JP6449175B2 - 眼の遺伝子関連疾患の治療のための方法及び組成物 - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、２０１３年２月１５日付けで出願された米国仮特許出願第６１／７６５，６５４号、及び２０１３年４月２４日付けで出願された米国仮特許出願第６１／８１５，６３６号（どちらも引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の優先権の利益を主張するものである。

本発明は遺伝子治療に関し、具体的には、発現ベクター、及び眼において特定のタンパク質を産生することができないこと、又は眼における非機能性タンパク質の産生に起因する眼疾患の治療においてかかるベクターを使用する治療方法に関する。

いくつかの眼疾患は、潜在的な遺伝的原因に起因する。例えば、或る疾患では、眼の細胞において発現されるタンパク質の突然変異がそのタンパク質の活性を変更又は無効にすることで疾患状態を生じる。他の疾患では、原因は眼の細胞が特定のタンパク質を産生することができないことに起因する場合がある。これらの疾患が単一のタンパク質の不活性化、又は変更に起因することから、これらの疾患は、特に、遺伝子導入に基づく治療法に適している。眼疾患に対する遺伝子治療は、小さい組織標的及び閉鎖された区画を含む一連の魅力的な特質を有し、そのため低用量を必要とする。さらに、眼は比較的免疫特権をもつ環境である。

遺伝学的原因を有する眼疾患の一例は、Ｘ染色体性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）である。ＸＬＲＳは、幼い時期に現れる神経発生的な網膜の異常であり、視力障害及び網膜剥離の傾向を引き起こす。ＸＬＲＳは、網膜神経層及び網状層の正常な積層の構造異常を特徴とする。臨床検査は、黄斑内の小嚢胞、及びスキーシス又は周辺部網膜の上記層の内部解離を示し（非特許文献１、非特許文献２）、ＸＬＲＳは眼コヒーレンストモグラフィ（ocular coherence tomography）を使用することにより明らかとなる（非特許文献３）。神経シグナルの網膜シナプス伝達の障害は、暗順応絶対視覚認知の喪失を引き起こす。これは、頻繁に「電気陰性ＥＲＧ波形」をもたらす、光受容体ａ波と比較した（二次網膜双極細胞からの）ｂ波応答の特徴的な減少として、臨床網膜電図（ＥＲＧ）検査において明らかとなる。脆弱なＸＬＲＳの網膜は、硝子体出血及び網膜剥離等の疾患と関連する合併症を起こしやすく、その状態は加齢により悪化する。ＸＬＲＳ集団における網膜剥離の割合は、一般的な集団の割合よりもかなり高く（それぞれ、１０％対０．０１％）、術後転帰は更に悪い。

Ｘ染色体性若年網膜分離症は、網膜及び松果体によってのみ発現される２２４アミノ酸の分泌タンパク質であるレチノスキシンをコードする遺伝子における突然変異によって引き起こされる。ヒトレチノスキシンは、２３アミノ酸のシグナル配列、３９アミノ酸のＲｓ１ドメイン、１５７アミノ酸のジスコイジンドメイン、及び５アミノ酸のＣ末端セグメントで構成される。ジスコイジンドメインを含むタンパク質は、真核生物において広く分布し、細胞接着、細胞外マトリクス相互作用、シグナル伝達、アポトーシス細胞の食作用、軸索誘導、血管新生及び血液凝固を含む様々な機能を媒介する。これらのタンパク質の多くは、細胞外マトリクス又は細胞結合に関与するが、一部は、血管内皮成長因子及びセマフォリン等のリガンドに結合する。レチノスキシンは、ジスルフィド結合したホモ八量体の複合体として網膜神経細胞から分泌され、細胞表面に接着するが、その機能は十分に理解されていない。レチノスキシンに起因する生化学的活性は、ｂ−２−ラミニン、ａｂ−クリスタリン、リン脂質、ガラクトース及びＮａ／Ｋ ＡＴＰアーゼ−ＳＡＲＭ１複合体の結合である。レチノスキシンは、生後１日目にマウス網膜において最初に観察される。発生の間、全ての網膜神経細胞が、最初に成熟する神経節細胞により開始して、より遠位の各層の神経細胞へと続く分化の後にレチノスキシンを発現する。Ｐ１４以降、レチノスキシンは、内顆粒層の外側半分において、及び光受容体内部セグメントによって強く発現される。水平細胞以外の全ての種類の網膜神経細胞は、成人においてレチノスキシン抗体によって標識されることが分かっている。

眼疾患の治療のため、複数のグループが遺伝子治療のアプローチを使用しようとした。例えば、いくつかのグループは、レチノスキシン遺伝子欠失を持つマウスの突然変異を補うため、レチノスキシンを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用した。これらのベクターによる網膜の形質導入は、網膜の全ての層においてかなりのレベルのレチノスキシンタンパク質をもたらし、また正常な陽性ＥＲＧ ｂ波の回復及び疾患の特徴である嚢胞様構造の減少を含む疾患表現型の改善をもたらした。上記治療効果は永続的であり、動物の生涯に亘って持続した。

Ｘ連鎖性網膜分離症の治療に加えて、他のグループは、別のＸ連鎖性網膜症である先天性網膜色素上皮（ＲＰＥ）６５欠損によるレーバー先天黒内障（ＬＣＡ）の治療に対するＡＡＶベクターの臨床使用を評価した。合計９名のＬＣＡを伴う被験体に網膜下注射によりＲＰＥ６５を発現するＡＡＶベクターを投与した。９名の被験体は、三つの研究の集団低用量コホートを構成し、各コホートは用量漸増計画を有した。治療した被験体の大半は、網膜変性が比較的進行した状態にもかかわらず、網膜機能、視力の改善、又は眼振の減少の兆候を示した。

ＬＣＡ治験は網膜下注射を使用してベクターを送達したが、網膜下注射が地理的に局在化した送達をもたらすため、この送達戦略はＸＬＲＳ治験には問題となる可能性がある。レチノスキシンは網膜の至る所に発現され、この疾患の最適な治療は網膜全体の形質導入を必要とする。網膜下注射によるベクター送達は、網膜の面積の最大約２５％に限定される。この形質導入の量は黄斑付近に及ぶには十分であるが、おそらくは網膜のかなりの部分が形質導入されず、未処理の領域はこの疾患に伴う失明の主な原因である網膜剥離及び硝子体出血を起こしやすいままとなるであろう。網膜下注射によって形質導入されたマウスの網膜において、レチノスキシンの更なる分散がいくつか報告されているが、これをどのようにヒト被験体に合わせて調整するのかは不明である。スキーシスの病態を伴う網膜の網膜下注射は困難であり、被験体の視覚機能に重大な危険因子となる可能性がある。通常、網膜下注射の前に硝子体切除術が実施される。硝子体の網膜への付着は、外科医が網膜から硝子体を分離しようとする際に、脆弱なＸＬＲＳ網膜の更なる層割裂を引き起こす可能性がある。さらに、注射自体が困難である場合もある。注射針の先端が十分深くに位置されていない場合、ベクター溶液は不注意にスキーシス腔へと投与されて、網膜内の割裂を悪化させる可能性がある。代替のベクター投与方法は、ＸＬＲＳの被験体にとって魅力的であろう。

以前の研究において、本発明者らは、網膜下注射を使用しないＸＬＲＳ網膜への効率的なＡＡＶベクター媒介遺伝子導入を得る方法を記載した。その研究において、レチノスキシンノックアウト（Ｒｓ１ＫＯ）マウス網膜の全ての層が、単純な硝子体注射によって投与された場合に、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）ベクターにより効率的に形質導入された（非特許文献４、非特許文献５）。しかしながら、ＡＡＶ２ベクターの投与は、ヒトがＡＡＶ２に対して高い既存の免疫性を有することから、眼において治療を制限する免疫応答をもたらす。本発明者らは、ヒトにおけるウイルス投与を補足するためのＡＡＶベクターを開発した。上記ベクターは、８型ＡＡＶキャプシドにパッケージされた、３．５ｋｂのヒトレチノスキシンプロモーター、切断型レチノスキシン第１イントロンを含むヒトレチノスキシンｃＤＮＡ、ヒトｂ−グロビンポリアデニル化部位、及び２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）逆位末端リピートで構成された。Ｒｓ１ＫＯマウスへのこのベクターの硝子体内注射は、野生型の網膜で観察されるものと類似する網膜分布を伴うロバストなレチノスキシン発現をもたらした。免疫標識は、視神経、ブドウ膜組織及び角膜等の他の眼の構造においてわずかな非特異的発現を伴うか、又は非特異的発現を伴わずに網膜のレチノスキシン発現細胞に特異的であった。

Eksandh LC, Ponjavic V, Ayyagari R, Bingham EL, Hiriyanna KT, Andreasson S, Ehinger B, Sieving PA. 2000. Phenotypic expression of juvenile X-linked retinoschisis in Swedish families with different mutations in the XLRS1 gene. Arch Ophthalmol 118: 1098-1104 Prenner JL, Capone A, Jr., Ciaccia S, Takada Y, Sieving PA, Trese MT. 2006. Congenital X-linked retinoschisis classification system. Retina 26: S61-64 Gerth C, Zawadzki RJ, Werner JS, Heon E. Retinal morphological changes of patients with X-linked retinoschisis evaluated by Fourier-domain optical coherence tomography. Arch Ophthalmol. 2008;126:807-11 Zeng Y, Takada Y, Kjellstrom S, Hiriyanna K, Tanikawa A, Wawrousek E, et al. RS-1 Gene Delivery to an Adult Rs1h Knockout Mouse Model Restores ERG b-Wave with Reversal of the Electronegative Waveform of X-Linked Retinoschisis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:3279-85 Kjellstrom S, Bush RA, Zeng Y, Takada Y, Sieving PA. Retinoschisin gene therapy and natural history in the Rs1h-KO mouse: long-term rescue from retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48:3837-45

よって、本発明は、顕著な免疫応用を誘発することなく他の利益も同様に提供する、かかる治療を必要とする個体の眼に治療用タンパク質をコードする遺伝子等の治療用分子を送達する改善された方法の必要性に対処する。

本発明者らは、驚くべきことに、本発明の組成物及び投与方法が、望ましくない炎症反応又は他の望ましくない副作用を最小化するか、又は回避しながら、眼の組織においてタンパク質の産生を誘導することができることを見出した。よって、本発明は、発現ベクター、及び眼疾患、特に、眼において特定のタンパク質を産生することができないこと、又は眼における非機能性タンパク質の産生に由来する眼の障害の治療においてかかるベクターを使用する治療方法を提供する。

本発明の一実施の形態は、眼疾患を患う個体を治療する方法であり、該方法が該個体の眼に、治療用タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを投与することを含み、発現ベクターが高レベルの該治療用タンパク質を発現し、ウイルスベクターの投与が最小の免疫応答を誘発する。一実施の形態では、前記ベクターの投与が、前記個体内で治療を制限する免疫応答を誘発しない。前記治療用タンパク質をコードする核酸が眼特異的プロモーターに連結されてもよい。さらに、プロモーターは、網膜等の眼のいくつかの部分に対して特異的であってもよい。かかる実施の形態では、網膜特異的プロモーターは、レチノスキシン遺伝子プロモーターの一部を含んでもよい。一実施の形態では、網膜特異的プロモーターは、配列番号９の少なくとも一部を含む。

いくつかの実施の形態では、エンハンサー要素等の遺伝子要素は、治療用タンパク質の発現を増強するために含まれてもよい。一実施の形態では、治療用タンパク質は、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー配列を含むプロモーターに連結される。一実施の形態では、ＩＲＢＰエンハンサー配列は配列番号１２を含む。

本発明の方法は眼疾患の治療に有用である。一実施の形態では、前記眼疾患が、網膜分離症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、網膜剥離（疾患、傷害、又は自然剥離に起因する）、嚢胞、嚢胞様黄斑浮腫、網膜色素変性症、及び老人性スキーシスからなる群から選択される。一実施の形態では、眼疾患はＸ染色体と関連する。

一実施の形態では、治療用タンパク質はレチノスキシンタンパク質である。レチノスキシンタンパク質は、既知のレチノスキシンタンパク質又はその任意の部分の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有してもよい。例えば、レチノスキシンタンパク質は、本発明のベクターによってコードされるタンパク質が野生型レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの活性を有する限り、配列番号２又はその任意の部分に対して少なくとも９０％の配列同一性を有してもよい。一実施の形態では、本発明のレチノスキシンタンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも一つのスプライス供与部位と少なくとも一つのラリアット／スプライス受容部位とを含む。スプライス供与部位及びラリアット／スプライス受容部位は、レチノスキシン遺伝子のイントロン１に由来するものであってもよい。また、治療用タンパク質をコードする核酸配列は、ヒトベータ−グロビン３’ポリアデニル化シグナル等のポリアデニル化シグナルに連結されてもよい。

本発明の一実施の形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス逆位末端リピート（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲは配列が同一であってもよく、異なってもよい。一つのＩＴＲは、ＲＥＰタンパク質ニッキング認識配列（nicking recognition sequence）又はＤ領域を欠いてもよい。少なくとも一つのＵＴＲはｐｓｕｂ２０１ベクターに由来してもよく、又はそれからなるものでもよい。一実施の形態では、ベクターは配列番号１６を含む。一実施の形態では、ベクターは、１又は複数のアデノ随伴ウイルスに由来するキャプシドタンパク質を含む。一実施の形態では、キャプシドタンパク質はＡＡＶ８に由来する。一実施の形態では、ベクターは硝子体内注射により投与される。

本発明の一実施の形態は、治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターであり、発現ベクターは個体の眼に投与された場合に高レベルの治療用タンパク質を発現する。本発明のベクターは、眼に投与された場合に個体において最小の免疫応答を誘発する。さらに、本発明のベクターは、わずかな免疫応答を誘発する用量で眼に投与された場合、網膜分離症の少なくとも一つの症状を緩和する。眼疾患を治療するのに有用なウイルスベクターは、本発明の発現ベクターをＡＡＶキャプシドタンパク質及びＡＡＶ ＲＥＰタンパク質を発現する細胞と共にインキュベートすることによって調製することができる。ＡＡＶキャプシドタンパク質及びＲＥＰタンパク質は、プラスミドによって、ヘルパーウイルスによって、又は細胞のゲノム中に導入された遺伝子によって提供することができる。

