方法が本明細書に提供され、対象に、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、肝臓の標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含む組換えＡＡＶベクターを、ＩＣＭ注射を介して投与することを含み、肝臓の形質導入のレベルが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、及び／又はＡＡＶ６．２カプシドを有するＡＡＶベクターで達成されたものと比較して増加する。

一態様では、対象にＡＡＶベクターを全身投与した後、肝臓を脱標的化し、かつ／又は肝臓毒性を減少させるための方法が本明細書に提供され、対象に、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、肝臓の細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された
導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含む組換えＡＡＶベクターを、静脈内注射を介して投与することを含み、ＡＡＶベクターの投与後に観察される肝臓の形質導入のレベル及び／又は肝臓毒性が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及び／又はＡＡＶ９カプシドを有するＡＡＶベクターと比較して減少する。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、配列番号１若しくは３のヌクレオチド配列、又は配列番号１若しくは３のヌクレオチド配列を少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％共有する配列の発現によって産生されるカプシドタンパク質を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、カプシドタンパク質を含み、カプシドタンパク質が、配列番号１又は３のヌクレオチド配列によってコードされる。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、（１）配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３から産生されるｖｐ１タンパク質、又は配列番号１若しくは３と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、又は配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ２タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、又は配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ３タンパク質の異種集団、並びに／あるいは（２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団、を含むカプシドタンパク質を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす。

一態様では、組換えＡＡＶを産生するために有用な組換えＡＡＶ産生系が本明細書に提供され、産生系が、（ａ）位置４１８、５４７、５８４、５８８、５９８、及び／又は６４２（配列番号２と整列した場合）のうちの１つ以上にアミノ酸置換を有するＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、（ｂ）ＡＡＶカプシドへのパッケージングに好適な核酸分子であって、当該核酸分子が、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、及び宿主細胞で産物の発現を指示する配列に作動可能に連結された遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、核酸分子と、（ｃ）ＡＡＶカプシドへの核酸分子のパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶのｒｅｐ機能及びヘルパー機能と、を含む。特定の実施形態では、（ａ）のヌクレオチド配列は、列挙された位置のうちの１つ以上で置換を有するクレードＡカプシドタンパク質をコードする。特定の実施形態では、（ａ）のヌクレオチド配列は、列挙された位置のうちの１つ以上にアミノ酸置換を有するＡＡＶ１、ＡＡＶｈｕ４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ４８、ＡＡＶｈｕ４４、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ．ＶＲ－１９５、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ６．２カプシドタンパク質をコードする。特定
の実施形態では、（ａ）のヌクレオチド配列は、位置４１８のＡｓｐ、位置５４７のＡｓｎ、位置５８４のＬｅｕ、位置５８８のＡｓｎ、位置５９８のＶａｌ、及び位置６４２のＨｉｓから選択される１つ以上のアミノ置換を有するカプシドタンパク質のアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、（ａ）のヌクレオチド配列は、Ｇｌｕ４１８、Ｓｅｒ５４７、Ｐｈｅ５８４、Ｓｅｒ５８８、Ａｌａ５９８、及び／又はＡｓｎ６４２にアミノ酸置換を有する配列番号８（ＡＡＶ１）のアミノ酸配列をコードし、コードされたアミノ酸配列が、配列番号８と少なくとも９５％同一又は少なくとも９９％同一である。特定の実施形態では、（ａ）のヌクレオチド配列は、位置４１８のＡｓｐ、位置５４７のＡｓｎ、位置５８４のＬｅｕ、位置５８８のＡｓｎ、位置５９８のＶａｌ、及び位置６４２のＨｉｓから選択される１つ以上のアミノ置換を有する配列番号８（ＡＡＶ１）のアミノ酸配列をコードし、コードされたアミノ酸配列が、配列番号８と少なくとも９５％同一又は少なくとも９９％同一である。特定の実施形態では、産生系は、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞を含む。

一態様では、組換えＡＡＶを生成する方法が本明細書に提供され、（ａ）位置４１８、５４７、５８４、５８８、５９８、及び６４２（配列番号２と整列した場合）のうちの１つ以上にアミノ酸置換を有するＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸分子と、（ｂ）機能的なｒｅｐ遺伝子と、（ｃ）ＡＡＶ５’ＩＴＲ、ＡＡＶ３’ＩＴＲ、及び導入遺伝子を含むミニ遺伝子と、（ｄ）ＡＡＶカプシドへのミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含む宿主細胞を培養するステップを含む。特定の実施形態では、生成された組換えＡＡＶは、未修飾カプシドタンパク質と比較して、改善された産生収率、及び／又は変化した細胞若しくは組織向性を有する。特定の実施形態では、生成された組換えＡＡＶは、未修飾カプシドタンパク質と比較してより高いレベルでＣＮＳの細胞を形質導入する。特定の実施形態では、（ａ）のヌクレオチド配列は、列挙された位置のうちの１つ以上に置換を有するクレードＡカプシドタンパク質をコードする。特定の実施形態では、（ａ）のヌクレオチド配列は、列挙された置換のうちの１つ以上を有するＡＡＶ１、ＡＡＶｈｕ４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ４８、ＡＡＶｈｕ４４、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ．ＶＲ－１９５、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ６．２カプシドをコードする。特定の実施形態では、（ａ）のヌクレオチド配列は、位置４１８のＡｓｐ、位置５４７のＡｓｎ、位置５８４のＬｅｕ、位置５８８のＡｓｎ、位置５９８のＶａｌ、及び位置６４２のＨｉｓから選択される１つ以上のアミノ置換を有するカプシドタンパク質のアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、（ａ）のヌクレオチド配列は、Ｇｌｕ４１８、Ｓｅｒ５４７、Ｐｈｅ５８４、Ｓｅｒ５８８、Ａｌａ５９８、及び／又はＡｓｎ６４２にアミノ酸置換を有する配列番号８（ＡＡＶ１）のアミノ酸配列をコードし、コードされたアミノ酸配列が、配列番号８と少なくとも９５％同一又は少なくとも９９％同一である。特定の実施形態では、（ａ）のヌクレオチド配列は、位置４１８のＡｓｐ、位置５４７のＡｓｎ、位置５８４のＬｅｕ、位置５８８のＡｓｎ、位置５９８のＶａｌ、及び位置６４２のＨｉｓから選択される１つ以上のアミノ置換を有する配列番号８（ＡＡＶ１）のアミノ酸配列をコードし、コードされたアミノ酸配列が、配列番号８と少なくとも９５％同一又は少なくとも９９％同一である。

一態様では、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）の１つ以上の標的細胞への導入遺伝子の送達に使用するための組換えＡＡＶベクターが本明細書に提供され、組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、ＣＮＳの標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含む。特定の実施形態では、ＣＮＳの標的細胞は、実質細胞、脈絡叢の細胞、上衣細胞、星状細胞、及び／又はニューロン、任意選択的に、皮質、海馬、及び／又は線条体のニューロンである。特定の実施形態では、導入遺伝子は、分泌型の遺伝子産物をコードする。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、任意選択的に、大槽内（ＩＣＭ）注射を介して、髄腔内に投与される。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、実質内投与を介して送達される。

一態様では、導入遺伝子を含むＡＡＶベクターを髄腔内投与した後、対象の肝臓への導入遺伝子の送達に使用するための組換えＡＡＶベクターが本明細書に提供され、組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、肝臓の標的細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含み、肝臓の形質導入のレベルが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、及び／又はＡＡＶ６．２カプシドを有するＡＡＶベクターで達成されたものと比較して増加する。

一態様では、対象にＡＡＶベクターを全身投与した後、肝臓を脱標的化し、かつ／又は肝臓毒性を減少させるのに使用するための組換えＡＡＶベクターが本明細書に提供され、組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、肝臓の細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含み、ＡＡＶベクターの投与後に観察される肝臓の形質導入のレベル及び／又は肝臓毒性が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及び／又はＡＡＶ９カプシドを有するＡＡＶベクターと比較して減少する。

これらの組成物及び方法の他の態様及び利点が、以下の詳細な説明において更に説明される。

ＡＡＶ－ＳＧＡのワークフローの図を示す。ゲノムＤＮＡを、アカゲザルの組織試料から単離し、ＡＡＶカプシド遺伝子の存在についてスクリーニングした。ＡＡＶ陽性のＤＮＡを、エンドポイント希釈し、さらなるラウンドのＰＣＲに供した。ポアソン分布によれば、ウェルの３０％以下でＰＣＲ産物を得るＤＮＡ希釈は、陽性ＰＣＲ８０％当たり１つの増幅可能なＤＮＡ鋳型を含む。陽性アンプリコンを、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ２ｘ１５０又は２ｘ２５０ペアエンド配列決定プラットフォームを使用して配列決定し、得られたリードを、ＳＰＡｄｅｓアセンブラを使用して新規に組み立てた。新規のＡＡＶ天然分離株及び代表的なクレード対照のＤＮＡゲノム配列の隣接結合系統樹を示す図である。ＡＡＶｒｈ９１（配列番号１）、ＡＡＶｒｈ９１ｅｎｇ（配列番号３）、ＡＡＶ６．２（配列番号５）、及びＡＡＶ１（配列番号７）のカプシドの核酸配列の整列を示す。ＡＡＶｒｈ９１（配列番号２）、ＡＡＶ６．２（配列番号６）、及びＡＡＶ１（配列番号８）のカプシドのアミノ酸配列の整列を示す。ベクター収率を評価するための、Ｈｕｈ７細胞（図１５Ａ）及びＨＥＫ２９３細胞（図１５Ｂ）のインビトロ導入の分析を示す。ルシフェラーゼ活性アッセイによって、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｆｆＬｕｃ導入遺伝子の発現をアッセイした。ベクターを、１×１０^１０ＧＣ／ｍＬの濃度で細胞に投与した（ｎ＝３）。データは、平均値及びＳＤとして示される；＊ｐ＜０．０１。精製後のベクター産生収率の分析を示す。（図６Ａ）カプシドに基づく平均ベクター収率。（図６Ｂ）導入遺伝子に基づくクレードＡカプシドベクター収率。データは、平均値及びＳＥＭとして示される；＊ｐ＜０．０１。ＡＡＶｒｈ９１ベクター調製物の質量分析の結果を示す。注入１４日後のマウス組織におけるｅＧＦＰ導入遺伝子の生体分布を示す。（図８Ａ及び図８Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マウス当たり１×１０^１２ＧＣの用量で、ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ（ｎ＝５）を含むＡＡＶカプシドをＩＶ注射した。（図８Ｃ及び図８Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マウス当たり１×１０^１１の用量で、ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ（ｎ＝５）を含む様々なＡＡＶカプシド（クレードＡベクターを６．９×１０^１０ＧＣ／マウスで投与）を脳室内ＩＣＶ注射した。値は、平均値±ＳＤとして表される；＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。ＡＡＶベクターのＩＭ送達後の骨格筋におけるβ－ガラクトシダーゼ発現の分析を示す。マウスに、様々なカプシドを有し、かつｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＬａｃＺ導入遺伝子を含む３×１０^９ＧＣのベクターを投与した。２０日目に筋肉組織を採取し、Ｘ－ｇａｌ染色（より濃い染色）により導入遺伝子の発現を評価した。様々なＡＡＶベクターのＩＭ送達後の血清中のｍＡｂのレベルを示す。Ｂ６マウスに、ｔＭＣＫプロモーターの下で３Ｄ６抗体を発現する１×１０^１１ＧＣのベクターを投与した。３Ｄ６又はＬａｃＺ導入遺伝子を発現するベクターの（ＡＡＶ８と比較した）収率を示す。ＮＨＰにおけるプールされたバーコード化ベクター研究の実験設計を示す（データは図１３Ａ～図１３Ｄに示されている）。５つの新規のカプシド及び５つの対照（ＡＡＶｒｈ．９０、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｒｈ．９２、ＡＡＶｒｈ．９３、ＡＡＶｒｈ９１．９３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ７、及びＡＡＶ９）は、固有の６ｂｐバーコードを有する修飾ＡＴＧ枯渇ＧＦＰ導入遺伝子を用いてパッケージングされた。ベクターを、等量でプールし、カニクイザルにＩＶ又はＩＣＭ注入して（総用量：２×１０^１３ＧＣ／ｋｇＩＶ及び３×１０^１３ＧＣＩＣＭ）。ＩＶ注入された動物は、ベースラインではＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶｒｈ３２．３３に対して血清陰性であり、ＡＡＶ７及びＡＡＶ９に対して、それぞれ１：５及び１：１０の中和抗体力価を有した。ＩＶ送達（図１３Ａ及び図１３Ｂ）及びＩＣＭ送達（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）後のバーコード化カプシドのＲＮＡ発現の分析を示すグラフである。ＩＶ投与－総用量２×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、３０日目に剖検。ＩＣＭ投与－３×１０^１３ＧＣ／動物、３０日目に剖検。各組織ＲＮＡ試料中のバーコード頻度は、各バーコードが混合物中に均等な表現（１０％）を有するように、注入入力材料の頻度に正規化された。８．５～１２％の範囲の１０種類のベクターの入力量。値は、平均値±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．００１。１４ｄｐｉでのマウスにおけるＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ６．２ベクターのＩＶ送達後のＧＦＰ発現の顕微鏡分析を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^１２ＧＣ／マウス（ｎ＝５）の用量で、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ導入遺伝子を含むベクターをＩＶ注射した。直接蛍光によるＧＦＰ導入遺伝子の発現を示す、肝臓、心臓、脳、及び筋肉からの代表的な画像。１４ｄｐｉでのマウスにおけるＩＣＶ送達後の新規ＡＡＶベクターのＧＦＰ発現の顕微鏡分析を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ導入遺伝子（ｎ＝５）を含むベクターをＩＣＶ注射した。クレードＡベクターを形質導入した上皮細胞及び脈絡叢のＧＦＰ蛍光の代表的な画像を示す。スケールバー：１００μｍ．アカゲザルＣＮＳ組織におけるＩＣＭ送達後のＧＦＰ導入遺伝子発現の免疫組織化学を示す。動物に、ＩＣＭ注射を介して、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ導入遺伝子を含む１．６×１０^１３ＧＣのベクターを投与した。脳（図１６Ａ）、側脳室（図１６Ｂ）、及び脊髄（図１６Ｃ）におけるベクターの形質導入を、２８～３１ｄｐｉで評価した（１群当たりｎ＝２）。動物ＩＤは右上隅。スケールバー：１００μｍ）。アカゲザル肝臓及び心臓組織におけるＩＣＭ送達後のＧＦＰ導入遺伝子発現の免疫組織化学を示す。動物に、ＩＣＭ注射を介して、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ導入遺伝子を含む１．６×１０^１３ＧＣのベクターを投与した。肝臓及び心臓におけるベクターの形質導入は、２８～３１ｄｐｉで評価した（群当たりｎ＝２）。動物ＩＤは右上隅。スケールバー：１００μｍ）。ＮＨＰにおけるＩＣＭ送達後の新規ベクターＡＡＶｒｈ９１の細胞向性の分析を示す。動物に、ＩＣＭ注射を介して、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ導入遺伝子を含む１．６×１０^１３ＧＣのベクターを投与した。ベクターの形質導入を、２８～３１ｄｐｉで評価した（カプシド当たりｎ＝２ＮＨＰ）。図１８Ａ及び図１８Ｂで同定された脳切片の星状細胞（図１８Ｃ）及びニューロン（図１８Ｄ）におけるＡＡＶ９と比較した平均ＧＦＰ発現の定量化。（図１８Ｅ）脳のサブ領域におけるＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ９ニューロンの形質導入の定量化。Ｃｔｘ：皮質、Ｆｒ：前頭、Ｔｅｍｐ：側頭、Ｐａｒ：頭頂、Ｏｃｃ：後頭、Ｓｔｒ：線条体、Ｔｈａｌ：視床、Ｈｉｐ：海馬。ＡＡＶｒｈ９１は、ＩＣＭ送達後、ＮＨＰ脳においてＡＡＶ９よりも高い割合のニューロン及び星状細胞を形質導入する。ＮＨＰにＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶ１、及びＡＡＶ９カプシドをＩＣＭ送達した後のベクター導入遺伝子の生体分布を示す。動物に、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ導入遺伝子を含む１．６×１０^１３ＧＣのベクターを投与した（カプシド当たりｎ＝２ＮＨＰ）。ベクターの体内分布を、皮質（図１９Ａ）、脳の非皮質領域（図１９Ｂ）、及び脊髄（図１９Ｃ）において、ｑＰＣＲによって２８～３１ｄｐｉで評価した。値は、平均値及びＳＥＭとして報告される。動物：ＡＡＶｒｈ９１（１４０９２０１及び１４０７０８８）、ＡＡＶ１（ＲＡ３６５４及びＲＡ３５８３）、ＡＡＶ９（１４０８２６６及び１４０９０２９）。動物ごとにグループ化された、図１９Ａ～図１９Ｃに報告された全てのＣＮＳ組織における平均ＧＣレベルを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。動物：ＡＡＶｒｈ９１（１４０９２０１及び１４０７０８８）、ＡＡＶ１（ＲＡ３６５４及びＲＡ３５８３）、ＡＡＶ９（１４０８２６６及び１４０９０２９）。ヒト集団におけるＡＡＶｒｈ９１の血清有病率を示す。ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ３２．３３、及びＡＡＶｒｈ９１に対する抗カプシド中和抗体（ＮＡｂ）を、５０のランダムなヒト血清試料で評価した。（図２１Ａ）様々なカプシドに対するＮＡｂの血清有病率及び（図２１Ｂ）ＮＡｂ応答の大きさ。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＩＶ投与後のＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶｒｈ９１の生体分布を示す。成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝５／群）に、ＣＢ７プロモーターからＧＦＰを発現する、１０^１１又は１０^１２ＧＣ／マウスのＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ９１をＩＶによって注射した。ベクター投与後２１日目にマウスを剖検した。肝臓（図２２Ａ）、脾臓（図２２Ｂ）、心臓（図２２Ｃ）、骨格筋（腓腹筋；図２２Ｄ）、脳（図２２Ｅ）、及び脊髄（図２２Ｆ）を、ベクターゲノムコピー及びベクター由来ＲＮＡ転写物のｑＰＣＲによる評価のために採取した。アカゲザルにおける、ＡＡＶ９と比較して、ＡＡＶｒｈ９１による心臓及び骨格筋の強化された遺伝子発現、並びに肝臓の減少した遺伝子発現を示す。アカゲザルに、５×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰをＩＶ投与した（ｎ＝３／群）。ベクター投与後２１日目に、動物を剖検した。（図２３Ａ）ＤＮＡ及び（図２３Ｂ）ＲＮＡを抽出し、ベクター由来配列をｑＰＣＲによって定量化した。ＧＦＰタンパク質の発現は、ＥＬＩＳＡ（図２３Ｃ）又はＩＨＣによって決定し、画像を定量化した（図２３Ｄ）。アカゲザルの大部分の筋肉群にわたる、ＡＡＶｒｈ９１による強化された骨格筋の形質導入を示す。アカゲザルに、５×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰをＩＶ投与した（ｎ＝３／群）。ベクター投与後２１日目に動物を剖検し、１３の骨格筋群から試料を採取した。（図２４Ａ）ＤＮＡ及び（図２４Ｂ）ＲＮＡを抽出し、ベクター由来配列をｑＰＣＲによって定量化した。ＧＦＰタンパク質の発現は、ＥＬＩＳＡによって決定した（図２４Ｃ）。各筋肉群について、左のドットのセットはＡＡＶ９であり、右のドットのセットはＡＡＶｒｈ９１である。ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ９１によるＩＶ投与後の肝臓変性及び個々の細胞の壊死を示す。アカゲザルに、５×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰをＩＶ投与した（ｎ＝３／群）。ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ９１によるＩＶ投与後のアカゲザルの臨床病理学的評価を示す。アカゲザルに、５×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰをＩＶ投与した（ｎ＝３／群）。（図２６Ａ）ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ、ＧＧＴ、総ビリルビン、（図２６Ｂ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、ＡＰＴＴ、及び血小板数の評価のための血液試料を、研究の生存期間全体を通して採取した。ベクター投与後２１日目に、動物を剖検した。ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ９１によるＩＣＭ投与後のアカゲザルの臨床病理学的評価を示す。アカゲザルに、３×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰをＩＣＭ投与した（ｎ＝３／群）。（図２７Ａ）ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、ＧＧＴ、総ビリルビン、（図２７Ｂ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、ＡＰＴＴ、血小板数、ＣＳＦ白血球数の評価のための血液試料を、研究の生存期間全体を通して採取した。ベクター投与後１４日目に、動物を剖検した。ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ９１によるＩＣＭ投与後の生体分布を示す。アカゲザルに、３×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰをＩＣＭ投与した。１４日目に剖検を行った。ＤＲＧにおけるＧＦＰ陽性感覚ニューロンの定量化を示す。アカゲザルに、３×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰをＩＣＭ投与した（ｎ＝３／群）。（図２９Ａ）免疫組織化学を行って、組織切片でＧＦＰを検出し、画像化ソフトウェアを使用してスライドを評価した。頸髄セグメントＤＲＧの分析のためのデータは、ＧＦＰ＋細胞／ｍｍ^２（図２９Ｂ及び図２９Ｃ）及びＧＦＰ陽性面積（％）（図２９Ｄ及び図２９Ｅ）として示される。腰髄セグメントＤＲＧの分析のためのデータは、ＧＦＰ＋細胞／ｍｍ^２（図２９Ｆ及び図２９Ｇ）及びＧＦＰ陽性面積（％）（図２９Ｈ及び図２９Ｉ）として示される。脊髄セグメントにおけるＧＦＰ陽性運動ニューロンの定量化を示す。アカゲザルに、３×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰをＩＣＭ投与した（ｎ＝３／群）。（図３０Ａ）免疫組織化学を行って、組織切片でＧＦＰを検出し、スライドを、画像化ソフトウェアを使用して評価した。頸髄セグメントの前角（図３０Ｂ及び図３０Ｃ）、胸髄セグメントの前角（図３０Ｄ及び図３０Ｅ）、及び腰髄セグメントの前角（図３０Ｆ及び図３０Ｇ）におけるＧＦＰ陽性ニューロンを、手動でカウントした。後頭皮質のニューロンにおけるＧＦＰ陽性細胞の定量を示す。アカゲザルに、３×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰをＩＣＭ投与した（ｎ＝３／群）。（図３１Ａ）免疫組織化学を行って、組織切片でＧＦＰを検出し、スライドを、画像化ソフトウェアを使用して評価した。ＧＦＰ陽性ニューロンを手動でカウントした（図３１Ｂ及び図３１Ｃ）。ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ９１のＩＣＭ投与後の神経伝導速度の評価を示す。アカゲザルに、３×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．２．１０ｍＡｂをＩＣＭ投与した（ｎ＝３／群）。評価は、ベースライン時及び生存期間中に行った。ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ９１のＩＣＭ投与後のＣＳＦ及び血清中の導入遺伝子の濃度を示す。アカゲザルに、３×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．２．１０ｍＡｂをＩＣＭ投与した（ｎ＝３／群）。２．１０ｍＡｂの発現について、血清（図３３Ａ）及びＣＳＦ（図３３Ｂ）を監視した。ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ９１によるＩＣＭ投与後の生体分布を示す。アカゲザルに、３×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．２．１０ｍＡｂをＩＣＭ投与した（ｎ＝３／群）。ベクター投与後９０日目に、マウスを剖検した。ＡＡＶｒｈ９１とＡＡＶ１カプシドとの間の構造的な違いを示す。ＡＡＶｒｈ９１の構造を、ｃｒｙｏＥＭを使用して２．３３の分解能で解析し、ＡＡＶ１の公開された構造（６ＪＣＲ）と比較した。２つのカプシド間で異なるＶＰ３のアミノ酸は、位置４１８（図３５Ａ）、５４７（図３５Ｂ）、５８４（図３５Ｃ）、５８８（図３５Ｄ）、５９８（図３５Ｅ）、及び６４２（図３５Ｆ）に位置し、それらの構造的文脈で示されている。指定された位置のアミノ酸は黒色、他の全てのアミノ酸は灰色で配色されている。指定された残基と密接な接触を形成するアミノ酸は、テキストラベルが付されている。各残基の鎖内接触及び鎖間接触は、Ａ又はＢの文字指定で示されている。図３５Ａは、同じ位置のＡＡＶ１のＧｌｕ４１８と比較して、その構造的文脈でＡＡＶｒｈ９１のＡｓｐ４１８アミノ酸残基を示す。位置４１８の残基に近接しているアミノ酸Ａｒｇ３０８、Ｌｙｓ３１０、及びＧｌｕ６８６もラベルされている。位置４１８のアミノ酸は黒色、他の全てのアミノ酸は灰色で配色されている。全てのラベルされたアミノ酸は、同じポリペプチド鎖上に位置し、位置４１８の残基と鎖内接触を形成する。図３５Ｂは、同じ位置のＡＡＶ１のＳｅｒ５４７と比較して、その構造的文脈でＡＡＶｒｈ９１のＡｓｎ５４７アミノ酸残基を示す。位置５４７のアミノ酸は黒色、他の全てのアミノ酸は灰色で配色されている。図３５Ｃは、同じ位置のＡＡＶ１のＰｈｅ５８４と比較して、その構造的文脈でＡＡＶｒｈ９１のＬｅｕ５８４アミノ酸残基を示す。位置５８４の残基に近接しているアミノ酸Ａｒｇ４８５、Ａｒｇ４８８、Ｌｙｓ５２８、Ｇｌｕ５３１、Ｐｈｅ５３４、Ｔｈｒ５７４、及びＧｌｕ５７５もラベルされている。位置５８４のアミノ酸は黒色、他の全てのアミノ酸は灰色で配色されている。鎖間接触は、Ａ又はＢの文字指定で示されている。位置５８４のアミノ酸は、Ａでラベルされ、周囲の残基は、Ｂでラベルされ、隣接するポリペプチド鎖上に見出される。図３５Ｄは、同じ位置のＡＡＶ１のＳｅｒ５８８と比較して、３回対称スパイク構造の先端におけるその文脈でＡＡＶｒｈ９１のＡｓｎ５８８アミノ酸残基を示す。位置５８８のアミノ酸は黒色、他の全てのアミノ酸は灰色で配色されている。図３５Ｅは、同じ位置のＡＡＶ１のＡｌａ５９８と比較して、その構造的文脈でＡＡＶｒｈ９１のＶａｌ５９８アミノ酸残基を示す。位置５９８の残基に近接しているアミノ酸Ｔｙｒ４８４、Ｖａｌ５８０、Ｖａｌ５９６、Ｍｅｔ５９９、及びＬｅｕ６０２もラベルされている。位置５９８のアミノ酸は黒色、他の全てのアミノ酸は灰色で配色されている。各残基の鎖内及び鎖間接触は、Ａ又はＢの文字指定で示されている。Ａでラベルされたアミノ酸は、位置５９８のアミノ酸と同じポリペプチド鎖上にあり、Ｂでラベルされたアミノ酸は、隣接する鎖上にある。図３５Ｆは、同じ位置のＡＡＶ１のＡｓｎ６４２と比較して、その構造的文脈でＡＡＶｒｈ９１のＨｉｓ６４２アミノ酸残基を示す。位置６４２の残基に近接しているアミノ酸Ｔｙｒ３４９、Ｔｙｒ４１４、Ｇｌｕ４１７、及びＬｙｓ６４１もラベルされている。位置６４２のアミノ酸は黒色、他の全てのアミノ酸は灰色で配色されている。全てのラベルされたアミノ酸は、同じポリペプチド鎖上に位置し、位置６４２の残基と鎖内接触を形成する。ＡＡＶｒｈ９１コード配列及び操作されたＡＡＶｒｈ９１コード配列（ＡＡＶｒｈ９１ｅｎｇ）を有するトランスプラスミドのＡＡＶベクター収率の比較を示す。各構築物について、プラスミドを再形質転換し、４つのクローンを、１２ウェルプレート中の個々の三重形質転換についてランダムに採取した。ベクター収率は、２つの方法－産生力価についてはｑＰＣＲ（図３６Ａ）、感染性力価についてはＨｕｈ７形質導入（図３６Ｂ）によって決定した。各実験は、反復１と反復２の２回実施された。追加の調節エレメントを有するトランスプラスミドのＡＡＶベクター収率の比較を示す。ＷＰＲＥ及び／又はｂＧＨポリＡを含むトランスプラスミドを生成した（図３７Ａ）。ベクター収率は、２つの方法－産生力価についてはｑＰＣＲ（図３７Ｂ）、感染性力価についてはＨｕｈ７形質導入（図３７Ｃ）によって決定した。各実験は、反復１と反復２の２回実施された。

