CN117801116A - 一种融合型新型腺相关病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了一种融合型腺相关病毒及其在肺部和眼部中基因递送的作用。所述融合型腺相关病毒包含血清型AAV1和AAV6的肽段融合形成的融合肽段或其变体，在低剂量的用量下高效感染肺部，所述腺相关病毒也能高效地感染视网膜色素上皮(RPE)层，用于向眼部的基因递送。所述融合型腺相关病毒作为安全的载体，在治疗肺部或者眼部疾病中具有广泛的应用前景。

Description

一种融合型新型腺相关病毒及其应用
技术领域
本发明涉及一种生物医药领域，特别是涉及一种融合型腺相关病毒及其应用，尤其涉及在肺部或者眼部中异源基因递送的应用。
背景技术
当下基因相关的遗传性疾病全球患病人群高达3.5个亿，而其中约80％是直接由基因突变导致的。传统的药物治疗方法以大分子或小分子作用于蛋白靶点发挥药效，对于基因变异等遗传性疾病无法有效发挥治疗效果。而新兴的基因治疗方法，能将异源基因、小RNA或基因编辑等工具导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，无需化学药物干预、放射治疗或手术治疗，就能达到治疗目的。
目前基因治疗的策略包括基因替代、基因修正、基因增强、基因抑制和基因失活，这些无一例外均需要基因转移。目前基因转移的方法有物理、化学和生物三大类，其中生物转移在人类细胞中应用最为广泛。生物法主要是指病毒介导的基因转移，以病毒为载体将异源基因通过重组技术与病毒重组，感染受体细胞以表达目的基因治疗疾病。近几十年来，病毒载体介导的基因疗法已被广泛应用于临床试验，以治疗心血管、肌肉、代谢、神经系统、血液、感官以及感染性疾病和癌症。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，属于微小病毒科，是目前发现一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒,其复制过程通常需要辅助病毒参与。腺相关病毒作为异源基因导入的病毒载体，具有多方面的显著优势。其一，腺相关病毒是非致病性微生物，具有很高的生物安全性；其二，腺相关病毒不仅可以感染分裂细胞，还可以感染非分裂期细胞，其适用的宿主范围非常广；此外，腺相关病毒的基因组仅有5kb左右，便于重组改造和操作；另外，腺相关病毒的物理性质稳定，易于保存，56℃高温及pH3-9范围波动均不影响其感染活性。上述特点，促使腺相关病毒被广泛用为基因转移载体，成为了基因治疗研究的热点。美国FDA在2017年宣布通过了Spark Therapeutics公司治疗遗传性视网膜营养不良(IRD)的药物Luxturna的申请许可，成为第一款获批的利用AAV作为载体的基因治疗药物。这种基因疗法能够通过AAV介导修复IRD患者缺失的PRE65基因，改善患者的感光能力和视野，达到改善功能视力的效果。该研究有力地证明了AAVs在基因治疗领域的光明前景。
肺是基因治疗重要的靶器官，其中肺部容易产生最常见的遗传性疾病，如囊性纤维化(CF)和α1-抗胰蛋白酶缺乏症(α1AT)，同时，肺癌也是人类最常见的死亡原因。迄今为止，已经批准了大约400个用于人类基因治疗的临床方案，其中大约10％的方案针对肺部疾病。目前从这些人体试验中获得的数据已经成功地证明了将基因转移到人类肺部是可能的，并且过度表达异源基因以治疗或控制肺部疾病的策略具有潜在的前景。迄今为止，通过病毒载体向肺部递送异源蛋白或者核酸的方式会有受限于目前的载体感染效率低，在低剂量条件下无法形成有效的感染，因此在治疗疾病的时候需要更高剂量的病毒，而高剂量的病毒具有更大的安全风险，因此，需要不断开发优化高效且特异的新型重组腺相关病毒，提高药效，降低安全隐患。
另外，全世界约有五百万人患有先天性视网膜营养不良，这通常会在幼年时期就导致失明。这些疾病往往是由特定的基因突变导致，目前已经发现了大约150个此类基因突变，这些突变会导致感光细胞或形成视网膜色素上皮的细胞功能丧失，从而导致失明。但目前基于AAV病毒载体的眼病基因治疗，都需要将病毒载体直接注射到视网膜下，这种技术只有在拥有高水平专家和设备的专科医院才能进行，并且这种注射方式存在损坏脆弱的视网膜组织的风险。该方法的另一个缺点是由于AAV病毒横向扩散能力较弱，每次注射只能靶向注射点附近的一小部分细胞。因此，需要开发出更好的适用于眼病基因治疗的病毒载体，可以通过微创给药就能更有效靶向视网膜感光细胞，以更安全更高效地治疗遗传性失明。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种融合型腺相关病毒，用于解决目前AAV病毒低剂量感染条件下肺部感染效率低，高剂量感染下安全风险高以及在视网膜等组织病毒递送困难的问题，用于基因治疗。本发明将改造的融合型新型腺相关病毒载体在体感染小鼠的肺近端和肺远端，能够介导目的基因在病毒低剂量感染下特异性在肺部细胞中表达。该新型腺相关病毒在肺部细胞的结构与功能分析、疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。同时，该将病毒通过玻璃体注射到小鼠眼球中发现，该病毒载体具有较目前现有载体更优异的感染特性，在眼科细胞的结构与功能解析、疾病模型建立和基因治疗等方面同样具有广泛的应用价值和市场前景。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白，融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白包含血清型AAV1和AAV6的融合肽段或其变体。
本发明还提供一种核酸，所述核酸编码如所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白。