本発明の一実施の形態は、ヒトにおいて低い既存の免疫性を有するキャプシドタンパク質と、硝子体内注射による投与の後に個体内で治療を制限する免疫応答を誘発しない用量で個体に投与された場合に、その個体において治療レベルのタンパク質を産生する発現カセットと、抗原提示細胞及び／又は通常は治療用タンパク質を発現しない組織において発現ベクターの発現を阻害又は抑制する組織特異的プロモーターと、を含む眼遺伝子治療用途に使用される発現ベクターである。或る一つ実施の形態では、硝子体内注射による投与の後に個体内でもたらされる免疫応答が、一過性には＋２細胞以下、慢性には＋１細胞以下である。さらに、抗原提示細胞及び眼の外の組織における発現は、眼の組織における発現の１％未満である。一実施の形態では、組織特異的プロモーターは、網膜特異的プロモーターである。組織特異的プロモーターは、配列番号９の少なくとも一部を含んでもよい。また、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含んでもよい。一実施の形態では、発現ベクターは配列番号１６を含む。また、発現ベクターは、１又は複数のアデノ随伴ウイルスに由来するキャプシドタンパク質を含んでもよい。一実施の形態では、発現ベクターは、ＡＡＶ８に由来するキャプシドタンパク質を含む。

本発明の一実施の形態は、ヒトにおいて低い既存の免疫性を有するキャプシドタンパク質と、硝子体内注射による投与の後に個体内で治療を制限する免疫応答を誘発しない用量で個体に投与された場合に、その個体において治療レベルのタンパク質を産生する発現カセットと、抗原提示細胞及び通常は治療用タンパク質を発現しない組織において発現ベクターの発現を阻害又は排除する組織特異的プロモーターと、を含む発現ベクターを患者の眼に投与することを含む、眼疾患を患う個体を治療する方法である。或る一つ実施の形態では、硝子体内注射による投与の後に個体内でもたらされる免疫応答が、一過性には＋２細胞以下、慢性には＋１細胞以下である。さらに、抗原提示細胞及び眼の外の組織における発現は、眼の組織における発現の１％未満である。一実施の形態では、組織特異的プロモーターは、網膜特異的プロモーターである。組織特異的プロモーターは、配列番号９の少なくとも一部を含んでもよい。また、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含んでもよい。一実施の形態では、発現ベクターは配列番号１６を含む。また、発現ベクターは、１又は複数のアデノ随伴ウイルスに由来するキャプシドタンパク質を含んでもよい。一実施の形態では、カセットはＡＡＶ８に由来するキャプシドタンパク質を含む。

本発明の一実施の形態は、ＡＡＶ８に由来するキャプシドタンパク質、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー配列と、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、及びヒトレチノスキシンタンパク質に操作可能に連結されたレチノスキシン遺伝子プロモーターを含む発現カセットと、を含む治療的有効量の発現ベクターを、Ｘ連鎖性網膜分離症を患うと診断された又はそれが疑われるヒト被験体に投与することを含み、その発現ベクターの投与が、被験体の網膜細胞におけるヒトレチノスキシンタンパク質の発現を引き起こして、網膜分離症の少なくとも一つの症状を軽減する、ヒトにおけるＸ連鎖性網膜分離症を治療する方法である。発現ベクターは、硝子体内、網膜下、又はテノン嚢下の注射法を使用して投与されてもよい。また、発現ベクターは、局所投与されてもよい。

本発明の発現ベクターは、治療的に有効な量で投与される。治療的有効量としては、例えば、約１×１０^１０ｖｇ／眼〜約２．５×１０^１１ｖｇ／眼の用量、約１×１０^８ｖｇ／眼〜約１×１０^１３ｖｇ／眼の用量、約１×１０^９ｖｇ／眼〜約１×１０^１３ｖｇ／眼の用量、約３×１０^９ｖｇ／眼〜約１×１０^１３ｖｇ／眼の用量、約１×１０^１０ｖｇ／眼〜約１×１０^１３ｖｇ／眼の用量、約３×１０^１０ｖｇ／眼〜約１×１０^１３ｖｇ／眼の用量、約１×１０^１１ｖｇ／眼〜約１×１０^１３ｖｇ／眼の用量、約３×１０^１１ｖｇ／眼〜約１×１０^１３ｖｇ／眼の用量が挙げられる。

ベクターｐＡＡＶ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳの構造を示す図である。 クーマシーＲ２５０（パネルＡ）及び銀染色（パネルＢ）した７．５％ＳＤＳゲル上で評価したＡＡＶ８ ｈＲＳ／ＩＲＢＰベクター及びＡＡＶ８ ｈＲＳｐ４ベクターを示す図である。試料の順序は以下の通りである：左パネル（クーマシー）：標準、ＡＡＶ８ ｈＲＳ／ＩＲＢＰ、ＡＡＶ８ ｈＲＳｐ４、標準；右パネル（銀）：標準、ＡＡＶ８ ｈＲＳ／ＩＲＢＰ、ＡＡＶ８ ｈＲＳｐ４。全てのベクターを２×１０^１０ｖｇ／レーンでのせた。標準は（上から）２５０ｋｄ、１５０ｋｄ、１００ｋｄ、７５ｋｄ、５０ｋｄ、３７ｋｄ、及び２５ｋｄである。 各眼について、体積強度投影（volume intensity projection）（右側画像）上の中央の緑色線によって示される視神経における中心網膜を通って取られたＢ−スキャン（左側画像）を示す野生型及びＲｓ１ＫＯマウスによるＯＣＴスキャンを示す図である。 Ｒｓ１ＫＯマウスのＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳ処理網膜におけるレチノスキシン免疫染色のスコアリングを示す図である。 Ｒｓ１ＫＯマウスのＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳ処理網膜におけるレチノスキシン免疫染色のスコアリングを示す図である。 未処理の眼、及びビヒクル、又は様々な用量のＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターの硝子体内投与により処理した眼のＥＲＧ ａ波及びｂ波の振幅を示す図である。注射後１１週間〜１５週間に眼を評価した。 １×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼及び２．５×１０^９ｖｇ／眼のベクター用量を受けた動物における注射後６ヶ月〜９ヶ月のＥＲＧ ａ波及びｂ波の振幅を示す図である。 図５及び図６に示されるデータセットから導かれる処理眼及び未処理の眼に対する短期及び長期のＥＲＧの結果の比較を示す図である。 様々ベクター用量に関するＯＣＴ画像による処理眼又は未処理の眼におけるスキーシス腔スコアリングの平均を示す図である。 １×１０^７ｖｇ／眼〜２．５×１０^９ｖｇ／眼のベクター用量に応じたレチノスキシンタンパク質発現を表す図である。 ビヒクルにより硝子体内注射したニュージーランド白ウサギにおける眼科的知見を表す図である。 ２×１０^１０ｖｇ／眼用量のＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳにより硝子体内注射したニュージーランド白ウサギにおける眼科的知見を表す図である。 ２×１０^１１ｖｇ／眼用量のＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳにより硝子体内注射したニュージーランド白ウサギにおける眼科的知見を表す図である。

実施形態例の説明
本発明は、一般的に、例えば、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、網膜剥離（疾患関連性、傷害誘導性、及び自然発生的）、加齢性黄斑変性症、嚢胞、嚢胞様黄斑浮腫、網膜色素変性症、及び老人性スキーシスを含む眼の障害を治療する改善された方法、またかかる治療方法において有用なベクターに関する。より具体的には、本発明は、最小の免疫応答の誘発を伴う、眼においてコードされるタンパク質の高レベルの発現をもたらすことができる改良された発現ベクターに関する。これらの特性により、かかるベクターは、眼において特定のタンパク質を産生することができないこと、又は眼における非機能性タンパク質の産生のいずれかに起因する眼疾患を治療するのに特に有用である。

本発明の方法は、一般的には、かかる治療を必要とする患者の眼に、眼において高レベルの治療用分子を発現する発現ベクターを投与することにより達成することができ、その発現ベクターの投与は、治療される患者の眼において免疫応答を誘発できないか、又は最小の免疫応答を誘発するいずれかである。

本発明を更に説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然に、それ自体が変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は特許請求の範囲のみによって限定されることから、限定を意図するものではないことが理解される。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される数量を指定していない単数形（the singular forms "a," "an," and "the"）は、文脈上別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。例えば、核酸分子は、１又は複数の核酸分子を指す。数量を指定しない用語（"a," "an"）、「１又は複数の」、及び「少なくとも一つの」の用語は、区別なく使用することができる。同様に、「含む（comprising）」、「含む、挙げられる（including）」、及び「有する（having）」の用語は区別なく使用することができる。特許請求の範囲は、あらゆる任意の要素を排除するように作成され得ることに更に留意されたい。そのため、この記載は、特許請求の範囲の要素の記述と関連して「単独で」、「のみ」等の排他的なかかる用語の使用に対して、又は「否定的な」限定の使用に対して先行詞としてはたらくことが意図される。

本明細書で検討される刊行物は、もっぱら本出願の出願日前のそれらの開示のため提供される。本明細書中のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる刊行物に先行する権利がないと認めるものと解釈されるものではない。さらに、提示される出版日は、実際の出版日とは異なる可能性があり、個別に確認を要する場合がある。

他に特に規定がなければ、本明細書に用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することもできるが、好ましい方法及び材料を以下に記載している。本明細書で言及される全ての刊行物は、それによって引用される刊行物と関連して上記方法及び／又は材料を開示及び説明するため引用することにより本明細書の一部をなす。

また、明確にするため個々の実施形態と関連して記載される本発明のいくつかの特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供される場合もあることが理解される。また、逆に言えば、簡潔にするため単一の実施形態と関連して記載される本発明の様々な特徴は、別々に、又は任意の好適なサブコンビネーションで提供される場合もある。実施形態の全ての組合せは、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組合せが個別にかつ明確に開示されるかのように本明細書に開示される。さらに、全てのサブコンビネーションも本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆるサブコンビネーションが本明細書に個別かつ明確に開示されるかのように本明細書に開示される。

本明細書で使用される個体、被験体及び患者の用語は、当該技術分野において十分に認識されており、本明細書では眼疾患の治療を必要とする任意のヒト又は他の動物を指すために区別なく使用される。例として、限定されないが、ヒト及び他の霊長類、チンパンジー及び他の類人猿等の非ヒト霊長類、並びにサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、アザラシ、ヤギ及びウマ等の家畜；イヌ及びネコ等の家畜化された哺乳動物；マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ及び他の家禽の鳥等の家畜化された鳥、野鳥及び猟鳥、アヒル、ガチョウ等を含む鳥類が挙げられる。好ましい治療患者はヒト患者である。個体、被験体及び患者の用語は、それ自体によって特定の年齢、性別、人種等を示すものではない。そのため、男性又は女性を問わず、任意の年齢の個体が本発明の開示によって包含されることが意図され、限定されないが、高齢者、成人、子供、赤ん坊、乳児、及び幼児が挙げられる。同様に、本発明の方法を、例えば、コーカサス人（白人）、アフリカ系アメリカ人（黒人）、ネイティブアメリカン、ネイティブハワイアン、スペイン系アメリカ人、ラテン系アメリカ人、アジア人、及びヨーロッパ人を含む任意の人種に適用することができる。

本発明を任意の眼疾患の治療に使用することができ、ここで、眼疾患はタンパク質の不適切な発現、又は眼において発現される機能不全型又は機能障害型のタンパク質の発現のいずれかに起因する。タンパク質の不適切な発現は、タンパク質の発現の欠如、低発現又は過剰発現を指す場合がある。機能不全型のタンパク質の発現は、そのタンパク質の活性を変更する１又は複数の突然変異を有するタンパク質の発現を指す。活性の変更は、タンパク質活性の完全な不活性化、タンパク質活性の減少、又はタンパク質活性の増加を指す場合がある。変更された活性は、例えば、タンパク質の活性部位の直接的な不活性化又はミスフォールディングに起因する場合がある。本発明を用いて治療することができる眼疾患の例としては、Ｘ連鎖性網膜分離症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、網膜剥離（疾患、傷害、又は自然発生に起因する）、嚢胞、嚢胞様黄斑浮腫、網膜色素変性症、及び老人性スキーシスが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明の発現カセットとしては、例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、又は色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）等のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を挙げることができる。例えば、本発明者らは、水晶体上皮細胞由来成長因子（ＬＥＤＧＦ）を発現するベクターを試験し、網膜色素変性症（ＲＰ）のＲＣＳラットモデルにおいて保護効果を実証した。

好ましい実施形態では、治療される眼疾患はＸ連鎖性網膜分離症である。Ｘ連鎖性網膜分離症は、視力障害及び網膜剥離の傾向を引き起こす神経発生的な網膜の異常である。ＸＬＲＳは、網膜のニューロン層及び網状層の正常な積層における構造異常を特徴とする。臨床検査は、黄斑内の小嚢胞、及びスキーシス又は周辺部網膜の層の内部解離を示す。Ｘ染色体性若年網膜分離症は、網膜及び松果体によってのみ発現される２２４アミノ酸の分泌タンパク質であるレチノスキシンをコードする遺伝子における突然変異によって引き起こされる。

本明細書で使用される発現ベクターは、本発明の治療用分子をコードする核酸配列（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含む組換え核酸分子であり、その核酸配列は、発現ベクターを、例えば、被験体又は臓器、組織若しくは細胞に投与した場合に治療用分子の高レベルの発現を駆動するプロモーターに連結される。本開示の発現ベクターは、人の介入により製造され、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその変異体であってもよい。発現ベクターは、線状分子（例えば、線状核酸分子、線状ウイルスゲノム等）であってもよく、又は例えばプラスミド等の環状分子であってもよい。一実施形態では、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶベクター）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶベクター）、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス（ワクシニアベクター）、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、又は任意の他のＤＮＡウイルス若しくはＲＮＡウイルスに由来する１又は複数の核酸配列を含んでもよい。一実施形態では、発現ベクターはＤＮＡプラスミドであってもよい。一実施形態では、発現ベクターはウイルスゲノムであってもよい。一実施形態では、発現ベクターは、核酸分子の送達及びコードされた治療用分子の高レベルの発現を可能とするためのプラスミドに由来する核酸配列、及びウイルスゲノムに由来する核酸配列を含む線状又は環状のいずれかのＤＮＡ分子であってもよい。一実施形態では、発現ベクターはＡＡＶ発現ベクターである。本明細書で使用されるＡＡＶ発現ベクターは、核酸分子の複製、パッケージング、及び／又は発現を可能とするＡＡＶ配列を含む核酸分子である。発現ベクターを構築する一般的な方法は当該技術分野で知られており、例えば、いずれもその全体が引用することにより本明細書の一部をなすMolecular Cloning: a Laboratory Manual, 3^rd edition, Sambrook et al. 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press、及びCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1994にも開示される。