天然の哺乳類宿主におけるＡＡＶの遺伝的バリエーションを、ＡＡＶ単一ゲノム増幅（個々のＡＡＶゲノムをウイルス集団内から正確に単離するために使用される技術）を使用することによって探索した（図１）。本明細書において、様々なクレードに分類することができるアカゲザル組織由来の新規ＡＡＶ配列の単離が記載される。記載される新規のカ
プシド配列を使用して、遺伝子送達ベクターを作製した。我々は、マウスにおける静脈内（ＩＶ）及び脳室内（ＩＣＶ）送達後、ならびにＮＨＰにおけるＩＶ及び大槽内（ＩＣＭ）送達後の、天然単離由来ＡＡＶベクターの生物学的特性を評価した。その結果、新規のＡＡＶバリアントのクレード特異的形質導入パターン及び可変形質導入パターンの両方が、それらの原型的なクレードメンバー対照と比較して特定された。

組換えＡＡＶｒｈ９１ベクターが本明細書で提供され、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、対象への送達後に導入遺伝子の発現を指示する調節配列の制御下にある導入遺伝子をコードする核酸と、を有する。ｒＡＡＶｒｈ９１カプシドは、独立して、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。これらのベクターを含む組成物が提供される。本明細書に記載の方法は、様々な状態の治療のために、目的の組織を標的とするｒＡＡＶの使用を対象とする。

特定の実施形態では、導中枢神経系への入遺伝子の送達に非常に好適なＡＡＶｒｈ９１カプシドを含むベクターが本明細書に提供される。特定の実施形態では、髄腔内送達が望まれ、例えば、ＩＣＭ送達を介した脳への送達が含まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを含むベクターは、平滑筋への導入遺伝子の送達に非常に好適である。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを含むベクターは、心臓組織への導入遺伝子の送達に非常に好適である。他の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを含むベクターは、骨格筋（横紋筋）への導入遺伝子の送達に非常に好適である。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１ベクターは、全身に送達され得るか、又はこれらの組織を標的化するのに好適な投与経路を介して標的化され得る。特定の実施形態では、ＣＮＳへのＡＡＶｒｈ９１ベクターの投与はまた、１つ以上の末梢臓器（例えば、心臓及び／又は肝臓を含む）への導入遺伝子の送達をもたらす。

別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって、及び本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。以下の定義は、明確にするために提供されるに過ぎず、特許請求される本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「宿主」は、１つ以上の宿主を表すことを留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔｌｅａｓｔｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照から１０％の変動性を意味する。明細書中の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語を使用して提示されるが、他の状況下では、関連する実施形態は、「～からなる」又は「～から本質的になる」という言語を使用して解釈され、記載されることも意図している。

以下の説明に関して、本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、本発明の方法で有用であることが意図される。加えて、本方法で有用な本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、それ自体が本発明の実施形態であることも意図される。

「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、及びＡＡＶカプシド内にパッケージングされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」という句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶｒｅｐ遺伝子又は機能的ＡＡＶｃａｐ遺伝子を欠き、後代を生成することができないため、「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子及び調節配
列がＡＡＶカプシド内にパッケージングされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’及び３’最末端に位置する。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内側にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。本明細書の例では、ベクターゲノムは、少なくとも、５’から３’へ、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、コード配列、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含有する。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来（カプシドとは異なるＡＡＶ供給源）であるか、又はそれ以外の完全長ＩＴＲが選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能又はトランス相補性ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。更に、他のＩＴＲが使用され得る。更に、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を指示する調節配列を含む。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。ベクターゲノムは、本明細書では「ミニ遺伝子」と称されることがある。

「発現カセット」という用語は、導入遺伝子配列及びそのための調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ）を含む核酸分子を指し、そのカセットは、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のカプシドにパッケージングされ得る。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する導入遺伝子配列、及び本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、パッケージングシグナルは、５’逆位末端配列（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、「発現カセット」と互換的に使用され得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、選択された遺伝子のコード配列のみを指す。

ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド及びベクターゲノムからなる。ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１の異種集団、ｖｐ２の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団の集合体である。本明細書で使用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。

本明細書で使用される場合、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種集団」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基の修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限、特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。

本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーまでからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中の少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質未満であり得る。ｖｐ３の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、１つのｖｐ３タンパク質から、すべてのｖｐ３タンパク質よりも少なくてもよい。例えば、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別の亜集団であ
り得、ｖｐ３はなお、ｖｐタンパク質のさらなる亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含み得る。２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／０１９８０４、及び２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／０１９８６１を参照されたい（これらの各々は、参照により本明細書に援用される）。

別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は最大約１００％の脱アミド化を指す。かかるパーセンテージは、２Ｄゲル、質量分析技術、又は他の好適な技術を使用して決定され得る。

理論に束縛されることを意図するものではないが、ＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質中の少なくとも高度に脱アミド化された残基の脱アミド化は、本質的に非酵素的であると考えられ、選択されたアスパラギンを脱アミド化するカプシドタンパク質内の官能基、及びより少ない程度でグルタミン残基によって引き起こされる。大部分の脱アミド化ｖｐ１タンパク質の効率的なカプシド組み立ては、これらの事象がカプシド組み立て後に生じるか、又は個々のモノマー（ｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３）における脱アミド化が構造的に十分許容され、ほとんどが組み立て動態に影響を及ぼさないことを示す。一般に、細胞侵入前に内部に位置すると考えられるＶＰ１固有（ＶＰ１－ｕ）領域（～ａａ１－１３７）における広範な脱アミド化は、カプシド組み立ての前にＶＰ脱アミド化が生じ得ることを示唆する。

理論に束縛されることを意図するものではないが、Ｎの脱アミド化は、そのＣ末端残基の骨格窒素原子を介して、Ａｓｎの側鎖アミド基炭素原子に対して求核攻撃を行うことによって生じ得る。中間環閉鎖スクシンイミド残基が形成されると考えられる。次いで、スクシンイミド残基は、高速加水分解を行って、最終産物であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はイソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）をもたらす。したがって、特定の実施形態では、アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）の脱アミド化は、Ａｓｐ又はＩｓｏＡｓｐをもたらし、例えば、以下に例示するように、スクシンイミド中間体を介して相互変換され得る。

本明細書に提供されるように、ＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３中の各脱アミド化Ｎは、独立して、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）、アスパルテ
ート、及び／又はＡｓｐ及びｉｓｏＡｓｐの相互変換ブレンド、又はこれらの組み合わせであり得る。α－及びイソアスパラギン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のアスパラギン酸対イソアスパラギン酸、約５０：５０のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、もしくは約１：３のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、又は別の選択された比率であり得る。

特定の実施形態では、１つ以上のグルタミン（Ｑ）は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、すなわちα－グルタミン酸、γ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）、又はα－及びγ－グルタミン酸のブレンドに脱アミド化され得、共通のグルタルイミド中間体を介して相互変換され得る。任意の好適な比率のα－グルタミン酸及びγ－グルタミン酸が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のα対γ、約５０：５０のα：γ、若しくは約１：３のα：γ、又は別の選択された比率であり得る。

したがって、ｒＡＡＶは、少なくとも１つの高度脱アミド化アスパラギンを含む少なくとも１つの亜集団を含む、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２、及び／又はｖｐ３タンパク質のｒＡＡＶカプシド中に亜集団を含む。更に、他の修飾は、特に、選択されたアスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）残基位置での異性化を含み得る。更に他の実施形態では、修飾は、Ａｓｐ位置でのアミド化を含み得る。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個から、少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３の亜集団を含み、そのうちの少なくとも１～１０％、少なくとも１０～２５％、少なくとも２５～５０％、少なくとも５０～７０％、少なくとも７０～１００％、少なくとも７５～１００％、少なくとも８０～１００％、又は少なくとも９０～１００％は、ｖｐタンパク質のコードアミノ酸配列と比較して脱アミド化されている。これらの大部分は、Ｎ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基も脱アミド化され得る。

本明細書で使用される場合、「コードされたアミノ酸配列」は、アミノ酸に翻訳される参照核酸配列の既知のＤＮＡコドンの翻訳に基づいて予測されるアミノ酸を指す。以下の表は、ＤＮＡコドン及び２０個の共通アミノ酸を例示し、１文字コード（ＳＬＣ）及び３
文字コード（３ＬＣ）の両方を示す。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を有するＡＡＶカプシドを有し、本明細書に提供される表（参照により本明細書に援用される）に示される位置に、２、３、４、５個、又はそれ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有する。

ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、及び／又は質量分析、及び／又はタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィーは、ＡｃｃｌａｉｍＰｅｐＭａｐカラム、及びＮａｎｏＦｌｅｘ源（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱＥｘａｃｔｉｖｅＨＦに連結されたＴｈｅｒｍｏＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＲＳＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。ＭＳデータは、ＱＥｘａｃｔｉｖｅＨＦのデータ依存性Ｔｏｐ－２０法を使用して取得され、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から、最も豊富でまだ配列決定されていない前駆体イオンを動的に選択する。配列決定は、予測自動ゲイン制御によって決定される１ｅ５イオンの標的値を有する、より高エネルギーの衝突解離断片化によって行われ、前駆体の単離は、４ｍ／ｚのウィンドウで行わ
れた。サーベイスキャンは、ｍ／ｚ２００、解像度１２０，０００で取得された。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注射時間５０ｍｓ及び正規化された衝突エネルギー３０で、ｍ／ｚ２００で３０，０００に設定されてもよい。ＳレンズＲＦレベルは、消化からのペプチドによって占められるｍ／ｚ領域の最適伝送を与えるために、５０に設定されてもよい。断片化選択からの単一の割り当てられていない帯電状態、又は６以上の帯電状態を有する前駆イオンは、除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒ１．０ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、取得したデータの分析に使用してもよい。ペプチドマッピングのために、固定修飾としてカルバミドメチル化設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド化、及びリン酸化の設定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、ならびにＭＳ／ＭＳスペクトルにおける信頼レベル０．８を使用して検索を実施する。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシン又はキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は、無傷分子の質量＋０．９８４Ｄａ（－ＯＨ及び－ＮＨ_２基の質量差）を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化の割合は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化及び天然ペプチドの面積の合計で割ることによって決定される。脱アミド化の可能性がある部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている同重種は、単一のピークで共移動し得る。その結果、複数の脱アミド化の可能性がある部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、脱アミド化の複数の部位を位置決定又は区別することができる。これらの場合に、観測される同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的な存在率を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位に依存しないことを想定する。これらの例示的な方法のいくつかの変形が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析器は、例えば、ＷａｔｅｒｓＸｅｖｏもしくはＡｇｉｌｅｎｔ６５３０などの四重飛行質量分析器（ＱＴＯＦ）、又はＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎ又はＯｒｂｉｔｒａｐＶｅｌｏｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などのオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィーシステムとしては、例えば、Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣシステム又はＡｇｉｌｅｎｔのシステム（１１００又は１２００シリーズ）が含まれる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ、及びＰｅｐｆｉｎｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅａｋｓＤＢ（ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）が含まれ得る。更に他の技法は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ．Ｊｉｎｅｔａｌ，ＨｕＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＭｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。

脱アミド化に加えて、他の修飾も生じ得るが、１つのアミノ酸が異なるアミノ酸残基に変換されることはない。かかる修飾は、アセチル化残基、異性化、リン酸化、又は酸化を含み得る。

脱アミド化の調節：特定の実施形態では、ＡＡＶは、アスパラギン－グリシン対におけるグリシンを変更して、脱アミド化を低減するように修飾される。他の実施形態では、アスパラギンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化するグルタミン、又はアミド基を欠くアミノ酸（例えば、グルタミン及びアスパラギンは、アミド基を含有する）、及び／又はアミン基を欠くアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが、アミン基を含有する）に変更される。本明細書で使用される場合、アミド又はアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファン、及び／又はプロリンを指す。記載されるような修飾は、コードされたＡＡＶアミノ酸配列中に見出されるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つ、又は３つにあり得る。
特定の実施形態では、かかる修飾は、アスパラギン－グリシン対の４つすべてでは行われない。したがって、ＡＡＶ及び／又は操作されたＡＡＶバリアントの脱アミドを低減するための方法は、より低い脱アミド率を有する。追加的に、又は代替的に、１つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変化させて、ＡＡＶの脱アミド化を低減させ得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される変異体ＡＡＶカプシドは、グリシンがアラニン又はセリンに変化するように、アスパラギン－グリシン対における変異を含む。変異体ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に４つのＮＧ対を含む位置に、１つ、２つ、又は３つの変異体を含有し得る。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に５つのＮＧ対を含む位置に、１つ、２つ、３つ、又は４つのかかる変異体を含有し得る。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対に単一の変異のみを含有する。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、２つの異なるＮＧ対に変異を含有する。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシド中で構造的に離れた位置に位置する２つの異なるＮＧ対に変異を含有する。特定の実施形態では、変異は、ＶＰ１固有領域にはない。特定の実施形態では、変異のうちの１つは、ＶＰ１固有領域にある。任意選択的に、変異体ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対中に修飾を含まないが、ＮＧ対から外れて位置する１つ以上のアスパラギン又はグルタミン中の脱アミド化を最小限に抑えるか、又は排除するために変異を含有する。

特定の実施形態では、野生型ＡＡＶカプシド中のＮＧの１つ以上を排除するＡＡＶカプシドを操作することを含む、ｒＡＡＶベクターの効力を増加させる方法が提供される。特定の実施形態では、「ＮＧ」の「Ｇ」のコード配列は、別のアミノ酸をコードするように操作される。以下の特定の例では、「Ｓ」又は「Ａ」が置換される。しかしながら、他の好適なアミノ酸コード配列が選択され得る。

これらのアミノ酸修飾は、従来の遺伝子工学技術によって行われ得る。例えば、修飾ＡＡＶｖｐコドンを含む核酸配列が生成され得、アスパラギン－グリシン対中のグリシンをコードするコドンのうちの１～３個が、グリシン以外のアミノ酸をコードするように修飾される。特定の実施形態では、修飾アスパラギンコドンを含む核酸配列は、アスパラギン－グリシン対のうちの１～３個が操作され得、その結果、修飾コドンはアスパラギン以外のアミノ酸をコードする。各修飾コドンは、異なるアミノ酸をコードし得る。代替的に、改変されたコドンのうちの１個以上は、同じアミノ酸をコードし得る。特定の実施形態では、修飾ＡＡＶｒｈ９１の核酸配列は、天然ＡＡＶｒｈ９１カプシドよりも低い脱アミド化を含むカプシドを有する変異体ｒＡＡＶを生成するために使用され得る。かかる変異ｒＡＡＶは、免疫原性が低下しており、及び／又は貯蔵、特に懸濁形態での貯蔵の際の安定性を増加させ得る。

本明細書には、低減された脱アミド化を有するＡＡＶカプシドをコードする核酸配列も提供される。ＤＮＡ（ゲノム又はｃＤＮＡ）、又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶカプシドをコードする核酸配列を設計することは当該技術の範囲内である。かかる核酸配列は、選択されたシステム（すなわち、細胞型）における発現のためにコドン最適化され得、様々な方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、又はコドン最適化サービスを提供する会社、例えば、ＤＮＡ２．０（ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ）を使用して実行され得る。１つのコドン最適化方法は、例えば、国際特許公開第２０１５／０１２９２４号に記載され、参照によりその全体が本明細書に援用される。また、例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号を参照されたい。好適には、産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を修飾する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみを改変してもよい。これらの方法のうちの１つを使用することによって、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生し得る。コ
ドンに実際の変化を行うために、又は本明細書に記載されるように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、いくつかのオプションが利用可能である。かかる修飾又は合成は、当業者によく知られている標準的かつ通常の分子生物学的操作を使用して行うことができる。あるアプローチでは、各々の長さが８０～９０ヌクレオチドであり、所望の配列長にわたる一連の相補的なオリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングの際に、付着末端を含む８０～９０塩基対の二本鎖断片が形成されるように合成され、例えば、対の各オリゴヌクレオチドは、対の他のオリゴヌクレオチドと相補的である領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の塩基を伸長するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖末端とアニーリングするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次いで、これらの二本鎖断片のおよそ５～６個を、凝集性一本鎖末端を介して一緒にアニールさせ、次いで、それらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次いで、構築物を標準的な方法で配列決定する。一緒にライゲーションされた８０～９０塩基対の断片の５～６個の断片（すなわち、約５００塩基対の断片）からなるこれらの構築物のいくつかを調製し、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物で表されるようにする。次いで、これらのプラスミドのインサートを、適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲーションし、最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を、標準的な細菌クローニングベクターにクローニングされ、配列決定される。追加の方法は、当業者にすぐに明らかになるだろう。加えて、遺伝子合成は、商業的に容易に利用可能である。

特定の実施形態では、複数の高度に脱アミド化された「ＮＧ」位置を含むＡＡＶカプシドアイソフォーム（すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の異種集団を有するＡＡＶカプシドが提供される。特定の実施形態では、高度に脱アミド化された位置は、予測される完全長のＶＰ１アミノ酸配列を参照して、以下に示す位置にある。他の実施形態では、カプシド遺伝子は、参照される「ＮＧ」が除去されるように修飾され、変異体「ＮＧ」は、別の位置に操作される。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」及び「標的組織」という用語は、対象となるＡＡＶベクターによって形質導入されることが意図される任意の細胞又は組織を指し得る。この用語は、筋肉、肝臓、肺、気道上皮、中枢神経系、ニューロン、眼（視覚細胞）、又は心臓のうちのいずれか１つ以上を指し得る。一実施形態では、標的組織は、肝臓である。別の実施形態では、標的組織は、心臓である。別の実施形態では、標的組織は、脳である。特定の実施形態では、標的細胞は、１つ以上のＣＮＳの細胞型であり、これには、星状細胞、ニューロン、上衣細胞、及び脈絡叢の細胞が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、標的組織は、筋肉である。

本明細書で使用される場合、「哺乳類対象」又は「対象」という用語は、本明細書に記載の治療方法又は予防を必要とする任意の哺乳類を含み、特にヒトを含む。かかる治療又は予防を必要とする他の哺乳動物としては、非ヒト霊長類を含む、イヌ、ネコ、又は他の家畜化動物、ウマ、家畜、実験動物などが挙げられる。対象は、雄又は雌であってもよい。

本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶの「ストック」は、ｒＡＡＶの集団を指す。脱アミド化に起因するカプシドタンパク質の不均一性にもかかわらず、ストック内のｒＡＡＶは、同一のベクターゲノムを共有することが予想される。ストックは、例えば、選択されたＡＡＶカプシドタンパク質及び選択された産生系に特徴的な不均一な脱アミド化パターンを有するカプシドを有するｒＡＡＶを含み得る。ストックは、単一の産生系から産生さ
れてもよく、又は産生系の複数の実行からプールされてもよい。本明細書に記載されるものを含むが、これらに限定されない様々な産生系が選択され得る。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ｒＡＡＶがプラスミドから産生されるパッケージング細胞株を指し得る。代替的に、「宿主細胞」という用語は、導入遺伝子の発現が所望される標的細胞を指し得る。

Ａ．ＡＡＶカプシド
配列番号２に示されるｖｐ１配列を有する新規のＡＡＶカプシドタンパク質が、本明細書に提供される。ＡＡＶカプシドは、３つのオーバーラップするコード配列からなり、これらは、代替的な開始コドン使用により長さが変化する。これらの可変タンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３として参照され、ＶＰ１は最長であり、ＶＰ３は最短である。ＡＡＶ粒子は、約１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比率で、３つすべてのカプシドタンパク質からなる。Ｎ末端のＶＰ１及びＶＰ２に含まれるＶＰ３は、粒子を構築する主要な構造成分である。カプシドタンパク質は、いくつかの異なる番号付けシステムを使用して参照され得る。便宜上、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ配列は、ＶＰ１の最初の残基のａａ１で始まるＶＰ１の番号付けを使用して参照される。しかしながら、本明細書に記載のカプシドタンパク質には、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３（本明細書でｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３と互換的に使用される）が含まれる。カプシドの可変タンパク質の番号付けは、以下のとおりである。
ヌクレオチド（ｎｔ）
ＡＡＶｒｈ９１：ｖｐ１－配列番号１のｎｔ１～２２０８、ｖｐ２－ｎｔ４１２～２２０８、ｖｐ３－ｎｔ６０７～２２０８。
ＡＡＶｒｈ９１ｅｎｇ：ｖｐ１－配列番号３のｎｔ１～２２０８、ｖｐ２－ｎｔ４１２～２２０８、ｖｐ３－ｎｔ６０７～２２０８。
図３Ａ～図３Ｄに、本明細書に記載のカプシドの核酸配列の整列を示す。
アミノ酸（ａａ）
ＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶｒｈ９１ｅｎｇ：ｖｐ１－配列番号２のａａ１～７３６、ｖｐ２－ａａ１３８～７３６、ｖｐ３－ａａ２０３～７３６。
図４Ａ及び図４Ｂに、本明細書に記載のカプシドのアミノ酸配列の整列を示す。

ＡＡＶｒｈ９１（配列番号２）のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３のうちの少なくとも１つ含むｒＡＡＶが、本明細書に含まれる。また、ＡＡＶｒｈ９１（配列番号１）又はＡＡＶｒｈ９１ｅｎｇ（配列番号３）のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３のうちの少なくとも１つによってコードされるＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶも、本明細書に提供される。

一実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の混合集団を含む組成物であって、該ｒＡＡＶの各々が、（ａ）約６０個のカプシドｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、及びｖｐ３タンパク質を含むＡＡＶカプシドであって、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、選択されるＡＡＶｖｐ１アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質の異種集団、選択されるＡＡＶｖｐ２アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質の異種集団、選択されるＡＡＶｖｐ３アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質の異種集団であり、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、ＡＡＶカプシド中のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶカプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、及び宿主細胞中で産物の発現を指示する配列に作動可能に連結された産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、組成物が提供される。

特定の実施形態では、脱アミド化アスパラギンは、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換アスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、又はそれらの組み合わせに脱アミド化される。特定の実施形態では、カプシドは、（α）－グルタミン酸、γ－グルタミン酸、相互変換（α）－グルタミン酸／γ－グルタミン酸対、又はそれらの組み合わせに脱アミド化される脱アミド化グルタミンを更に含む。

特定の実施形態では、新規の単離されたＡＡＶｒｈ９１カプシドが提供される。ＡＡＶｒｈ９１をコードする核酸配列は、配列番号１に提供され、コードされたアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。ＡＡＶｒｈ９１（配列番号２）のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３のうちの少なくとも１つを含むｒＡＡＶが、本明細書に提供される。また、ＡＡＶｒｈ９１（配列番号１）のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３のうちの少なくとも１つによってコードされるＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶも、本明細書に提供される。ＡＡＶｒｈ９１のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号３に提供され、コードされるアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。また、ＡＡＶｒｈ９１ｅｎｇ（配列番号３）のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３のうちの少なくとも１つによってコードされるＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶも、本明細書に提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１、ｖｐ２、及び／又はｖｐ３は、ＡＡＶｒｈ９１（配列番号２）の完全長カプシドタンパク質である。他の実施形態では、ｖｐ１、ｖｐ２、及び／又はｖｐ３は、Ｎ末端及び／又はＣ末端の切断（例えば、約１～約１０個のアミノ酸の切断）を有する。

さらなる態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供され、（Ａ）ＡＡＶｒｈ９１カプシドであって、（１）配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されるｖｐ１タンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、若しくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ２タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、若しくは配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ３タンパク質の異種集団、並びに／又は（２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団、を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、（Ｂ）ＡＡＶｒｈ９１カプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、及び宿主細胞における産物の発現を指示する配列に作動可能に連結された
産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。