本发明还提供一种构建体，所述构建含有所述的核酸。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所诉的构建体或基因组中整合有异源的所述的核酸，或所述宿主细胞包含所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03。
本发明还提供一种融合型腺相关病毒AAV-WM03，所述融合型腺相关病毒的衣壳结构包含任一种所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白。
此外，本发明还提供一种融合型腺相关病毒载体系统，包含包装质粒，辅助质粒。所述包装质粒包含所述的核酸、所述核酸的片段和所述的构建体。
本发明还提供一种融合型腺相关病毒，所述融合型腺相关病毒由所述融合型腺相关病毒载体系统经病毒包装获得。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合包含所述的融合型腺相关病毒以及药学上可接受的辅料。
最后，本发明还提供所述融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白、核酸、构建体、融合型腺相关病毒、宿主细胞、融合型腺相关病毒载体系统、药物组合物或偶联物在制备治疗疾病的药物中的用途；优选地，在制备基因治疗疾病的药物中的用途；更优选地，在制备肺部疾病或者眼部疾病的基因治疗药物中的用途。
如上所述，本发明的融合型新型腺相关病毒，具有以下优点及有益效果：(1)提供了一种在AAV病毒感染低剂量条件下可以高效感染肺部细胞的新型腺相关病毒AAV-WM03；(2)提供了一种新型腺相关病毒载体AAV-WM03，能够介导目的基因特异性地在成年小鼠视网膜RPE层中表达；(3)新型腺相关病毒载体AAV-WM03介导目的基因表达比传统的转基因方法更灵活，安全性更高，应用更方便，成本更低；(4)新型特异性的腺相关病毒载体AAV-WM03为开发精准治疗肺部及眼部相关疾病的基因疗法提供应用基础。
附图说明
图1a.AAV-WM03序列示意图。
图1b.AAV-WM03与来源亲本的序列比对图。
图1c.计算机模拟的AAV-WM03结构模拟图。
图2.AAV-WM03 DNA序列比对图。
图3a.高剂量AAV-WM03，AAV6，AAV6.2ff，AAV9感染肺部免疫荧光图。
图3b.肺部近端感染高剂量AAV-WM03，AAV6，AAV6.2ff，AAV9的统计图及平均感染情况。
图3c.肺部远端感染高剂量AAV-WM03，AAV6，AAV6.2ff，AAV9的统计图及平均感染情况。
图4a.低剂量AAV-WM03，AAV6，AAV6.2ff，AAV9感染肺部免疫荧光图。
图4b.肺部近端感染低剂量AAV-WM03，AAV6，AAV6.2ff，AAV9的统计图及平均感染情况。
图4c.肺部远端感染低剂量AAV-WM03，AAV6，AAV6.2ff，AAV9的统计图及平均感染情况。
图5.AAV-WM03-CMV-EGFP对眼球RPE层感染情况。
具体实施方式
本发明提供了一种融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白，融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白包含血清型AAV1和AAV6的肽段融合形成的肽段(融合肽段或嵌合肽段)或其变体。
所述的融合肽段或其变体包含AAV1和6的肽段中的1段或多段。在一种具体实施方案中，所述融合肽段由两节肽段组成，分别为第一肽段和第二肽段。所述第一肽段包含来自AAV1的肽段，所述第二肽段包含来自AAV6的肽段。所述第一肽段和第二肽段依次连接。优选地，所述第一肽段包含SEQ ID No.1所示的氨基酸片段，所诉第二肽段包含SEQ ID No.2所示的氨基酸片段。
所述AAV1的肽段包含1或多个突变的氨基酸序列位点。在一种具体实施方案中，所述AAV1的肽段包含1个突变位点。优选地，所述突变位点位置及突变类型为S268R。
所述融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白中，所述各肽段之间直接融合。
在电镜下，腺相关病毒的核衣壳一般呈近圆形。这种近圆形衣壳，实际上是由多个蛋白质壳粒排列构成的封闭的二十面体对称中空衣壳，基因组核酸即包裹于其中。一个二十面体对称结构包含三种旋转对称方式：3-重、2-重、5-重对称(3-，2-，5-fold symmetry)。即这个对称立体结构有穿过病毒颗粒相对两面中心点的3-重对称轴，壳粒绕3-重对称轴120°旋转三次复位，构成三角面；有2-重对称轴(棱)，壳粒绕2-重对称轴180°旋转二次复位，形成两个相交三角面；还有穿过两个相对顶点的5-重对称轴，壳粒绕5-重对称轴72°旋转五次复位，构成五聚体(pentamel)。因此，二十面体对称型衣壳由20个等边三角面所组成，其中每2个三角面相交形成棱边，共有30条棱边；每5个三角面相接，聚成12个顶点。
所述融合型腺相关病毒衣壳蛋白中，所述血清型AAV1和AAV6的肽段组装成融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白的三重对称轴突起；所述血清型AAV1和AAV6的肽段组装成融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白的五重对称轴的通道,其计算机模拟结构示意图如图1c所示。
在一些优选实施方式中，融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白包括：
a)如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；
b)如SEQ ID No.4具有90％及以上的序列一致性，以及具有a)限定的氨基酸序列的功能的多肽片段。