上述のように、本発明の発現ベクターは、治療用分子をコードする核酸配列の高レベルの発現を駆動するプロモーターを含む。本明細書で使用される「発現を駆動する」の文言は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からの転写を促進するプロモーターの能力を指す。本開示によれば、本発明の発現ベクターで使用されるプロモーターは、眼の細胞に特異的である（すなわち、眼特異的プロモーター）。すなわち、プロモーターは、発現ベクターが眼の細胞に導入された場合のみＯＲＦからの発現を駆動する。かかるプロモーターは、光受容体細胞、双極細胞、水平細胞、無軸索細胞、神経節細胞、桿体細胞及び錐体細胞等の細胞に特異的である。かかるプロモーターの例として、限定されないが、レチノスキシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、ＣＲＸプロモーター、及び光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーターが挙げられる。そのプロモーターがＯＲＦの高レベルの発現を駆動する限り、コードされるタンパク質の眼特異的発現を可能とする任意のプロモーターを使用することができる。よって、一実施形態では、発現ベクターは眼特異的プロモーターを含む。

本明細書で使用される高レベルの発現の文言は、眼疾患の症状を緩和するのに必要とされるベクターの量が最小の免疫応答を誘発するか、又は免疫応答を誘発しないように十分に高レベルで治療用分子を発現する本発明のベクター（すなわち、発現ベクター及び発現ベクターを含むウイルスベクター）の能力を指す。本発明によれば、眼疾患の症状の緩和は、眼疾患に由来する病態及び関連する症状を軽減又は排除する治療用分子の能力を指す。かかる緩和は、眼疾患の症状を完全に排除して患者の眼を正常な機能レベルまで回復し得るか、又はいくつかの病態を軽減して患者の眼の一部の機能を回復し得る。機能の正常なレベル及び部分的なレベルは相対的な用語であり、治療した眼における機能レベルと、比較可能な個体（例えば、同じ年齢、人種、性別等の個体）のコホートの眼において観察される機能レベルとを比較することにより決定されることが当業者に理解される。個体における眼機能のレベルを決定する方法は、当業者に知られている。また、必要な治療用分子のレベルを決定することは、経験上のプロセスである場合があることが当業者に理解される。しかしながら、かかるレベルが既知になると、参照プロモーターを使用して観察される発現のレベルとそのレベルとを比較することによりレベルを定量することができる。
かかる参照を確立した場合には、高レベルの発現は、その参照プロモーターを使用して観察される発現のレベルよりも顕著に高いレベルでのＯＲＦの発現をもたらすプロモーターの能力を指す場合がある。参照プロモーターの例は、Colosi et al. (Gene Therapy, 16, 2000, 916-926)に記載される。一実施形態では、本発明のプロモーターは、参照プロモーターよりも少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、又は少なくとも１０００倍高いレベルでＯＲＦの転写をもたらす場合がある。例えば、各発現ベクターによって産生されたＯＲＦ特異的ｍＲＮＡのレベルと比較することにより、発現のレベルを比較することができる。かかる比較を行う方法は、当業者に知られている。

本明細書で使用される最小の免疫応答は、本発明のコンストラクト（例えば、ベクター）に対して生じる治療を制限しない免疫応答を指す。そのため、例えば、本発明のコンストラクトが免疫応答を誘発し得る一方、その免疫応答はステロイド系又は非ステロイド系の抗炎症化合物／組成物の投与等の標準的な医療行為を使用して管理可能である。また、かかる免疫応答は解決可能とされ得る。一実施形態では、ベクターの投与は、そのベクターに対するいかなる免疫応答も誘発することがない。別の実施形態では、ベクターの投与は、そのベクターに対する治療を制限する免疫応答を誘発することがない。別の実施形態では、ベクターの投与は、そのベクターに対する用量を制限する免疫応答を誘発することがない。別の実施形態では、ベクターの投与は、そのベクターに対する検出可能な免疫応答を誘発することがない。別の実施形態では、ベクターの投与は、そのベクターに対する治療的に管理可能な免疫応答のみを誘発する。別の実施形態では、５０％未満のベクターが、ベクター中和アッセイにおいて２０ｍｇ／ｍｌでの静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）により中和される（Arbetman, A.E., et al., Novel Caprine Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid (AAV-Go.1) Is Closely Related to the Primate AAV-5 and Has Unique Tropism and Neutralization Properties, J Virol. 2005 December; 79(24):15238-15245を参照されたい）。別の実施形態では、ベクターの投与に続いて個体内でもたらされる免疫応答は、一過性には＋２細胞以下であり、慢性には＋１細胞以下である。

組織特異的プロモーターの一つの種類は、眼特異的プロモーターである。例えば、網膜の細胞（例えば、双極細胞、水平細胞、無軸索細胞、神経節細胞、桿体細胞及び錐体細胞を含む）にある場合のみＯＲＦの発現を駆動するプロモーターは、網膜特異的プロモーターと呼ばれる。そのため、一実施形態では、プロモーターは網膜特異的プロモーターである。一実施形態では、抗原提示細胞及び眼の外の組織における眼特異的プロモーターを含むウイルスベクターの発現は、眼の組織における発現の１％未満である。

網膜特異的プロモーターの一例は、レチノスキシン遺伝子プロモーターであり、その配列は、配列番号９により表される。配列番号９内において、塩基１〜８はクローニング用に操作したＮｏｔＩ部位であり、塩基９〜２４８はヒトＲＳプロモーター配列であり、塩基２４９〜２５４はＩＲＢＰエンハンサーの付加のため操作したＳａｌＩ部位であり、塩基２５５〜５１５はヒトＩＲＢＰエンハンサー配列であり、塩基５１６〜５２１はＩＲＢＰエンハンサーの付加のため操作したＳａｌＩ部位であり、塩基５２２〜７５０は近位レチノスキシンプロモーターであり、塩基５５１〜８０２はレチノスキシン第１エクソンであり、塩基８０３〜１０６３はスプライス供与部位及び近位レチノスキシン第１イントロンであり、塩基１０６４〜１０７１はイントロンのスプライス受容部位の連結のため操作したＡｓｃＩ部位である。

大半のｃＤＮＡについてイントロン無しのコンストラクトと比較して、イントロン配列が核から細胞質へのｍＲＮＡの排出を増加して導入遺伝子発現のおよそ１０倍の増加をもたらすことから、イントロン配列をプロモーター中に含める。ウイルスは、スプライシングを伴わないウイルスｍＲＮＡの排出を促進する他の機構を進化させている。スプライシングを阻害することにより、これらのウイルスは、ウイルス複製の後期に宿主ｍＲＮＡからウイルスｍＲＮＡへとタンパク質産生を転用することができる。このｍＲＮＡ輸送を果たすためにウイルスが使用する要素として、ＷＰＲＥ（マーモット肝炎ウイルス転写後調節因子）、及びＲＲＥ（ＨＩＶ及びＳＩＶ ｒｅｖ応答因子）が挙げられる。

そのため、一実施形態では、プロモーターは、レチノスキシンプロモーターの少なくとも一部を含む。具体的な実施形態では、その部分は配列番号９の一部である。一実施形態では、プロモーターは、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択される少なくとも一つの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み、プロモーターはレチノスキシン遺伝子プロモーター活性を有する。一実施形態では、プロモーターは、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択される少なくとも一つの配列を含み、プロモーターはレチノスキシン遺伝子プロモーター活性を有する。一実施形態では、プロモーターは配列番号９を含む。一実施形態では、プロモーターは配列番号９を含む。一実施形態では、プロモーターは配列番号９からなる。

本発明者らは、レチノスキシンプロモーター等のプロモーターに対する修飾が、ＯＲＦの発現を駆動するプロモーターの能力の顕著な改善をもたらす可能性があることを発見した。本発明のプロモーターの性能を改善するのに有用な可能性がある修飾の例として、転写因子結合要素、エンハンサー要素、サイレンサー要素及び境界要素等の調節要素の配列突然変異（例えば、ヌクレオチドの置換、付加、又は欠失）、及び付加、又は除去が挙げられる。かかる要素の例として、ＴＡＴＡ要素、Ｂ認識要素、及びＥ−ｂｏｘ要素が挙げられる。よって、一実施形態では、眼特異的プロモーターは、異種性の核酸配列を含むように修飾されている。本明細書で使用される異種性の核酸配列は、それらの天然の状況で（例えば、ゲノム中で）参照される配列に連結されていない核酸配列である。例えば、本発明の発現ベクターに存在する眼特異的プロモーターに関しては、それに対して異種性の配列は、眼の細胞においてかかる眼特異的プロモーター配列と関連して見出されない任意の核酸配列である。プロモーター領域に付加される任意の要素は、眼の細胞に特異的であることが好ましい。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、エンハンサー要素を含むプロモーターを含む。有用なエンハンサー要素の一例は、配列番号１２により表される、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー要素である。一実施形態では、プロモーターはＩＲＢＰプロモーターの少なくとも一部を含む。一実施形態では、エンハンサー要素は、配列番号１２に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、エンハンサーは近くのプロモーター（すなわち、エンハンサー配列のいずれかの末端の５００ヌクレオチド以内のプロモーター）からの転写を増強する能力を保持する。一実施形態では、ＩＢＲＰエンハンサー要素は配列番号１２を含む。一実施形態では、ＩＲＢＰエンハンサー要素は、眼特異的プロモーターの一方の末端に連結される。一実施形態では、ＩＲＢＰエンハンサー要素は、眼特異的プロモーターの配列内に挿入される。一実施形態では、ＩＲＢＰエンハンサー要素は、レチノスキシン遺伝子プロモーターの配列内に挿入される。

本明細書で使用される治療用分子は、眼の内部に導入された場合に、眼疾患の症状を改善又は排除することができる分子である。治療用分子の例として、タンパク質、及びｓｉＲＮＡを含むＲＮＡが挙げられる。かかる分子は、疾患に罹患した眼において失われているか、又は著しく減少される活性を提供することにより作用し得る。また、かかる分子は、疾患に罹患した眼において過剰発現された、又は正常レベルを顕著に上回って上昇された活性を変更若しくは減少することにより作用し得る。例えば、治療用分子は、眼の細胞において欠損している活性（例えば、特異的結合活性、酵素活性、転写調節活性等）を持つタンパク質であってもよい。かかる活性の欠損は、細胞がタンパク質を産生することができないこと、突然変異した不活性形態のタンパク質の産生、又は不活性形態を生じるタンパク質のミスフォールディングに起因し得る。いくつかの場合では、タンパク質の「良好な」（すなわち、機能的な）コピーを導入することが、失われた活性を直接的に置き換えることによって疾患の症状を緩和する場合がある。代替的には、治療用分子は、眼の細胞において他のタンパク質の活性を増加又は減少することによって作用し得る。例えば、治療用タンパク質は、別のタンパク質に結合することにより、第２のタンパク質の活性を減少又は排除する場合がある。代替的には、眼の細胞における治療用タンパク質の別のタンパク質への結合は、かかるタンパク質の安定化及び／又は関連する活性の増加をもたらす場合がある。最後に、治療用分子は、眼の細胞において遺伝子の転写、又は遺伝子に由来する転写産物の翻訳を増加又は減少する場合がある。例えば、治療用タンパク質は、遺伝子の転写領域に結合することにより、その遺伝子の転写を増加又は減少する場合がある。

タンパク質が眼疾患の治療に治療的に有利な活性を持つ限り、任意のタンパク質を治療用タンパク質として使用することができる。例えば、治療される疾患が異常な血管の成長（例えば、滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症等）に関連している場合、有用な治療用タンパク質は、抗血管新生活性を有する任意のタンパク質とすることができる。更なる例として、治療される疾患が眼のニューロパシー（例えば、緑内障、網膜色素変性症等）に起因する場合、有用な治療用タンパク質は、眼において神経保護効果を提供する任意のタンパク質又は分子とすることができる。かかるタンパク質の例として、限定されないが、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及び色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）が挙げられる。

有用な治療用タンパク質の一例は、２２４アミノ酸のジスコイジンドメイン含有網膜特異的分泌タンパク質のレチノスキシンタンパク質である。レチノスキシンタンパク質機能の喪失は、Ｘ連鎖性網膜分離症に関係があるとされている。本明細書で使用されるレチノスキシンタンパク質は、全長レチノスキシンタンパク質、又は野生型レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの活性を有するその任意の部分を指す。よって、一実施形態では、治療用タンパク質は、レチノスキシンタンパク質の少なくとも一部を含む。かかる部分は、得られる治療用タンパク質が全長レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの機能を持つ限り、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１２５アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１７５アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸を含んでもよい。関連する実施形態では、治療用タンパク質は、野生型レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの活性を有する、全長レチノスキシンタンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するレチノスキシンタンパク質、又はその任意の部分である。具体的な実施形態では、治療用タンパク質は、野生型レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの活性を有する、全長ヒトレチノスキシンタンパク質（配列番号２又は配列番号５）に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヒトレチノスキシンタンパク質、又はその任意の部分である。レチノスキシンタンパク質の既知の機能として、陰イオン性リン脂質への結合、ステライルアルファ及びＴＩＲモチーフ含有タンパク質（ＳＡＲＭ１）への結合、アルファ−Ｂ結晶性タンパク質への結合、及びベータ２ラミニンへの結合が挙げられる。

上述のように、レチノスキシンタンパク質は、他の分泌タンパク質及び膜貫通タンパク質に見出された構造であるジスコイジンドメインを含む。レチノスキシンタンパク質におけるジスコイジンドメインの機能は十分に理解されていないが、他のタンパク質においてジスコイジンドメインは細胞−細胞接着及び細胞−細胞シグナリングに関係があるとされている。レチノスキシンに関して、ジスコイジンドメイン構造を変更する突然変異の導入は、レチノスキシン機能の喪失及びＸ連鎖性網膜分離症の発症をもたらすことが実証されている（引用することにより本明細書の一部をなす、Wu and Molay, J. Biol. Chem., 278(30):28139-28146, 2003を参照されたい）。

一実施形態では、治療用タンパク質は、得られる治療用タンパク質が全長レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの機能を保持する限り、ヒトレチノスキシンタンパク質の少なくとも５０の連続するアミノ酸、少なくとも７５の連続するアミノ酸、少なくとも１２５の連続するアミノ酸、少なくとも１５０の連続するアミノ酸、少なくとも１７５の連続するアミノ酸、又は少なくとも２００の連続するアミノ酸を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は、その治療用タンパク質が全長レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの機能を保持する限り、配列番号２に由来する少なくとも５０の連続するアミノ酸、少なくとも７５の連続するアミノ酸、少なくとも１２５の連続するアミノ酸、少なくとも１５０の連続するアミノ酸、少なくとも１７５の連続するアミノ酸、又は少なくとも２００の連続するアミノ酸を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は配列番号２又は配列番号５を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は配列番号２又は配列番号５からなる。