さらなる態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供され、（Ａ）ＡＡＶｒｈ９１カプシドであって、（１）配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号３から産生されるｖｐ１タンパク質、若しくは配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、若しくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ２タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、若しくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ３タンパク質の異種集団、並びに／又は（２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団、を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、（Ｂ）ＡＡＶｒｈ９１カプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、及び宿主細胞における産物の発現を指示する配列に作動可能に連結された産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす。配列番号２の数と比較して、Ｎ－Ｇ対のＮ５７、Ｎ３８３、及び／又はＮ５１２で、高いレベルの脱アミド化が観察される。以下の表及び図７Ｂ及び図７Ｃに示されるように、脱アミド化は、他の残基において観察されている。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１は、脱アミド化された他の残基を有し得（例えば、典型的には１０％未満）、かつ／又はリン酸化（例えば、存在する場合、約２～約３０％、もしくは約２～約２０％、もしくは約２～約１０％の範囲で）（例えば、Ｓ１４９で）、又は酸化（例えば、～Ｗ２２、～Ｍ２１１、Ｗ２４７、Ｍ４０３、Ｍ４３５、Ｍ４７１、Ｗ４７８、Ｗ５０３、～Ｍ５３７、～Ｍ５４１、～Ｍ５５９、～Ｍ５９９、Ｍ６３５、及び／もしくはＷ６９５のうちの１つ以上で）を含む他の修飾を有し得る。任意で、Ｗは、キヌレニンに酸化し得る。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、上記の表で特定される１つ以上の位置、提供される範囲で修飾されており、トリプシン酵素を用いた質量分析を使用して決定される。特定の実施形態では、１つ以上の位置、又はＮに続くグリシンは、本明細書に記載されるように修飾されている。残基番号は、本明細書に提供されるＡＡＶｒｈ９１配列に基づく。配列番号２を参照されたい。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６でのアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１に提供される。他の実施形態では、配列番号１と７０％～９９．９％同一又は配列番号１と１００％同一の核酸配列を選択して、ＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質を発現するように選択することができる。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号１と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％、又は１００％同一である。しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶカプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２をコードする配列番号１の核酸配列を有するか、又は配列番号１と少なくとも７０％～９９．９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一の配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする配列番号１の核酸配列、又は配列番号１の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２０８と、少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一の配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）配列番号１の核酸配列、又は配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８と、少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一の配列を有する。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３に提供される。他の実施形態では、配列番号３と７０％～９９．９％同一又は配列番号３と１００％同一の核酸配列を選択して、ＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質を発現するように選択することができる。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号３と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％～９９．９％同一、又は１００％同一である。しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶカプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２をコードする配列番号３の核酸配列を有するか、又は配列番号３と少なくとも７０％～９９．９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一の配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする配列番号３の核酸配列、又は配列番号３の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２０８と、少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一の配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする配列番号３の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８の核酸配列、又は配列番号３のｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８と少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、若しくは１００％同一の配列を有する。

本発明はまた、ＡＡＶｒｈ９１カプシド配列（配列番号２）、又は変異体ＡＡＶｒｈ９１をコードする核酸配列を包含し、１つ以上の残基は、本明細書で特定される脱アミド化又は他の修飾を低減させるために改変されている。かかる核酸配列は、変異体ＡＡＶｒｈ９１カプシドの産生において使用することができる。

特定の実施形態では、配列番号１の配列、又は本明細書に記載される修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を有する配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードする配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を有する核酸分子が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号３の配列、又は本明細書に記載される修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を有する配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を有する核酸分子が本明細書に提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号２に再現される。特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸配列を有するプラスミドが提供される。かかるプラスミドとしては、ＡＡＶｒｈ９１（配列番号１）のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３のうちの少なくとも１つをコードする核酸配列、又は配列番号１のｖｐ１、ｖｐ２、及び／若しくはｖｐ３配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を共有する配列が挙げられる。更なる実施形態では、プラスミドは、非ＡＡＶ配列を含む。特定の実施形態では、プラスミドは、ＷＰＲＥ及び／又はｂＧＨポリＡシグナルを含む。本明細書に記載のプラスミドを含む培養宿主細胞も提供される。

また、例えば、カプシド機能／標的細胞への遺伝子送達を改善し、かつ／又は収率を増加させることによってＡＡＶベクターの製造を改善するために、１つ又はアミノ酸置換を導入することによって修飾されたＡＡＶカプシドタンパク質も、本明細書に提供される。
記載のように、カプシドａ間の違いは、ベクターパッケージングの違いをもたらし得る。例えば、ＡＡＶｒｈ９１ベクターは、ＶＰ１タンパク質配列において１．１％の違いしかないにもかかわらず、ベクター収率に基づいて、ＡＡＶ６．２ベースのベクターよりも有意に高いレベルで導入遺伝子をパッケージングすることが見出された。ＡＡＶｒｈ９１はまた、導入遺伝子をＡＡＶ１よりも高いレベルでパッケージングする。

記載のように、カプシド構造の比較は、ＡＡＶｒｈ９１とＡＡＶ１カプシドとの間で異なる残基の位置の特定につながっている。それらの残基のうち６つは、ＡＡＶｒｈ９１ｖｐ３タンパク質において、Ａｓｐ４１８、Ａｓｎ５４７、Ｌｅｕ５８４、Ａｓｎ５８８、Ｖａｌ５９８、及びＨｉｓ６４２に位置する。ＡＡＶベクター（他のクレードＡベクターを含む）を、ＡＡＶｒｈ９１カプシドで同定されたものと比較して、これらのアミノ酸置換又は保存的アミノ酸置換を含むように改変することにより、向性の変化及び収率の向上を含む、改善された特性を有する新規のカプシドをもたらすことができる。したがって、特定の実施形態では、位置４１８のＡｓｐ、位置５４７のＡｓｎ、位置５８４のＬｅｕ、位置５８８のＡｓｎ、位置５９８のＶａｌ、及び位置６４２のＨｉｓから選択される１つ以上のアミノ置換を含むように改変されたカプシドタンパク質を有するＡＡＶが本明細書に提供される。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ベクターの製造収率を増加させるために、位置５８４に（例えば、Ｌｅｕ由来の）Ｌｅｕを含むように修飾される。特定の実施形態では、位置５９８のＡｌａ又はＶａｌ置換は、ベクターの製造収率を改善する。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、位置４１８、５４７、５８４、５８８、５９８、及び６４２から選択される１つ以上の残基にアミノ酸置換を含むように修飾される。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換、すなわち、ＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質のアミノ酸残基を、ＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質の位置４１８、５４７、５８４、５８８、５９８、及び／又は６４２で観察された置換と同様の特性を有すると予想される別の残基で置換することであり得る。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、位置５８４にＬｅｕ及び位置５４７にＡｓｎを含むように修飾される。位置の番号付けは、カプシドタンパク質配列を、ＡＡＶｒｈ９１のアミノ酸配列（配列番号２）又はＡＡＶ１のアミノ酸配列（配列番号８）と整列させることによって決定することができる。特定の実施形態では、修飾されるカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質である。更なる実施形態では、修飾されるカプシドタンパク質は、配列番号８と少なくとも９５％同一又は少なくとも９９％同一の配列を有する。他の実施形態では、修飾されるカプシドは、クレードＡのＡＡＶカプシドタンパク質である。更なる実施形態では、修飾されるカプシドタンパク質は、ＡＡＶｈｕ４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ４８、ＡＡＶｈｕ４４、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ．ＶＲ－１９５、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ６．２カプシドタンパク質である。

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置き換え」又は「保存的アミノ酸置換」は、当業者によって知られている、類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、及びサイズ）を有する異なるアミノ酸へのアミノ酸の変更、置き換え、又は置換を指す。また、例えば、ＦＲＥＮＣＨｅｔａｌ．Ｗｈａｔｉｓａｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ？ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｈ１９８３，Ｖｏｌｕｍｅ１９，Ｉｓｓｕｅ２，ｐｐ１７１－１７５、及びＹＡＭＰＯＬＳＫＹｅｔａｌ．ＴｈｅＥｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００５Ａｕｇ；１７０（４）：１４５９－１４７２を参照されたい（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、核酸、又はその断片を参照する場合、別の核酸（又はその相補的鎖）と適切なヌクレオチド挿入又は欠失によって最適にアラインメントされるとき、アラインメントされる配列の少なくとも約９５～９９％のヌ
クレオチド配列同一性を有することを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、又はそのオープンリーディングフレーム、又は少なくとも１５ヌクレオチド長である別の適切な断片にわたる相同性である。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。

核酸配列の文脈において、「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、又は「同一パーセント」という用語は、対応のために整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、又は、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたってもよく、これが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。

同一性パーセントは、タンパク質の全長ポリペプチド、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、もしくはそのペプチド断片にわたるアミノ酸配列、又は配列をコードする対応する核酸配列について容易に決定することができる。好適なアミノ酸フラグメントは、長さが少なくとも約８個のアミノ酸であり得、最大で約７００個であり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、又は「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、又は「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「アラインメントされた」配列又は「アラインメント」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損又は追加塩基又はアミノ酸についての補正を含む。

同一性は、配列の整列を作成することによって、及び当該技術分野で既知の、又は市販されている様々なアルゴリズム及び／もしくはコンピュータプログラムを使用することによって［例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ、ＣｌｕｓｔａｌＯ、ＦＡＳＴＡ、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して］、決定することができる。アラインメントは、公的又は商業的に利用可能な様々な多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。アミノ酸配列の場合、配列整列プログラム、例えば、「ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムが利用可能である。一般的に、これらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変更し得る。あるいは、当業者は、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性又はアラインメントを提供する、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

多重配列整列プログラムはまた、核酸配列についても利用可能である。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ」、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」、「ＣＡＰＳｅｑｕｅｎｃｅＡｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会及び検索配列の間の最良の重複領域のアラインメント及び配列同一性パ
ーセントを提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に援用される）に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）とともに使用して決定することができる。

Ｂ．ｒＡＡＶベクター及び組成物
別の態様では、異種遺伝子又は他の核酸配列の標的細胞への送達に有用なウイルスベクターを産生するために、本明細書に記載のＡＡＶカプシド配列（その断片を含む）を利用する分子が、本明細書に提供される。一実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に有用なベクターは、少なくとも、本明細書に記載されるＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶｒｈ９１カプシド）、又はその断片をコードする配列を含む。別の実施形態では、有用なベクターは、少なくとも、選択されたＡＡＶ血清型のｒｅｐタンパク質、又はその断片をコードする配列を含む。任意選択的に、かかるベクターは、ＡＡＶｃａｐタンパク質及びｒｅｐタンパク質の両方を含み得る。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐの両方が提供されるベクターでは、ＡＡＶのｒｅｐ配列及びＡＡＶのｃａｐ配列は、いずれも起源が１つの血清型（例えば、すべてＡＡＶｒｈ９１起源）であり得る。あるいは、ｒｅｐ配列が、ｃａｐ配列を提供する野生型ＡＡＶとは異なるＡＡＶ由来であるベクターを使用してもよい。一実施形態では、ｒｅｐ配列及びｃａｐ配列は、別個の供給源（例えば、別個のベクター、又は宿主細胞及びベクター）から発現される。別の実施形態では、これらのｒｅｐ配列を、異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列とインフレームで融合して、米国特許第７，２８２，１９９号（参照により本明細書に援用される）に記載されているＡＡＶ２／８などのキメラＡＡＶベクターを形成する。任意選択的に、ベクターは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ及びＡＡＶ３’ＩＴＲに隣接する選択された導入遺伝子を含むミニ遺伝子を更に含む。別の実施形態では、ＡＡＶは、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃ－ＡＡＶ）である。ＵＳ２０１２／０１４１４２２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。自己相補的ベクターは、ＤＮＡ合成又は複数のベクターゲノム間の塩基対合を必要とせずに、ｄｓＤＮＡに折り畳むことができる逆位反復ゲノムをパッケージングする。ｓｃＡＡＶは、発現前に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換する必要がないため、それらはより効率的なベクターである。しかしながら、この効率のトレードオフは、ベクターのコード容量が半分失われることから、ＳｃＡＡＶは、小さなタンパク質のコード遺伝子（最大約５５ｋｄ）に対して有用であり、現在ＲＮＡベースの療法に利用可能である。

１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。例示的な目的で、本明細書に記載されるＡＡＶｒｈ９１カプシドを利用するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲとともに、以下に記載の実施例で使用される。上で引用されたＭｕｓｓｏｌｉｎｏｅｔａｌ．を参照されたい。別途指定されない限り、ＡＡＶＩＴＲ、及び本明細書に記載の他の選択されたＡＡＶ成分は、任意のＡＡＶ血清型の中から個別に選択され得、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又は他の既知もしくは未知のＡＡＶ血清型を含む。望ましい一実施形態では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲが使用される。しかし、他の適切な血清型からのＩＴＲが選択されてもよい。これらのＩＴＲ又は他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶ血清型から容易に単離され得る。このようなＡＡＶは、学術的、商業的、又は公的資源（例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離又は入手することができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献又はデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどで利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成又は他の好適な手段を通して入手され得る。

本明細書に記載のｒＡＡＶはまた、ベクターゲノムを含む。ベクターゲノムは、少なく
とも、以下に記載される非ＡＡＶ又は異種の核酸配列（導入遺伝子）、及びその調節配列、ならびに５’及び３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）から構成される。カプシドタンパク質にパッケージングされ、選択された標的細胞に送達されるものが、このミニ遺伝子である。

導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、又は他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列に対して異種の核酸配列である。核酸コード配列は、標的細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で、調節成分に作動可能に連結される。異種核酸配列（導入遺伝子）は、任意の生物に由来し得る。ＡＡＶは、１つ以上の導入遺伝子を含み得る。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ９１ベクターが本明細書に提供され、エリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌ又はネコのＥＰＯ遺伝子をコードする。かかる組換えベクターは、例えば、循環赤血球の量の減少を特徴とする対象における慢性腎疾患及び他の状態を治療するためのレジメンでの使用に好適である。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ９１ベクターが本明細書に提供され、抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体をコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌ又はネコの抗ＮＧＦ抗体をコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象における変形性関節症疼痛を治療するためのレジメンで使用するのに好適である。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ９１ベクターが本明細書で提供され、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）をコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌ又はネコのＧＬＰ－１をコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象におけるＩＩ型糖尿病を治療するためのレジメンで使用するのに好適である。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ９１ベクターが本明細書に提供され、インスリンをコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌ又はネコのインスリンをコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象におけるＩ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病を治療するためのレジメンで使用するのに好適である。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ９１ベクターが本明細書に提供され、ＣＬＮ（セロイドリポフスチン症、神経性）遺伝子を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１－ＰＰＴ１（ＣＬＮ１）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、トリペプチジルペプチダーゼ１－ＴＰＰ１（ＣＬＮ２）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＬＮ３（ＣＬＮ３）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＤＮＡＪＣ５（ＣＬＮ４）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＬＮ５（ＣＬＮ５）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＬＮ６（ＣＬＮ６）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＭＦＳＤ８（ＣＬＮ７）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＬＮ８（ＣＬＮ８）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＴＳＤ（ＣＬＮ１０）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＧＲＮ（ＣＬＮ１１）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＡＴＰ１３Ａ２（ＣＬＮ１２）をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＡＴＰ１３Ａ２（ＣＬＮ１３）をコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象におけるバッテン病又は神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）を治療するためのレジメンでの使用に好適である。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ９１ベクターが本明細書に提供され、ＰＴＥＮ誘導
キナーゼ１をコードする配列、ＰＩＮＫ１遺伝子によってコードされるミトコンドリアセリン／トレオニンプロテインキナーゼを含む導入遺伝子を含む。かかる組換えベクターは、例えば、若年発症パーキンソン病を治療するためのレジメンでの使用に好適である。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ９１ベクターが本明細書に提供され、例えば、抗体及び受容体－ＩｇＧ融合タンパク質を含む、ＩｇＥ、ＩＬ－３２、又はＩＬ－４／ＩＬ－１３受容体のインターロイキン－４受容体α（ＩＬ－４Ｒα）サブユニットのアンタゴニストをコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌ又はネコのＩｇＥ、ＩＬ－３２、又はＩＬ－４Ｒαサブユニットのアンタゴニストをコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象におけるアトピー性皮膚炎を治療するためのレジメンで使用するのに好適である。

導入遺伝子配列の組成は、得られたベクターが用いられる使用に依存する。例えば、あるタイプの導入遺伝子配列は、発現時に検出可能なシグナルを生成するレポーター配列を含む。かかるレポーター配列には、限定されないが、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合タンパク質（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む）、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、及び当該技術分野で周知の他のもの（それらを対象とする高親和性抗体が存在するか、又は従来の手段によって産生され得るもの）、ならびに融合タンパク質（中でも、ヘマグルチニン又はＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含む）をコードするＤＮＡ配列が含まれる。

これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントに関連する場合、酵素、放射線、比色、蛍光又は他の分光学的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならびに免疫学的アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学を含む）を含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを有するベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼである場合、シグナルを有するベクターは、ルミノメーターで色又は光生成によって視覚的に測定することができる。

しかしながら、導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブ変異体、又は触媒ＲＮＡなどの、生物学及び医学において有用な産物をコードする非マーカー配列であることが望ましい。望ましいＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置される動物において標的の核酸配列の発現を阻害又は失わせる配列である。典型的には、好適な標的配列には、腫瘍標的及びウイルス性疾患が含まれる。そのような標的の例については、免疫原に関連するセクションで後述する腫瘍標的及びウイルスを参照されたい。

導入遺伝子は、遺伝子欠損を修正又は改善するために使用され得る。遺伝子欠損は、正常な遺伝子が正常レベルよりも低く発現する欠損、又は機能的な遺伝子産物が発現しない欠損を含み得る。代替的に、導入遺伝子は、細胞型又は宿主で天然に発現されない生成物を細胞に提供し得る。好ましいタイプの導入遺伝子配列は、宿主細胞で発現される治療用タンパク質又はポリペプチドをコードする。本発明は、複数の導入遺伝子を使用することを更に含む。ある状況では、異なる導入遺伝子は、タンパク質の各サブユニットをコードするために、又は異なるペプチドもしくはタンパク質をコードするために使用することができる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい場合（例
えば、免疫グロブリン、血小板由来成長因子、又はジストロフィンタンパク質）に望ましい。細胞がマルチサブユニットタンパク質を生成するために、異なるサブユニットの各々を含む組換えウイルスを細胞に感染させる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子によってコードされていてもよい。この場合、単一の導入遺伝子は、各サブユニットのＤＮＡが内部リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離された、各サブユニットをコードするＤＮＡを含む。これは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡのサイズが小さい場合（例えば、サブユニットをコードするＤＮＡ及びＩＲＥＳの総サイズが５キロベース未満）に望ましい。ＩＲＥＳの代替として、翻訳後事象において自己切断する２Ａペプチドをコードする配列によってＤＮＡが分離されていてもよい。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ１）：１３－２１（Ｊａｎ１９９７）、Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔａｌ，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，８（１１）：８６４－８７３（Ｊｕｎｅ２００１）、ＫｌｕｍｐＨ．，ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，８（１０）：８１１－８１７（Ｍａｙ２００１）を参照されたい。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも著しく小さく、スペースが制限因子である場合の使用に非常に好適である。より多くの場合、導入遺伝子が大きい場合、マルチサブユニットからなる場合、又は２つの導入遺伝子が同時送達される場合、所望の導入遺伝子又はサブユニットを有するｒＡＡＶを同時投与することで、インビボでそれらをコンカテマー化して、単一のベクターゲノムを形成することが可能になる。そのような実施形態では、宿主細胞での同時発現のために、第１のＡＡＶは、単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを有し得、第２のＡＡＶは、異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを有し得る。しかし、選択される導入遺伝子は、任意の生物学的に活性な産物又は他の産物（例えば、研究に望ましい産物）をコードすることができる。

好適な導入遺伝子又は遺伝子産物の例としては、家族性高コレステロール血症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、及び希少疾患又はみなしご病（ｏｒｐｈａｎｄｉｓｅａｓｅ）に関連するものが含まれ得る。そのような希少疾患の例としては、なかでも、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンティンドン病、レット症候群（例えば、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５１６０８）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（例えば、フラタキシン）、２型脊髄小脳失調症（ＳＣＡ２）／ＡＬＳに関連するＡＴＸＮ２、ＡＬＳに関連するＴＤＰ－４３、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）（非アルツハイマー型脳変性に関連する）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語症（ＰＮＦＡ）及び意味性認知症）、ＣＤＫＬ５欠損症、アンジェルマン症候群、Ｎ－グリカナーゼ１欠損症、アルツハイマー病、脆弱Ｘ症候群、ニーマン・ピック病（Ａ型及びＢ型（ＡＳＭＤ又は酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症）、及びＣ型（ＮＰＣ）を含む）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ウォルマン病、テイ・サックス病が挙げられる。例えば、ｗｗｗ．ｏｒｐｈａ．ｎｅｔ／ｃｏｎｓｏｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／Ｄｉｓｅａｓｅ＿Ｓｅａｒｃｈ＿Ｌｉｓｔ．ｐｈｐ；ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓを参照されたい。

導入遺伝子によってコードされる有用な治療用産物には、ホルモン並びに増殖因子及び分化因子が含まれ、限定されないが、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、形質転換増殖因子βスーパーファミリーのうちのいずれか１つ（ＴＧＦβ、
アクチビン、インヒビン）、又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１－１５のうちのいずれか、成長因子のヘレグルイン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（ＮＴ－３及びＮＴ－４／５）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ又はＬＡＬ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのうちのいずれか１つ、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、チロシンヒドロキシラーゼが挙げられる。他の有用な導入遺伝子は、ムコ多糖症（ＭＰＳ）を引き起こすリソソーム酵素をコードし、α－Ｌ－イズロニダーゼ（ＭＰＳＩ）、イズロン酸スルファターゼ（ＭＰＳＩＩ）、ヘパランＮ－スルファターゼ（スルファミニダーゼ）（ＭＰＳＩＩＩＡ、サンフィリッポＡ）、α－Ｎ－アセチル－グルコサミニダーゼ（ＭＰＳＩＩＩＢ、サンフィリッポＢ）、アセチル－ＣｏＡ：α－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳＩＩＩＣ、サンフィリッポＣ）、Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ（ＭＰＳＩＩＩＤ、サンフィリッポＤ）、ガラクトース６－スルファターゼ（ＭＰＳＡ、モルキオ）、β－ガルコシダーゼ（ＭＰＳＩＶＡ、モルキオＡ）、β－ガラクトシダーゼ（ＭＰＳＩＶＢ、モルキオＢ）、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン４－スルファターゼ（ＭＰＳＶＩ、マロトー・ラミー）、β－グルクロニダーゼ（ＭＰＳＶＩＩ、スライ）、及びヒアルロニダーゼ（ＭＰＳＩＸ）が含まれる。

他の有用な導入遺伝子産物としては、免疫系を制御するタンパク質が含まれ、限定されないが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ－１～ＩＬ－２５（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１８）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドなどのサイトカイン及びリンホカインが挙げられる。免疫系によって産生される遺伝子産物も本発明において有用である。これらには、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩＭＨＣ分子、ならびに操作された免疫グロブリン及びＭＨＣ分子が含まれるがこれらに限定されない。有用な遺伝子産物としては、補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２、及びＣＤ５９などの補体調節タンパク質も含まれる。

更に他の有用な遺伝子産物としては、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、制御性タンパク質、及び免疫系タンパク質の受容体のうちのいずれか１つが含まれる。本発明は、コレステロール調節のための受容体を包含し、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体、及びスカベンジャー受容体を含む。本発明はまた、糖質コルチコイド受容体及びエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体及び他の核受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーなどの遺伝子産物を包含する。加えて、有用な遺伝子産物としては、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びミオゲニンなどの転写因子、タンパク質を含むＥＴＳボックス、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えば、ＧＡＴＡ－３、並びに翼状螺旋タンパク質のフォークヘッドファミリーが含まれる。

他の有用な遺伝子産物としては、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカ
ルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンβシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、β－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィン配列、又はそれらの機能的断片が挙げられる。更に他の有用な遺伝子産物は、酵素補充療法に有用であり得るような酵素を含み、これは酵素の不十分な活性に起因する様々な状態において有用である。例えば、マンノース－６－リン酸を含む酵素は、リソソーム蓄積症の療法に利用され得る（例えば、好適な遺伝子は、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードする遺伝子を含む）。別の例では、遺伝子産物は、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）である。更に有用な遺伝子産物としては、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼファミリー１メンバーＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）が挙げられる。

他の有用な遺伝子産物としては、挿入、欠失、又はアミノ酸置換を含む非天然アミノ酸配列を有するキメラ又はハイブリッドポリペプチドなどの非天然ポリペプチドが含まれる。例えば、一本鎖操作された免疫グロブリンは、特定の免疫不全患者において有用であり得る。他の種類の非天然遺伝子配列としては、アンチセンス分子及びリボザイムなどの触媒核酸が含まれ、標的の過剰発現を低減するために使用され得る。

遺伝子の発現の低減及び／又は調節は、癌及び乾癬と同様に、過増殖細胞を特徴とする過増殖状態の治療に特に望ましい。標的ポリペプチドとしては、正常細胞と比較して、過剰増殖細胞において排他的又はより高いレベルで産生されるポリペプチドが含まれる。標的抗原としては、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎなどの癌遺伝子、ならびに転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ、及びＥＧＲＦによってコードされるポリペプチドが含まれる。標的抗原としての癌遺伝子産物に加えて、抗癌治療及び保護レジメンのための標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫によって作製された抗体の可変領域及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を含み、いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の標的抗原としても使用される。他の腫瘍関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体１７－１Ａ及び葉酸結合ポリペプチドによって認識されるポリペプチドを含む腫瘍細胞中でより高いレベルで見出されるポリペプチドなどの標的ポリペプチドとして使用することができる。