进一步地，b)中的多肽片段具体指：如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体为1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体为1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的多肽片段的功能的多肽片段，所述b)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.4具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列一致性。
所述SEQ ID No.4氨基酸序列对应的核苷酸序列包括1种或多种。在一种具体实施方案中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种构建体，所述构建体含有上述的核苷酸序列。所述构建体通过将上述核苷酸序列插入合适的表达载体中构建获得，本领域技术人员可选择合适的表达载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的构建体或基因组中整合有异源的上述核苷酸序列，或所述宿主细胞包含如上任一项所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03。
进一步地，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞(如CHO、COS和N2A)、植物细胞、人细胞(人宫颈癌细胞如HELA和人胚胎肾细胞如HEK293T)、细菌细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌)、真菌细胞(如酵母)、昆虫细胞(如Sf9)中任一种。优选地，所述宿主细胞是动物细胞，且更优选是人细胞。所述宿主细胞为传代细胞或原代细胞即直接从生物体(如人)中分离的细胞。所述宿主细胞为粘附性细胞或悬浮的细胞即悬液形式生长的细胞。
本发明还提供了一种融合型腺相关病毒AAV-WM03，所述融合型腺相关病毒含有如上任一项所述融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白。
进一步地，所述融合型腺相关病毒AAV-WM03还包括编码目的产物的异源核苷酸序列，所述编码目的产物的异源核苷酸序列为各种衣壳蛋白能包裹携带的。上述编码目的产物的异源核苷酸序列为构建体，所述构建体为含有编码目的产物的核酸。所述构建体通过将编码目的产物的核酸插入合适的表达载体中构建获得，本领域技术人员可选择合适的表达载体，例如，上述表达载体选自pAAV-CAG、pAAV-TRE、pAAV-EF1a、pAAV-GFAP、pAAV-Lgr5、pAAV-Sox2、pAAV-Syn或pAAV-CMV表达载体中的任一种。
进一步地，编码目的产物为核酸或蛋白质，所述核酸选自选自小向导RNA(sgRNA)、干扰RNA(RNAi)。所述sgRNA或RNAi针对靶标选自表皮生长因子受体EGFR或程序性死亡受体PD-1。所述蛋白质编码的基因选自D亚型表面活性蛋白SFTPD、B亚型表面活性蛋白SFTPB、A1亚型面活性蛋白SFTPA1、干扰素γIFN-γ、囊性纤维化跨膜调节蛋白CFTR或天门冬氨酸蛋白酶Napsin A。
本发明还提供了一种使用如上所述的融合型腺相关病毒转化获得的工程化细胞。所述工程化细胞包含上述融合型腺相关病毒。所述细胞为真核细胞和/或原核细胞。
作为适当细胞的代表性示例，选自哺乳动物细胞(如CHO、COS和N2A)、植物细胞、人细胞(人宫颈癌细胞如HELA和人胚胎肾细胞如HEK293FT)、细菌细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌)、真菌细胞(如酵母)、昆虫细胞(如Sf9)中任一种。优选地，所述宿主细胞是动物细胞，且更优选是人细胞。所述宿主细胞为传代细胞或原代细胞即直接从生物体(如人)中分离的细胞。所述宿主细胞为粘附性细胞或悬浮的细胞即悬液形式生长的细胞。
本发明还提供了一种融合型腺相关病毒载体系统，所述融合型腺相关病毒载体系统包含包装质粒、表达质粒和辅助质粒。所述包装质粒中包含如上所述的核酸或核酸片段。所述表达质粒包含编码目的产物的异源核苷酸序列。
进一步地，所述包装质粒中还包含腺相关病毒的rep基因片段。其中所述rep基因片段包含内含子，所述内含子包含转录终止序列。
进一步地，目的产物为核酸或蛋白质，所述核酸选自小向导RNA(sgRNA)、干扰RNA(RNAi)。所述sgRNA或RNAi针对靶标选自表皮生长因子受体(EGFR)，程序性死亡受体1(PD-1)。所述蛋白质编码基因选自D亚型表面活性蛋白(SFTPD)、B亚型表面活性蛋白(SFTPB)、A1亚型面活性蛋白(SFTPA1)、干扰素γIFN-γ、囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)和天门冬氨酸蛋白酶Napsin A。
所述的包装质粒、表达质粒、辅助病毒质粒转入宿主细胞，其中的核酸序列全部整合于宿主细胞中，以生产所述融合型腺相关病毒。在一些实施方式中，所述核酸序列全部一起整合在所述宿主细胞细胞基因组内的单一基因座处。在一些实施方式中，编码各种基因的核酸序列作为单独的表达盒存在，其防止任何重组以形成能够复制的病毒的风险；编码rep和cap基因的核酸序列存在于同一表达盒中。
本发明还提供了一种融合型腺相关病毒，由如上所述的融合型腺相关病毒载体系统经病毒包装获得。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的融合型腺相关病毒以及药学上可接受的辅料。所述药物组合物或者偶联物通过全身途径或局部途径施用，选自内耳施用、眼科施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用。所述药物组合物或者偶联物剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、滴眼剂或滴鼻剂中的一种或多种。