一実施形態では、治療用タンパク質はレチノスキシンのジスコイジンドメインを含む。一実施形態では、治療用タンパク質はヒト又はマウスレチノスキシンタンパク質のジスコイジンドメインを含む。一実施形態では、治療用タンパク質は配列番号２又は配列番号５を含むタンパク質のジスコイジンドメインを含む。一実施形態では、治療用タンパク質は配列番号８を含む。

また、本発明の治療用タンパク質は、野生型タンパク質の変異体であってもよい。本明細書で使用される変異体は、その配列が参照配列に類似するが、同一ではないタンパク質、又は核酸分子を指し、ここで、その変異体タンパク質（又は変異体核酸分子によってコードされるタンパク質）の活性は著しく変更されていない。これらの配列の変異は、自然発生的な変異であってもよく、又は当業者に既知の遺伝子工学の技法を使用して変異を操作してもよい。かかる技法の例は、Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57のSambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al.、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出され得る。

変異体に関し、得られる変異体タンパク質が野生型タンパク質の機能を保持する限り、アミノ酸配列、又は核酸配列における任意の種類の改変が許容される。かかる変異の例として、限定されないが、欠失、挿入、置換及びそれらの組み合せが挙げられる。例えば、タンパク質に関して、そのタンパク質の活性に著しく影響を及ぼすことなく、タンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端から１又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）のアミノ酸を除去できることが多いことが当業者に十分理解されている。同様に、１又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）のアミノ酸を、そのタンパク質の活性に著しく影響を及ぼすことなく、タンパク質へと挿入できることが多い。

そのタンパク質の活性が著しく影響されない限りどのようなアミノ酸置換も許容される。この点について、アミノ酸をそれらの物理的特性に基づいてグループ分けすることができることが当該技術分野で理解される。かかるグループの例として、限定されないが、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性非荷電アミノ酸、及び疎水性アミノ酸が挙げられる。置換を含む好ましい変異体は、アミノ酸が同じグループのアミノ酸によって置換されているものである。かかる置換は保存的置換と呼ばれる。

自然発生的な残基を共通する側鎖の特性に基づいてクラス分けすることができる。
１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び、
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

例えば、非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーと別のクラスに由来するメンバーとの交換を含む場合がある。

アミノ酸の交換を行うに際し、アミノ酸の疎水性親水性指標（hydropathic index）を考慮してもよい。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷の特性に基づいて疎水性親水性指標に割り当てられている。疎水性親水性指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能の付与において疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当該技術分野で一般的に理解されている（Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-31）。いくつかのアミノ酸を、類似の疎水性親水性指標又はスコアを有し、なおも類似の生物学的活性を保持する他のアミノ酸に置換してもよいことが知られている。疎水性親水性指標に基づく交換を行うに際し、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがより一層好ましい。

また、特に、そのようにして作製される生物学的機能が同等のタンパク質又はペプチドが本発明のような免疫学的発明における使用を意図するものである場合、類似のアミノ酸の置換を親水性に基づいて効果的に行うことができることが当該技術分野で理解されている。その近接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大の局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわちそのタンパク質の生物学的特性と相関する。以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；及びトリプトファン（−３．４）。親水性値の類似に基づく交換を行うに際して、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換が更に特に好ましい。また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列に由来するエピトープを同定してもよい。

所望のアミノ酸置換（保存的又は非保存的を問わず）は、かかる置換が望まれる時に当業者によって決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、治療用タンパク質の重要な残基を同定する、又は本明細書に記載される治療用タンパク質の免疫原性、溶解性若しくは安定性を増加若しくは減少することができる。アミノ酸置換の例を以下に示す。

本明細書で使用される「タンパク質の活性に著しく影響を及ぼす」の文言は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％のタンパク質の活性の減少を指す。かかる活性を測定する方法は、当業者に知られている。

一実施形態では、治療用タンパク質は、得られる治療用タンパク質が全長レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの機能を保持する限り、野生型レチノスキシンタンパク質の配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は、得られる治療用タンパク質が全長レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの機能を保持する限り、野生型ヒトレチノスキシンタンパク質の配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は、得られる治療用タンパク質が全長レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの機能を保持する限り、配列番号（配列番号２又は配列番号５）の配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は、配列番号８に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含み、治療用タンパク質は、全長レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの機能を保持する。一実施形態では、治療用タンパク質は、配列番号８に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列はレチノスキシン機能に必要なそれらのシステイン残基を含む。

また、治療用分子は、特定の遺伝子の発現を調節するＲＮＡ分子等の核酸分子であってもよい。例えば、低分子阻害性（small inhibitory）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は特定の転写産物に結合することによって、かかる転写産物が翻訳されるのを抑制することができる。一実施形態では、治療用分子はｓｉＲＮＡである。

細胞への核酸分子の送達効率は、ウイルスベクター等の送達ビヒクルを使用することにより増加され得ることが当該技術分野でよく理解されている。よって、一つの実施形態では、発現ベクターは、ウイルス系によるベクターの複製、及びウイルスベクターへの発現ベクターのパッケージングを可能とする核酸配列を含んでもよい。かかる配列の一例は、アデノ随伴ウイルスに見られる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列である。ウイルス複製系の例は当該技術分野で知られており、例えば、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列を認識するタンパク質を発現する組換え細胞の使用、並びにＩＴＲ配列を含む核酸分子の直接の複製（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を発現する細胞）が挙げられる。同様に、発現ベクターをウイルスベクターにパッケージングすることができるパッケージングシステムが当業者に知られている（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質を発現する組換え細胞）。よって、一実施形態では、発現ベクターは少なくとも一つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。一実施形態では、発現ベクターは一対のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。本発明の発現ベクターを構築するのに有用なＡＡＶ ＩＴＲ配列は、それらがＡＡＶ複製系による発現ベクターの複製、及びウイルスベクターへの発現ベクターのパッケージングを可能とすることができる限り、どんなＡＡＶに由来するものであってもよい。一実施形態では、発現ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９からなる群から選択されるウイルスに由来する少なくとも一つのＩＴＲ配列を含む。一実施形態では、発現ベクターはＡＡＶ８に由来する少なくとも一つのＩＴＲ配列を含む。

本発明者らは、ＩＴＲ配列の修飾が、発現ベクターによってコードされる治療用タンパク質の発現の増加をもたらし得ることを見出した。例えば、ＩＴＲ配列は、相補的核酸鎖の正確な合成及び個々のＡＡＶゲノムへの二本鎖分子の分解に必要なｒｅｐニッキング配列及びＤ領域等の特定の配列を含むことが当該技術分野よく知られている。１又は複数のこれらの領域の除去は、二本鎖のゲノム核酸分子を二つの個別の分子へと分解できなくして、自己相補性分子を産生し、結果的にコードされるタンパク質の発現の増加をもたらす。よって、一実施形態では、発現ベクターは、ｒｅｐニッキング配列において又はＤ領域内で修飾された少なくとも一つのＩＴＲを含む。一実施形態では、発現ベクターはｒｅｐニッキング配列を欠く少なくとも一つのＩＴＲを含む。一実施形態では、発現ベクターはＤ領域を欠く少なくとも一つのＩＴＲを含む。一実施形態では、発現ベクターはｒｅｐニッキング配列及びＤ領域を欠く少なくとも一つのＩＴＲを含む。

検討されているように、ウイルスベクターへの発現ベクターのパッケージングは、眼の細胞への発現ベクターの送達効率を増加し得る。本明細書で使用されるウイルスベクターは、１又は複数のウイルスに由来するキャプシドタンパク質を含み、その粒子内に発現ベクターを封入するか、又は含有することができる粒子を指す。ウイルスベクターは、細胞表面の受容体へと結合して内部移行し、それにより眼の細胞の内部へと発現ベクターを送達することによって（例えば、細胞膜との融合により又はエンドサイト―シスにより）送達効率を増加し得る。得られるウイルスベクターが眼の細胞へと発現ベクターを送達することができる限り、任意のウイルスのキャプシドタンパク質を使用してウイルスベクターを構築することができる。ウイルスベクターの構築に使用される好ましいキャプシドタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶウイルス）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、及びシンドビスウイルスからなる群から選択されるウイルスから得ることができる。

一実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するキャプシドタンパク質を含む。ＡＡＶは、パルボウイルス科の小さな（直径およそ２０ｎｍ）エンベロープの無いウイルスである。ＡＡＶは、それ自体により複製する能力を欠くため、外部から供給される複製機能及びパッケージング機能に依存する点でこの科の他のメンバーとは異なる。これらの機能は、ヘルパーウイルスにより、又はかかる機能を提供するように操作された細胞により供給され得る。ＡＡＶウイルスのゲノムは、長さおよそ５ｋｂの単一の線状セグメントからなる。上記ゲノムの末端は、ウイルスの複製起点としてはたらくＴ字形のヘアピン構造に折りたたまれた短い逆位反復（ＩＴＲ）配列からなる。ＩＴＲ領域は、ＩＴＲの機能の中心として説明されている二つの要素を含む。これらの要素は、Ｄ領域反復モチーフ及び末端分解部位（ｔｒｓ）である。反復モチーフはＲｅｐタンパク質に結合し、子孫ゲノムの複製、転写、及び産生の調節に関与する。Ｒｅｐタンパク質の結合は、Ｒｅｐタンパク質がｔｒｓで切断することができるようにＲｅｐタンパク質に位置付ける。

現在、いくつかの既知のＡＡＶが存在し、その例としてＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９が挙げられる。得られる粒子が本発明の発現ベクターを封入して眼の細胞へとそれを送達することができる限り、任意のＡＡＶに由来するキャプシドタンパク質を使用することができる。好ましい実施形態では、キャプシドタンパク質はＡＡＶ８に由来する。よって、本発明の一実施形態は、ＡＡＶ８に由来するキャプシドタンパク質を含むウイルスベクター（ＡＡＶ８ベクター）であり、そのウイルスベクターは本発明の発現ベクターを含む。

霊長類ＡＡＶ血清型と反応性のヒトの既存の抗体の存在が、これらのＡＡＶ血清型から作製されたベクターの臨床上の有用性を低くし得ることが発見されている（上記のArbetman, et. al.）。特に、かなりの割合のヒトがＡＡＶ血清型１〜６を中和する抗体を有し、実験により、低中和力価を有する血清を作製するためのマウスへのヒト抗体の注入がＡＡＶ２ベクターによる形質導入を著しく低下したことが実証された。ＡＡＶ血清型に対するヒトの既存の液性免疫の問題に対処するため、本発明のウイルスベクターは、限定されないがＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含む、ヒトにおける既存の免疫性をわずかに有するか、又は有しないＡＡＶキャプシドタンパク質を含むことが好ましい。

本明細書で使用されるＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、全長ＡＡＶ８キャプシドタンパク質、又はウイルス粒子を形成し、本発明のベクターの発現ベクターの封入、及び細胞への封入された発現ベクターの送達が可能なその任意の部分を指す。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質に由来する少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸を含むタンパク質を含む。一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１４に由来する少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸を含む。一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１４を含むタンパク質を含む。

また、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質の変異体がウイルス粒子を形成し、本発明の発現ベクターを封入し、細胞へと封入した発現ベクターを送達することができる限り、その変異体タンパク質を使用して本発明のウイルスベクターを産生することができる。一実施形態では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％同一のキャプシドタンパク質を含む。一実施形態では、ウイルス粒子は、配列番号１４に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％同一のキャプシドタンパク質を含む。本発明の方法は、かかる治療を必要とする個体の眼に本発明のベクターを投与することを含む。上記発現ベクターが眼の内部へと送達される限り、任意の投与方法を使用して発現ベクターを送達することができる。例えば、一実施形態では、発現ベクターは、封入された発現ベクターが眼の外層（すなわち、角膜、虹彩、強膜、瞳孔、水晶体、又は結膜）を横切って眼内液（眼房水とも呼ばれる）に入ることができるように、他の分子（例えば、タンパク質、脂質等）に封入されてもよい。一実施形態では、発現ベクターは、眼の外層を横切って眼内液に入ることができるウイルスベクターに封入される。よって、いくつかの実施形態では、発現ベクターは眼に局所投与される。好ましい実施形態では、発現ベクターは、単独又は封入形態で眼に注入される。これは、筋肉内、皮内、皮下、結膜下及びテノン嚢下、硝子体内、網膜下、静脈内及び前房内の注射を含んでもよい。かかる注射は、眼内液又は網膜内の場所に発現ベクター又は発現ベクターを含むウイルスベクターを送達することができる。一実施形態では、注射は、眼内液へと発現ベクター又は発現ベクターを含むウイルスベクターを送達する。一実施形態では、注射は網膜へと発現ベクター又は発現ベクターを含むウイルスベクターを送達する。一実施形態では、発現ベクターは硝子体内注射により投与される。別の実施形態では、発現ベクターは網膜下注射により投与される。別の実施形態では、発現ベクターはテノン嚢下注射により投与される。眼内注射を行う方法は当業者に知られている。これら全ての実施形態において、発現ベクターはポリプロピレンシリンジ内に含まれ、それを介して投与されることが好ましい。これらの手段によって投与する場合、単一注射投与量としては、１×１０^８ｖｇ／眼〜３×１０^１３ｖｇ／眼（すなわち、１つの眼につき１ｘ１０^８ベクターゲノム（ｖｇ）〜１つの眼につき３ｘ１０^１３ベクターベクターゲノム）を挙げることができる。これらの手段によって投与する場合、単一注射投与量は、３×１０^８ｖｇ／眼〜１×１０^１３ｖｇ／眼、又は１×１０^９ｖｇ／眼〜１×１０^１３ｖｇ／眼、又は３×１０^９ｖｇ／眼〜１×１０^１３ｖｇ／眼、又は１×１０^１０ｖｇ／眼〜１×１０^１３ｖｇ／眼、又は３×１０^１０ｖｇ／眼〜１×１０^１３ｖｇ／眼、又は１×１０^１１ｖｇ／眼〜１×１０^１３ｖｇ／眼、又は３×１０^１１ｖｇ／眼〜１×１０^１３ｖｇ／眼、又は１×１０^１２ｖｇ／眼〜１×１０^１３ｖｇ／眼、又は３×１０^１２ｖｇ／眼〜１×１０^１３ｖｇ／眼であってもよい。