他の好適な治療用ポリペプチド及びタンパク質としては、細胞の受容体及び「自己」指向性の抗体を産生する細胞を含む自己免疫に関連する標的に対して広範な防御免疫応答を付与することにより、自己免疫性の疾患及び障害に罹患している個体を治療するために有用であり得るものが含まれる。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病、及び潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの疾患の各々は、内因性抗原と結合し、自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。

更に他の有用な遺伝子産物としては、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を含む）及び血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子及びそのバリアント、例えばヘテロ二量体及びＢ－欠失ドメインの軽鎖ならびに重鎖を含む；米国特許第６，２００，５６０号及び米国特許第６，２２１，３４９号）を含む血友病の治療に使用されるものが含まれる。いくつかの実施形態では、ミニ遺伝
子は、１０個のアミノ酸シグナル配列をコードする第ＶＩＩＩ因子重鎖の最初の５７塩基対、ならびにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列を含む。代替的な実施形態では、ミニ遺伝子は、Ａ１及びＡ２ドメイン、ならびにＢドメインのＮ末端からの５個のアミノ酸、かつ／又はＢドメインのＣ末端の８５個のアミノ酸、ならびにＡ３、Ｃ１、及びＣ２ドメインを更に含む。更に他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、Ｂドメインの１４個のアミノ酸をコードする４２個の核酸によって分離される単一ミニ遺伝子内に提供される［米国特許第６，２００，５６０号］。

ｒＡＡＶを介して送達され得る更なる例示的な遺伝子にとしては、限定されないが、糖原病又は１Ａ型欠乏症（ＧＳＤ１）に関連するグルコース－６－ホスファターゼ、ＰＥＰＣＫ欠乏症に関連するホスホエノールピルビン酸－カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、発作及び重度神経発達障害に関連するセリン／トレオニンキナーゼ９（ＳＴＫ９）としても知られるサイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、（ＮＧＬＹ１）Ｎ－グリカナーゼ１、ガラクトース血症に関連するガラクトース－１リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に関連するフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＧＯ／ＨＡＯ１）及びＡＧＸＴを含む原発性高シュウ酸尿症１型に関連する遺伝子産物、メープルシロップ尿症に関連する分枝鎖α－ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ、ＢＣＫＤＨ－Ｅ２、ＢＡＫＤＨ－Ｅ１ａ、及びＢＡＫＤＨ－Ｅ１ｂを含む）、チロシン血症１型に関連するフマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、メチルマロン酸血症に関連するメチルマロニルＣｏＡムターゼ、中鎖アセチルＣｏＡ欠乏症に関連する中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連するオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、シトルリン血症に関連するアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、レシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）欠損症、アメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、ニーマン・ピック病（Ｃ１型）に関連するＮＰＣ１、プロピオンアカデミア（ＰＡ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連遺伝性アミロイドーシスに関連するＴＴＲ、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関連する低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質、ＷＯ２０１５／１６４７７８に記載のＬＤＬＲバリアント、ＰＣＳＫ９、認知症に関連するＡｐｏＥ及びＡｐｏＣタンパク質、クリグラー・ナジャー病に関連するＵＤＰ－グルコウロシルトランスフェラーゼ、重症複合免疫不全症に関連するアデノシンデアミナーゼ、痛風及びレッシュ・ナイアン症候群に関連するヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチミダーゼ欠損症に関連するビオチミダーゼ、ファブリー病に関連するα－ガラクトシダーゼＡ（ａ－ＧａｌＡ））、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連するβ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、ウィルソン病に関連するＡＴＰ７Ｂ、ゴーシェ病２型及び３型に関連するβ－グルコセレブロシダーゼ、ツェルウェーガー症候群に関連するペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ、異染性白質ジストロフィーに関連するアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、クラッベ病に関連するガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）酵素、ポンペ病に関連するα－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ニーマン・ピック病Ａ型に関連するスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）遺伝子、成人発症ＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ２）に関連するアルギニノコハク酸シンターゼ、尿素サイクル障害に関連するカルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、脊髄性筋萎縮症に関連する生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質、ファーバー脂肪肉芽腫症に関連するセラミダーゼ、ＧＭ２ガングリオシドーシス及びテイ・サックス病及びサンドホフ病に関連するβ－ヘキソサミニダーゼ、アスパルチル－グルコサミン尿症に関連するアスパルチルグルコサミニダーゼ、フコシドーシスに関連するα－フコシダーゼ、α－マンノシドーシスに関連するα－マンノシダーゼ、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）に関連するポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、α－１アンチトリプシン欠損症（気腫）の治療のためのα－１アンチトリプシン、サラセミア又は腎不全による貧血の治療のためのエリスロポエチン、虚血性疾患の治療のための血管内皮増殖因子、アンジオポエチン－１、及び線維芽細胞増殖因子、例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、又は塞栓症に見られる閉塞した血管の治療のための
トロンボモジュリン及び組織因子の経路の阻害剤、パーキンソン病の治療のための芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、うっ血性心不全の治療のためのβアドレナリン受容体、アンチセンス又はその変異体、ホスホランバン、筋小胞体（小胞体）アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）、及び心臓アデニル酸シクラーゼ、様々ながんの治療のためのｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子、炎症性障害及び免疫障害及びがんの治療のための様々なインターロイキンのうちの１つのようなサイトカイン、筋ジストロフィーの治療のためのジストロフィン又はミニジストロフィン及びユートロフィン又はミニユートロフィン、並びに糖尿病の治療のためのインスリン又はＧＬＰ－１が挙げられる。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、遺伝子編集システムで使用され得、システムは、１つのｒＡＡＶ又は複数のｒＡＡＶ系統の共投与を伴い得る。例えば、ｒＡＡＶは、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＡＲＣＵＳ、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても知られる）、ＣｊＣａｓ９、及び他の好適な遺伝子編集構築物を送達するように操作され得る。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶベースの遺伝子編集ヌクレアーゼシステムが本明細書に提供される。遺伝子編集ヌクレアーゼは、疾患関連遺伝子（すなわち、目的の遺伝子）内の部位を標的とする。

特定の実施形態では、ＡＡＶベースの遺伝子編集ヌクレアーゼシステムは、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、を含み、その中に封入されたベクターゲノムと、を含むｒＡＡＶを含み、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、発現カセットであって、目的の遺伝子における認識部位を認識及び切断する遺伝子編集ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、当該遺伝子編集ヌクレアーゼのコーディング配列が、目的の遺伝子を含む細胞でその発現を指示する発現制御配列に作動可能に連結されている、発現カセットと、ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含む。また、ｒＡＡＶベースの遺伝子編集ヌクレアーゼシステムを使用した治療方法も本明細書に提供される。

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベースの遺伝子編集メガヌクレアーゼシステムは、疾患、障害、症候群、及び／又は状態を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子編集ヌクレアーゼは、目的の遺伝子を標的とし、目的の遺伝子が、疾患、障害、症候群、及び／又は状態に関連及び／又は関与する１つ以上の遺伝子変異、欠失、挿入、及び／又は欠陥を有する。いくつかの実施形態では、障害は、これらに限定されないが、心血管障害、肝障害、内分泌障害若しくは代謝障害、筋骨格障害、神経障害、及び／又は腎障害から選択される。

代替的に、又は追加的に、本発明のベクターは、本発明のＡＡＶ配列及び選択された免疫原に対する免疫応答を誘導するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする導入遺伝子を含み得る。例えば、免疫原が、様々なウイルスファミリーから選択され得る。免疫応答が望まれる望ましいウイルスファミリーの例としては、ピコルナウイルスファミリーが挙げられ、感冒の症例の約５０％を担うライノウイルス属、ポリポリオウイルスオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、及びＡ型肝炎ウイルスなどのヒトエンテロウイルスを含むエンテロウイルス属、ならびに主に非ヒト動物における口蹄疫を担うアプトウイルス属が含まれる。ウイルスのピコルナウイルスファミリー内で、標的抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びＶＰＧを含む。別のウイルスファミリーとしては、カルシウイルスファミリーが挙げられ、流行性胃腸炎の重要な原因病原体であるノーウォークウイルス群を包含する。ヒト及び非ヒト動物における免疫応答を誘導するための標的化抗原で使用するための望ましい更に別のウイルスファミリーは、トガウイルスファミリーであり、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、及びベネズエラ、東部、及び西部ウマ脳炎ウイルス、ならびに風疹ウイルスを含むルビウイルスを含むアルファウイ
ルス属を含む。フラビウイルス科には、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎及びダニ媒介性脳炎ウイルスが含まれる。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス又はコロナウイルスのファミリーから生成され得、それらは、伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）、及びヒト呼吸器コロナウイルスなどのいくつかの非ヒトウイルスを含み、これらは、感冒及び／又は非Ａ型、Ｂ型、又はＣ型肝炎を引き起こし得る。コロナウイルスファミリー内の標的抗原としては、Ｅ１（Ｍ又はマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓ又はスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥ又はヘマグルチン－エルテロースとも呼ばれる）糖タンパク質（すべてのコロナウイルスに存在しない）、又はＮ（ヌクレオカプシド）が挙げられる。更に他の抗原は、ラブドウイルスファミリーを標的にしてもよく、これには、ベシクロウイルス属（例えば、小胞性口内炎ウイルス）、及び一般的なリッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）が含まれる。ラブドウイルスファミリー内で、好適な抗原は、Ｇタンパク質又はＮタンパク質に由来し得る。フィロウイルス科には、マールブルグウイルス及びエボラウイルスなどの出血熱ウイルスが含まれ、抗原の好適な供給源であり得る。パラミキソウイルスファミリーには、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫ウイルス、麻疹ウイルス、及びイヌジステンパーを含むモルビリウイルス、ならびに呼吸器合胞体ウイルスを含むニューモウイルスが含まれる。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルスファミリー内に分類され、抗原（例えば、ＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）の好適な供給源である。ブニヤウイルスファミリーには、ブニャウイルスブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス属（リフトバレー熱）、ハンタウイルス属（ピュレマラはヘマハギン熱ウイルス）、ナイロウイルス属（ナイロビヒツジ病）、及び様々な未分類のブンガウイルスが含まれる。アレナウイルスファミリーは、ＬＣＭ及びラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルスファミリーには、レオウイルス属、ロタウイルス属（小児に急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルス、及びカルチウイルス（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）が含まれる。

レトロウイルスファミリーには、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、及びスプマウイルスを含む）などのヒト疾患及び獣医疾患を包含するオンコリウイルス亜科が含まれる。ＨＩＶとＳＩＶとの間には、多くの好適な抗原が記載されており、容易に選択することができる。好適なＨＩＶ及びＳＩＶの抗原の例としては、限定されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、及びＲｅｖのタンパク質、ならびにそれらの様々な断片が挙げられる。加えて、これらの抗原に対する様々な修飾が記載されている。この目的のための好適な抗原は、当業者に既知である。例えば、他のタンパク質のうち、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ及びＶｐｒ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、ならびにＲｅｖをコードする配列を選択してもよい。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号に記載されている修飾ｇａｇタンパク質を参照されたい。また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈｅｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２－２４６７（Ｍａｒｃｈ２００１），ａｎｄＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９－７４（６Ａｐｒｉｌ２００１）に記載されているＨＩＶ及びＳＩＶタンパク質も参照されたい。これらのタンパク質又はそのサブユニットは、単独で、又は別個のベクターを介してもしくは単一のベクターからの組み合わせで送達され得る。

パポバウイルスファミリーには、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵ及びＪＣＵウイルス）ならびにパピローマウイルス亜科（癌又はパピローマの悪性進行に関連する）が含まれ
る。アデノウイルスファミリーには、呼吸器疾患及び／又は腸炎を引き起こすウイルス（例えば、ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）が含まれる。パルボウイルスファミリーには、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコパンロイコペニアウイルス、イヌパルボウイルス、及びブタパルボウイルスが含まれる。ヘルペスウイルスファミリーには、シンプレックスウイルス属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセロウイルス属（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）を含むアルファヘルペスウイルス亜科、及びサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を含むベータヘルペスウイルス亜科、ならびにリンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルス、及びラジノウイルスを含むガンマヘルペスウイルス亜科が含まれる。ポックスウイルスファミリーには、オルソポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）及びワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス、トリポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルスを包含するコードポックスウイルス亜科、及びエントモポックスウイルス亜科が含まれる。ヘパドナウイルスファミリーには、Ｂ型肝炎ウイルスが含まれる。抗原の好適な供給源であり得る１つの非分類ウイルスは、デルタ型肝炎ウイルスである。更に他のウイルス源には、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス及びブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスが含まれる。アルファウイルスファミリーには、ウマ動脈炎ウイルス及び様々な脳炎ウイルスが含まれる。

本発明はまた、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する細菌、真菌、寄生微生物、もしくは多細胞性寄生虫を含む他の病原体に対して、又は癌細胞もしくは腫瘍細胞から、ヒト又は非ヒト動物を免疫化するのに有用な免疫原を包含し得る。細菌病原体の例には、病原性グラム陽性球菌、肺炎球菌、ブドウ球菌、及び連鎖球菌が含まれる。病原性グラム陰性球菌には、髄膜炎菌、淋菌が含まれる。病原性腸内グラム陰性桿菌には、腸内細菌科（シュードモナス、アシネトバクテリア、及びエイケネラを含む）、類鼻疽、サルモネラ、シゲラ、ヘモフィルス、モラクセラ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ（軟性下疳を引き起こす）、ブルセラ、Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病を引き起こす）、エルシニア（パスツレラ属）、ストレプトバチルス、モニリフォルミス、及びスピリラムが含まれる。グラム陽性桿菌には、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリア）、コレラ、炭疽菌（炭疽病）、ドノヴァン症（鼠径肉芽腫）、及びバルトネラ症が含まれる。病原性嫌気性細菌によって引き起こされる疾患としては、破傷風、ボツリヌス症、他のクロストリジウム、結核、ハンセン病、及び他のマイコバクテリアが挙げられる。病原性スピロヘータ疾患には、梅毒、トレポネーマ症（いちご腫、ピンタ、及び地方病性梅毒）、及びレプトスピラ症が含まれる。高病原性細菌及び病原性真菌によって引き起こされる他の感染症としては、放線菌症、ノーカルジオーシス、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症、及びコクチジオイデス症、カンジダ症、アスペルギルス症、及びムコール症、スポロトリクム症、パラコクシジオイデス症、ペトリエリジア症、トルロプシス症、マイセトーマ、及びクロモミセス症、ならびに皮膚糸状菌症が挙げられる。リケッチア感染症には、チフス熱、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱、及びリケッチア痘が含まれる。クラミジア属マイコプラズマ及びクラミジア感染症の例としては、マイコプラズマ肺炎、性病性リンパ肉芽腫、オウム病、及び周産期クラミジア感染症が挙げられる。病原性真核生物は、病原性原虫及び蠕虫、ならびにそれによって生じる感染症を包含し、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ、トリチャン、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ、バベシオーシス、バベシア症、ジアルジア症、旋毛虫症、フィラリア症、住血吸虫症、線虫、吸虫又はフルーク、及び条虫（サナダムシ）感染症が挙げられる。

これらの生物及び／又はそれによって生成された毒素の多くは、疾患管理センター［（ＣＤＣ）、保健福祉省、米国］によって、生物攻撃で使用される可能性がある病原体とし
て特定されている。例えば、これらの生物学的薬剤病原体の一部には、以下が含まれる：Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽病）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ及びその毒素（ボツリヌス症）、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ（ペスト菌）、大痘瘡（天然痘）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、及びウイルス性出血熱は、現在、これらのすべてがカテゴリーＡ病原体に分類されており、Ｃｏｘｉｅｌｌａｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｑ熱）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ及びその毒素（リシン毒素）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ及びその毒素（イプシロン毒素）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌種及びその毒素（エンテロトキシンＢ）は、現在、これらのすべてがカテゴリーＢ病原体に分類されており、ならびに二パンウイルス及びハンタウイルスは、カテゴリーＣ病原体に分類されている。加えて、このように分類されるか、又は分類が異なる他の生物は、将来的にかかる目的のために特定及び／又は使用され得る。本明細書に記載のウイルスベクター及び他の構築物が、これらの生物、ウイルス、それらの毒素、又は他の副産物由来の抗原を送達するのに有用であり、これらの生物学的病原体による感染又は他の有害反応を予防及び／又は治療することが容易に理解されるであろう。

Ｔ細胞の可変領域に対して免疫原を送達するための本発明のベクターの投与は、それらのＴ細胞を排除するためのＣＴＬを含む免疫応答を誘発する。関節リウマチ（ＲＡ）では、疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいくつかの特定の可変領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲには、Ｖ－３、Ｖ－１４、Ｖ－１７及びＶα－１７が含まれる。したがって、これらのポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘発するであろう。多発性硬化症（ＭＳ）では、疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特定の可変領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲには、Ｖ－７及びＶα－１０が含まれる。したがって、これらのポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘発するであろう。強皮症では、疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特定の可変領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲには、Ｖ－６、Ｖ－８、Ｖ－１４、ならびにＶα－１６、Ｖα－３Ｃ、Ｖα－７、Ｖα－１４、Ｖα－１５、Ｖα－１６、Ｖα－２８、及びＶα－１２が含まれる。したがって、これらのポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする核酸分子の送達は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘発するであろう。

一実施形態では、導入遺伝子は、光遺伝学療法を提供するように選択される。光遺伝学療法では、人工光受容体は、残りの網膜回路における生存細胞型への光活性化チャネル又はポンプの遺伝子送達によって構築される。これは、かなりの量の光受容体機能を失ってはいるが、神経節細胞及び視神経への双極細胞の回路がそのまま残っている患者に特に有用である。一実施形態では、異種核酸配列（導入遺伝子）は、オプシンである。オプシン配列は、ヒト、藻類、及び細菌を含む任意の好適な単細胞生物又は多細胞生物に由来することができる。一実施形態では、オプシンは、ロドプシン、フォトプシン、Ｌ／Ｍ波長（赤／緑）－オプシン、又は短波長（Ｓ）オプシン（青）である。別の実施形態では、オプシンは、チャネルロドプシン又はハロロドプシンである。

別の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子増強療法で使用するため、すなわち、欠損している又は欠陥のある遺伝子の置換コピーを提供するために選択される。この実施形態では、導入遺伝子は、必要な置換遺伝子を提供するために、当業者によって容易に選択され得る。一実施形態では、欠損／欠陥遺伝子は、眼障害に関連する。別の実施形態では、導入遺伝子は、ＮＹＸ、ＧＲＭ６、ＴＲＰＭ１Ｌ、又はＧＰＲ１７９であり、眼障害は、先天性停止性夜盲症である。例えば、Ｚｅｉｔｚｅｔａｌ，ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ．２０１３Ｊａｎ１０；９２（１）：６７－７５．Ｅｐｕｂ２０１２Ｄｅｃ
１３を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。別の実施形態では、導入遺伝子は、ＲＰＧＲである。

別の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子抑制療法における使用のために選択され、すなわち、１つ以上の天然遺伝子の発現が、転写又は翻訳のレベルで、中断又は抑制される。これは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又は当該技術分野で既知の他の技術を使用して達成することができる。例えば、Ｓｕｎｅｔａｌ，ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ．２０１０Ｆｅｂ１；１２６（３）：７６４－７４、及びＯ’ＲｅｉｌｌｙＭ，ｅｔａｌ．ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ．２００７Ｊｕｌ；８１（１）：１２７－３５を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。この実施形態では、導入遺伝子は、サイレンシングされることが望まれる遺伝子に基づいて、当業者によって容易に選択され得る。

別の実施形態では、導入遺伝子は、２つ以上の導入遺伝子を含む。これは、２つ以上の異種配列を有する単一のベクターを使用して、又は各々が１つ以上の異種配列を有する２つ以上のＡＡＶを使用して達成され得る。一実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子抑制（又はノックダウン）併用療法及び遺伝子増強併用療法に使用される。ノックダウン／増強併用療法では、目的の遺伝子の欠陥コピーがサイレンシングされ、非変異コピーが供給される。一実施形態では、これは、２つ以上の同時投与ベクターを使用して達成される。Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ－Ｗａｒｄｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，Ａｐｒｉｌ２０１１，１９（４）：６４２－６４９を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。導入遺伝子は、所望の結果に基づいて、当業者によって容易に選択され得る。

別の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子修正療法での使用のために選択される。これは、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）誘導ＤＮＡ二本鎖切断を、外因性ＤＮＡドナー基質と併せて使用して達成され得る。例えば、Ｅｌｌｉｓｅｔａｌ，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ（ｅｐｕｂＪａｎｕａｒｙ２０１２）２０：３５－４２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。導入遺伝子は、所望の結果に基づいて、当業者によって容易に選択され得る。

一実施形態では、本明細書に記載のカプシドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓデュアルベクターシステムにおいて有用であり、米国仮特許出願第６１／１５３，４７０号、第６２／１８３，８２５号、第６２／２５４，２２５号、及び第６２／２８７，５１１号に記載されている（その各々は、参照により本明細書に援用される）。カプシドは、ホーミングエンドヌクレアーゼ又は他のメガヌクレアーゼの送達にも有用である。

別の実施形態では、本明細書で有用な導入遺伝子は、発現時に検出可能なシグナルを生成するレポーター配列を含む。かかるレポーター配列には、限定されないが、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合タンパク質（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、及び当該技術分野で既知の他のもの（それらを対象とする高親和性抗体が存在するか、又は従来の手段によって産生され得るもの）、ならびに融合タンパク質（中でも、ヘマグルチニン又はＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含む）をコードするＤＮＡ配列が含まれる。

これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントに関連する場合、酵素、放射線、比色、蛍光又は他の分光学的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならび
に免疫学的アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学を含む）を含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを有するベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼである場合、シグナルを有するベクターは、ルミノメーターで色又は光生成によって視覚的に測定することができる。

導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、又は触媒ＲＮＡなどの、生物学及び医学において有用な産物をコードすることが望ましい。望ましいＲＮＡ分子は、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置される動物において標的の核酸配列の発現を失わせる配列である。

調節配列は、ベクターでトランスフェクトされた、又は本明細書に記載されるように産生されたウイルスで感染された細胞でその転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で、導入遺伝子に作動可能に連結された従来の制御エレメントを含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで又は離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。

タンパク質又は核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質又は核酸が、天然における互いの関係と同じ関係で見出されない、２つ以上の配列又は下位配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、ある遺伝子由来のプロモーターを有し、異なる遺伝子由来のコード配列の発現を指令するように配置される。したがって、コード配列を参照すると、プロモーターは、異種性である。

発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、及びエンハンサーの配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）のシグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強させる配列、及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強させる配列を含み得る。プロモーターを含む多数の発現制御配列が当該分野で既知であり、利用することができる。

本明細書に提供される構築物に有用な調節配列はまた、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と遺伝子との間に位置するイントロンを含み得る。１つの所望のイントロン配列は、ＳＶ－４０に由来し、ＳＤ－ＳＡと称される１００ｂｐのミニイントロンスプライスドナー／スプライスアクセプターである。別の好適な配列としては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後エレメントが挙げられる。（例えば、ＷａｎｇａｎｄＩ．Ｖｅｒｍａ，１９９９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：３９０６－３９１０を参照されたい）。ＰｏｌｙＡシグナルは、限定されないが、ＳＶ－４０、ヒト、及びウシを含む多くの好適な種に由来し得る。

本明細書に記載の方法に有用なｒＡＡＶの別の調節成分は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列、又は他の好適なシステムは、単一の遺伝子転写物から２つ以上のポリペプチドを生成するために使用され得る。ＩＲＥＳ（又は他の好適な配列）を用いて、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生するか、又は同じ細胞から又は同じ細胞内で２つの異なるタンパク質を発現させる。例示的なＩＲＥＳは、ポリオウイルス内部リボソーム進入配列であり、光受容器、ＲＰＥ、及び神経節細胞における導
入遺伝子の発現を支持する。好ましくは、ＩＲＥＳは、ｒＡＡＶベクター内の導入遺伝子の３’に位置する。

一実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、プロモーター（又はプロモーターの機能的断片）を含む。ｒＡＡＶに用いられるプロモーターの選択は、選択された導入遺伝子を所望の標的細胞内で発現させることができる多数の構成的又は誘導性プロモーターの中から行われ得る。一実施形態では、標的細胞は、視覚細胞である。プロモーターは、ヒトを含む任意の種に由来し得る。望ましくは、一実施形態では、プロモーターは、「細胞特異的」である。「細胞特異的」という用語は、組換えベクターについて選択された特定のプロモーターが、特定の細胞組織において選択された導入遺伝子の発現を導くことができることを意味する。一実施形態では、プロモーターは、筋肉細胞における導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、肺における発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、肝細胞における導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、気道上皮における導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、ニューロンにおける導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、心臓における導入遺伝子の発現に特異的である。

発現カセットは、典型的には、発現制御配列の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列と免疫グロブリン構築物のコード配列との間に位置するプロモーター配列を含む。一実施形態では、肝臓における発現が望ましい。したがって、一実施形態では、肝臓特異的プロモーターが使用される。組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、又は生理学的手がかりに応答するプロモーターが、本明細書に記載のベクターに使用され得る。別の実施形態では、筋肉における発現が望ましい。したがって、一実施形態では、筋肉特異的プロモーターが使用される。一実施形態では、プロモーターは、ｄＭＣＫ（５０９ｂｐ）又はｔＭＣＫ（７２０ｂｐ）のプロモーターなどのＭＣＫベースのプロモーターである。例えば、Ｗａｎｇｅｔａｌ，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００８Ｎｏｖ；１５（２２）：１４８９－９９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２００８．１０４．Ｅｐｕｂ２００８Ｊｕｎ１９を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。別の有用なプロモーターは、ＳＰｃ５－１２プロモーターである。Ｒａｓｏｗｏｅｔａｌ，ＥｕｒｏｐｅａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＪｏｕｒｎａｌＪｕｎｅ２０１４ｅｄｉｔｉｏｎｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１８を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。別の実施形態では、ＣＢ７プロモーター又はＣＡＧプロモーターが使用される。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワトリβアクチンプロモーターである。あるいは、他の肝臓特異的プロモーターが使用され得る［例えば、肝臓特異的プロモーターデータベース，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ：ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ、α１抗－トリプシン（Ａ１ＡＴ）、ヒトアルブミン：Ｍｉｙａｔａｋｅｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４３２（１９９７）、ｈｕｍＡｌｂ、及びＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター：Ｓａｎｄｉｇｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，３：１００２９（１９９６）を参照されたい］。ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、α－アンチトリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）２５（イントロンレスｓｃＡＡＶを必要とする）。

プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０最初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又は神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロ
モーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、及びニワトリβアクチンプロモーターから選択され得る。

発現カセットは、少なくとも１つのエンハンサー、すなわち、ＣＭＶエンハンサーを含んでもよい。更に他のエンハンサーエレメントとしては、例えば、アポリポタンパク質エンハンサー、ゼブラフィッシュエンハンサー、ＧＦＡＰエンハンサーエレメント、及びＷＯ２０１３／１５５５２２２に記載されているような脳特異的エンハンサー、ウッドチャック肝炎転写後（ＷＰＲＥ）調節エレメントが挙げられ得る。追加的に、又は代替的に、他の、例えば、ハイブリッドのヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）－最初期（ＩＥ）－ＰＤＧＲプロモーター又は他のプロモーター－エンハンサーエレメントが選択されてもよい。本明細書で有用な他のエンハンサー配列としては、ＩＲＢＰエンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ２００７，ＪＧｅｎｅＭｅｄ．２００７Ｄｅｃ；９（１２）：１０１５－２３）、最初期サイトメガロウイルスエンハンサー、免疫グロブリン遺伝子又はＳＶ４０エンハンサーに由来するもの、マウス近位プロモーターで同定されたシス作用性エレメントなどが挙げられる。

プロモーターに加えて、発現カセット及び／又はベクターは、好適な転写開始配列、終結配列、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強させる配列、及び必要に応じて、コードされた生成物の分泌を増強させる配列を含み得る。様々な好適なポリＡが知られている。一例では、ポリＡは、１２７ｂｐのウサギβグロビンポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｖ００８８２．１）などのウサギβグロビンである。他の実施形態では、ＳＶ４０ポリＡシグナルが選択される。特定の実施形態では、ポリＡは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨ－ポリＡ）シグナルである。

更に他の好適なポリＡ配列が選択されてもよい。特定の実施形態では、イントロンが含まれる。１つの好適なイントロンは、ニワトリβアクチンイントロンである。一実施形態では、イントロンは、８７５ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ、＃Ｘ００１８２．１）である。別の実施形態では、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なキメライントロンが使用される。しかしながら、他の好適なイントロンが選択されてもよい。一実施形態では、スペーサーは、ベクターゲノムが天然のＡＡＶベクターゲノムとほぼ同じサイズ（例えば、４．１～５．２ｋｂ）であるように含まれる。一実施形態では、スペーサーは、ベクターゲノムが約４．７ｋｂであるように含まれる。Ｗｕｅｔａｌ，ＥｆｆｅｃｔｏｆＧｅｎｏｍｅＳｉｚｅｏｎＡＡＶＶｅｃｔｏｒＰａｃｋａｇｉｎｇ，ＭｏｌＴｈｅｒ．２０１０Ｊａｎ；１８（１）：８０－８６を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。

これら及び他の一般的なベクター及び調節エレメントの選択は従来行われており、多くのそのような配列が利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ及びその中で引用される参照文献、例えば、３．１８～３．２６及び１６．１７～１６．２７のページ、並びに、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９を参照されたい。もちろん、すべのベクター及び発現制御配列が、本明細書に記載されているように、すべての導入遺伝子を発現するように良好に十分に等しく機能するわけではない。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、これら及び他の発現制御配列の中から選択することができる。

特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８３の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、（配列番号１３）を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含む

（ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列には、下線が引かれている）。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的な配列を、２コピー以上（例えば、２又は３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１３に部分的に相補的な配列を含み、したがって、配列番号１３と整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１３と整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補性の領域を含み、また、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３標的配列を含み、切断された配列番号１３（すなわち、配列番号１３の５’末端もしくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子及び１つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。

特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８２の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含み、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号１４）を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的である配列を、２コピー以上（例えば、２又は３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号１４に部分的に相補的な配列を含み、したがって、配列番号１４と整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１４と整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号１４（すなわち、配列番号１４の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む、ｍｉＲ－１８２標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。

「タンデム反復」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すように本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であり得、すなわち、一方の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端のすぐ上流にあるように、又はその逆で、互いの後に直接的に配置され得る。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。

本明細書で使用される場合、「スペーサー」は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、又はより長い数値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧ又はＧＣＡＴＧＣである。

特定の実施形態では、タンデム反復は、２つ、３つ、４つ以上の同じｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、タンデムリピートは、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、又は少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列などを含む。特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つ又は３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、及び異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。

特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるセットのタンデム反復が存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子のすぐ下流のタンデム反復と、ＵＴＲ配列と、ＵＴＲの３’末端に近接する２つ以上のタンデム反復と、を含み得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。別の例では、３’は、タンデム反復を含有し得、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。

特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内で開始する、２つ、３つ、４つ以上のタンデム反復を含有する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドでｍｉＲＮＡタンデム反復を含む。

２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８３，９５６号（参照により本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する、２０１９年１２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。２０２０年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，５９３号、２０２０年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０３８，４８８号、及び２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，５６２号も、参照により本明細書に組み込まれる。

別の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルスを生成する方法が提供される。好適な組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、宿主細胞を培養することによって生成され、宿主細胞は、本明細書に記載されるＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、又はその断片、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び所望の導入遺伝子をコードする異種核酸配列からなるミニ遺伝子、ならびにミニ遺伝子をＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを可能にする十分なヘルパー機能を含む。ＡＡＶミニ遺伝子をＡＡＶカプシドにパッケージングするために宿主細胞中で培養される必要がある
成分は、トランスで宿主細胞に提供され得る。代替的に、必要な成分（例えば、ミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／又はヘルパー機能）のうちの任意の１つ以上は、当業者に既知の方法を使用して、必要な成分のうちの１つ以上を含有するように操作された安定な宿主細胞によって提供され得る。カプシド、コーディング配列を生成する方法、したがって、及びｒＡＡＶウイルスベクターを産生する方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい（参照により本明細書に組み込まれる）。

また、本明細書に記載されるｒＡＡＶで形質導入された宿主細胞も、本明細書に提供される。最も好適には、かかる安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で必要な成分を含むであろう。しかしながら、必要な成分は、構成的プロモーターの制御下にあり得る。好適な誘導性プロモーター及び構成的プロモーターの例は、導入遺伝子との使用に好適な調節エレメントの以下の考察において、本明細書に提供される。更に別の代替として、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分と、１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された成分とを含み得る。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含む）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐ及び／又はｃａｐタンパク質を含む、安定な宿主細胞が生成され得る。更に他の安定な宿主細胞は、当業者によって生成され得る。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される核酸分子を含む。特定の実施形態では、記載される新規のベクターは、既知のカプシドと比較して、改善された産生（すなわち、より高い収率）を有する。例えば、ＡＡＶｒｈ９１ベクターの産生は、ＡＡＶ１及びＡＡＶ６と比較して、改善された収率を示した。

本明細書に記載のｒＡＡＶの産生に必要なミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、それに担持される配列を導入する任意の遺伝要素の形態で、パッケージング宿主細胞に送達され得る。選択される遺伝子要素は、本明細書に記載されるものを含む任意の好適な方法によって送達され得る。本発明の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを産生する方法は周知であり、適切な方法の選択は、本発明を限定するものではない。例えば、特に、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ，１９９３Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。これらの刊行物は参照により本明細書に組み込まれる。

Ｃ．医薬組成物及び投与
一実施形態では、上で詳述した標的細胞で使用するための所望の導入遺伝子及びプロモーターを含む組換えＡＡＶは、任意選択的に、従来の方法によって汚染について評価され、次いで、医薬組成物に製剤化され、それを必要とする対象への投与が意図される。かかる製剤は、薬学的及び／又は生理学的に許容されるビヒクル又は担体（適切な生理学的レベルでｐＨを維持するための、緩衝生理食塩水又は他の緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）など）、及び任意選択的に、他の薬剤（ｍｅｄｉｃｉｎａｌａｇｅｎｔｓ）、薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｇｅｎｔｓ）、安定化剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈剤などを含む。注射の場合、担体は、典型的には液体である。例示的な生理学的に許容される担体としては、滅菌された、パイロジェンフリーの水及び滅菌された、パイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。かかる様々な既知の担体は、米国特許公開第７，６２９，３２２号に提供されている（参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、担体は、等張塩化ナトリウム溶液である。別の実施形態では、担体は、平
衡塩類溶液である。一実施形態では、担体は、ｔｗｅｅｎを含む。ウイルスを長期保存する場合は、グリセロール又はＴｗｅｅｎ２０の存在下で凍結させることができる。別の実施形態では、薬学的に許容される担体は、パーフルオロオクタン（Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｎ液）などの界面活性剤を含む。ベクターは、ヒト対象における注入に好適な緩衝液／担体中に製剤化される。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。

本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、上に記載の医薬組成物は、対象に筋肉内（ＩＭ）投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、静脈内（ＩＶ）投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）注入によって投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、大槽内（ＩＣＭ）注入によって投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、実質内注入によって投与される。本明細書に記載の方法に有用であり得る他の形態の投与には、これらに限定されないが、網膜下又は硝子体内送達を含む所望の臓器（例えば、眼）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の親の投与経路が含まれる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入を介した、投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰椎穿刺の手段によって、クモ膜下腔全体に拡散させるために導入され得る。別の例では、大槽内への注射であってもよい。

本明細書で使用される場合、「大槽内送達」又は「大槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄の脳脊髄液内への直接的な投与経路、より詳細には、後頭下穿刺を介した、又は大槽内への直接的な注入による、又は永久的に配置されたチューブを介した、投与経路を指す。

組成物は、治療される領域のサイズ、使用されるウイルス力価、投与経路、及び本方法の所望の効果に応じて、範囲内のすべての数値を含めて、約０．１μＬ～約１０ｍＬの容量で送達され得る。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。更に別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約８５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１０００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約２ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約２．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約３ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約３．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約４ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約５．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約６ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約６．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約７ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約８ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約８．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約９ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約９．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約１０ｍＬである。

調節配列の制御下にある所望の導入遺伝子をコードする核酸配列を有する組換えアデノ随伴ウイルスの有効濃度は、望ましくは、１ミリリットル当たり約１０^７～１０^１４個のベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）（ゲノムコピー／ｍＬ（ＧＣ／ｍＬ）とも呼ばれる）の範囲である。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、リアルタイムＰＣＲによって測定される。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、デジタルＰＣＲによって測定される。Ｌｏｃｋｅｔａｌ，Ａｂｓｏｌｕｔｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ
ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄａｎｄｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｇｅｎｏｍｅｔｉｔｅｒｓｂｙｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ
Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ２０１４Ｆｅｂ１４を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。別の実施形態では、ｒＡＡＶ感染性単位は、Ｓ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ，１９８８Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３に記載されているように測定される（参照により本明細書に援用される）。

好ましくは、濃度は、約１．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬであり、より好ましくは、約１．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬである。一実施形態では、有効濃度は、約１．４×１０^８ｖｇ／ｍＬである。一実施形態では、有効濃度は、約３．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は、約５．６×１０^１１ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は、約５．３×１０^１２ｖｇ／ｍＬである。更に別の実施形態では、有効濃度は、約１．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は、約１．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬである。本明細書に記載のすべての範囲は、エンドポイントを含む。

一実施形態では、投用量は、約１．５×１０^９ｖｇ／ｋｇの体重～約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇであり、より好ましくは、約１．５×１０^９ｖｇ／ｋｇ～約１．５×１０^１１ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、投与量は、約１．４×１０^８ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、投与量は、約３．５×１０^１０ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約５．６×１０^１１ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約５．３×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。更に別の実施形態では、投与量は、約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約３．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。本明細書に記載のすべての範囲は、エンドポイントを含む。

一実施形態では、有効投与量（送達される総ゲノムコピー）は、約１０^７～１０^１３ベクターゲノムである。一実施形態では、総投与量は、約１０^８ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^９ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１０ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１１ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１２ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１３ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１４ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１５ゲノムコピーである。

毒性などの望ましくない効果のリスクを低減するために、ウイルスの最低有効濃度を利用することが望ましい。更に、これらの範囲の他の投与量及び投与容量は、治療される対象（好ましくは、ヒト）の身体状態、対象の年齢、特定の障害、及び進行性の場合、発症した障害の程度を考慮して、主治医によって選択され得る。例えば、静脈内送達は、１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの程度の用量を必要とし得る。

Ｄ．方法
別の態様では、標的の組織又は細胞を形質導入する方法が提供される。一実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶを投与することを含む。以下の実施例に示されるように、本発明者らは、ＡＡＶｒｈ９１と称されるＡＡＶが、心臓（平滑筋）、ＣＮＳ細胞、及び骨格（横紋）筋を効果的に形質導入することを示している。本明細書に記載されるように、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するベクターは、様々な細胞型及び組織型を形質導入することができ、投与経路に依存する固有の向性を示す。特定の実施形態では、本方法は、ＡＡＶｒｈ９１ベクターの全身投与を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１ベクターは、特定の細胞型又は組織型を標的とするのに好適な投与経路を介して送達される。例えば、ＡＡＶｒｈ９１ベクターは、髄腔内投与後の肺及び膵臓などの組織において、ＡＡＶ６．２よりも高い導入遺伝子発現レベルを有する。同様に、髄腔内投与後のＡＡＶｒｈ９１については、ＡＡＶ６．２と比較して筋肉組織における発現の増強が観察されている。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶを投与することを含む、ＣＮＳの細胞（例えば、ニューロン、内皮細胞、グリア細胞、及び上衣細胞のうちの１つ以上）を形質導入する方法が、本明細書に提供される。一実施形態では、静脈内投与が用いられる。別の実施形態では、ＩＣＶ投与が用いられる。更に別の実施形態では、ＩＣＭ投与が用いられる。特定の実施形態では、これらに限定されないが、脊髄、海馬、運動皮質、小脳、及び運動ニューロンのいずれかを含む、導入遺伝子をＣＮＳの細胞に送達する方法が、本明細書に提供される。本方法は、細胞を、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶと接触させることを含み、当該ｒＡＡＶは、導入遺伝子を含む。別の態様では、導入遺伝子をＣＮＳに送達するための、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶの使用が提供される。特定の実施形態では、上衣細胞又は脈絡叢に導入遺伝子を送達するために、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶの使用が提供される。特定の実施形態では、上皮細胞及び／又は脈絡叢の形質導入は、ＣＮＳにおける形質導入遺伝子の分泌レベルの増加をもたらす。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１は、ＡＡＶ１又はＡＡＶ６．２のカプシドを有するベクターで観察されるよりも高いレベルでＣＮＳの細胞に導入遺伝子を送達する。特定の実施形態では、より高いレベルの形質導入が、１つ以上又は上衣細胞、ニューロン、及び／又は星状細胞で観察される。特定の実施形態では、導入遺伝子を脳実質に送達するための、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶの使用が提供される。本明細書では、ＡＡＶ９ベクターを使用して達成されるよりも高いレベルの形質導入で、星状細胞などの脳細胞を標的とするためのＡＡＶｒｈ９１ベクターの使用が提供される。特定の実施形態では、より高い形質導入のレベルは、前頭皮質及び側頭皮質を含む脳の尾側セクションで達成される。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１ベクターは、例えば、ＡＡＶ９と比較して、皮質、海馬、及び／又は線条体内のニューロンのより高いレベルの形質導入を達成する。

本明細書で考察されるように、本明細書に記載のＡＡＶカプシドを含むベクターは、心臓組織を高レベルで形質導入することができる。導入遺伝子を心臓細胞に送達する方法が、本明細書に提供される。本方法は、細胞を、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶと接触させることを含み、当該ｒＡＡＶは、導入遺伝子を含む。別の態様では、導入遺伝子を心臓に送達するための、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶの使用が提供される。特定の実施形態では、導入遺伝子を心臓の細胞に送達する方法は、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＶＶの全身送達（例えば、ＩＶ投与）を含む。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶを投与することを含む、骨格筋を形質導入する方法が、本明細書に提供される。ＡＡＶｒｈ９１は、ＡＡＶ９と比較して、増加しないにしても、同様の骨格筋の形質導入を有する。特定の実施形態では
、本方法は、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを骨格（横紋）筋に送達することを含む。特定の実施形態では、導入遺伝子を骨格筋に送達する方法が提供される。本方法は、細胞を、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＡＶと接触させることを含み、当該ｒＡＡＶは、導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子骨格筋の送達方法は、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有するｒＡＶＶの全身送達（例えば、ＩＶ投与）を含む。

特定の実施形態では、記載のＡＡＶｒｈ９１ベクターは、対象の肝臓における脱標的化発現の形質導入を減少させるために使用される。したがって、潜在的な肝臓毒性を回避するか、又は肝臓組織のＡＡＶ標的化に関連する肝臓毒性を減少させるためにＡＡＶｒｈ９１が使用される。特定の実施形態では、肝臓毒性の減少は、全身注射（特に、静脈内投与）後に観察される。特定の実施形態では、毒性の減少は、ＡＡＶ９カプシドを有するベクターなどの別のカプシドによるベクターの送達に関連する。

単一ゲノム増幅
ＡＡＶゲノムは、従来、ＰＣＲベースの方法を使用して哺乳類ゲノムＤＮＡ全体の中から単離されてきた。プライマーは、多様なＶＰ１（カプシド）遺伝子の大部分に隣接する保存領域を検出するために使用される。次いで、ＰＣＲ産物をプラスミド骨格にクローニングし、個々のクローンを、Ｓａｎｇｅｒ法を使用して配列決定する。従来のＰＣＲ及び分子クローニングに基づくウイルス単離方法は、新規のＡＡＶゲノムを回収するのに有効ではあるが、回収されるゲノムが、ＰＣＲ媒介性の組換え及びポリメラーゼエラーの影響を受ける可能性がある。加えて、現在利用可能な次世代配列決定技術により、以前に使用されたサンガー技術と比較して、他に類を見ない正確さでウイルスゲノムを配列決定することが可能になった。個々のＡＡＶゲノムをウイルス集団内から正確に単離する新規でより高スループットのＰＣＲ及び次世代配列決定に基づく方法が、本明細書に提供される。本方法、ＡＡＶ－単一ゲノム増幅（ＡＡＶ－ＳＧＡ）は、哺乳類宿主内のＡＡＶ多様性に関する我々の知識を向上させるために使用することができる。更に、それは、遺伝子療法のためのベクターとして使用するための新規のカプシドを同定することを可能にした。

ＡＡＶ－ＳＧＡは、ゲノムの集団を含む試料から個々のＡＡＶ配列を効果的に回収するように検証及び最適化されている。この技術は、ヒト及び非ヒト霊長類の宿主内から単一のＨＩＶ及びＨＣＶゲノムを単離するために以前に使用されている。カプシド検出ＰＣＲによってＡＡＶ陽性をスクリーニングするゲノムＤＮＡ試料は、エンドポイント希釈される。ＰＣＲ増幅が、８０％の信頼性を有するポアソン分布によれば、３０％未満の陽性反応をもたらす希釈は、単一の増幅可能なＡＡＶゲノムを含む。この手順は、ポリメラーゼの鋳型を切り替えることによって引き起こされるＰＣＲ媒介性組換えの可能性が低減されたウイルスゲノムのＰＣＲ増幅を可能にする。ＡＡＶ－ＳＧＡのＰＣＲアンプリコンは、２×１５０又は２×２５０ペアエンド配列決定を使用して、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して配列決定される。この方法は、高い相同性の領域を有する複数のウイルスを含む単一の試料由来の配列決定リードの収束を憂慮することなく、完全長ＡＡＶＶＰ１配列の正確なデノボアセンブリを可能にする。

ＡＡＶ－ＳＧＡ技術により、アカゲザル組織から複数の新規ＡＡＶカプシド配列を単離することに成功している。単一の試料から、ＡＡＶの異なるクレード由来の複数のウイルスが同定されており、これは、ＡＡＶの集団が宿主組織に存在し得ることを示す。例えば、クレードＤ、Ｅ、及び離れた「フリンジ」ウイルスと配列類似性を有するカプシドは、単一の肝臓組織試料から単離された。

ＡＡＶを発見するためのＳＧＡの応用は、以前に記載されていない。このアプローチは、無効なＡＡＶゲノム配列をもたらす可能性のある鋳型の切り替え及びポリメラーゼエラーの問題に対処する。更に、単一の分離株と同じ宿主試料から同じ配列を繰り返し回収す
ると、単離されたゲノムの質は自明である。

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために提供される。本実施例は、本発明をいかなる方法でも限定することを意図するものではない。
Ｅ．

実施例１：材料及び方法
ＡＡＶ配列の検出及び単離
非ヒト霊長類組織源
ペンシルベニア大学のコロニーのアカゲザルは飼育下で繁殖され、中国又はインド起源であった。

新規ＡＡＶの単離
ゲノムＤＮＡを抽出し（ＱＩＡｍｐＤＮＡミニキット、ＱＩＡＧＥＮ）、ＰＣＲ戦略を使用して、ＮＨＰ肝臓組織試料から３．１ｋｂの全長Ｃａｐ断片を増幅することによって、ＡＡＶＤＮＡの存在について分析した。ＡＡＶＲｅｐ遺伝子の保存領域内の５’プライマー（ＡＶ１ＮＳ、５’－ＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ－３’）（配列番号９）を、ＡＡＶＣａｐ遺伝子の下流の保存領域内に位置する３’プライマー（ＡＶ２ＣＡＳ、５’－ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡ－３’）（配列番号１０）と組み合わせて、全長ＡＡＶＣａｐアンプリコンの増幅に使用した。Ｑ５Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用して、以下のサイクル条件を使用してＡＡＶＤＮＡを増幅した：９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、５９℃で１０秒間、７２℃で９３秒間を５０サイクル；及び７２℃で１２０秒間の伸長。

陽性のＰＣＲ反応をもたらした鋳型ゲノムＤＮＡ試料を、ＡＡＶ－単一ゲノム増幅（ＡＡＶ－ＳＧＡ）に供した。ゲノムＤＮＡを９６ウェルプレート中でエンドポイント希釈し、上に記載の同じプライマーを使用して、９６回のうち２９回未満のＰＣＲ反応が増幅産物を生じるようにした。ポアソン分布によれば、ウェルの３０％以下でＰＣＲ産物が得られるＤＮＡ希釈は、８０％超の確率で、陽性ＰＣＲ当たり１つの増幅可能なＡＡＶＤＮＡ鋳型を含む。陽性のＰＣＲ反応からのＡＡＶＤＮＡアンプリコンを、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ２×１５０又は２×２５０ペアエンド配列決定プラットフォームを使用して配列決定し、得られたリードを、ＳＰＡｄｅｓアセンブラ（ｃａｂ．ｓｐｂｕ．ｒｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｐａｄｅｓ）を使用してデノボアセンブリを行った。ＮＣＢＩＢＬＡＳＴｎ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）及びＶｅｃｔｏｒＮＴＩＡｌｉｇｎＸソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して配列解析を行った。

ＡＡＶ産生及び力価決定
インビトロ分析に使用されるＡＡＶベクターは、ＨＥＫ２９３細胞における三重トランスフェクション法によって産生された。ベクターは、前述の１細胞スタックスケールのＨＥＫ２９３三重トランスフェクション法からの適合プロトコルを使用して、６ウェルプレートスケールで産生された。削減された培養面積に基づいて、以下の変更を行った：１）使用したプラスミド比は２：１：０．１（ヘルパープラスミド：トランスプラスミド：シスプラスミド、質量で）であった；及び２）回収時、凍結／融解以外の他の処理は行われなかった（Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｈｕｍａｎｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ，２０１０．２１：ｐ．１２５９－７１）。ベクターは、ＣＢ７．ｆｆｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ｒＢＧ導入遺伝子をパッケージングした。細胞溶解物を回収し、ＤＮａｓｅＩ及びプロテアーゼＫ耐性ベクターゲノムを、導入遺伝子カセットにコードされているウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナルに対するプライマー及びプローブを使用して、ＴａｑＭａ
ｎｑＰＣＲ増幅（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）によって滴定した。

インビトロ導入アッセイ
三重トランスフェクション及びベクター溶解物の回収後、１×１０^１０ＧＣ／ｍＬの各ベクターを、新鮮な完全培地で段階希釈し、次いで、それを使用して、前日にそれぞれ１×１０^５細胞／ウェル又は１．５×１０^６細胞／ウェルで播種されたＨｕｈ７細胞又はＨＥＫ２９３細胞を形質導入した。Ｄ－ルシフェリン処理（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）後、ルミノメーター（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いてルシフェラーゼ活性を検出した。

げっ歯類における新規のＡＡＶカプシドのインビボ特徴付け
動物
すべての動物プロトコルは、ｔｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにより認可された。Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウスは、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＧＦＰレポーター遺伝子実験の場合、成体（６～８週齢）のオスに注射した。動物を、１ケージ当たり２～５匹で、標準的なケージに収容した。バリア施設のケージ、給水瓶、及び床敷は、オートクレーブ処理し、ケージは、週に１回交換した。自動制御で、１２時間の明暗サイクルを維持した。各暗期は午後７時（±３０分）に開始した。放射線照射された実験用げっ歯類の餌は、自由摂食で提供された。

被験試料及び研究設計
マウスは、マウス１匹当たり１×１０^１２ＧＣの各ベクターを０．１ｍＬ、外側尾静脈を介して静脈内（ＩＶ）投与されたか、又はマウス１匹当たり１×１０^１１ＧＣの用量で５ｕＬ、側脳室に脳室内（ＩＣＶ）注入された。各群について、３匹又は５匹のマウスが投薬された。

注入１４日後、ＣＯ_２の吸入により、マウスを安楽死させた。組織を採取し、生体分布分析のためにドライアイス上でスナップ凍結したか、又は１０％中性ホルマリン中で浸漬固定し、スクロース中で凍結保存し、ＯＣＴ中で凍結し、ＧＦＰ直接観察のためにクライオスタットで切片化した。剖検後、内皮細胞の形質導入の分析に使用される組織をパラフィン包埋した。