所述辅料包括各种赋形剂和稀释剂，这些辅料并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。所述辅料包含无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)或粘合剂。所述辅料还包含其它低分子量的多肽、血清白蛋白、甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸、多糖、单糖、甘露糖醇或山梨糖醇。所述辅料用于注射的水溶液时选自生理盐水、葡萄糖等渗溶液、D-山梨糖醇等渗溶液、D-甘露糖等渗溶液、D-甘露或糖醇等渗溶液。所述注射的水溶液包含增溶剂。所述增溶剂选自醇(乙醇)、多元醇(丙二醇或PEG)和/或非离子表面活性剂(吐温80或HCO-50)。本发明所提供的药物组合物中，所述融合型腺相关病毒AAV-WM03为单一有效成分，也可以与其他一种或多种对于肺部疾病或眼部疾病治疗有用的活性组分进行组合，构成联合制剂。所述活性组分为其他各种用于治疗肺部疾病或眼部疾病治疗的药物。所述药物组合物中活性组分的含量为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述融合型腺相关病毒AAV-WM03和药物组合物的活性成分的施用量依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的所述双功能化合物的施用量为1～1000mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～20mg/kg/day、20～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100mg/kg/day、100～200mg/kg/day、200～500mg/kg/day、或大于500mg/kg/day。本发明还提供了一种偶联物，所述偶联物包括如上所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03或连接的生物活性多肽。
所述肺部疾病选自肺炎、肺纤维化、肺结核中的一种或多种。
所述眼科疾病还选自年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、脉络膜新生血管膜(CNVM)、黄斑囊样水肿(CME)、视网膜前膜(ERM)和黄斑裂洞、血管样条纹，视网膜脱落、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿(DME)、视网膜色素上皮细胞(RPE)的萎缩性病变、视网膜色素上皮细胞(RPE)的肥厚性病变、视网膜静脉阻塞、脉络膜视网膜静脉阻塞、黄斑水肿、翼状胬肉结膜、视网膜下水肿和视网膜内水肿、色素性视网膜炎、斯特格氏病、青光眼、炎性疾病、白内障、难治性异常现象、圆锥形角膜、早产儿视网膜病变、眼前部血管生成、角膜炎后角膜血管生成或角膜移植或角膜成形中的一种或几种。在一些优选实施方式中，所述眼科疾病是为RPE层相关疾病。
所述炎症选自皮肤炎症、脉管炎症、变态反应、自身免疫性疾病、纤维组织形成、硬皮病或移植物排斥；所述自身免疫性疾病选自风湿关节炎、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、类口眼干燥综合征或多发性肌炎中的一种或多种。
所述癌症选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤；具体地，所述癌症选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、T细胞淋巴瘤或B细胞淋巴瘤中的一种或多种；优选地，所述肿瘤为肺癌、结直肠癌和/或黑色素细胞瘤等中的一种或几种。
所述代谢疾病选自糖尿病，选自I型和II型糖尿病以及与糖尿病相关的疾病和病症；所述代谢性疾病选自动脉粥样硬化、心血管疾病、肾病、神经病、视网膜病、β-细胞机能障碍、血脂异常、高血糖、胰岛素抵抗或慢性阻塞性肺病中的一种或几种。在一些更优选实施方式中，所述基因治疗是指肺部疾病的治疗。所述融合型腺相关病毒或药物组合物可通过在AAV病毒感染低剂量条件下将目的产物递送至肺部细胞以实现肺部疾病的治疗。
本发明所述融合型腺相关病毒AAV-WM03、宿主细胞、载体系统、药物组合物或偶联物在用于在AAV病毒感染低剂量条件下将目的产物递送至肺部细胞以实现肺部疾病治疗的用途中，所述目的产物递送为非诊断治疗目的的，包括在体外对肺部细胞进行目的产物递送。
所述肺部疾病可为环境因素引起的肺纤维化导致的。因此，本发明还提供了所述融合型腺相关病毒在治疗个体中环境因素导致的肺部疾病的药物中的用途。
进一步地，所述肺部疾病为肺上皮细胞相关疾病。在一些具体实施方案中，所述肺上皮细胞疾病通过过表达Napsin A抑制细胞表型转化和增殖能力进行预防或治疗。
进一步地，所述肺部疾病为基因缺陷、环境损伤或衰老的相关疾病，例如，为基因突变等所导致的相关疾病，再例如，为空气污染所致的、药物所导致的相关疾病，再例如，为衰老所导致的相关疾病。
进一步地，肺部疾病为细胞损伤等的相关疾病，具体为肺上皮细胞损伤和/或成纤维细胞损伤，更具体为基因突变导致的肺上皮细胞损伤、基因突变导致的成纤维细胞损伤等、噪声所致的细胞损伤、药物所导致的细胞损伤或者衰老所导致的细胞损伤。
进一步地，所述融合型腺相关病毒作为递送目的产物的载体。
本发明还提供了一种治疗肺部疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予有效量的本发明所述的融合型腺相关病毒、本发明所述宿主细胞、载体系统或药物组合物或偶联物。医师都可确定对单个患者而言最适用的实际剂量且其会根据特定个体的年龄、体重和反应而变化。
在本发明中，可向患者给予本发明的融合型腺相关病毒或宿主细胞或载体系统或药物组合物。本领域技术人员能够确定适当的给药方式和剂量。
通过本发明所述融合型腺相关病毒递送一种或多种治疗基因，可单独使用或与其他治疗方法或治疗组分联用。