また、本発明は、本明細書に開示される方法を実施するためのベクターを提供する。よって、本発明の一実施形態は、眼疾患を治療するための治療用タンパク質をコードする発現ベクターであり、発現ベクターはかかる治療を必要とする個体の眼に投与された場合に高レベルの治療用タンパク質を発現する。一実施形態では、発現ベクターはプラスミドである。一実施形態では、発現ベクターは線状核酸分子である。一実施形態では、発現ベクターはＤＮＡを含む。一実施形態では、発現ベクターはＲＮＡを含む。一実施形態では、発現ベクターは、１又は複数のウイルスに由来する１又は複数の配列を含む。更なる実施形態では、発現ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶウイルス）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶベクター）、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス（ワクシニアベクター）、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、又は任意の他のＤＮＡウイルス若しくはＲＮＡウイルスに由来する１又は複数の核酸配列を含む。一実施形態では、発現ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９からなる群から選択されるＡＡＶに由来する核酸配列を含む。好ましい実施形態では、発現ベクターはＡＡＶ８由来の核酸配列を含む。

本発明の発現ベクターは、眼疾患の症状を緩和することができる治療用分子の高レベルの発現を提供する。よって、本発明の一実施形態は、治療用分子をコードする発現ベクターであり、発現ベクターは治療用分子の高レベルの発現を駆動するプロモーターを含む。一実施形態では、プロモーターは眼特異的プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは網膜特異的プロモーターである。一実施形態では、プロモーターはレチノスキシンプロモーターの少なくとも一部を含む。一実施形態では、上記一部は配列番号９に由来する。一実施形態では、プロモーターは配列番号９を含む。一実施形態では、プロモーターは配列番号９からなる。一実施形態では、プロモーターは、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択される少なくとも一つの配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、プロモーターはレチノスキシン遺伝子プロモーター活性を有する。一実施形態では、プロモーターは、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択される少なくとも一つの配列を含み、プロモーターはレチノスキシン遺伝子プロモーター活性を有する。一実施形態では、プロモーターは配列番号９を含む。

また、本発明の発現ベクターは、コードされる治療用分子の発現を増加又は減少するために修飾されたプロモーターを含んでもよい。よって、一実施形態では、発現ベクターは、プロモーター配列の突然変異によって修飾された、レチノスキシンプロモーター等のプロモーターを含む。一実施形態では、発現ベクターは、ＴＡＴＡ要素、Ｂ認識要素、又はエンハンサー要素等の１又は複数の遺伝子要素を欠くプロモーターを含む。一実施形態は、治療用分子をコードする発現ベクターであり、コードする配列は、コードされる分子の高レベルの発現を駆動するプロモーターに連結され、発現ベクターはエンハンサー要素を含む。一実施形態では、エンハンサー要素はＩＲＢＰエンハンサー要素である。一実施形態では、エンハンサー要素は配列番号１２を含む。一実施形態では、エンハンサー要素は、配列番号１２に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、エンハンサーは近くのプロモーター（すなわち、エンハンサー配列のいずれかの末端の５００ヌクレオチド以内のプロモーター）からの転写を増強する能力を保持する。一実施形態では、ＩＲＢＰエンハンサー要素は、眼特異的プロモーターの一方の末端に連結される。一実施形態では、ＩＲＢＰエンハンサー要素は、眼特異的プロモーターの配列内に挿入される。一実施形態では、ＩＲＢＰエンハンサー要素は、レチノスキシン遺伝子プロモーターの配列内に挿入される。

上述のように、本発明の発現ベクターは眼疾患の治療のための治療用分子をコードする。治療用分子は、眼の細胞において発現された場合に眼疾患の治療に有用な任意の分子であってもよい。よって、本発明の一実施形態は、治療用分子をコードする発現ベクターであり、発現ベクターは眼において治療用分子の高レベルの発現を駆動するプロモーターを含み、眼の細胞における治療用分子のこの発現が眼疾患の症状を改善する。一実施形態では、治療用分子はＲＮＡ分子である。一実施形態では、治療用分子はｓｉＲＮＡ分子である。一実施形態では、治療用分子はタンパク質である。一実施形態では、治療用分子は眼において通常見出されるタンパク質である。一実施形態では、治療用分子は、レチノスキシンタンパク質の少なくとも一部を含むタンパク質であり、コードされるタンパク質はレチノスキシンタンパク質活性を有する。一実施形態では、治療用分子は、レチノスキシンタンパク質に由来する少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸を含むタンパク質であり、コードされるタンパク質はレチノスキシンタンパク質活性を有する。一実施形態では、治療用分子は、レチノスキシンタンパク質に由来するアミノ酸６３〜２２４を含むタンパク質であり、コードされるタンパク質はレチノスキシンタンパク質活性を有する。一実施形態では、治療用分子は、配列番号２に由来する少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸を含むタンパク質である。一実施形態では、治療用タンパク質は、配列番号２に由来する少なくともアミノ酸６３〜２２４を含み、コードされるタンパク質はレチノスキシン活性を有する。一実施形態では、治療用タンパク質は配列番号２又は配列番号５を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は、配列番号２又は配列番号５からなる。

また、本発明の発現ベクターによってコードされる治療用タンパク質は、眼疾患の症状を緩和するタンパク質の変異体であってもよい。かかる変異体は、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を含んでもよい。よって、本発明の一実施形態は、野生型治療用タンパク質の変異体をコードする発現ベクターであり、発現ベクターは眼における変異体タンパク質の高レベルの発現を駆動するプロモーターを含み、眼の細胞における変異体タンパク質の発現が眼疾患の症状を緩和する。一実施形態では、治療用タンパク質は、野生型の治療用タンパク質の配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み、変異体タンパク質は野生型タンパク質の機能を保持する。一実施形態では、発現ベクターは野生型レチノスキシンタンパク質の変異体をコードする。一実施形態では、コードされるタンパク質は、野生型レチノスキシンタンパク質の配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み、コードされるタンパク質はレチノスキシン活性を有する。一実施形態では、コードされるタンパク質は、野生型ヒトレチノスキシンタンパク質の配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み、コードされるタンパク質はレチノスキシン活性を有する。一実施形態では、治療用タンパク質は、配列番号（配列番号２又は配列番号５）の配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み、コードされるタンパク質はレチノスキシン活性を有する。

本発明の発現ベクターは、それらの送達効率を改善するため、ウイルスベクターにパッケージングされてもよい。よって、本発明の一実施形態は、治療用分子をコードする発現ベクターであり、発現ベクターは眼における治療用分子の高レベルの発現を駆動するプロモーターを含み、眼の細胞におけるその治療用分子の発現が眼疾患の症状を緩和し、上記ベクターが発現ベクターの複製、それからの転写、又はそのパッケージングを方向づける核酸配列を含む。一実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターへと発現ベクターをパッケージングすることを可能とする配列を含む。一実施形態では、発現ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９からなる群から選択されるウイルスに由来する１又は複数のＩＴＲ配列を含む。一実施形態では、発現ベクターはＡＡＶ８に由来する１又は複数のＩＴＲを含む。一実施形態では、発現ベクターは、ＡＡＶ８ ＩＴＲの少なくとも一部を含む少なくとも一つのＩＴＲ配列を含み、ＩＴＲはなおも発現ベクターの複製、転写及びパッケージングを方向づけることができる。

また、本発明の発現ベクターのＩＴＲは、発現ベクターの特性を改善するために修飾されてもよい。よって、本発明の一実施形態は、治療用分子をコードする発現ベクターであり、発現ベクターは眼において治療用分子の高レベルの発現を駆動するプロモーターを含み、眼の細胞におけるその治療用分子の発現が眼疾患の症状を緩和し、上記ベクターは２以上のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、少なくとも一つのＩＴＲはｒｅｐニッキング配列又はＤ領域を欠く。一実施形態では、発現ベクターは、ｒｅｐニッキング配列を欠く少なくとも一つのＩＴＲを含む。一実施形態では、発現ベクターは、Ｄ領域配列を欠く少なくとも一つのＩＴＲを含む。一実施形態では、発現ベクターは、ｒｅｐニッキング配列及びＤ領域配列の両方を欠く少なくとも一つのＩＴＲを含む。

また、本発明は、開示される方法を実施するのに有用なウイルスベクターを提供する。本発明のウイルスベクターは、ウイルスキャプシドタンパク質に封入された本発明の発現ベクターを含む。かかるキャプシドタンパク質内の発現ベクターの封入は、眼の細胞へと発現ベクターを送達する効率を高める。本発明のウイルスベクターは、個体の眼に投与された場合に、わずかな免疫応答を生じるか、又は免疫応答を生じないかのいずれかである。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、これは、治療用タンパク質の発現レベルが十分に高いため、治療される疾患の症状を緩和するのに必要なウイルスベクターの用量が、免疫応答を誘発することがないか、又はわずかな免疫応答を誘発する程度に十分低い可能性があると考える。これに関連して、「わずかな免疫応答」は、これが治療を制限しないか、又は用量制限的でないか、又は投薬量若しくはタイミングを調整することによって、若しくは抗炎症剤（ステロイド系又は非ステロイド系）の同時投与によって臨床上管理され得るか、又はこれらの因子の組合せのいずれかの免疫応答を意味する。よって、本発明の一実施形態は、眼疾患の治療のための治療用タンパク質をコードする発現ベクターを含むウイルスベクターであり、発現ベクターは、個体の眼に投与された場合に高レベルの治療用タンパク質を発現し、発現ベクターは１又は複数のウイルスに由来するキャプシドタンパク質によって封入される。一実施形態では、１又は複数のウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶウイルス）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、及びシンドビスウイルスからなる群から選択される。好ましい実施形態では、ウイルスキャプシドタンパク質はＡＡＶ由来である。一実施形態では、ウイルスキャプシドタンパク質はＡＡＶ８由来である。一実施形態では、ウイルスキャプシドタンパク質は配列番号１４を含む。

また、本発明のウイルスベクターは、ウイルスキャプシドタンパク質の機能性部分を使用して構築されてもよい。よって、本発明の一実施形態は、眼疾患の治療のための治療用分子をコードする発現ベクターを含むウイルスベクターであり、発現ベクターは個体の眼に投与された場合に高レベルの治療用分子を発現し、発現ベクターは１又は複数のウイルスに由来するキャプシドタンパク質の少なくとも一部を含むタンパク質によって封入され、１又は複数のウイルスに由来するキャプシドタンパク質の少なくとも一部を含むタンパク質はウイルスベクターに自己組織化する。一実施形態では、封入タンパク質は、１又は複数のＡＡＶに由来するキャプシドタンパク質の少なくとも一部を含む。一実施形態では、封入タンパク質は、１又は複数のＡＡＶに由来するキャプシドタンパク質に由来する少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸を含む。好ましい実施形態では、封入タンパク質は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質の少なくとも一部を含む。一実施形態では、封入タンパク質は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質に由来する少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸を含む。一実施形態では、封入タンパク質は、配列番号１４に由来する少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸を含む。

また、本発明のウイルスベクターは、ウイルスキャプシドタンパク質の変異体を使用して構築されてもよい。よって、本発明の一実施形態は、眼疾患の治療のための治療用分子をコードする発現ベクターを含むウイルスベクターであり、発現ベクターは個体の眼に投与された場合に高レベルの治療用分子を発現し、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶウイルス）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、及びシンドビスウイルスから選択されるウイルスに由来するキャプシドタンパク質に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むタンパク質によって封入され、封入タンパク質はウイルスベクターに自己組織化することができる。一実施形態では、封入タンパク質は、ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、封入タンパク質は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、封入タンパク質は、配列番号１４に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。

また、本発明は、本発明の方法に使用されるウイルスベクターを製造する方法を提供する。よって、本発明の一実施形態は、本発明の発現ベクターとパッケージングシステムとを接触させることを含み、発現ベクターが発現ベクターのウイルスベクターへのパッケージングを方向づける配列を含む、眼疾患を治療するためのウイルスベクターを製造する方法である。一実施形態では、発現ベクターは、眼疾患を治療するための治療用分子をコードし、発現ベクターは個体の眼に投与された場合に高レベルの治療用分子を発現し、発現ベクターは発現ベクターのパッケージングを方向づける核酸配列を含む。一実施形態では、発現ベクターは１又は複数のＡＡＶ ＩＴＲを含む。一実施形態では、発現ベクターとパッケージングシステムとを接触させる工程は、発現ベクターを細胞へと導入することを含む。核酸分子を細胞へと導入する方法は、当該技術分野で知られており、例えば、形質移入及びエレクトロポレーションが挙げられる。一実施形態では、発現ベクターは１又は複数のＡＡＶタンパク質を発現する細胞へと導入される。一実施形態では、１又は複数のＡＡＶタンパク質を発現する細胞は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶキャプシドタンパク質、又はＲｅｐタンパク質とキャプシドタンパク質との両方を発現するように操作された組換えタンパク質である。また、パッケージング機能はヘルパーウイルスによって提供されてもよい。よって、一実施形態では、発現ベクターは、ヘルパーウイルスにも感染した細胞へと導入される。

また、本発明は、本発明の発現ベクターを含む治療用組成物を提供する。かかる組成物は、例えば、水、生理食塩水、塩、緩衝溶液、希釈剤、安定化剤、ポリマー、キレート剤等を含む生理学的に許容可能な溶液中に発現ベクターを含む。生理学的に許容可能な溶液の一例は、約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）及び約１８０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液である。好適な溶液の更なる例は、約３１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、約１８０ｍＭ ＮａＣｌ、及び約０．００１％プルロニックＦ−６８を含む溶液である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、約１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）、約１８０ｍＭ ＮａＣｌ、及び約０．００１％プルロニックＦ−６８を含有する溶液を含む。かかる濃度はおおよその値であり、上記組成物の有効性に著しく影響を及ぼすことなく、１０％以上程変化し得ることが当業者に理解される。

また、本発明は、開示される方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明の発現ベクターと本発明のウイルスベクターとを備ることができる。また、かかるキットは、例えば、緩衝溶液、希釈剤、シリンジ、針、及びかかる試薬を投与するための指示書等の開示される方法を実施するのに必要な試薬及び道具を備えてもよい。本発明はその具体的な実施形態を参照して説明されるが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変形を行ってもよく、等価物を置換できることが当業者によって理解される。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程又は工程を本発明の目的、趣旨及び範囲に適合させるために多くの修正を行ってよい。かかる修飾は全て、特許請求の範囲に含まれることが意図される。