レポーター遺伝子の可視化
直接ＧＦＰ蛍光を観察するために、組織試料を、ホルマリン中で約２４時間固定し、ＰＢＳ中で短時間洗浄し、ＰＢＳ中の１５％及び３０％のスクロースで最大密度に達するまで順次平衡化し、次いで、凍結切片の調製のために、ＯＣＴ包埋媒体中で凍結した。核の対比染色としてのＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）中で、切片を載せた。

パラフィン包埋組織試料に対して、ＧＦＰ免疫組織化学を実施した。切片を、エタノール及びキシレンで脱パラフィン化し、抗原賦活化のために１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間煮沸し、順次、２％のＨ_２Ｏ_２で１５分間、アビジン／ビオチンブロッキング試薬（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で各々１５分間、及びブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％ロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎ）で１０分間処理した。続いて、一次抗体と１時間、ブロッキング緩衝液中のビオチン化二次抗体と４５分間インキュベーションした（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）。一次抗体のニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍａｂ１３９７０）及び内皮細胞マーカーのウサギ抗Ｃ
Ｄ３１（Ａｂｃａｍａｂ２８３６４）を使用した。ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅ
ＡＢＣキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、製造元の指示に従って、ＤＡＢを基質として用いて、結合した抗体を褐色沈殿物として可視化した。

免疫蛍光の場合、パラフィン切片を脱パラフィン化し、抗原賦活化後、ＰＢＳ中の１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎで１５分間ブロッキングし、続いて、ブロッキング緩衝液中で希釈された一次抗体（１時間）及び蛍光標識二次抗体（４５分間、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、順次インキュベーションした。使用した抗体は、ニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍａｂ１３９７０）、ウサギ抗ＣＤ３１（Ａｂｃａｍａｂ２８３６４）、及びマウス抗ＮＦ－２００（クローンＲＴ９７，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣＢＬ２１２）であった。一次抗体を一緒に混合し、ＧＦＰ抗体及びＮＦ－２００抗体を、それぞれＦＩＴＣ標識及びＴＲＩＴＣ標識の二次抗体により検出した。ＣＤ３１に対するウサギ抗体のシグナルを、ＶｅｃｔａＦｌｕｏｒ（商標）ＥｘｃｅｌＡｍｐｌｉｆｉｅｄＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８抗－ウサギＩｇＧキットを使用して、製造元のプロトコルに従って（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）増強した。Ｘ－ｇａｌ染色に基づくＬａｃＺ遺伝子発現の検出を、以前に実証されたプロトコル（Ｂｅｌｌ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，ＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，２００５．１２４：ｐ．７７－８５）を使用して、筋肉組織の切片に対して行った。蛍光及び明視野の顕微鏡画像は、ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴｉＥ顕微鏡を用いて撮影した。

バーコード化ベクター導入遺伝子の非ヒト霊長類導入の評価
被験試料及び研究設計
５つの新規カプシド及び５つの対照カプシド（ＡＡＶｒｈ．９０、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｒｈ．９２、ＡＡＶｒｈ．９３、ＡＡＶｒｈ９１．９３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ７、及びＡＡＶ９）を使用して、修飾ＡＴＧ枯渇自己相補ｅＧＦＰ（ｄＧＦＰ）導入遺伝子をパッケージングした。各固有のカプシド調製物は、ベクターゲノムのポリアデニル化配列の前に、対応する固有の６ｂｐバーコードを有するｄＧＦＰ導入遺伝子を含んだ。導入遺伝子は、ＣＢ８プロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化配列（ＡＡＶｓｃ．ＣＢ８．ｄＧＦＰ．Ｂａｒｃｏｄｅ．ＳＶ４０）を含んだ。ＡＡＶベクターを生成し、以前に記載されているように、ＰｅｎｎＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅによって滴定した（例えば、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（２０１０）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２１：１２５９－７１を参照されたい）。ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、細胞培養上清を回収し、濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、以前に記載されているように、ＳＶ４０ポリＡ配列を標的とするプライマーを使用して、デジタルドロップレットＰＣＲで滴定した（例えば、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（２０１４）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２５：１１５－２５）を参照されたい）。

１０種類の精製ベクターを、２つの別個の動物への注入用に均等なゲノムコピー量でプールした：送達された総用量は、ＩＶ送達を介して２×１０^１３ＧＣ／ｋｇ及び髄腔内空間への大槽内（ＩＣＭ）送達を介して３×１０^１３ＧＣ／動物であった。動物は、注射の３０日後に犠牲にされ、すべての組織は、下流導入遺伝子のＲＮＡ発現分析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）で回収された。

動物
動物手順はすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。カニクイザルマカク（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は、ＢｒｉｓｔｏｌＭｅｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ（ＵＳＡ）から寄贈された。動物は、国際実験動物管理評価認証協会認定のフィラデルフィア小児病院（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ
）の非ヒト霊長類研究プログラム施設で、ステンレス鋼製スクイーズバックケージ内に収容された。動物は、給餌、視覚及び聴覚刺激、操作、及び社会的相互作用などの様々な豊かさ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ）を享受した。

ＩＣＭ試験には、１０歳齢、雄、８ｋｇの動物を使用した。ＩＶ試験には、６歳齢、雄、６．９８ｋｇの動物を使用した。この動物を、ＡＡＶ中和抗体の存在についてスクリーニングし、ベースラインでは、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶｒｈ３２．３３に対して血清陰性であった。この動物は、ベースラインでは、ＡＡＶ７及びＡＡＶ９に対して、それぞれ１：５及び１：１０の中和抗体力価を有した。

ＩＣＭ注入手順
麻酔されたマカクは、Ｘ線撮影台上に側臥位で、頭部を前方に屈曲させて、配置された。無菌技術を使用して、２１Ｇ～２７Ｇ、１～１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅ脊椎針（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を、ＣＳＦ流れが観察されるまで、後頭下空間へと前進させた。１ｍＬのＣＳＦを、ベースライン分析用に採取した。針の正確な配置は、脳幹の損傷の可能性を避けるために、蛍光透視（ＯＥＣ９８００Ｃ－ａｒｍ；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）により確認した。ＣＳＦ採取の後、ルアーアクセスエクステンション又は小口径Ｔポートエクステンションセットカテーテルを脊椎針に連結して、１８０ｍｇ／ｍＬのイオヘキソール造影剤の投与を容易にした（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）。針の配置を確認した後、被験試料を含むシリンジ（１ｍＬに加えてシリンジ容量及びリンカーのデッドスペースに等しい容量）を可撓性のリンカーに連結して、３０±５秒間かけて注入した。針を取り外し、穿刺部位に直接圧力を加えた。

ＩＶ注入手順
マカクに、１０ｍＬのベクター被験試料を、注入ポンプ（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を介して１ｍＬ／分の速度で末梢静脈に投与した。

導入遺伝子の発現分析
全組織ＲＮＡを、製造元の仕様（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、ＴＲＩｚｏｌを使用して、すべてのＲＮＡＬａｔｅｒ処理組織から抽出した。抽出したＲＮＡを、製造元のプロトコルに従ってＤＮａｓｅＩで処理した（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。ｃＤＮＡの逆転写合成は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓの高容量ｃＤＮＡ逆転写酵素キット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。１１７ｂｐのアンプリコンをＰＣＲ増幅するために、６ｂｐの固有のバーコードに隣接する領域を標的とするプライマー（フォワードプライマー：ＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＣＧＡＴＡＴＧＡＡ（配列番号１１）、リバースプライマー：ＧＧＣＴＣＴＣＧＴＣＧＣＧＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡ（配列番号１２））及びＱ５高忠実度ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用して、以下のサイクリング条件：９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、７２℃で１７秒間を２５サイクル；及び７２℃で１２０秒間の伸長で、反応を行った。アンプリコンを、ＭｉＳｅｑＳｔａｎｄａｒｄ２ｘ１５０ｂｐ配列決定プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定した。

バーコードリードを、発現分析パッケージ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ／ｅａ－ｕｔｉｌｓ）、ｃｕｔａｄａｐｔ（ｃｕｔａｄａｐｔ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｓｔａｂｌｅ／）、ｆａｓｔｘツールキットパッケ
ージ（ｈａｎｎｏｎｌａｂ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｆａｓｔｘ＿ｔｏｏｌｋｉｔ／）、及びＲバージョン３．３．１．（ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｂｉｎ／ｗｉｎｄｏｗｓ／ｂａｓｅ／ｏｌｄ／３．３．１／）からのｆａｓｔｑ－ｊｏｉｎプログラムを使用して分析した。組織試料からのバーコード発現カウントデータを、各動物について配列決定された注入用ベクター材料からのバーコードカウントに正規化し、各組織試料からのバーコードの割合を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン７．０４を使用してプロットした。

ＮＨＰにおけるＡＡＶｒｈ９１のＩＣＭ形質導入特性の試験
動物及び研究設計
動物手順はすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。動物は、国際実験動物管理評価認証協会認定のフィラデルフィア小児病院（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）の非ヒト霊長類研究プログラム施設で、ステンレス鋼製スクイーズバックケージ内に収容された。動物は、給餌、視覚及び聴覚刺激、操作、及び社会的相互作用などの様々な豊かさ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ）を享受した。

ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９カプシドに、以前に記載された方法を使用して、ニワトリβアクチン（ＣＢ７）プロモーターから強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するプラスミド（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ）をパッケージングした（例えば、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（２０１０）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２１：１２５９－７１及びＬｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（２０１４）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２５：１１５－２５を参照されたい）。１．５５７×１０^１３ＧＣの用量を、各動物にＩＣＭ注入した。ＩＣＭ注入方法は上に記載されている。注入の２８～３１日後に動物を犠牲にし、ＤＮＡベクター生体分布試験のために組織をドライアイス上で採取した。非臨床一般毒性試験の際の神経系のサンプリング及び処理のための推奨手順（脳、脊髄、神経、及び眼）に従って、脳モールド（ｂｒａｉｎｍｏｌｄ）を使用して、脳全体を採取し、トリミングし、切片化した。Ｐａｒｄｏ，ｅｔ．ａｌ．（２０１２）．ＳＴＰＰｏｓｉｔｉｏｎＰａｐｅｒ。また、組織を採取し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋して、組織病理学的分析を行った。

ベクター形質導入の組織学的分析
ＧＦＰ免疫組織化学（ＩＨＣ）の場合、切片を、エタノール及びキシレンで脱パラフィン化し、抗原賦活化のために１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間煮沸し、順次、２％のＨ_２Ｏ_２で１５分間、アビジン／ビオチンブロッキング試薬（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で各々１５分間、及びブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎ）で１０分間処理した。続いて、ブロッキング緩衝液中のＧＦＰに対するヤギ抗体（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢ１００－１７７０，１：５００）とともに４℃で一晩インキュベーションし、ＰＢＳ中で洗浄した後、ブロッキング緩衝液中のビオチン化抗ヤギ二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１：５００）とともに４５分間インキュベーションした。ＰＢＳ中で洗浄した後、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅＡＢＣキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用して、製造元の指示に従って、ＤＡＢを基質として用いて、結合した抗体を褐色沈殿物として可視化した。

免疫蛍光（ＩＦ）の場合、パラフィン切片を同様に前処理したが、Ｈ_２Ｏ_２及びアビジン／ビオチンのブロッキングは行わなかった。以下の一次抗体を組み合わせ、切片を３７℃で１時間インキュベートした：ヤギ抗ＧＦＰ（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢ１００－１７７０；１：３００～５００）、モルモット抗ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＢＮ９０；１：５００）、ニワトリ抗ＧＦＡＰ（Ａｂｃａｍ，ａｂ４６７４；１
：１０００）。これに続いて、ＰＢＳ中で洗浄後、蛍光色素標識二次抗体（ＦＩＴＣ抗ヤギ、Ｃｙ５抗モルモット、ＴＲＩＴＣ抗ＧＦＡＰ；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、室温で１時間、１：２００）とインキュベーションした。ＰＢＳ中で洗浄後、ＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ）中で切片をマウントし、核の対比染色を行った。

ベクターの生体分布の分析
ＱＩＡａｍｐＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）で組織ゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＡＶベクターゲノムを、Ｔａｑｍａｎ試薬（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにベクターのＥＧＦＰ配列を標的とするプライマー／プローブを使用して、リアルタイムＰＣＲによって定量化した。

中枢神経系（ＣＮＳ）の組織における細胞形質導入の定量分析
上に記載のようにスライドを調製し、ＡｐｅｒｉｏＶＥＲＳＡ走査システムを使用してスキャンした。まず、スライド全体を低倍率で（１．２５倍）でスキャンして、関心領域を定義した。最初の１．２５倍のスキャン後、スライドを、４つの異なるチャネルＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ及びＣｙ５を用いて、２０倍の倍率でスキャンした。Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ画像解析ソフトウェアｖ．２０１９．０７で開発された共染色検出アルゴリズムを使用して、最終的な２０倍のスキャンから、形質導入されたニューロン及び星状細胞を定量した。

ＡＡＶｒｈ９１の低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）
ＡＡＶｒｈ９１のＣｒｙｏＥＭを、マサチューセッツ大学医学部のＣｒｙｏ－ＥＭコア施設で実施した。３μｌのベクターを、希釈することなく（３．３７×１０^１３ＧＣ／ｍｌ）、２ｎｍ厚の連続炭素膜（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ）を有するグロー放電Ｒ２／１銅グリッドに添加した。２２℃、相対湿度９５％の濾紙で７～８秒間ブロットした後、グリッドを、ＶｉｔｒｏｂｏｔＭａｒｋＩＶ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して液体エタンスラッシュで凍結した。氷の厚さがわずかに異なる２つのグリッドが得られた。ＧａｔａｎＫ３直接検出器（Ｇａｔａｎ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＵＳＡ）を備えた２００ｋＶで動作するＴａｌｏｓＡｒｃｔｉｃａ電子顕微鏡（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）使用して、グリッド１で１５８４本のムービーを収集し、グリッド２で３６７５本のムービーを収集した。データは、ＳｅｒｉａｌＥＭソフトウェアを使用して取得した。ピクセルサイズは、０．４３５Å／ｐｉｘ（ｂｉｎ＝０．５）であり、総線量は、３６．９８４電子／Å^２であり、ムービー当たり２６フレームであった。画像は、－０．５～－１．５μｍの範囲のデフォーカスで収集した。

ＡＡＶｒｈ９１構造決定、モデル構築、精密化
グリッド１及びグリッド２の場合、ムービーは、ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２のＲｅｌｉｏｎ３．０実装を使用してモーション補正され、最終的なピクセルサイズは０．８７Åにビニングされた。動作補正後、ｃｔｆｆｉｎｄ４を使用して顕微鏡写真のデフォーカスを推定し、Ｒｅｌｉｏｎ３．０を使用して処理した。次いで、グリッド１の全ての処理された画像及びグリッド２からの３６６４の処理された画像は、合計５２４８画像の単一のデータセットに合わせた。このセットから、２次元（２Ｄ）分類のために約１，０００個の粒子を選別した。最良のクラスを、自動選択のためのテンプレートとして使用した。自動選択からの合計２８３，８１８個の粒子を、１ラウンドの２Ｄ分類を通して選別して、偽陽性及び最適でない粒子を除去し、２５４，４４２個の粒子を得た。初期モデルは、Ｒｅｌｉｏｎを使用したアブイニシオ（ａｂｉｎｉｔｉｏ）モデルの生成を介してＣ１対称性で生成された。更に、Ｃ１対称性を使用した３次元（３Ｄ）分類と回転角サンプリングを５つのクラスに分類した。合計１７３，５５８個の粒子について、３つの最良のクラスが選
択された。これらの粒子を使用して、Ｃ１対称性で３Ｄ自動精密化を行い、二十面体対称性を適用し、別のラウンドの二十面体対称性による３Ｄ自動精密化を行った。次いで、本発明者らは、精密化された粒子に対して、ＣＴＦ精密化及び粒子研磨を行った。最終的な３Ｄ自動精密化と後処理により、フーリエシェル相関のゴールドスタンダードカットオフ０．１４３に基づいて、ＡＡＶｒｈ９１の構造が２．３３Åまで得られた。

初期モデルは、以前に公開されているＡＡＶ１（６ＪＣＲ）の構造から生成された。これらのモデルを電子密度に適合させ、ＣＯＯＴでＡＡＶｒｈ９１配列を反映するように修正した。最初の構築ステップの後、ＰＨＥＮＩＸソフトウェアパッケージに含まれるｐｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔプログラムを使用して、電子密度マップに対してモデルを精密化した。非結晶学的な二十面体対称性を有する完全なモデルを生成した。本発明者らは、剛体フィッティング、グローバル最小化、ローカルグリッドサーチ、及び異方性変位パラメータ（ＡＤＰ）の精密化を使用して、二次構造及び非結晶学的対称性（ＮＣＳ）の制約の下で精密化を行った。

ＡＡＶカプシドのアミノ酸の修飾についての質量分析（ＭＳ）
試薬
重炭酸アンモニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。アセトニトリル、ギ酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、８Ｍの塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ）、及びトリプシンは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。

トリプシン消化
１ＭのＤＴＴ及び１．０Ｍのヨードアセトアミドのストック溶液を調製した。カプシドタンパク質を、１０ｍＭのＤＴＴ及び２ＭのＧｎｄＨＣｌの存在下で、９０℃で１０分間変性させ還元した。試料を室温に冷却し、次いで、暗所で、３０ｍＭのＩＡＭを用いて室温で３０分間アルキル化した。ＤＴＴを１ｍＬ添加して、アルキル化反応をクエンチした。最終ＧｎｄＨＣｌ濃度を２００ｍＭに希釈する量で、変性タンパク質溶液にｐＨ７．５～８の２０ｍＭ重炭酸アンモニウムを添加する。トリプシン対タンパク質の比率が１：２０になるようにトリプシン溶液を加え、３７℃で４時間インキュベートする。消化後、ＴＦＡを最終濃度が０．５％になるように添加し、消化反応をクエンチした。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
ＡｃｃｌａｉｍＰｅｐＭａｐカラム（長さ１５ｃｍ、内径３００μｍ）及びＮａｎｏＦｌｅｘ源（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱＥｘａｃｔｉｖｅＨＦと結合したＴｈｅｒｍｏＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＲＳＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてオンラインクロマトグラフィーを実行した。オンライン分析中、カラム温度を３５℃の温度で維持した。移動相Ａ（０．１％ギ酸を含むＭｉｌｌｉＱ水）及び移動相Ｂ（０．１％ギ酸を含むアセトニトリル）の勾配でペプチドを分離した。１５分間にわたって４％Ｂから６％Ｂへ、次いで、２５分間（合計４０分間）で１０％Ｂへ、その後４６分間（合計８６分間）で３０％Ｂへと勾配を実行した。試料をカラムに直接ロードする。カラムサイズは、７５ｃｍ×１５ｕｍの内径であり、２ミクロンのＣ１８媒体（ＡｃｃｌａｉｍＰｅｐＭａｐ）が充填される。負荷、導入、及び洗浄ステップにより、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実行の合計時間は約２時間であった。

ＭＳデータは、ＱＥｘａｃｔｉｖｅＨＦのデータ依存性Ｔｏｐ－２０法を使用して取得され、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から、最も豊富でまだ配列決定されていない前駆体イオンが動的に選択された。配列決定は、予測自動ゲイン制御で決定され
た１ｅ５イオンの標的値で、より高いエネルギー衝突解離断片化を介して行われ、４ｍ／ｚのウィンドウで前駆体の単離を行った。サーベイスキャンは、ｍ／ｚ２００、解像度１２０，０００で取得された。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注入時間が５０ｍｓ、正規化された衝突エネルギーが３０のｍ／ｚ２００で３０，０００に設定された。ＳレンズのＲＦレベルを５０に設定し、これにより、消化由来のペプチドが占めるｍ／ｚ領域が最適に透過される。単一、未割り当て、又は６以上の電荷状態を有する前駆体イオンを断片化選択から除外した。

データ処理
ＢｉｏＰｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒ１．０ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、取得したデータの分析に使用された。ペプチドマッピングのために、固定修飾として設定されたカルバミドメチル化、可変修飾として設定された酸化、脱アミド、及びリン酸化、質量精度１０ｐｐｍ、高プロテアーゼ特異性、ならびにＭＳ／ＭＳスペクトルに対する信頼水準０．８を用いて、単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベースを使用して検索を行う。ペプチドのパーセント修飾は、修飾ペプチドの質量面積を、修飾ペプチド及び天然ペプチドの面積の合計で割ることによって決定した。考えられる修飾部位の数を考慮すると、異なる部位で修飾されている等張種は、単一のピークで共移動し得る。したがって、複数の潜在的な修飾部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、複数の修飾部位を特定又は区別することができる。これらの事例では、観察された同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる修飾ペプチド異性体の相対存在量を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、修飾部位において独立していることを想定している。このアプローチにより、特定の修飾部位及び関連する潜在的な組み合わせの定義が可能となる。

統計分析
Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）バージョン７．０４を使用して、全ての統計分析を完了した。２群間の比較は、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して行い、複数の群間の比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、及びＤｕｎｎの多重比較検定）を使用して行った。

組織病理学
委員会認定の獣医病理学者は、試験物群を盲検化し、確立された病理学的重症度スコアを、病変の不在について０、最小（１０％未満）について１、軽度（１０～２５％）について２、中等度（２５～５０％）について３、顕著（５０～９５％）について４、及び重度（９５％超）について５と定義した。スコアは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した組織の顕微鏡での評価に基づいており、平均高倍率顕微鏡視野における病変によって影響を受けた組織の割合を表す。

ベクターゲノムコピー及び導入遺伝子ＲＮＡ分析
組織試料は、剖検時に急速凍結し、ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して抽出した。ＤＮａｓｅ処理した全ＲＮＡを、１００ｍｇの組織から単離した。ＲＮＡを、分光光度測定によって定量化し、アリコートを、ランダムプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写した。抽出されたＤＮＡ中のベクターＧＣ及び抽出されたＲＮＡ中の相対ヌクレアーゼＨＡＯ１転写物発現の検出及び定量化は、リアルタイムＰＣＲによって行った。簡潔には、ベクターのポリＡ配列及び導入遺伝子特異的配列に対してそれぞれ設計されたプライマー／プローブを使用して、ベクターＧＣ及びＲＮＡレベルを定量化した。

ＧＦＰタンパク質発現の定量化
横隔膜、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨格筋（上腕二頭筋、大腿二頭筋、三角筋、橈側手根伸筋、腓腹筋、大臀筋、肋間筋、大胸筋、腹直筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、僧帽筋、及び外側広筋を含む）、及び脾臓の試料をホモジナイズし、製造元の説明書に従って、酵素結合免疫吸着性アッセイ（ＥＬＩＳＡ；ａｂｃａｍａｂ１７１５８１）によってＧＦＰタンパク質のレベルを決定した。簡潔には、組織試料を５００μｌの１×細胞抽出緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離し、上清を抽出した。各試料について希釈した上清を、ＥＬＩＳＡプレートに２重に添加し、製造元の説明書に従ってアッセイを行った。上清のタンパク質濃度はまた、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡプロテインアッセイキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって決定した。ＧＦＰタンパク質レベルは、試料当たりの総タンパク質レベル（１ｐｇタンパク質当たりのμｇＧＦＰ発現）に正規化された。

免疫組織化学
組織試料を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、標準プロトコルに従ってパラフィン包埋し、免疫組織化学によるｅＧＦＰ発現の決定に使用した。切片を、エタノール及びキシレンシリーズを通して脱パラフィン化し、１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間沸騰させて、抗原賦活化を行い、２％のＨ_２Ｏ_２（１５分間）、アビジン／ビオチンブロッキング試薬（各１５分間、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及びブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中に１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１０分間）で順次ブロッキングした後、ＧＦＰに対する一次抗体（ヤギ抗体ＮＢ１００－１７７０、ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１：５００希釈）と４℃で一晩インキュベートした。切片を、ブロッキング緩衝液で希釈されたビオチン化抗ウサギ二次抗体（１：５００希釈、４５分；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とインキュベートした。３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質として使用するＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅＡＢＣキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、結合した抗体を、褐色沈殿物として可視化することを可能にした。

ＩＨＣ画像解析によるＧＦＰ発現の定量化
ＧＦＰの発現は、心臓、肝臓、及び腓腹筋からの、抗ＧＦＰ抗体で免疫標識された切片から定量化された。動物当たり最大３つの免疫標識切片を、ＡｐｅｒｉｏＡＴ２スキャナー（ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でスキャンし、５～１０の目的の領域を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．５３ｃ）を使用してＧＦＰシグナルの定量化のために選択した。ＧＦＰシグナルのバックグラウンドは、ナイーブ対照を使用して確立し、バックグラウンドを超えるＧＦＰシグナルを定量化し、次いで、切片領域に正規化した。

ヒト集団におけるＡＡＶｒｈ９１の血清有病率
１００個のランダムなヒト血清試料を、ＬｅｅＢｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＭａｒｙｌａｎｄＨｅｉｇｈｔｓ，ＭＯ）から取得した。以前に記載されているように、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ３２．３３、及びＡＡＶｒｈ９１に対するＮＡｂ力価を決定した（Ｃａｌｃｅｄｏｅｔａｌ．，２００９）。

実施例２：ＡＡＶ－単一ゲノム増幅（ＡＡＶ－ＳＧＡ）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり、非病原性及び弱免疫原性であるため、遺伝子療法のためのベクターとして有効な候補になる。第１世代のＡＡＶ（ＡＡＶ１～６）の発見以来、本発明者らの研究室は、様々な高等霊長類種から多数のウイルスを単離する努力を重ねてきた。本明細書で同定されたこの第２世代のＡＡＶは、霊長類由来のＡＡＶゲノムに特異的である保存領域に対するプライマーを使用して、バルクＰＣＲベースの技術を使用して単離された。ＡＡＶ－ＳＧＡを使用して、本発明者らは、天然の哺乳類宿主におけるＡＡＶの遺伝的バリエーションを探索した（図１）。