本发明的融合型腺相关病毒用于感染细胞，从而将基因和/或连接的(例如但不限于，共价连接的)生物活性多肽递送至细胞。因此，本发明提供了一种将异源基因递送至细胞的方法，所述方法通过使一个或多个本发明的融合型腺相关病毒或偶联物至细胞来感染细胞，其中所述融合型腺相关病毒或偶联物包含一个或多个异源基因。
本发明还提供了产生稳定的融合型腺相关病毒载体的生产细胞系的方法，其包括：
(a)将如本文所定义的融合型腺相关病毒载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和/或，
(b)在所述培养物内选择具有在整合至所述哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。
所述AAV载体生产细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞选自HEK293细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、K562细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述哺乳动物宿主细胞是HEK293细胞，或源自HEK293细胞。在一些实施方式中，所述HEK293细胞是HEK293T细胞。
AAV的各种血清型的基因组序列以及天然ITR、Rep蛋白和衣壳蛋白的序列是本领域中已知的。此类序列可见于文献中或公共数据库诸如GenBank中。其公开内容通过引用并入本文用于AAV核酸和氨基酸序列。
本发明化合物及其应用中，当所述融合型腺相关病毒与其他治疗剂联用时，所述活性化合物与其他治疗剂共同给予。“共同给予”表示在同一制剂中或在两种不同制剂中经由相同或不同途径同时给予，或通过相同或不同途径顺次给予。“顺次”给予表示在两种或多种不同化合物的给药之间具有以秒、分钟、小时或天计的时间差异。
在某些实施方式中，本发明的融合型腺相关病毒及其方法可用于预防肺部疾病，可作为预防性治疗方法在肺部损伤之前施用或在接触易造成肺部损伤的环境后的一段时间后施用。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
术语“载体”指含有多肽或与多肽结合并可用于介导多肽递送至细胞的大分子或大分子的联合体。说明性的载体包括，例如质粒、病毒载体、脂质体或其它基因递送载体。
术语“AAV”是腺相关病毒的缩写，可用于指病毒自身或其衍生物。
术语“重组AAV载体”指含有异源性多核苷酸序列的AAV载体，通常是用于遗传性转化细胞的感兴趣的序列。总体上，异源多核苷酸的两侧连接有至少一条，一般是两条AAV末端反向重复序列(ITR)。
术语“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”指至少含有一种AAV衣壳蛋白和一种包裹的多核苷酸的AAV载体的病毒颗粒。
术语“包装”指导致AAV颗粒装配和包裹的一系列胞内过程。
术语AAV“rep”和“cap”基因指编码腺相关病毒的复制和包裹蛋白的多核苷酸序列。文中AAV rep和cap指AAV“包装基因”。
术语AAV的“辅助病毒”指能使AAV被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。各种这样的AAV辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(例如牛痘)。
术语“感染性”病毒或病毒颗粒是含有能将多核苷酸成分递送进该病毒种类具有嗜性的细胞。该术语无需暗示病毒有任何复制能力。
术语“生产细胞”是指具有稳定整合至宿主细胞基因组中的AAV包装基因(rep和cap基因)、所需的辅助病毒基因和重组AAV载体的DNA基因组(例如，由两个AAV反向末端重复(ITR)侧接的目标转基因)的细胞系。
术语“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。
术语“个体”通常包括人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用所述制剂、试剂盒或联合制剂进行治疗而获益。
术语“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。
术语“治疗性”和“预防性”应理解为其最宽的意义。术语“治疗性”不一定暗示哺乳动物接受治疗直至完全恢复。类似地，“预防性”不一定表示对象最终不会感染疾病病症。因此，治疗和预防包括缓解具体病症的症状或防止或降低具体病症产生的风险。术语“预防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作的频率。
本发明中，进行治疗性或预防性治疗的对象或个体优选哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、牲畜(如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(如狗、猫)、实验室试验动物(如小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)或被捕获的野生动物(如狐狸、鹿)。所述对象优选灵长类。所述对象最优选人。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1.新型腺相关病毒AAV-WM03的获得
a.AAV-WM03的Rep-Cap质粒的构建
AAV的血清型由AAV包装所需的Rep-Cap质粒中的Cap蛋白的序列决定，因此，不同的Cap序列包装产生的AAV具有不同的感染嗜性。对现有的天然血清型进行改造，将来源于AAV1的氨基酸序列SEQ ID No.1和来源于AAV6的序列氨基酸SEQ ID No.2融合，其中AAV1的序列包含突变位点S268R(图1a,b)，共同组成新的AAV血清型，命名为AAV-WM03，其核苷酸序列由为SEQ ID No.3，氨基酸序列为SEQ ID No.4。衣壳的内表面和外表面都显示出来自两个亲本AAV1和AAV6衣壳片段的存在，并表明AAV-WM03的三重对称轴突起和五重对称轴的通道也均是由AAV1、6共同构成(图1c)。