これらの実施例は、ヒトレチノスキシンタンパク質（配列番号２）を発現するＡＡＶベクターの網膜分離症のマウスモデルにおいて網膜機能を保護する能力を実証する。

実施例１
提案される臨床用アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）レチノスキシンベクターであるＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳの網膜の機能及び構造を保護する能力、並びにレチノスキシン欠損Ｒｓ１ＫＯマウスに硝子体内投与した場合にレチノスキシンタンパク質発現を媒介する能力を評価するため研究を行った。１．０×１０^６ｖｇ／眼、１．０×１０^７ｖｇ／眼、５．０×１０^７ｖｇ／眼、１．０×１０^８ｖｇ／眼、５．０×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量のＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクター、又はビヒクルを、１８日齢〜３４日齢のＲｓ１ＫＯマウスに硝子体内注射により投与した。反対側の眼には注射しなかった。角膜網膜電図（ＥＲＧ）ａ波及びｂ波の振幅を注射後（ＰＩ）１１週間〜１５週間、及び６ヶ月〜９ヶ月に測定し、網膜腔の形成を注射後１２週間〜１６週間に光コヒーレンストモグラフィ（ＯＣＴ）により測定し、また、レチノスキシンタンパク質発現を注射後１２週間〜１８週間、及び６ヶ月〜９ヶ月に免疫組織化学により測定した。ＥＲＧ及びＯＣＴは、それぞれ網膜の機能及び構造の指標として臨床上使用される。注射後１１週間〜１５週間において、５×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量を受ける眼は、ＥＲＧ ａ波振幅の統計学的に有意な改善を示し、５×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量は注射していない眼と比較してＥＲＧ ｂ波振幅の統計学的に有意な改善を示した。６ヶ月〜９ヶ月の時点で１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の３つのベクター用量を試験したところ、全てが注射していない眼と比較してＥＲＧ ａ波及びｂ波の振幅の統計学的に有意な改善をもたらした。注射後１１週間〜１５週間にＯＣＴによって測定される網膜腔もまた、未処理の眼と比較して５×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量で顕著に減少した。網膜免疫組織化学は、注射後１１週間〜１５週間の未処理の眼と比較して、１×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量で顕著なレチノスキシンタンパク質レベルをもたらすことを示した。１×１０^８、５×１０^８、及び２．５×１０^９の用量は、野生型マウスの２５％以上の発現をもたらした。注射後６ヶ月〜９ヶ月において、２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量のみを試験したところ、野生型レチノスキシンレベルの６５％を生じ、これは１１週間〜１５週間を上回る顕著な増加である。これらのデータは、ＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳが、これまでに与えられたベクターＡＡＶ８ ｈＲＳｐ４よりも１０倍〜１００倍低い用量で有効性を示すことを実証した。マウス網膜分離症モデルにおける有効性、及びウサギにおける毒性に関するいくつかのレチノスキシンベクターの調査により、ＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳを開発した。

上述の通り、本研究は、ＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターの網膜機能及び網膜構造を保護する能力、並びにレチノスキシン欠損Ｒｓ１ＫＯマウスに硝子体内投与した場合にレチノスキシンタンパク質発現を媒介する能力を調査した。Ｒｓ１ＫＯマウスは、ａ波に比べて非常に減少したｂ波、並びにスキーシスの存在又は内顆粒層及び外網状層の割裂を含むヒト疾患の特徴である構造及び機能の変化を呈するＸ連鎖性網膜分離症のレチノスキシンノックアウトモデルである。本研究では、ビヒクル又は１．０×１０^６ｖｇ／眼、１．０×１０^７ｖｇ／眼、５．０×１０^７ｖｇ／眼、１．０×１０^８ｖｇ／眼、５．０×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量のＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターを１８日齢〜３４日齢のＲｓ１ＫＯマウスに硝子体内注射により投与した。非常に大雑把な推定ではあるが、この日齢のマウスは、治療の成功により最も利益を得る可能性がある患者集団の年齢（青年期及び若年成人）におおよそ対応する。その後、注射後１１週間〜１５週間及び６ヶ月〜９ヶ月に、網膜機能に関してＥＲＧ、網膜構造に関してＯＣＴ、及びレチノスキシン発現に関して免疫組織化学により上記マウスを評価した。

また、本明細書に開示される実験は、このベクターがＲｓ１ＫＯマウスにおいて網膜機能及び構造を顕著に保護し、タンパク質の顕著な網膜発現を達成する用量範囲を決定するために計画された。

本実施例で使用されるウイルスベクターの説明
本実施例で使用されるベクターであるＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳは、ヒトレチノスキシンｃＤＮＡの発現を駆動する修飾ヒトレチノスキシンプロモーターで構成される自己相補型ベクターゲノムを送達する８型アデノ随伴ウイルスベクターである。また、このベクターは、プロモーター活性を増大するための光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー、切断型レチノスキシン第１イントロン、並びにヒトベータ−グロビン３’非翻訳領域及びポリアデニル化部位を採用するものである。ＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳの構造を図１に示し、このベクターの完全な配列を配列番号１６として提供する。

ｐＡＡＶ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクター産生プラスミドの構造
ｐＡＡＶ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳと呼ばれるＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクター用の産生プラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（カリフォルニア州サンディエゴのStratagene Inc.）へとクローニングされた、ＡＡＶ２逆位末端反復配列により結合された上述のヒトレチノスキシン発現カセットで構成される。

ｐＡＡＶ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクター産生プラスミドの構築
レチノスキシン発現カセット：上記発現カセットのタンパク質コーディング部分は、３１９ｂｐの切断型レチノスキシン第１イントロンを保持するヒトレチノスキシンｃＤＮＡで構成される。切断型イントロンは、レチノスキシン転写開始部位に対して＋９５〜＋３５５、及び＋１４３９６〜＋１４４４５の塩基対からなる。これらの配列は、それぞれ、スプライス供与要素、及びラリアット／スプライス受容要素をコードする。ベクター構築を容易にするため、８塩基対のＡｓｉＳＩ制限酵素部位を上記イントロンの２つの部分の間に導入した。上記発現カセットの転写は、開始コドンより前の塩基である、転写開始部位に対して−７３９位から＋４２位まで伸びるヒトレチノスキシンゲノム配列によって駆動される。このプロモーター配列は、−４９６位〜−１８８位に３０８ｂｐのＡｌｕ反復配列を含み、これは、欠失されて、ＳａｌＩ部位に隣接したヒトＩＲＢＰ遺伝子に由来する２６１ｂｐのエンハンサーで置き換えられている。ＩＲＢＰエンハンサーは、ＩＲＢＰ転写開始部位に対して−１３７４位〜−１６３５位に位置する。ポリアデニル化は全ヒトベータ−グロビン３’非翻訳領域及びポリアデニル化部位をコードする２１８ｂｐのフラグメントによって方向づけられる。この領域は、ヒトベーターグロビン停止コドンに直接続く２１８ｂｐのゲノム配列に対応する。構築を容易にするため、ＸｈｏＩ部位及びＢｇｌＩＩ部位をコードする合成ＤＮＡを、レチノスキシン停止コドンと、３’非翻訳部位及びポリアデニル化部位をコードするベータグロビン配列との間に導入した。５’及び３’ＡＡＶ２逆位末端反復要素に連結するため、ＮｏｔＩ部位及びＡｓｃＩ部位を上記発現カセットの５’末端と３’末端にそれぞれ付加した。

ＡＡＶ逆位末端反復配列：このコンストラクトで使用するＩＴＲは同一ではない。５’ＩＴＲはｐｓｕｂ２０１に由来する。ｐｓｕｂ２０１に由来するＩＴＲは、導入遺伝子に近接しないパリンドロームのＡ領域におけるＩＴＲ配列の１５塩基対の欠失を有する。その結果、ｐｓｕｂ２０１に由来するＩＴＲは、野生型の１４５ｂｐの長さと異なり、１３０ｂｐの長さである。ｒｅｐニッキング部位を含む「Ｄ領域」の除去により、５’ＩＴＲを更に修飾した。これを行うため、ＩＴＲパリンドロームの内部境界の近くに位置するＭｓｃＩ部位をＭｓｃＩにより切断し、Ｄ領域に代えて、ＳｍａＩ（ハーフサイト）−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＸｂａＩ−ＮｏｔＩをコードするポリリンカーをそれに連結した。この修飾ＩＴＲは、自己相補型ＡＡＶベクターゲノムの産生を可能とする。また、ＰａｃＩ部位をＩＴＲの外側（導入遺伝子に近接しない）に付加した。３’ＩＴＲは１４５ｂｐの全長ＩＴＲであり、核酸合成（ワシントン州ボセルのBlue Heron）により産生された。その内側（導入遺伝子に近接する）で３’ＩＴＲはＡｓｃＩ部位に隣接し、その外側ではＦｓｅＩ部位に隣接する。ＩＴＲをＮｏｔＩ（５’）部位及びＡｓｉＳＩ（３’）部位により上記発現カセットに連結し、ＰａｃＩ（５’）部位及びＦｓｅＩ（３’）部位によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド骨格に連結する。上記発現カセットのプロモーターは５’ＩＴＲに近接する。

ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド骨格：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ／Ｋ＋プラスミドをＡＡＶベクタープラスミド骨格として使用するため修飾した。上記プラスミド中４５７位及び１１５０位に位置するＡｆｌｌＩＩ部位とＢｓｔＵＩ（部分）部位との間の配列を除去し、制限酵素部位ＳｓｅＩ−ＰｖｕＩＩ−ＳｓｅＩ−ＡｆｌＩＩをコードする合成ＤＮＡで置き換えた。このポリリンカーを、第１ポリリンカーの二つのＳｓｅＩ部位の間に制限酵素部位ＳｓｅＩ−ＰｓｐＸＩ−ＰｍｌＩ−ＰｖｕＩＩ−ＳｓｅＩをコードするポリリンカーを連結することにより更に修飾した。最後に、ＰｓｐＸＩ及びＳａｐＩ（平滑）を用いて切断することによりＩＴＲに隣接するＡＡＶベクターをその構築に使用されるｐＵＣ１８から切除し、上記ポリリンカーのＰｓｐＸＩ部位とＰｖｕＩＩ部位との間に連結して、ｐＡＡＶ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳ産生プラスミドを作製した。

ウイルスベクターの構築
ＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターを以前に記載されるように調製した（Grimm D et al. 2003）。簡潔には、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００７０．０３）を含有し、ペニシリン、ストレプトマイシン及びグルタミンを添加したＤＭＥ（高グルコース）培地中、８５０ｃｍ^２のローラーボトルにおいて培養した２９３細胞に、ヘルパープラスミドｐＬａｄｅｎｏ５（アデノウイルス２型Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡのＲＮＡをコードする）及びｐＨＬＰ１９−８（ＡＡＶ２ ｒｅｐ及びＡＡＶ８ ｃａｐをコードする）、並びにｐＡＡＶ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクタープラスミドを、リン酸カルシウム法を使用して一過性に形質移入した。形質移入の後、培地を交換し、血清を含まない同じ培地で置き換えた。６０時間後、遠心分離により細胞を採取し、−８０℃で保存した。ウイルスベクターを精製するため、細胞ペレットを溶解し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ８．０に懸濁し、３回の顕微溶液化により破壊した。細胞片を遠心分離により除去し、上清を２５ｍＭ ＣａＣｌ_２に調整し、得られたペレットも遠心分離により除去した。ベンゾナーゼヌクレアーゼを１ｍｌ当たり１００単位の最終濃度まで上清に添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。その後、４０％ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ）／２．５Ｍ ＮａＣｌを添加して、最終濃度８％ＰＥＧ及び０．６５０Ｍ ＮａＣｌとし、ベクター画分を沈殿させて、遠心分離により採取した。ベクター画分を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ラウロイルサルコシンナトリウム、１０μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼ Ａ、ｐＨ８．０に可溶化した。この溶液をＣｓＣｌステップグラジエントに適用し、超遠心分離によりバルクタンパク質及び核酸からベクターを分離した。ベクター画分を採取し、直線ＣｓＣｌ勾配に適用し、再度精製した。精製したベクター画分を採取し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１８０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４に対して透析し、３１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％プルロニックＦ−６８ ｐＨ７．４中に配合し、濾過滅菌して−８０℃で保存した。

精製したｐＡＡＶ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターの分析
精製したベクター粒子をＱ−ＰＣＲタンパク質アッセイ（ＢＣＡ）、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、エンドトキシンアッセイ（タイプ）及び動的光散乱により分析した。レチノスキシンのエクソン３及びエクソン４にそれぞれ位置する上流及び下流のプライマー、並びにエクソン３／４接合部に及ぶプローブを用い、Ｔａｑｍａｎ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲアッセイを使用して、Ｑ−ＰＲＣアッセイを行った。存在するタンパク質のレベルをウシガンマ−グロブリン（カリフォルニア州リッチモンドのRio-Rad）を標準として使用し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により特定した。Ｑ−ＰＣＲの結果に基づき、理論上のタンパク質濃度を１ｍｌ当たりのＡＡＶキャプシドタンパク質の質量として算出した。７．５％ＳＤＳゲルを使用して１．２×１０^１０ｖｇ（調製１）及び２×１０^１０ｖｇ（調製２）についてＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を行った。分離したタンパク質の可視化をクーマシーＲ２５０又は銀染色でゲルを染色することにより行った。カイネティック比色法カブトガニの血球抽出成分エンドトキシンアッセイキット（Clonegen Laboratories）を使用してカイネティックＬＡＬエンドトキシンアッセイを行った。それぞれ、ＡＡＶ８ ｈＲＳｐ４ベクター及びＡＡＶ８ ｈＲＳ／ＩＲＢＰベクターに対して２．２５×１０^１２ｖｇ／ｍｌ及び５×１０^１２ｖｇ／ｍｌのベクター濃度で、Ｖｉｓｃｏｔｅｃ ８０２ ＤＬＳ機器を使用して、動的光散乱アッセイを行った。この分析の結果を図２に示し、以下に表にまとめる。