ＡＡＶ－ＳＧＡは、単一のウイルスゲノムを混合集団内から高精度に単離するために使用することができる強力な技術である。この研究では、本発明者らは、アカゲザル組織標本から新規のＡＡＶゲノムを同定するためにＡＡＶ－ＳＧＡを使用した。新規のウイルス分離株は、遺伝的に多様であり、クレードＤ、Ｅ、及びフリンジクレードに分類することができる（図２）。

ベクター収率及びインビトロ形質導入の分析
全ての新規のカプシド配列を使用して、遺伝子送達ベクターを生成した。各カプシドＶＰ１配列を、標準的なＡＡＶ２Ｒｅｐ遺伝子を含むトランスプラスミドにクローニングした。このトランスプラスミドを、ベクター導入遺伝子を含む様々なシスプラスミド、並びにＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションベクターの産生方法のためのアデノウイルスヘルパープラスミドと組み合わせて使用した。精製されたベクターの力価を、ＤＮＡｓｅＩ処理後のドロップレットデジタルＰＣＲによって測定して、ベクターにカプシド化された導入遺伝子の量を決定した。

ユビキタスプロモーター（ＣＢ７）の制御下でホタルルシフェラーゼ導入遺伝子を含むベクターを使用して、本発明者らは、２つのヒト細胞型で新規のカプシドのインビトロ形質導入の能力を試験した。Ｈｕｈ７は、肝臓由来の細胞株であり、ＨＥＫ２９３は、腎臓由来の細胞株である。ベクターは、主に、ＨＥＫ２９３細胞よりも高い効率でＨｕｈ７細胞を形質導入した。Ｈｕｈ７細胞では、ＡＡＶ６．２及びＡＡＶ７は両方とも、それらの新規カプシド対応物よりも有意に高いルシフェラーゼ活性、形質導入のレベルの直接読み取り値を示した（図５Ａ）。全てのカプシドは、使用された用量では、同様に低いレベルでＨＥＫ２９３細胞を形質導入した（図５Ｂ）。

新規のカプシドは、ＡＡＶｒｈ９１（図６Ａ）を除いて、それらのクレード対照と同様の効率で導入遺伝子をパッケージングした。ＡＡＶｒｈ９１ベースのベクターは、ＡＡＶ６ベースのベクターよりも有意に高い収率でベクターを産生した。ＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ１カプシドにおけるベクター産生に対するパッケージングされた導入遺伝子の種類の効果を考慮すると、同じ導入遺伝子を含むＡＡＶ１調製物よりも、ＡＡＶｒｈ９１調製物の力価が等しいか、又は１～２倍高いことが観察されたが、統計的有意性の検定は、低い反復数のために全ての群で実施することができなかった（図６Ｂ）。

ＡＡＶｒｈ９１カプシドを、以前に記載されているように、脱アミド化及び他の修飾について分析した（ＰＣＴ／ＵＳ１９／０１９８０４及びＰＣＴ／ＵＳ１９／２０１９／０１９８６１を参照されたい）。図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃに示されるように、結果は、ＡＡＶｒｈ９１が、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンに対応する、高度に脱アミド化されている３つのアミノ酸（Ｎ５７、Ｎ３８３、Ｎ５１２）を有することを示した（配列番号２のようなＡＡＶｒｈ９１の番号付け）。残基Ｎ３０３、Ｎ４９７、及びＮ６９１でのより低い脱アミド化率、ならびにＳ１４９でのリン酸化が一貫して観察された。

げっ歯類における新規ＡＡＶカプシドのインビボ形質導入
次に、マウスにおいて、５つの新規カプシドの組織向性を特徴付けた。全てのカプシドを、ユビキタスプロモーターであるＣＢ７又はＣＭＶ、並びに３つのマウス実験での試験のための強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）又はβ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）レポーター導入遺伝子のいずれかを含む遺伝子送達ベクターとして産生した。

ベクターの全身形質導入能を試験するために、本発明者らは、静脈内（ＩＶ）尾静脈投与経路（ＲＯＡ）を介して、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射した。ベクターは、ＣＢ７．ｅＧＦＰ導入遺伝子を含み、マウス当たり１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）の用量で注射
した。肝臓、心臓、脳、及び骨格筋の免疫蛍光顕微鏡検査は、ＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ６．２ベクターのｅＧＦＰ発現において同様の傾向を示した（図１４）。

ＢＢＢをバイパスし、ＣＮＳ組織における形質導入を促進するために、各ＣＢ７．ｅＧＦＰベクターを、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＣＳＦを含む側脳室に、ＩＣＶＲＯＡで注射した。クレードＡベクターを除いて、全てのカプシドを、マウス当たり１×１０^１１ＧＣの用量で投与した。クレードＡベクターは、マウス当たり６．９×１０^１０ＧＣで投与した。ＡＡＶ６．２の製造収率が低かったため、この群については適切なベクター濃度を達成することができなかった。

注射の１４日後、肝臓、心臓、骨格筋、及び最も重要なことに、脳におけるベクターゲノムの生体分布をアッセイした（図８Ｄ）。平均して、ＡＡＶ６．２及びＡＡＶ７の脳ＧＣレベルは、それぞれ新規のカプシド対応物であるＡＡＶｒｈ９１並びにＡＡＶｒｈ９３及びＡＡＶｒｈ９１．９３よりも高かったが、これらのデータは統計的に有意ではなかった。また、より多量のＡＡＶｒｈ９１ベクターゲノムが肝臓で見出されたことよって示されるように、送達後、対照カプシドＡＡＶ６．２よりもＡＡＶｒｈ９１でより多くのＧＣが末梢に逃れたことを観察した（図８Ｄ）。

本発明者らは、直接蛍光によってＩＣＶ注射された脳内における導入遺伝子の発現を定性的に分析し、新規カプシドと対照との間で様々なレベルの形質導入を観察した。クレードＡベクターであるＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ６．２は、脈絡叢及び脳室の上皮細胞の顕著な形質導入を示した（図１５）。

最後に、骨格筋細胞の形質導入のための筋肉内ＲＯＡによるベクター送達を試験した。この研究では、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス当たり３×１０^９ＧＣの用量でＣＭＶ．ＬａｃＺ導入遺伝子含有ベクターを注射した。β－ガラクトシダーゼ検出後の組織の顕微鏡検査により、クレードＡベクターであるＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶ１、及びＡＡＶ６による均一に強い筋細胞形質導入が明らかになった。対照的に、この用量では、ＡＡＶ８は、筋肉組織の不十分な形質導入を示した（図９Ｂ）。ＡＡＶｒｈ９１によるＩＭ送達はまた、血清中で、高レベルの検出可能なｍＡｂをもたらした（図１０）。図１１は、ｍＡｂ及びＬａｃＺベクターの様々な調製物の収率を示す。両方の導入遺伝子について、ＡＡＶｒｈ９１は、ＡＡＶ１及びＡＡＶ６と比較して、高い収率を有した。

全体として、これらの研究は、新規ＡＡＶｒｈ９１カプシドが、マウスにおいて様々な細胞型及び組織型を形質導入することができ、ＲＯＡに依存する固有の向性を示すことを示した。

実施例３：バーコード化導入遺伝子システムを使用した非ヒト霊長類における新規のＡＡＶ天然分離株の形質導入の評価
ＡＡＶベクターは、臨床応用において安全かつ効果的な遺伝子導入ビヒクルであることが示されてきたが、ウイルスに対する既存の免疫によって阻害され得、組織向性が制限され得る。本発明者らは、バーコード化導入遺伝子法が、複数のＡＡＶ血清型による単一の動物における様々な組織の形質導入を同時に比較するのに有効であることを実証した。この技術は、使用した動物の数を削減し、外来導入遺伝子関連の免疫応答を防止する。したがって、新規のカプシド及びそれらのそれぞれの原型的なクレードメンバー対照（ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ３２．３３、及びＡＡＶ９）を、転写物のポリＡシグナルの前に、改変ｅＧＦＰ導入遺伝子及び固有の６塩基対バーコードを含むベクターへと作製した（図１２）。導入遺伝子を、ＡＴＧ配列モチーフの欠失によって修飾して、ポリペプチドの翻訳及び結果としての外来タンパク質に対する免疫応答を防止した。ベクターを、等量でプールし、カニクイザルにＩＶ又はＩＣＭ注入して（総用量：２×１０
^１３ＧＣ／ｋｇ（ＩＶ）及び３×１０^１３ＧＣ（ＩＣＭ））、新規カプシドの全身及び中枢神経系の形質導入パターンを評価した。全ての発現データは、プールされた割合のこのわずかな変動を制御するために、実際の入力比に対して正規化された。

プールされたベクターを、２つの異なるＲＯＡを使用して、２匹のカニクイザルに投与した。新規ＡＡＶカプシドの全身形質導入をアッセイするために、総用量が２×１０^１３ＧＣ／ｋｇのプールされたベクター混合物を、第１の動物に静脈内注射した。更に、大槽内（ＩＣＭ）注射を介した髄腔内（ＩＴ）送達アプローチを利用して、３×１０^１３ＧＣのベクター用量を、ＣＮＳ組織の直接標的化のための第２のＮＨＰのＣＳＦに送達した。ベクターが送達されてから３０日後、導入遺伝子ＲＮＡを抽出し、その後、注射材料と比較して、各試料からの各ベクターに対応するバーコード頻度を定量化することによって、各動物の様々な組織から導入遺伝子発現を分析した。

興味深いことに、肺及び膵臓組織において、ＡＡＶｒｈ９１は、ＡＡＶ６．２よりも高い導入遺伝子の発現レベルを有した（図１３Ａ）。また、ＡＡＶｒｈ９１は、ＡＡＶ６．２よりも高いレベルで筋肉組織を形質導入することも観察されたが、これは、膵臓又は肺における形質導入の増強ほど顕著ではなかった。この動物は、注射時にＡＡＶ７及びＡＡＶ９に対する既存の中和抗体のレベルが低かったため（それぞれ１：５及び１：１０の力価）、全ての組織におけるクレードＤ及びＦのカプシドのバーコード頻度は非常に低かった。平均して、全てのバーコードのうちの０．３～７％だけが、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ９３、及びＡＡＶｒｈ９１．９３導入遺伝子に由来していた。

ＩＣＭＲＯＡによってベクターを投与した動物では、クレードＡベクターであるＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ６．２が、ＣＮＳの組織並びに末梢の組織の両方において相対的に高い形質導入頻度を示した。これは、ベクターの一部が、ＩＣＭ送達後に全身循環に入ったことを示す（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）。この動物はまた、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９に対して、それぞれ１：１０、１：５、及び１：５の力価で低レベルの既存の血清中和抗体を有した。

これらの研究により、個々のＮＨＰにおける新規ＡＡＶカプシドの相対的な組織向性を効率的に評価することができ、全身及びＣＮＳを標的とする遺伝子療法用途の潜在的なベクターとしてのＡＡＶｒｈ９１が強調された。

実施例４：ＡＡＶｒｈ９１は、髄腔内送達後に強力なＣＮＳ形質導入プロファイルを示す。
分子バーコード化導入遺伝子法を使用して、全体的なＡＡＶベクターの組織形質導入をアッセイすることは、様々な臓器で相対発現レベルをスクリーニングするための効果的な方法である。しかしながら、同じ細胞を形質導入する多くの異なるベクターが存在し得るため、組織内の細胞向性を評価することは技術的に複雑であり得る。加えて、複数のベクターをプールする場合、個々のベクターの用量を無症状レベルに減少させることができるため、臨床応用に対するカプシドの有用性を評価することが困難になる。

ＡＡＶｒｈ９１ベクターのＣＮＳ内の細胞向性を完全に評価するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞における三重トランスフェクション法によってＣＢ７．ｅＧＦＰ導入遺伝子を含むベクターを生成し、１．６×１０^１３ＧＣのベクターを、ＩＣＭ注射を介してアカゲザルに注射した。同じ導入遺伝子を含むＡＡＶ１及びＡＡＶ９ベクターはまた、両方のベクターが十分に研究されていることから、対照として２つの追加の群に投与した。ＡＡＶ１は、ＡＡＶｒｈ９１と同じクレードであり、ＡＡＶ９は、現在のゴールドスタンダードであるＣＮＳ向性ベクターである。したがって、本発明者らは、臨床応用的に関連するモデル生物で、３つのカプシドの形質導入効率を比較しようと試みた。

ＩＣＭ注射の約４週間後、本発明者らは、ＧＦＰ免疫組織化学による導入遺伝子の発現を評価した。脳の前頭皮質、側頭皮質、及び後頭皮質において、広範なレベルのＡＡＶｒｈ９１ベクター媒介性遺伝子発現を、ＡＡＶ９よりも高いレベルで観察した（図１６Ａ）。側脳室のＣＳＦ産生性上衣細胞もまた、クレードＡベクターであるＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ１の両方によって強く形質導入された。対照的に、ＡＡＶ９ベクターを投与した動物では、この細胞型の有意な形質導入を見ることができなかった（図１６Ｂ）。脊髄の運動ニューロンにおけるＧＦＰの発現は、同様に、腰髄セグメントに存在するより強いＧＦＰ染色を有する３つのベクター全てによって形質導入された（図１６Ｃ）。興味深いことに、ＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ１を投与した動物の肝臓及び心臓組織では、ＧＦＰ発現の顕著な染色が観察された。これは、ベクターの一部がＣＳＦから全身循環に入ったことを示す。これらの末梢組織の形質導入は、ＡＡＶ９動物ではより弱かった（図１７）。

次に、免疫蛍光細胞定量分析を使用して、ＡＡＶ１及びＡＡＶ９と比較して、ＡＡＶｒｈ９１の細胞向性を評価した。哺乳類の脳は、ニューロンとグリアの２つの主要な細胞型で構成されている。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及びニューロン核タンパク質（ＮｅｕＮ）マーカーを使用して、それぞれ、脳組織切片において星状細胞（グリア細胞の主要なタイプ）及びニューロンを染色することができた（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。ＤＡＰＩ核染色で染色し、ＧＦＡＰ又はＮｅｕＮのいずれかとともにＧＦＰを形質導入して、脳内に存在する形質導入された星状細胞及びニューロンの数を決定した。

本発明者らは、平均して、ＡＡＶｒｈ９１が、脳のほとんどの領域において、ＡＡＶ９よりも約２～４倍高い割合で星状細胞を形質導入し、吻側領域から尾側領域への形質導入が顕著に増加することを見出した。尾側切片８Ｂ、９、及び１２－１では、ＡＡＶ１は、ＡＡＶ９よりも約２倍高いレベルで星状細胞を形質導入したが、主に前頭皮質及び側頭皮質を含む切片２、５、及び７では、レベルはＡＡＶ９とより類似していた（図１８Ｃ）。対照的に、ＡＡＶｒｈ９１とＡＡＶ９との間のニューロン形質導入の差は少なく、前者が後者よりも１．５～２．５倍高いレベルで形質導入した（図１８Ｄ）。特定の脳領域によって層別化した場合、全体的に同様の傾向が観察され、皮質、海馬、及び線条体のニューロンの約１％がＡＡＶｒｈ９１によって形質導入され、ＡＡＶ９による形質導入は０．２５～０．７％であった。興味深いことに、視床は、評価された脳領域の残りの部分よりも、両方のベクターによる形質導入のレベルがはるかに高かった（図１８Ｄ）。

全ての群におけるベクターゲノムの生体分布を、ｑＰＣＲによってアッセイした。本発明者らは、ＡＡＶｒｈ９１が、ＣＮＳからスクリーニングされたほとんどの組織で最も高いＧＣレベルを有することを見出した。ＡＡＶ９で形質導入された組織は、脊髄を除いて（全ての群において同等のＧＣの存在を示した）、ほとんどの組織においてＧＣ量が約１対数分減少した（図１９Ａ～図１９Ｃ）。スクリーニングした全てのＣＮＳ組織におけるＧＣの平均生体分布を考慮すると、ＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ１を投与された動物は、ＡＡＶ９ベクターを投与された動物よりも有意に高いレベルの形質導入を有した（図２０）。

興味深いことに、クレードＡのＧＦＰ発現ベクターを投与された４匹の動物は、剖検時にＤＲＧ及び末梢神経の病理（ＡＡＶ媒介性ＤＲＧ毒性を示す）を示した。本発明者らは、最高の形質導入レベルのＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ１を有した動物が、様々な末梢神経、ＤＲＧ、脊髄領域、及び肝臓において、全体的により高いグレードの病理を有することを見出した。注目すべきことに、ＡＡＶ１を投与した１匹のＮＨＰ（ＲＡ３６５４）は、研究２１日目に軽度の臨床所見（両方の後肢に意識性固有感覚欠陥及び後肢失調）を示した。これらの臨床所見は、コルチコステロイド（プレドニゾロン）を投与した後、試験の残りの期間（２２～３０日目）にわたって解消された。

上記の研究は、天然源から単離され、インビトロ及びインビボで遺伝子導入ベクターとして試験された新規ＡＡＶカプシドの包括的な分析を提供する。新規カプシドは、表面に露出したＨＶＲと構造的に内部にあるＶＰ１及びＶＰ２の固有領域との両方において、アミノ酸配列が対照カプシドとは異なっていた。この配列の多様性は、宿主細胞の受容体への差次的結合を可能にし得、これは、異なるカプシド間の組織向性の変動をもたらす。加えて、ＶＰ１及びＶＰ２の固有領域内の配列の違いは、これらの領域が、核への導入遺伝子送達を媒介する様々な細胞質成分との相互作用に起因するため、ベクターの輸送における矛盾に寄与している可能性がある。カプシドの変異誘発技術を使用した更なる研究は、ＡＡＶ向性及び輸送に対するアミノ酸変異の効果を解明することができる。

新規カプシドと対照との間の違いは、ベクターパッケージングの違いにもつながる可能性がある。興味深いことに、本発明者らは、ＡＡＶｒｈ９１ベクターが、ＶＰ１タンパク質配列において１．１％の違いしかないにもかかわらず、ベクター収率に基づいて、ＡＡＶ６．２ベースのベクターよりも有意に高いレベルで導入遺伝子をパッケージングすることを見出した。また、ＡＡＶｒｈ９１が、ＡＡＶ１よりも高いレベルで導入遺伝子をパッケージングすることを見出した。

ＡＡＶ９は、ＣＮＳ向性ベクターとしてのその有用性のために最もよく研究されたＡＡＶカプシドのうちの１つであり、ＣＮＳ遺伝子療法のためのゴールドスタンダードと考えられている。マウスでは、静脈内送達後にＢＢＢを通過し、脳及び脊髄の細胞を高効率で形質導入することができることが示されている。また、小型動物モデル及び大型動物モデルの両方において、ＣＳＦへのＩＴ送達後のＣＮＳの局所的な形質導入におけるその有効性を実証する多数の研究があるが、脳におけるその形質導入は散在的である。ここで、本発明者らは、霊長類のＣＮＳを効果的に標的とする新規のＡＡＶカプシド、ＡＡＶｒｈ９１を同定した。その固有な上衣細胞形質導入の表現型は、分泌型の導入遺伝子が必要とされる疾患の治療に非常に有用であり得る。なぜなら、この細胞型は、導入遺伝子を、ＣＳＦに放出した後、脳室系全体にわたって循環させることができるからである。本発明者らはまた、ＡＡＶ１を使用してこの上衣細胞の形質導入パターンも観察したが、ＡＡＶｒｈ９１は、より高いレベルの全体的な脳の形質導入を有し、より良好な製造プロファイルを有する。興味深いことに、ＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ１群の肝臓及び心臓組織における形質導入細胞の頻度は、ＡＡＶ９群と比較して高いことが観察された。ＡＡＶｒｈ９１はまた、少なくともＡＡＶ９に匹敵する効率的な実質形質導入も示す。全体として、試験した脳領域の大部分において、ＧＣの生体分布及び形質導入のレベルがＡＡＶ９のそれよりも大きいことから、ＡＡＶｒｈ９１は、ＡＡＶ９の代わりに、臨床応用の遺伝子療法研究のための治療用導入遺伝子のＩＴ送達に強く考慮されるべきである。

実施例５：ヒト集団におけるＡＡＶｒｈ９１の血清有病率
本発明者らは、最大１００個のランダムなヒト血清試料を使用して、ヒト集団におけるＡＡＶｒｈ９１に対する抗カプシドＮＡｂの血清有病率を評価した（図２１Ａ）。また、比較のために、同じ試料のうちの少なくとも５０の試料でＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶｒｈ３２．３３に対するＮＡｂを評価した。ＡＡＶｒｈ９１は、ここで評価されたヒト試料において、ＡＡＶ８（４２％）と同様の血清有病率（３７％）を有し、ＡＡＶ９（６０％）と比較して減少した。ＮＡｂ応答の大きさを調べたところ、ＡＡＶｒｈ９１に対して陽性であった試料のうち、低い陽性範囲（１／５～１／１０のＮＡｂ力価）にあった試料はほとんどなかった。対照的に、他のカプシドに対するＮＡｂ応答の大きさの広がりはより広範囲に広がり、増加した試料は低陽性範囲で報告された（図２１Ｂ）。

実施例６：全身投与後のＡＡＶｒｈ９１の生体分布
本発明者らは、ＡＡＶｒｈ９１カプシドの生物学的特性を、動物モデルへの全身投与後
のＡＡＶベクターとして特徴付けようと試みた。様々な組織形質導入特性は、ＩＶ送達後、マウス及びアカゲザルの両方において、インビボで観察された。

ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９と比較した全身投与後のマウスにおけるＡＡＶｒｈ９１の生体分布
小型動物モデルにおけるＡＡＶｒｈ９１の生体分布及び形質導入プロファイルを評価するために、ＣＢ７プロモーターからｅＧＦＰを発現する１０^１１又は１０^１２ＧＣのベクターをＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにＩＶ投与した。マウスにも、同じ用量のＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９ベクターを投与した。ベクター投与後２１日目にマウスを剖検し、肝臓、心臓、及び骨格筋（腓腹筋）を採取した。ＤＮＡ及びＲＮＡの単離後、試料を、それぞれ、ベクターゲノムコピー及びベクター由来ＲＮＡ転写物レベルについて評価した（図２２Ａ～図２２Ｆ）。

評価した全ての組織（肝臓、心臓、及び骨格筋）について、評価した４つのカプシド全てについて、ベクターゲノムコピーの用量依存的な増加があった。ＡＡＶ８ベクターの投与は、肝臓における最高のベクターゲノムコピー及び導入遺伝子の発現をもたらした。興味深いことに、ＡＡＶ１と比較して、高用量（１０^１２ＧＣ／動物）において肝臓におけるＡＡＶｒｈ９１ゲノムコピーの数が減少しているようにみえ、肝臓からのこのカプシドの潜在的な脱標的化が示唆された。ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ９１ベクターの導入遺伝子のＲＮＡレベルにおいて用量効果は検出されなかった。

心臓及び骨格筋において、本発明者らは、評価した他のベクターよりも高いゲノムコピーをＡＡＶｒｈ９１で観察した。ＡＡＶｒｈ９１は、心臓においてＡＡＶ９ほど高度に発現しなかったが、ＡＡＶ８と同様であった。興味深いことに、骨格筋におけるＡＡＶ１、ＡＡＶ９、及びＡＡＶｒｈ９１の導入遺伝子の発現は類似していた。剖検時に組織試料を採取して、蛍光によるＧＦＰの発現の評価を行った。導入遺伝子のタンパク質発現は、肝臓、心臓、及び骨格筋（腓腹筋）にわたってＲＮＡレベルと相関した。

全身投与後のアカゲザルにおけるＡＡＶｒｈ９１の評価
大型動物モデルにおける全身投与後のＡＡＶｒｈ９１の生体分布及び形質導入プロファイルを評価するために、３匹のアカゲザルに５×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰを投与した。追加の３匹のアカゲザルを、同じ用量のＡＡＶ９で投与して、ＡＡＶｒｈ９１を、現在のクラス最高のベクターの全身生体分布と直接比較した。

ベクターのＩＶ投与後、全てのＮＨＰを、臨床病理学上の変化について監視した（図２６Ａ及び図２８Ｂ）。記録された変化のいずれも統計的有意性に達しなかったが、３日目は、ＡＬＴ、ＡＳＴ、及び総ビリルビンの上昇があり、ＡＡＶ９を投与した動物でより大きかった。これらの上昇は、７日目以降に急速にベースラインレベルに戻り、ＡＡＶｒｈ９１を投与したＮＨＰでは、１４日目にＡＬＴ及びＡＳＴで生じた上昇がより小さかった。総ビリルビンレベルはまた、１４日目に、多くの動物で再びピークに達し、ＡＡＶ９を投与された１匹の動物（１８－０１７）は、５．８ｍｇ／ｄｌに上昇した。この動物は黄疸を呈し、皮下液体を投与されたが、それ以外は安定していた。総ビリルビンのこの二次的な上昇は、肝臓におけるＧＦＰの発現及び非自己タンパク質に対するその後の応答による可能性が高い。３日目に評価した両方のカプシドにわたって凝固時間（ＰＴ及びＡＰＴＴ）がわずかに延び、ＡＡＶｒｈ９１を投与した動物では血小板数の幾分の低下が見られた。

ベクター投与後２１日目にＮＨＰを剖検し、組織を採取した。サンプリングの問題による変動を低減するために、横隔膜、腎臓、及び脾臓を除く各組織からのいくつかの試料を評価し、１匹のＮＨＰ当たり１つの試料のみを評価した。心臓から左右の心室の両方を評
価し、肝臓の３つの葉（左、中、右）、左右の肺、及び１３の骨格筋（上腕二頭筋、大腿二頭筋、三角筋、橈側手根伸筋、腓腹筋、大臀筋、肋間筋、大胸筋、腹直筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、僧帽筋、及び外側広筋）の試料を、カプシド当たり３匹のＮＨＰから評価した。

ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ９１は、全身注射後、かなり類似したベクター生体分布プロファイルを有し、肝臓において最も多くのベクターゲノムが検出された（図２３Ａ）。カプシド間の差は統計的に有意ではなかったが、ＡＡＶ９を投与したＮＨＰは、肝臓において２．５倍より高いベクターゲノムコピーを有した（平均８１．６ＧＣ／二倍体ゲノム、対してＡＡＶｒｈ９１を投与したＮＨＰについては３２．６ＧＣ／二倍体ゲノム）。他の末梢臓器（心臓、腎臓、肺、骨格筋、及び脾臓）におけるゲノムコピーは、肝臓におけるものよりも最大２対数分低かったが、ＡＡＶｒｈ９１の値は、ＡＡＶ９の値よりもわずかに高かった。

導入遺伝子が静脈内投与後に発現されていた場所を更に評価するために、導入遺伝子のＲＮＡコピー及びＧＦＰタンパク質の発現を評価した（図２３Ｂ、図２３Ｃ、及び図２３Ｄ）。ＡＡＶ９は、腎臓、肝臓、肺、及び脾臓においてより高い導入遺伝子のＲＮＡレベルを有したが、ＡＡＶｒｈ９１は、横隔膜、心臓、及び骨格筋において、ＡＡＶ９のＲＮＡレベルを上回った（図２３Ｂ）。ＧＦＰタンパク質の発現を、ＥＬＩＳＡ（図２３Ｃ）又はＩＨＣで検出されたＧＦＰ発現の画像定量化（図２３Ｄ）のいずれかによって評価した場合、これらの傾向は保持された。ＡＡＶ９ベクターを投与され、１４日目に血清総ビリルビンレベルの顕著な上昇を有した動物１８－０１７は、肝臓において、一貫して、低いベクターゲノムコピー、低い導入遺伝子のＲＮＡレベル、及びほぼ不在のＧＦＰタンパク質発現を有した。これは、非自己の導入遺伝子に対する免疫応答が、形質導入された肝細胞の枯渇した導入遺伝子の発現及びクリアランスをもたらすことを示す。組織病理学では、最も重度の肝臓毒性（肝細胞変性及び個々の細胞壊死）が動物１８－０１７及び１８－０２２（２／３、ＡＡＶ９）で観察されたことが明らかになった。群間で比較すると、ＡＡＶｒｈ９１ベクターを投与された動物（最小～軽度）と比較して、ＡＡＶ９ベクターを投与された動物（中等度～顕著）において、肝臓毒性の重症度が増加した（図２５）。

ＮＨＰごとに採取された１３の骨格筋試料の各々におけるベクターゲノムコピー、導入遺伝子のＲＮＡレベル、及びＧＦＰ発現の更なる分析は、ＡＡＶｒｈ９１遺伝子導入及び導入遺伝子発現の一貫性を示した。評価した骨格筋群にわたって、ベクターゲノムコピーは、ＡＡＶｒｈ９１の投与後、ＡＡＶ９と比較して、一貫して０．５～４．６倍増加したが、合わせたデータでは、その違いが統計的有意性に達しなかった（図２４Ａ）。また、導入遺伝子ＲＮＡ（図２４Ｂ）及びＧＦＰ発現（図２４Ｃ）の変動の増加により、ＡＡＶｒｈ９１による導入遺伝子発現の増加の傾向も統計的有意性に達し得なかった。

小型動物モデル及び大型動物モデルの両方におけるこれらの研究は、天然源から単離され、遺伝子導入ベクターとして評価された新規のＡＡＶカプシドであるＡＡＶｒｈ９１の包括的な分析を提供する。マウス及びアカゲザルの両方において、ＡＡＶｒｈ９１は、ＡＡＶ９と比較して、増加しないにしても、同様の骨格筋の形質導入を有する。本発明者らはまた、ＡＡＶｒｈ９１ベクターが、肝臓において、評価した他のＡＡＶカプシドよりも少なく導入遺伝子を発現することを観察した。ＡＡＶｒｈ９１カプシドによる肝臓のこの潜在的な脱標的化は、ＡＡＶｒｈ９１ベクターが、全身注射後の肝臓毒性に関して、カプシドよりも有利であり、結果として肝臓における導入遺伝子の発現が減少することを示唆し得る。

実施例７：非ヒト霊長類へのＩＣＭ投与後のＡＡＶｒｈ９１の生体分布
更なる研究を実施して、アカゲザルへの大槽内（ＩＣＭ）投与後のＡＡＶｒｈ９１カプ
シドによる導入遺伝子送達を評価した。

最初の研究では、３×１０^１３ＧＣ／ｋｇのｅＧＦＰ導入遺伝子を担持するベクター（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｅＧＦＰ又はＡＡＶ９．ＣＢ７．ｅＧＦＰ）を、ＮＨＰ（ｎ＝３／群）に送達した。投与後１４日目に、剖検を実施した。神経伝導速度の評価を、ベースラインで、及び１４日目の剖検の前に行った（図３２）。図２８Ａ～図２８Ｃに、生体分布プロファイル及び形質導入プロファイルの比較を示す。免疫組織化学を行って、脳（図３１Ａ～図３１Ｃ）、脊髄（図３０Ａ～図３０Ｇ）、及び後根神経節（ＤＲＧ）（図２９Ａ～図２９Ｉ）におけるＧＦＰ陽性ニューロンを定量化した。ＡＡＶｒｈ９１を投与したＮＨＰにおいて、ＤＲＧでより少ない導入遺伝子の発現が観察された（ＡＡＶ９と比較して）（図２９Ａ～図２９Ｉ）。これらの知見は、ＩＣＭ経路を介したＡＡＶｒｈ９１遺伝子送達が、ＡＡＶ９よりも少ないＤＲＧ毒性と関連している可能性が高いことを示唆する。

更なる研究では、抗体導入遺伝子（２．１０ＡｍＡｂ）を担持する３×１０^１３ＧＣ／ｋｇのベクター（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．２．１０Ａ又はＡＡＶ９．ＣＢ７．２．１０Ａ）を、ＮＨＰ（ｎ＝３／群）に送達した。血清及びＣＳＦを、２．１０ＡｍＡｂの発現について監視した（図３３Ａ及び図３３Ｂ）。ベクター投与後９０日目に剖検を行い、ベクターの生体分布の分析のために組織を採取した（図３４Ａ及び図３４Ｂ）。

実施例８：ＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ１カプシドを比較するＣｒｙｏ－ＥＭ構造データ
ＡＡＶｒｈ９１ベクターの改善された特性に関する機構的洞察を提供するために、本発明者らは、低温電子顕微鏡法を使用して、このベクターの構造を２．３３Åの分解能で解析した。本発明者らは、その構造を、臨床試験で最も広く使用されているクレードＡのベクターであるＡＡＶ１の以前に公開されている構造と比較した。ＡＡＶｒｈ９１は、１１のアミノ酸位置でＡＡＶ１とは異なり、そのうち６つは、カプシドのＶＰ３タンパク質に位置し、表面に露出している。図３５Ａ～図３５Ｆを参照されたい。

結果
ＡＡＶｒｈ９１のＡｓｐ４１８及びＡＡＶ１のＧｌｕ４１８は、他の荷電残基であるＡｒｇ３０８、Ｌｙｓ３１０、及びＧｌｕ６８６に近接し、ＡＡＶカプシドの内部表面に位置する溶媒に露出した残基である（図３５Ａ）。Ａｓｐ及びＧｌｕはどちらも、酸性残基であり、中性ｐＨで負電荷を有し、両方の構造で同様の確認を採用していることがわかる。位置４１８の周囲の荷電残基の構造変化は観察されない。全体として、Ｇｌｕ４１８からＡｓｐ４１８への変化は非常に保存的であり、カプシド機能への影響はほとんどない可能性が高い。

ＡＡＶｒｈ９１のＡｓｎ５４７及びＡＡＶ１のＳｅｒ５４７は、ＡＡＶカプシドの外側表面のＨＶＲＶＩＩに位置する溶媒に露出した残基であり、他のアミノ酸に近接していない（図３５Ｂ）。どちらも極性アミノ酸であり、中性ｐＨでは無電荷であるが、異なる官能基を有する。Ａｓｎは、側鎖にカルボニル及びアミン官能基を含み、Ｓｅｒは、単一のヒドロキシル基を含む。カプシドの外側でのそれらの溶媒への曝露は、これらの残基が細胞受容体と相互作用するために利用可能であることを意味するが、これまでのところ、この位置の残基についてＡＡＶの構造機能相関は明らかにされていない。全体として、この変化も保存的であるが、アミノ酸間の官能基の違いは、カプシド機能に影響を与える可能性を有する。

ＡＡＶｒｈ９１のＬｅｕ５８４、及びＡＡＶ１のＰｈｅ５８４は、ＡＡＶカプシドの外側表面のＨＶＲＶＩＩＩに位置する溶媒露出残基であり、Ａｒｇ４８５、Ａｒｇ４８８、Ｌｙｓ５２８、Ｇｌｕ５３１、Ｐｈｅ５３４、Ｔｈｒ５７４、及びＧｌｕ５７５に近接
し、これらは全て、隣接する鎖上に位置する（図３５Ｃ）。Ｌｅｕは、小さい疎水性アミノ酸であり、Ｐｈｅは、大きい疎水性アミノ酸である。位置５８４に近接する残基は、Ｐｈｅ５３４（疎水性）及びＴｈｒ５７４（極性）を除いて、全て荷電アミノ酸である。ＡＡＶｒｈ９１において、より小さいＬｅｕ残基は、ＡＡＶ１のより大きいＰｈｅよりもこれらの近位の荷電残基に対して破壊的ではない可能性がある。この荷電ポケットへの混乱を軽減させることで、カプシドの安定性を高めるように機能することができる。この位置での鎖間接触の多さを考えると、位置５８４のＰｈｅからＬｅｕへの変化は、ＡＡＶ１と比較してＡＡＶｒｈ９１について観察される製造収率の増加を部分的に説明し得る。

ＡＡＶｒｈ９１のＡｓｎ５８８及びＡＡＶ１のＳｅｒ５８８は、ＡＡＶの３回対称スパイク構造の先端にある、ＡＡＶカプシドの外側表面のＨＶＲＶＩＩＩに位置する溶媒に露出した残基であり、他のアミノ酸に近接していない（図３５Ｄ）。上述のように、両方の残基は、中性ｐＨで非荷電であるが、カプシド／受容体相互作用に影響を与える可能性のある異なる官能基を有する極性アミノ酸である。位置５８８は、ＡＡＶ向性を変化させるためのタンパク質工学的な取り組みにおいてペプチド挿入に使用される一般的な位置であるという点で重要である。これは、その際立った位置及び高レベルの溶媒曝露が、細胞受容体との相互作用の可能性を増加させるためである。露出が増大しているため、このＳｅｒからＡｓｎへの変異は、位置５４７で観察される同じ変異よりもカプシド機能に影響を与える可能性がより高い。

ＡＡＶｒｈ９１のＶａｌ５９８及びＡＡＶ１のＡｌａ５９８もＨＶＲＶＩＩＩに位置するが、高度に溶媒に露出した場所にはない。代わりに、これらの小さな疎水性残基は、隣接する残基Ｔｙｒ４８４、Ｖａｌ５８０、Ｖａｌ５９６、Ｍｅｔ５９９、及びＬｅｕ６０２（図３５Ｅ）を有する疎水性ポケットの形成に関与する。これらの残基は、３つのＶＰ３タンパク質が一緒になるＡＡＶの３回対称軸の中心に位置し、隣接するペプチド鎖といくつかの接触を有する。ＡＡＶ１の位置５９８にあるＡｌａは、最小の疎水性アミノ酸であるが、ＡＡＶｒｈ９１のＶａｌ５９８はわずかにより大きく、より疎水性である。Ｖａｌ残基は、カプシドの安定性を改善する可能性がある、より小さいＡｌａの対応物よりも、この疎水性ポケット内の空間をよりよく充填するように見える。この疎水性ポケットの中心位置とその鎖間接触の数を考えると、位置５９８でのこのＡｌａ／Ｖａｌ置換は、ＡＡＶｒｈ９１で観察された製造上の利点の最も可能性の高い説明である。

ＡＡＶｒｈ９１のＨｉｓ６４２及びＡＡＶ１のＡｓｎ６４２は、極性残基Ｔｙｒ３４９及びＴｙｒ４１４並びに荷電残基Ｇｌｕ４１７及びＬｙｓ６４１に近接し、ＡＡＶカプシドの内面に位置する溶媒に露出した残基である（図３５Ｆ）。Ｈｉｓは、中性ｐＨで正電荷を担持する塩基性残基であり、Ａｓｎは、中性ｐＨで非電荷の極性残基である。位置６４２でのＡｓｎ／Ｈｉｓ置換は、周囲の親水性残基に観察可能な構造変化を誘導しない。全体として、Ａｓｎ６４２からＨｉｓ６４２への変化は、局所正電荷の増加をもたらすが、カプシドの内部のその位置及び周囲のカプシド構造に対する最小限の影響は、この変化がカプシド機能を劇的に変化させないであろうことを示唆する。

実施例９：ＡＡＶｒｈ９１ベクター産生の最適化
ＡＡＶｒｈ９１のベクター収率を改善するために、複数の戦略を利用して、ＡＡＶｒｈ９１のトランス産生プラスミドを改変した。

１つの戦略は、ＡＡＶｒｈ９１カプシドの遺伝子配列を操作することであり、コドン使用を最適化することを含んだ。生成された配列（ｒｈ９１Ｍ１１３、ＡＡＶｒｈ９１ｅｎｇ、配列番号３）は、１１３ヌクレオチドで天然ＡＡＶｒｈ９１コード配列とは異なるが、同じアミノ酸配列をコードする。各バージョンについて、プラスミドを再形質転換し、１２ウェルプレートの個々の三重トランスフェクションについて、４つのクローンをラン
ダムに選択した。ベクター収率は、２つの方法：産生力価についてはｑＰＣＲ（図３６Ａ）、及び感染性力価についてはＨｕｈ７形質導入（図３６Ｂ）によって決定した。両方の測定を使用した反復実験で、ｒｈ９１Ｍ１１３が収率を改善することが観察されたが、その差異は統計的に有意ではなかった（ｐ値のいずれも０．０５未満ではなかった）。

第２の戦略は、トランスプラスミドに調節エレメントを追加することであった。本発明者らは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリＡ）シグナルのいずれか又は両方を含むプラスミドを生成した（図３７Ａ）。ベクター収率を、上記の方法を使用して評価した。結果は、調節エレメント（ＷＰＲＥ及びｂＧＨポリＡ、ＷＰＲＥ単独、及びｂＧＨポリＡ単独）を含めることで、ベクター収率が改善され得ることを示した（図３７Ｂ及び図３７Ｃ）。

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下のフリーテキストを含む配列に関して提供される。

本明細書に引用されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８４０，１８４０号、２０１９年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９１３，３１４号、２０１９年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９２４，０９５号、２０２０年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０６５，６１６号、２０２０年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１０９，７３４号、及び２０２０年４月２０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３０２６６号は、それらの配列表とともに、それらの全体が参照により組み込まれる。これとともに出願された「２１－９５４５ＰＣＴ＿ＳＴ２５」とラベルされた配列表並びにその中の配列及びテキストは、参照により組み込まれ
る。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に収まることが意図される。

Claims

対象の中枢神経系（ＣＮＳ）の１つ以上の標的細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、前記対象に、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、ＣＮＳの前記標的細胞における前記導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された前記導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することを含む、方法。
ＣＮＳの前記標的細胞が、実質細胞、脈絡叢の細胞、上衣細胞、星状細胞、及び／又はニューロン、任意選択的に、皮質、海馬、及び／又は線条体のニューロンである、請求項１に記載の方法。
前記導入遺伝子が、分泌型の遺伝子産物をコードする、請求項１又は２に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが、任意選択的に、大槽内（ＩＣＭ）注射を介して、髄腔内に送達される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが、実質内投与を介して送達される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
導入遺伝子を含むＡＡＶベクターを髄腔内投与した後、対象の肝臓への前記導入遺伝子の送達を改善するための方法であって、前記対象に、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、肝臓の前記標的細胞における前記導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された前記導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含む組換えＡＡＶベクターを、ＩＣＭ注射を介して投与することを含み、肝臓の形質導入のレベルが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、及び／又はＡＡＶ６．２のカプシドを有するＡＡＶベクターで達成されたものと比較して増加する、方法。
対象にＡＡＶベクターを全身投与した後、肝臓を脱標的化し、かつ／又は肝臓毒性を減少させるための方法であって、前記対象に、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、肝臓の細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された前記導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含む組換えＡＡＶベクターを、静脈内注射を介して投与することを含み、前記ＡＡＶベクターの投与後に観察される肝臓の形質導入のレベル及び／又は肝臓毒性が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及び／又はＡＡＶ９カプシドを有するＡＡＶベクターと比較して減少する、方法。
前記ＡＡＶｒｈ９１カプシドが、配列番号２のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＡＡＶｒｈ９１カプシドが、配列番号１若しくは３のヌクレオチド配列、又は配列番号１若しくは３のヌクレオチド配列を少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％共有する配列の発現によって産生されるカプシドタンパク質を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＡＡＶｒｈ９１カプシドが、カプシドタンパク質を含み、前記カプシドタンパク質が、配列番号１又は３のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記ＡＡＶｒｈ９１カプシドが、
（１）配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの
発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３から産生されるｖｐ１タンパク質、又は配列番号１若しくは３と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ１タンパク質の異種集団、
配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、又は配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ２タンパク質の異種集団、
配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、又は配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ３タンパク質の異種集団、並びに／あるいは
（２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含む、カプシドタンパク質を含み、前記ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、前記脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記カプシドタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３、又は配列番号１若しくは３と少なくとも８０％～少なくとも９９％同一の配列である、請求項１１に記載の方法。
前記核酸配列が、配列番号１又は３と少なくとも８０％同一である、請求項１１又は１２に記載の方法。
組換えＡＡＶを産生するために有用な組換えＡＡＶ産生系であって、
（ａ）位置４１８、５４７、５８４、５８８、５９８、及び／又は６４２（配列番号２と整列した場合）のうちの１つ以上にアミノ酸置換を有するＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｂ）ＡＡＶカプシドへのパッケージングに好適な核酸分子であって、前記核酸分子が、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、及び宿主細胞における産物の発現を指示する配列に作動可能に連結された遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、核酸分子と、
（ｃ）前記核酸分子の前記ＡＡＶカプシドへのパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶｒｅｐ機能及びヘルパー機能と、を含む、組換えＡＡＶ産生系。
前記（ａ）のヌクレオチド配列が、列挙された前記位置のうちの１つ以上で置換を有するクレードＡカプシドタンパク質をコードする、請求項１５に記載の系。
前記（ａ）のヌクレオチド配列が、列挙された前記位置のうちの１つ以上にアミノ酸置
換を有するＡＡＶ１、ＡＡＶｈｕ４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ４８、ＡＡＶｈｕ４４、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ．ＶＲ－１９５、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ６．２カプシドタンパク質をコードする、請求項１４又は１５に記載の系。
前記（ａ）のヌクレオチド配列が、位置４１８のＡｓｐ、位置５４７のＡｓｎ、位置５８４のＬｅｕ、位置５８８のＡｓｎ、位置５９８のＶａｌ、及び位置６４２のＨｉｓから選択される１つ以上のアミノ置換を有するカプシドタンパク質のアミノ酸配列をコードする、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の系。
前記（ａ）のヌクレオチド配列が、Ｇｌｕ４１８、Ｓｅｒ５４７、Ｐｈｅ５８４、Ｓｅｒ５８８、Ａｌａ５９８、及び／又はＡｓｎ６４２にアミノ酸置換を有する配列番号８（ＡＡＶ１）のアミノ酸配列をコードし、コードされた前記アミノ酸配列が、配列番号８と少なくとも９５％同一又は少なくとも９９％同一である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の系。
前記（ａ）のヌクレオチド配列が、位置４１８のＡｓｐ、位置５４７のＡｓｎ、位置５８４のＬｅｕ、位置５８８のＡｓｎ、位置５９８のＶａｌ、及び位置６４２のＨｉｓから選択される１つ以上のアミノ置換を有する配列番号８（ＡＡＶ１）のアミノ酸配列をコードし、コードされた前記アミノ酸配列が、配列番号８と少なくとも９５％同一又は少なくとも９９％同一である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の系。
前記産生系が、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞を含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の系。
組換えＡＡＶを生成する方法であって、宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞が、（ａ）位置４１８、５４７、５８４、５８８、５９８、及び６４２（配列番号２と整列した場合）のうちの１つ以上にアミノ酸置換を有するＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸分子と、（ｂ）機能的なｒｅｐ遺伝子と、（ｃ）ＡＡＶ５’ＩＴＲ、ＡＡＶ３’ＩＴＲ、及び導入遺伝子を含むミニ遺伝子と、（ｄ）ＡＡＶカプシドへの前記ミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含む、方法。
生成された前記組換えＡＡＶが、未修飾カプシドタンパク質と比較して、改善された産生収率、及び／又は変化した細胞若しくは組織向性を有する、請求項２１に記載の方法。
前記生成された組換えＡＡＶが、未修飾カプシドタンパク質と比較して、より高いレベルでＣＮＳの細胞を形質導入する、請求項２１又は２２に記載の方法。
前記（ａ）のヌクレオチド配列が、列挙された前記位置のうちの１つ以上に置換を有するクレードＡカプシドタンパク質をコードする、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
前記（ａ）のヌクレオチド配列が、前記列挙された置換のうちの１つ以上を有する、ＡＡＶ１、ＡＡＶｈｕ４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ４８、ＡＡＶｈｕ４４、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ．ＶＲ－１９５、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ６．２カプシドをコードする、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
前記（ａ）のヌクレオチド配列が、位置４１８のＡｓｐ、位置５４７のＡｓｎ、位置５８４のＬｅｕ、位置５８８のＡｓｎ、位置５９８のＶａｌ、及び位置６４２のＨｉｓから選択される１つ以上のアミノ置換を有するカプシドタンパク質のアミノ酸配列をコードする、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
前記（ａ）のヌクレオチド配列が、Ｇｌｕ４１８、Ｓｅｒ５４７、Ｐｈｅ５８４、Ｓｅｒ５８８、Ａｌａ５９８、及び／又はＡｓｎ６４２にアミノ酸置換を有する配列番号８（ＡＡＶ１）のアミノ酸配列をコードし、コードされた前記アミノ酸配列が、配列番号８と少なくとも９５％同一又は少なくとも９９％同一である、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
前記（ａ）のヌクレオチド配列が、位置４１８のＡｓｐ、位置５４７のＡｓｎ、位置５８４のＬｅｕ、位置５８８のＡｓｎ、位置５９８のＶａｌ、及び位置６４２のＨｉｓから選択される１つ以上のアミノ置換を有する配列番号８（ＡＡＶ１）のアミノ酸配列をコードし、コードされた前記アミノ酸配列が、配列番号８と少なくとも９５％同一又は少なくとも９９％同一である、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
対象の中枢神経系（ＣＮＳ）の１つ以上の標的細胞への導入遺伝子の送達に使用するための組換えＡＡＶベクターであって、前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、ＣＮＳの前記標的細胞における前記導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された前記導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含む、組換えＡＡＶベクター。
ＣＮＳの前記標的細胞が、実質細胞、脈絡叢の細胞、上衣細胞、星状細胞、及び／又はニューロン、任意選択的に、皮質、海馬、及び／又は線条体のニューロンである、請求項２９に記載の使用のための組換えＡＡＶベクター。
前記導入遺伝子が、分泌型の遺伝子産物をコードする、請求項２９又はに記載の使用のための組換えＡＡＶベクター。
前記ＡＡＶベクターが、任意選択的に、大槽内（ＩＣＭ）注射を介して、髄腔内に投与される、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の使用のための組換えＡＡＶベクター。
前記ＡＡＶベクターが、実質内投与を介して送達される、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の使用のための組換えＡＡＶベクター。
導入遺伝子を含むＡＡＶベクターを髄腔内投与した後、対象の肝臓への前記導入遺伝子の送達に使用するための組換えＡＡＶベクターであって、前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、肝臓の標的細胞における前記導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された前記導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含み、肝臓の形質導入のレベルが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、及び／又はＡＡＶ６．２カプシドを有するＡＡＶベクターで達成されたものと比較して増加する、組換えＡＡＶベクター。
対象にＡＡＶベクターを全身投与した後、肝臓を脱標的化し、かつ／又は肝臓毒性を減少させるのに使用するための組換えＡＡＶベクターであって、前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶｒｈ９１カプシドと、肝臓の細胞における導入遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された前記導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含み、前記ＡＡＶベクターの投与後に観察される肝臓の形質導入のレベル及び／又は肝臓毒性が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及び／又はＡＡＶ９カプシドを有するＡＡＶベクターと比較して減少する、組換えＡＡＶベクター。
前記ＡＡＶカプシドが、配列番号２のアミノ酸配列（ＡＡＶｒｈ９１）を含むカプシドタンパク質を含む、請求項３４又は３５に記載の使用のための組換えＡＡＶベクター。
前記ＡＡＶカプシドが、配列番号１若しくは３のヌクレオチド配列、又は配列番号１又は３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を共有する配列の発現により産生されるカプシドタンパク質を含み、前記カプシド中に、異種核酸配列を含むベクターゲノムがパッケージングされている、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の使用のための組換えＡＡＶベクター。
前記ＡＡＶカプシドが、カプシドタンパク質を含み、前記カプシドタンパク質が、配列番号１又は３のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の使用のための組換えＡＡＶベクター。
前記ＡＡＶカプシドが、
（１）配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３から産生されるｖｐ１タンパク質、又は配列番号１若しくは３と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ１タンパク質の異種集団、
配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、又は配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ２タンパク質の異種集団、
配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、又は配列番号１若しくは３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ｖｐ３タンパク質の異種集団、並びに／あるいは
（２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含む、ＡＡＶカプシドタンパク質を含み、前記ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、前記脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の使用のための組換えＡＡＶベクター。
前記タンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１若しくは３、又は配列番号１若しくは３と少なくとも８０％～少なくとも９９％同一の配列である、請求項３９に記載の使用のための組換えＡＡＶベクター。
前記核酸配列が、配列番号１又は３と少なくとも８０％同一である、請求項３９又は４０に記載の使用のための組換えＡＡＶベクター。