野生型AAV之间有比较高的同源性，因此不同血清型AAV的核酸序列高度相似，因此在氨基酸序列一致的前提下，所对应的核酸序列来源或者组合方式包含有多种，其中可以翻译AAV-WM03外壳蛋白的一条DNA序列，如图2所示，来源于AAV1、AAV3和AAV13,其中包含了AAV3的3个碱基突变，对应S268R氨基酸突变(图2)，即由血清型AAV1和AAV6融合成融合型腺相关病毒AAV-WM03的核酸序列也可由血清型AAV1、AAV3和AAV13组合而成。
b.AAV-WM03病毒的制备与纯化
上述测序结果中得到的AAV-WM03的编码基因的序列由苏州金唯智生物科技有限公司进行合成，得到AAV-WM03的Rep-Cap质粒，即pAAV-WM03。将得到的AAV-WM03的Rep-Cap质粒pAAV-WM03，表达一个绿色荧光蛋白EGFP的基因组质粒pAAV-CMV-EGFP,核苷酸序列SEQID No.5，pHelper质粒(质粒全序列同AAV-ie专利文献CN110437317A的SEQ ID NO.12所示)以80，60，110μg每盘细胞的质粒用量共转于HEK-293T细胞中，采用碘二烷醇梯度超高速离心纯化AAV病毒，测量病毒滴度在2E+13GC/mL为合适浓度，放置-80℃备用。
SEQ ID No.1
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGARNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVN
SEQ ID No.2
LQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL
SEQ ID No.3
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAGCCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAACGTCCGGTAGAGCAGTCGCCACAAGAGCCAGACTCCTCCTCGGGCATCGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGATCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAACCCCCGCTGCTGTGGGACCTACTACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGCACCTGGGCCTTGCCCACCTACAATAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGAAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGATTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAACTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCGTCACAACCATCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAAGTCTTCTCGGACTCGGAGTACCAGCTTCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCGCAATACGGCTACCTGACGCTCAACAATGGCAGCCAAGCCGTGGGACGTTCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCTTCTCAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTACCTTCAGCTACACCTTTGAGGAAGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAATACCTGTATTACCTGAACAGAACTCAAAATCAGTCCGGAAGTGCCCAAAACAAGGACTTGCTGTTTAGCCGTGGGTCTCCAGCTGGCATGTCTGTTCAGCCCAAAAACTGGCTACCTGGACCCTGTTATCGGCAGCAGCGCGTTTCTAAAACAAAAACAGACAACAACAACAGCAATTTTACCTGGACTGGTGCTTCAAAATATAACCTCAATGGGCGTGAATCCATCATCAACCCTGGCACTGCTATGGCCTCACACAAAGACGACGAAGACAAGTTCTTTCCCATGAGCGGTGTCATGATTTTTGGAAAAGAGAGCGCCGGAGCTTCAAACACTGCATTGGACAATGTCATGATCACAGACGAAGAGGAAATCAAAGCCACTAACCCCGTGGCCACCGAAAGATTTGGGACTGTGGCAGTCAATCTCCAGAGCAGCAGCACAGACCCTGCGACCGGAGATGTGCATGTTATGGGAGCCTTACCTGGAATGGTGTGGCAAGACAGAGACGTATACCTGCAGGGACCCATTTGGGCCAAGATTCCTCACACCGATGGACACTTTCATCCTTCTCCACTGATGGGAGGTTTTGGGCTCAAACACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACGCCTGTTCCTGCGAATCCTCCGGCGGAGTTTTCAGCTACAAAGTTTGCTTCATTCATCACCCAATACTCCACAGGACAAGTGAGTGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAGCGCTGGAATCCCGAAGTGCAGTACACATCCAATTATGCAAAATCTGCCAACGTTGATTTTACTGTGGACAACAATGGACTTTATACTGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTTACCCGTCCCCTGTAA
SEQ ID No.4
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGARNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL*
SEQ ID No.5
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTTCTCGAGCGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATCCGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGATATCAAGCTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGACTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCAGATCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTAGACACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
实施例2新型腺相关病毒AAV-WM03-mNeonGreen在肺部的活体验证
AAV6和AAV6.2ff是目前已知对肺部感染效果较好的两种AAV载体。实验设4种测试病毒，AAV6，AAV9，AAV6.2ff，AAV-WM03，分别包装绿色荧光蛋白mNeonGreen，并设置高剂量组(5E+10GC/mL)和低剂量组(2.5E+10GC/mL)，总共8组。所有测试组均使用4只周龄为6-8周的小鼠进行肺部气管内注射。将麻醉的小鼠麻醉以背卧姿势把小鼠固定在动物工作台上，将其前爪向身体两侧伸直并用胶带固定。剃除颈部部分区域的鼠毛，并用碘伏做消毒剃毛区域。用手术剪刀在小鼠颈部做一个5～7mm的小切口。使用镊子夹住并固定小鼠气管，将有AAV的注射器针头斜面朝上，与气管成45°，插入气管，确认针头正确插入后，将50μL的AAV缓慢注入气管，等待5s后缓慢取出针管。将颈部伤口缝合，将小鼠放回笼中恢复，直到完全清醒。注射完后1周后取样，利用4％PFA灌流，固定组织，解剖出肺部组织并记录形态，通过冰冻切片制备样本，染色成像。
对荧光图像分析后可知，高剂量下AAV-WM03在肺部的近端和远端对肺组织的感染效率高，不低于目前常用的天然血清型AAV6及其突变体(图3a),其中高剂量条件下AAV-WM03在肺部近端的感染效率为59.67±1.202，与AAV-WM03作为效果对比的AAV6在肺部近端的感染效率为39.00±1.528，AAV6.2ff为77.67±1.453和AAV9为83.00±2.887(图3b)；AAV-WM03在肺部远端的感染效率为54.33±0.667与AAV-WM03作为效果对比的AAV6在肺部远端的感染效率为27.67±1.453，AAV6.2ff为64.33±1.202和AAV9为72.67±5.783(图3c),**为p<0.005，***为p<0.0005，****为p<0.00005。而在低剂量下AAV-WM03在肺部的近端和远端对肺组织的感染较天然血清型AAV6及其突变体AAV6.2ff更有优势(图4a),低剂量条件下AAV-WM03在肺部近端的感染效率为61.00±1.528，与AAV-WM03作为效果对比的AAV6在肺部近端的感染效率为59.67±0.882，AAV6.2ff为41.00±1.155和AAV9为68.67±1.764(图4b)；AAV-WM03在肺部远端的感染效率为58.33±0.8819，与AAV-WM03作为效果对比的AAV6在肺部远端的感染效率为21.33±2.028，AAV6.2ff为41.67±2.186和AAV9为13.00±2.082(图4c)，*为p<0.05，***为p<0.0005，****为p<0.00005。
实施例3新型腺相关病毒AAV-WM03在视觉系统的活体验证
将麻醉的成年小鼠放在显微镜下，在眼球上滴1-2滴托吡卡胺眼药水使瞳孔扩散。左手持弯头镊子从视神经盘处托起并固定眼球，右手持1ml注射器或玻璃针戳破角膜以减小眼内压力。用纸巾轻拭去眼周液体。左手持镊子固定眼球，右手持吸取2μl病毒的玻璃针,在角巩膜后缘与虹膜平面呈50°进针，缓慢注入AAV-WM03，滴度为1.5E13gc/ml。注射完，玻璃针停留30s再慢慢拔出。在伤口处抹上红霉素软膏后，小鼠放到41℃水浴锅中的鼠笼上保温，待小鼠苏醒后移至小鼠房饲养。11天后，取眼杯。脊椎脱臼法处死小鼠，取下眼球后用1ml注射器扎破角膜，放出房水。眼球放在装有PBS溶液的小培养皿中，在显微镜下解剖。尖头镊夹住角膜，眼科剪从角膜的伤口中戳进去，圆周剪下角膜，用镊子取出晶状体，视神经保留约2mm。眼杯放在4％PFA中固定12h，4℃。已固定的眼杯放在30％蔗糖中脱水12h，4℃。冷冻切片后，在荧光显微镜下挑出效果较好、组织完整的切片进行染色。免疫荧光结果表明，AAV-WM03可以感染RPE层，结果如图5所示。

Claims (19)

1.一种融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白，其特征在于，融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白包含血清型AAV1和AAV6的肽段的融合肽段或其变体。