投薬調製及び投与
解剖顕微鏡のもと、１マイクロリットル（μｌ）のベクター又はビヒクルを、１０μｌのＮａｎｏｆｉｌシリンジ（フロリダ州サラソタのWorld Precision Instruments, Inc.）及び取り外し可能な３５ゲージ針を使用して硝子体内注射により右眼又は左眼に投与した。注射物質は０．２２μｌフィルタの通過により滅菌され、無菌条件下でシリンジに充填した。マウスをＩＰケタミン８０ｍｇ／ｋｇ、及びキシラジン４ｍｇ／ｋｇで麻酔し、１滴の０．５％テトラカインを角膜に局所適用した。各マウスの一つの眼の角膜輪部からおよそ１ｍｍ後ろの上鼻側四分円の毛様体扁平部を通して、１マイクロリットルのベクター又はビヒクルの溶液を注射した。注入量は、硝子体全体積のおよそ五分の一である。低速でベクターを送達する前に硝子体の中心に針先を配置するように注射を行った。その後、眼から針を注意深く抜き、３種類の抗生物質眼軟膏（ネオマイシン、ポリミキシンＢ及びバシトラシン）を注射部位に塗布した。マウスが麻酔から回復するまで保温プレート（３５℃〜３７℃）に置き、その後、ケージに戻した。

試験系
レチノスキシンノックアウト（Ｒｓ１ＫＯ）マウスモデルを２００３年に作製した。２００３年の１１月より、これらのマウスをアメリカ国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）によって維持される共有動物施設においてＮＩＨで飼育し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統（メーン州バーハーバーのJackson Laboratory）に１８世代を超えて戻し交配した。Ｒｓ１ＫＯマウスは注射の時に１８日齢〜３４日齢であり、ＥＲＧの時に１４週齢〜３７週齢であり、網膜におけるレチノスキシン発現が欠如し、ａ波振幅と比較したｂ波振幅の減少、並びに外網状層（ＯＰＬ）及び内顆粒層（ＩＮＬ）の内部の割裂又は分離を含む「スキーシス」腔の存在を含むＸＬＲＳ患者に類似した網膜の構造及び機能の表現型を有することが確認された。

投与：２８匹のマウスは２．５×１０^９ｖｇ／眼を受けた。４１匹のマウスは５．０×１０^８ｖｇ／眼を受けた。３９匹のマウスは１．０×１０^８ｖｇ／眼を受けた。２６匹のマウスは５．０×１０^７ｖｇ／眼を受けた。２６匹のマウスは１．０×１０^７ｖｇ／眼を受けた。２６匹のマウスは１．０×１０^６ｖｇ／眼を受けた。４３匹のマウスはビヒクル注射を受けた。

上記研究は、２２９匹の雄性Ｒｓ１ＫＯマウスを含むものであった。レチノスキシンベクターを１８６匹のＲｓ１ＫＯマウスに一側性に投与し、対側の眼には注射しなかった。上記マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの雄と交配した２６匹の異なるホモ接合及び６匹のヘテロ接合の雌性Ｒｓ１ＫＯマウスの子孫である６０匹の同腹仔に由来するものであった。ビヒクルを４３匹の雄性Ｒｓ１ＫＯマウスに一側性に投与し、対側の眼には注射しなかった。これらのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスと交配した１３匹の異なるホモ接合の雌性Ｒｓ１ＫＯマウスの子孫である１５匹の同腹仔に由来するものであった。ホモ接合のＲｓ１ＫＯの雌がＲｓ１ＫＯのみを生じることから、これらの雄の遺伝子型を確認する必要はなかったが、この交配系に由来する数匹の雄を無作為に選択して遺伝子型を確認した。全てのヘテロ接合の雌及びそれらの子孫の遺伝子型を遺伝子型判定により確認した。

実験手法
本研究で使用した全てのマウス、マウスの親、マウスが受けた試験材料、及びマウスの出生日の一覧、注射、ＥＲＧ、ＯＣＴ及び組織学的調査／屠殺を収集し、記録した。

注射
生後（ｐ）１８日〜２５日（２１±２日、平均±１ＳＤ）に１マイクロリットルのＡＡＶ８ ＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクター溶液を、無菌条件下でＲｓ１／ＫＯマウスに硝子体内注射により一側性に投与した。対照Ｒｓ１ＫＯマウスは、生後１８日〜３４日（２４±５日）に１μｌのビヒクルの一側性の硝子体内注射を受けた。１マイクロリットルのＡＡＶ８ ｈＲＳ１／ＩＲＢＰ又はビヒクルを２２９匹のＲｓ１ＫＯマウス、すなわち、２．５×１０^９ｖｇ／眼を２８匹のマウス、５．０×１０^８ｖｇ／眼を４１匹のマウス、１．０×１０^８ｖｇ／眼を３９匹のマウス、５．０×１０^７ｖｇ／眼を２６匹のマウス、１．０×１０^７ｖｇ／眼を２６匹のマウス、１．０×１０^６ｖｇ／眼を２６匹のマウス、ビヒクルを４３匹のマウスに投与した。角膜混濁等の眼の変化、及び注射部位からの逆流量を注射中又は注射直後に各動物について記録した。ベクターを注射した１８６匹の動物の注射は全て成功したが、２匹のマウス（１．１％）が注射後、まだ麻酔されている間に死亡した。

ＥＲＧを完了する前にベクターを注射した３匹のマウスを安楽死させなければならなかった。すなわち、２匹のマウスは小さすぎて生存できないと考えられたため注射の３日以内に屠殺し、亜系により０．０５％〜０．０９％のＣ５７ＢＬマウスにおいて発生する歯の過度の成長を伴う問題である咬合異常のため、ＥＲＧ記録の前に１匹のマウス（０．５％）を屠殺しなければならなかった。咬合異常のためビヒクルを注射した１匹の動物（２．３％）をＥＲＧの前に屠殺し、眼の閉鎖のため１匹の動物を屠殺した。ベクターを注射した２５匹の動物（１３％）がＥＲＧ又はＯＣＴのための麻酔中又は麻酔後に死亡した。ビヒクルを注射した２匹の動物（４．６％）はＥＲＧを完了した後に死亡した。

ベクターの注射は、ＥＲＧのための麻酔前の動物の死亡、すなわち、麻酔注射から回復する前に死亡した２匹のマウス、サイズが小さかったためすぐに屠殺した２匹のマウス、及び咬合異常
のため屠殺した１匹のマウスとは無関係と考えた。全体的には、ベクターを注射した群の２５匹の動物がＥＲＧ又はＯＣＴのための麻酔中又は麻酔後に死亡したが、死亡数はビヒクルを注射した対照群と比べて統計学的に大きくはなく（Ｐ＝０．１８、フィッシャーの直接確率検定）、用量による有意な傾向を示さなかった（Ｐ＝０．７２、傾向に関するカイ二乗検定）。

ベクターを注射した群における死亡の三分の一は、１×１０^６ｖｇ／眼の用量を受けるコホートで起こり、各用量を別々にビヒクルと比較した場合に、この用量のみがビヒクルよりも統計学的に大きかった（Ｐ＝０．００５）。これが最も低い用量であったことから、これらの死亡は、ベクターの効果というよりも動物の既存の状態又は技術的な操作を反映するものである可能性がある。

網膜電図（ＥＲＧ）
ＥＲＧ記録手順：Ｒｓ１ＫＯマウスの網膜機能の保護におけるレチノスキシンベクターＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳの有効性を評価するため、ベクターの硝子体内注射後１１週間〜１５週間（「短期」）及び／又はベクターの硝子体内注射後６ヶ月〜９ヶ月（「長期」）に両眼において同時に、暗順応網膜電図（ＥＲＧ）を記録した。ビヒクル対照マウスを硝子体内注射後の１４週間〜１８週間に記録した。

遮光換気ボックスにおける一晩の暗順応のため、記録前日にマウスを動物施設から実験室に移した。その後の全ての手順を薄暗い赤ランプ又は暗闇で行った。腹腔内注射によって与えられる８０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び４ｍｇ／ｋｇのキシラジンによる麻酔の後、局所の０．５％トロピカミド及び０．５％フェニレフリンＨＣＬにより瞳孔を散大させ、マウスを３７℃の加熱パッドに置いた。角膜の中心及び強膜の縁にそれぞれ金のワイヤループ活性電極及び参照電極を置く前に、角膜に１パーセントのプロパラカインを局所麻酔した。記録は、全体野（全視野）ボウルにおける−６．９ｌｏｇ ｃｄ・ｓ／ｍ^２〜＋０．６ｌｏｇ ｃｄ・ｓ／ｍ^２の０．５対数単位強度段階において提示される１０μ秒のフラッシュに対する１〜２０の暗順応応答の平均であった。マウスにおけるこれらの応答を誘発する強度は、ヒトのものと類似していた。主な相違は、ヒトの光受容体では５％が錐体細胞であるのに対し、わずか約３％のマウス光受容体が錐体細胞であり、したがって、錐体光受容体からの相対的な寄与は、混合桿体細胞−錐体細胞応答を誘発する最大強度においてはるかに少ない。各記録の合計時間は約２０分間であり、記録に続いて、マウスをケージに戻す前に加熱パッド上で回復させた。

ＥＲＧシグナルを５０００倍に増幅し、５ｋＨｚでNational InstrumentsのADボードによりデジタル化される前に、Ｇｒａｓｓ ＣＰ５１１ ＡＣ増幅器を使用する０．１ｋＨｚ〜１ｋＨｚ ３ｄｂ／デケードバンドパス及び６０Ｈｚのラインフィルタによるフィルタをかけた。１〜２０の波形を採取して各強度において平均したところ、強度が高いほど採取された数は少なかった。

ＥＲＧデータ分析：本研究で報告されたＥＲＧの結果は、０．６ｌｏｇ ｃｄ・ｓ／ｍ^２の単一の刺激強度に対する反応におけるａ波及びｂ波の振幅である。暗順応ａ波は、光に応答して桿体光受容体の活性化相を反映し、ｂ波は、光受容体によって経シナプス的に活性化される双極細胞の応答に起因する。ビヒクル群を注射手順の可能性のある影響について制御するために使用し、ベクターの最大の治療効果が予想される場合に短期の時点で分析した。

統計学的手法：ベクター及びビヒクルを注射した眼における処理したａ波及びｂ波の振幅を、集団が同じ標準偏差を有すると仮定してホルム−シダック法を用いて多重比較のため補正した独立ｔ検定を使用し、短期の時点の未処理の眼、及び長期の時点の３つの最も高用量のベクターを注射した群におけるａ波及びｂ波の振幅と比較した。全ての統計をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０．（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．００）を使用して行った。

眼コヒーレンストモグラフィ（ＯＣＴ）
ベクターを受け、短期ＥＲＧを生存し、変化していない透光体を有した全てのマウスの両眼の網膜を、ＥＲＧ後２日〜２１日にＯＣＴによりｉｎ ｖｉｖｏで画像化した。各用量群において画像化したマウスの数には、２．５×１０^９ｖｇ／眼で２５匹の画像化したＲｓ１ＫＯマウス、５．０×１０^８ｖｇ／眼で２５匹の画像化したＲｓ１ＫＯマウス、１．０×１０^８ｖｇ／眼で２０匹の画像化したＲｓ１ＫＯマウス、５．０×１０^７ｖｇ／眼で１９匹の画像化したＲｓ１ＫＯマウス、１．０×１０^７ｖｇ／眼で２５匹の画像化したＲｓ１ＫＯマウス、１．０×１０^６ｖｇ／眼で１６匹の画像化したＲｓ１ＫＯマウスが含まれる。

ＯＣＴ画像化システムは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける網膜組織の微細構造の断層画像を取得し、加工し、表示し、保存する。本発明者らは、２ミクロンの軸分解能による網膜の顕微鏡断層画像を提供する非侵襲の非接触的画像化を可能とする、Bioptigenによる超高解像度スペクトルドメインＯＣＴを使用した。ＸＬＲＳ患者におけるＯＣＴ画像化は、網膜の病態を特性評価するために機能測定と併せて有用な手段であることが示されている。マウスを麻酔し（８０ｍｇ／ｋｇケタミン及び４ｍｇ／ｋｇキシラジン）、特注の保持器に固定し、網膜の視神経乳頭を１．４ｍｍ×１．４ｍｍの矩形スキャン領域（水平方向及び垂直方向の視神経の各側面上に０．７ｍｍ）の中心に置いた。この領域を、網膜色素上皮（ＲＰＥ）からレンズ後方まで１０００回のＡ−スキャンにより、２×２×２のマイクロボクセルで選択した領域に亘って１００回のＢ−スキャンにより画像化した。そのようにして、各マウスの中心網膜のおよそ三分の一を画像化した。さらに、他の領域からの画像を定期的に得て、中心領域が網膜全体の代表であることを確認した。

矩形スキャンした領域に及ぶＢスキャンは、網膜を水平に通って採取された組織学的切片を見る場合に光学顕微鏡において見られるような一連の網膜の横断面として表示される（図３）。また、スキャンは、眼底検査の画像と同様にスキャン（体積強度投影）した全領域のアンファス画像を提供する。腔は、外網状層（ＯＰＬ）及び内顆粒層（ＩＮＬ）の間及びそれらの内部における網膜組織の異常な分離からなる（図３）。解像度は顕微鏡画像よりも低いが、Ｒｓ１ＫＯ網膜の個々の網膜層及び組織学的性質を容易に区別できる。マウスにおいてＯＣＴにより画像化されるように、これらの腔は数十ミクロン〜数百ミクロンの半径長さ（視神経から周辺）及び数ミクロン〜数十ミクロンの軸方向の深さ（網膜の厚さに亘って）に伸びた。これらの腔は、顕微鏡下で固定された組織において見られるものと非常に類似した外観を有する。体積強度投影では、スキャンした領域内の腔の分布は明暗の斑として見られる。

図３は、各眼に対して体積強度投影（右側画像）上に中心の緑色線によって示される視神経における中心網膜を通って取られたＢ−スキャン（左側画像）を示す野生型及びＲｓ１ＫＯマウスによるＯＣＴスキャンを示す。体積強度投影は、眼の正面から網膜表面を画像化する眼底写真に類似する。野生型の網膜における層は、規則正しく明確であり、眼底は平滑な外観及び明確な網膜血管を有する。Ｒｓ１ＫＯ網膜のＢ−スキャンは、「スキーシス腔」と呼ばれる大きな領域の分離を示し、上記層はより不規則で、より不明瞭でより薄い。眼底は斑の外観を有する。赤色星印は、腔幅の測定位置を示す。各測定を１〜６のスケールに採点し、これら６つの測定の最も小さい、及び最も大きいものを平均して各網膜に対するスコアを得た。

処理及び未処理のＲｓ１ＫＯ網膜の内顆粒層におけるこれらの分離又は「スキーシス腔」の最大の高さを、四つの別々の領域におけるＢスキャン、すなわち、画面上のマイクロメートルを使用する、図３に赤色星印で示される、視神経の上０．６ｍｍの一つの測定、視神経を通る正中線スキャンの鼻側の一つの測定及び側頭部の一つの測定、並びに視神経の下０．６ｍｍの一つの測定に沿って測定した。測定を併せて、以下の通り各網膜に対するスコアを得た。