2.如权利要求1所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白，其特征在于，所述融合肽段包含依次连接的第一肽段、第二肽段；所述第一肽段包含来自AAV1的肽段，所述第二肽段包含来自AAV6的肽段。
3.如权利要求1所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白，其特征在于，所述第一肽段包含SEQ ID No.1所示的氨基酸片段，所诉第二肽段包含SEQ ID No.2所示的氨基酸片段。
4.如权利要求1所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白，其特征在于，所述融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白包括：
a)如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；
b)如SEQ ID No.4具有90％及以上的序列一致性，以及具有a)限定的氨基酸序列的功能的多肽片段。
5.一种核酸，其特征在于，其所述核酸编码如权利要求1-4任一权利要求所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白。
6.一种构建体，其特征在于，所述构建体含有如权利要求5所述的核酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求6所述的构建体或者基因组中整合有异源的如权利要求5所述的核酸，或所述宿主细胞包含如权利要求1-4任一项所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白。
8.一种融合型腺相关病毒AAV-WM03，其特征在于，所述融合型腺相关病毒AAV-WM03的衣壳结构含有如权利要求1-4任一项的融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白。
9.如权利要求8所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03，其特征在于，所述融合型腺相关病毒还包括编码目的产物的异源核苷酸序列；优选地，所述目的产物为核酸或者蛋白质；进一步地，所述核酸选自小向导RNA、干扰RNA。
10.一种细胞，其特征在于，所述细胞为使用如权利要求8或9所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03转化得到。
11.一种融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述融合型腺相关病毒载体系统包含包装质粒，所述包装质粒中包含权利要求5所述的核酸。
12.如权利要求11所述的融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述包装质粒中还包含腺相关病毒的rep基因片段。
13.根据权利要求11所述的融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体系统还包括表达质粒，所述表达质粒包含负责编码目的产物的异源核苷酸；优选地，所述目的产物为核酸或者蛋白质；进一步地，所述核酸选自小向导RNA、干扰RNA。
14.根据权利要求11-13任一项所述的融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体系统还包括辅助病毒质粒或辅助病毒，所述融合型腺相关病毒载体系统还包括宿主细胞。
15.一种药物组合物或偶联物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求8或9任一项所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03以及药学上可接受的辅料；所述偶联物包含如权利要求8或9任一项所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03以及其上连接的生物活性多肽。
16.根据权利要求15所述的药物组合物或偶联物，其特征在于，所述药物组合物或者偶联物剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、滴眼剂或滴鼻剂中的一种或多种。
17.如权利要求1～4任一项所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03衣壳蛋白、或如权利要求5所述的核酸、或如权利要求6所述的构建体、如权利要求8或9所述的融合型腺相关病毒AAV-WM03或如权利要求7所述的宿主细胞或权利要求10所述的细胞、权利要求11-13任一项所述的融合型腺相关病毒载体系统、或如权利要求15或16所述的药物组合物或偶联物在制备预防或治疗疾病的药物中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，包括以下至少一项：
1)所述疾病选自肺部疾病、眼科疾病、炎症、肿瘤、代谢疾病、疼痛、神经退行性炎症疾病中的一种或几种；
2)所述药物组合物或偶联物用于制备基因治疗药物。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，包括以下至少一项：
1)所述肺部疾病或眼科疾病为细胞损伤的相关疾病；
2)所述肺部疾病或眼科疾病为基因缺陷导致的相关疾病；
3)所述肺部疾病或眼科疾病为环境因素导致的相关疾病；
4)所诉肺部疾病或眼科疾病为衰老导致的相关疾病；
5)所述肺部疾病或眼科疾病为原发性肿瘤导致的相关疾病；
6)所述肺部疾病或眼科疾病为癌细胞迁移导致的相关疾病；
7)所述眼科疾病为RPE层相关疾病。
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