データ採取
１．網膜領域の中心三分の一を網膜腔についてＯＣＴによりスキャンした。スキャンされる網膜領域の決定は以下の検討に基づいた。
ａ．以前に公開された研究において、本発明者らは、腔の形態における網膜病態が１ヶ月齢〜４ヶ月例の間で数及び程度が最大であり、視神経から周辺まで分布したことを見出した。
ｂ．本研究における１１週間〜１５週間の注射後時間は、Ｒｓ１ＫＯマウスの未処理の眼が最大の腔数及び分布を有する場合に動物をＯＣＴによって分析することを意味した。
ｃ．ベクターを硝子体の中心に注射し、全ての方向に均等に分布すると仮定した。
ｄ．Ｒｓ１ＫＯマウスにおける単一の矩形スキャンによりＯＣＴ画像化された網膜の中心三分の一は、残りの網膜を代表する。
２．位置Ａ（＋０．６ｍｍ）、位置Ｂ（０ｍｍ又は視神経）及び位置Ｃ（−０．６ｍｍ）で線形スキャンを行った（図３、Ｒｓ１ＫＯ、右側画像）。

腔の採点
３回のスキャンを行った。それぞれ最上部及び最下部のスキャンＡ及びＣを最大の腔高さについて採点し、中心網膜を通るスキャンＣを正中線の両側の最大の腔高さについて採点し、各網膜に対する合計四つの値は以下の通りであった（図３における星印）。
ａ．腔無し＝１
ｂ．高さ３０μｍ未満の腔＝２
ｃ．高さ３０μｍ〜４９μｍの腔＝３
ｄ．高さ５０μｍ〜６９μｍの腔＝４
ｅ．高さ７０μｍ〜９９μｍの腔＝５
ｆ．高さ１００μｍ以上の腔＝６

スコアリング式：スコア＝（位置１〜４における最大グレード＋位置１〜４における最小グレード）／２

免疫組織化学によるＲｓ１タンパク質発現
１又は２のＥＲＧ記録から生存した全ての動物の網膜を、網膜レチノスキシン免疫染色のため採取してレチノスキシン発現を定量した。

ＥＲＧ又はＯＣＴの１日後〜２１日後にマウスを安楽死させ、リン酸ナトリウム緩衝溶液中の４％パラホルムアルデヒドで灌流した。眼を摘除し、リン酸ナトリウム緩衝溶液中の４％パラホルムアルデヒド及び０．５％グルタルアルデヒドにおいて一晩固定した後、凍結切片用に加工した。網膜の鼻骨縁から開始して、視神経乳頭及び網膜側頭部のおよそ２００μｍを含んで通過する、注射した眼の２５の矢状切片を採取した。レチノスキシンのＮ末端に対するウサギポリクローナル抗体（アミノ酸残基２４〜３７）、及び赤色蛍光Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８色素（Invitrogen）に複合化された二次抗体を使用して上記切片を染色した。核をＤＡＰＩで染色した。

ＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳを受ける眼、及び未処理の眼の網膜におけるレチノスキシン発現を、網膜の鼻骨縁から視神経の均等に間を空けた間隔で採取した四つの垂直切片、及び視神経のすぐ側頭部から採取した一つの切片における免疫染色の強度及び程度を決定するため、蛍光顕微鏡を使用して評価した。これら５つの切片による結果を平均した。ベクター処理したＲｓ１ＫＯ網膜に由来する各切片において、光受容体及び内網膜層における染色強度を、各バッチによるバックグラウンド染色のレベルの変化に対する対照を補助するため同時に染色した野生型網膜と比較して評価した。野生型の強度を値４とし、図４Ａに示されるようにＲｓ１ＫＯ切片を０〜７と採点した。図４は、Ｒｓ１ＫＯマウスのＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳ処理した網膜におけるレチノスキシン免疫染色のスコアリングを示す。野生型（ＷＴ）マウス及び硝子体内注射によってＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳで処理したＲｓ１ＫＯマウスに由来する凍結網膜切片において免疫蛍光標識（赤）によりレチノスキシンタンパク質を可視化した。注射後１２週間〜１８週間に網膜を加工した。レチノスキシン染色のスコアリングを強度及び分布の採点を使用して行った。図４Ａは、レベル０〜７の強度基準を示す。光受容体染色は飽和されなかったため、レベル０〜４を光受容体染色の強度のみ（白塗り矢印）に基づいて採点できた。レベル４における内顆粒染色も見られた。Ｒｓ１ＫＯ及び野生型の網膜におけるレベル４染色を示す。光受容体染色がレベル４において飽和に近づくため、レベル５、６及び７を内顆粒層（白抜き矢印）及び内網状層（白線）における染色強度及び濃度（consistency）に基づいて採点する。いずれかの層における以前のグレードと比べた明るさの増加及び／又はより確実な染色を次の最も高いグレードに対する基準として使用した。グレード５を上回る場合、ＩＰＬはグレード４よりも強く染色され、グレード６ではＩＰＬはグレード５と同様であったが、ＩＮＬは５よりも明るく、グレード７ではＩＰＬはグレード６よりも確実に染色された。ＲＰＥ層における染色（Ｒｓ１ＫＯ及び野生型４番において楕円）がある場合には、無視した。図４Ｂは、染色スコアを得るための染色強度と分布を併せる方法を示す。染色した切片の割合を染色した組織の最も幅の広い分離によって規定した（連続している必要はない）。その長さの中で最も強い、及び最も弱い染色グレードを加算し、染色した切片の割合で乗じて染色スコアを得た。例は、３種の異なる用量のｓｃＡＡＶ８／ＩＲＢＰ ｈＲＳで処理した網膜における高レベルの発現である。

レチノスキシン染色が大部分の処理した網膜に由来する切片に亘って均一に分布していなかったため、各切片について二つのスコアを使用し、すなわち、一つのスコアを最も弱い領域に割り当て、もう一つを最も強い領域に割り当てた。各網膜において最低及び最高のグレードを加算した。染色が切片に亘って一貫していた場合には、グレードを２倍した。野生型網膜に由来する切片を均一に染色したところ、強度グレード８（４＋４）を有した。多くの切片において染色は網膜の長さの一部のみに限定されたため、染色強度のグレードを染色が観察された網膜の長さの割合で乗じて最終スコアを得た（図４Ｂ）。例えば、切片における染色強度が１〜８の範囲であるが、半分の網膜切片のみがレチノスキシン染色を有した場合には、上記スコアは（１＋８）×１／２＝４．５となる。野生型網膜はスコア８、すなわち（４＋４）×１／１が与えられた。いずれの未処理の眼も非特異的バックグラウンドレベル（スコア０）を上回る染色を示さなかった。

免疫染色スコア公式
１切片当たりのスコア＝（切片における最大染色グレード［０〜７］＋切片における最小染色グレード）×（全ての染色を含む全長の割合）
一つの眼当たりのスコア＝（切片に対するスコア１＋２＋３＋４＋５）／５

結果
ＥＲＧ、Ｏｃｔ及びレチノスキシン発現の分析
本研究では、ビヒクル、又は１．０×１０^６ｖｇ／眼、１．０×１０^７ｖｇ／眼、５．０×１０^７ｖｇ／眼、１．０×１０^８ｖｇ／眼、５．０×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量のＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターを１８日齢〜３４日齢のＲｓ１ＫＯマウスに硝子体内注射によって投与した。その後、上記マウスを注射後１１週間〜１５週間、及び６ヶ月〜９ヶ月に網膜機能についてＥＲＧにより、その後、網膜構造についてＯＣＴにより、また、レチノスキシン発現について免疫組織化学により評価した。このベクターがＲｓ１ＫＯマウスにおいて網膜の機能及び構造を顕著に保護し、タンパク質の顕著な網膜発現を達成する用量範囲を決定するため、これらの実験を行った。図５〜図９は、ＥＲＧ、ＯＣＴ（網膜腔）、及びレチノスキシン発現のデータを示す。

図５は、未処理の眼、並びにビヒクル又は１×１０^６ｖｇ／眼、１×１０^７ｖｇ／眼、５×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量のＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターの硝子体内注射により処理した眼のＥＲＧ ａ波及びｂ波の振幅を示す。１８日齢〜３４日齢のＲｓ１ＫＯマウスは、硝子体内注射により片方の眼にビヒクル又は指定される用量（ベクターゲノム／眼として表される）でＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターを受けた。ａ波及びｂ波に対する振幅値を示し、用量の下に群の大きさを示す。二つ、三つ及び四つの星印（＊）は、それぞれ、ホルム−シダック法を使用して多重比較のため補正した独立ｔ検定に基づく０．０１未満、０．００１及び０．０００１のＰ値による未処理の値と異なる処理の値を示す。これらの眼を、「短期」とされる期間の注射後１１週間〜１５週間の間に評価した。

図６は、「長期」とされる期間の注射後６ヶ月〜９ヶ月における１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼のベクター用量を受ける動物におけるＥＲＧ ａ波及びｂ波の振幅を示す。この群は、図５で短期の時点において評価した動物の部分集団である。

図７は、治療の有効性の持続を評価できるように、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼のベクター用量における処理及び未処理の眼に関する短期及び長期のＥＲＧ結果の比較を提示する。このデータは、図５及び図６のパネルにおけるデータセットに由来する。読者に経時的な変化をより良く視覚化するため棒グラフ頂部に直線を引いた。一つ、二つ、及び四つの星印（＊）は、それぞれ、ホルム−シダック法を使用して多重比較のため補正した独立ｔ検定に基づく０．０５未満、０．０１及び０．０００１のＰ値による未処理の値と異なる処理の値を示す。

図８は、１×１０^６ｖｇ／眼、１×１０^７ｖｇ／眼、５×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼のベクター用量に対するＯＣＴ画像による処理及び未処理の眼におけるスキーシス腔スコアリングの平均を示す。上記マウスを短期の時点（注射後１１週間〜１５週間）で評価した。棒グラフは、各用量における処理及び未処理の網膜に対する平均素点（±ＳＥＭ）、及びホルム−シダック法を使用して多重比較のため補正した独立ｔ検定に基づく未処理の眼に対する処理した眼の統計学的比較を示す。上記マウスを、ＥＲＧ記録（パネルＡのデータ）の後直接、短期の時点（注射後１１週間〜１５週間）において評価した。（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。

図９は、１×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の間のベクター用量に反応したレチノスキシンタンパク質発現を示す。上記マウスを短期の時点（注射後１１週間〜１５週間）に検査した。また、２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量を長期の時点（注射後６ヶ月〜９ヶ月）に評価した。散布図は、各動物に対する値、各用量に対する平均及び９５％信頼区間、並びに一標本ｔ検定による未処理の眼に対する統計学的比較を示す。（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。

結論
本研究では、１８日齢〜３４日齢のＲｓ１ＫＯマウスに硝子体内注射によって、ビヒクル、又は１．０×１０^６ｖｇ／眼、１．０×１０^７ｖｇ／眼、５．０×１０^７ｖｇ／眼、１．０×１０^８ｖｇ／眼、５．０×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量のＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターを投与した。その後、注射後１１週間〜１５週間、及び６ヶ月〜９ヶ月に網膜機能についてＥＲＧにより、続いて、網膜構造についてＯＣＴにより、レチノスキシン発現について免疫組織化学によりマウスを評価した。このベクターがＲｓ１ＫＯマウスにおいて網膜の機能及び構造を顕著に保護し、タンパク質の顕著な網膜発現を達成する用量範囲を決定するため、上記実験を計画した。これらの実験より、以下を結論付けることができる。
１．注射後１１週間〜１５週間に記録された場合（短期の時点）、注射していない眼と比較して、５×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼のＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクター用量はＥＲＧ ａ波振幅の統計学的に有意な改善を示し、５×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、又は２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量はＥＲＧ ｂ波振幅の統計学的に有意な改善を示した。注射ビヒクルは効果がなかった。
２．注射後６ヶ月〜９ヶ月に記録された場合（長期の時点）、未処理の眼と比較して、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼のベクター用量はＥＲＧ ａ波及びｂ波の振幅の統計学的に有意な改善をもたらした。
３．注射後１１週間〜１５週間に続いて評価した場合（短期の時点）、未処理の眼と比較して、５×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼のベクター用量はスキーシス腔スコアリングの統計学的に有意な改善をもたらす。
４．注射後１１週間〜１５週間に続いて評価した（短期の時点）１×１０^７ｖｇ／眼、１×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、及び２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量によるベクター処理の後、Ｒｓ１／ＫＯマウスの眼においてレチノスキシンタンパク質発現は有意に上昇される。１×１０^８ｖｇ／眼以上のベクター用量において、レチノスキシンタンパク質発現は野生型レベルの２５％以上である。２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量を受けたＲｓ１／ＫＯの眼を注射後６ヶ月〜９ヶ月に評価したところ、野生型レチノスキシンレベルの６５％を示した。これは、長期の時点で評価した唯一の用量であった。

１×１０^８ｖｇ／眼〜２．５×１０^９ｖｇ／眼の用量のＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターで処理したＲｓ１／ＫＯマウスの眼は、網膜機能（ＥＲＧによる）及び網膜構造（ＯＣＴによる）における統計学的に有意な改善を示し、また顕著な量のレチノスキシンタンパク質を発現する。網膜表面積によってヒトに調整した場合（１００倍）、これらの用量は１×１０^１０ｖｇ／眼〜２．５×１０^１１ｖｇ／眼である。付随する毒性報告では、２．５×１０^１０ｖｇ／眼の用量でＡＡＶ８ ｓｃＲＳ／ＩＲＢＰ ｈＲＳベクターを用いて硝子体内処理したウサギは、注射後４ヶ月にわずかな毒性を示した。

実施例２
ビヒクル単独の対照注射と比較した、ウサギの眼における本発明の発現ベクターの耐容性を判定するため研究を行った。簡潔には、３９匹のニュージーランド白ウサギ（注射時に６ヶ月齢〜７ヶ月齢；体重２．４ｋｇ〜３．８ｋｇ）を本研究で使用した。全ての生命操作（life procedures）は眼及び視力研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明に準じて行われ、アメリカ国立眼学研究所の実験動物委員会により承認された。

持続的に取り付けられた２８ゲージ針を有する１／２ｃｃのインスリンシリンジ（Ｕｌｔｒａｆｉｎｅ Ｕ−１００シリンジ−カリフォルニア州サンジョーズのBD Biosciences）を使用し、５０μｌの注入量で、硝子体内注射により右眼にベクター又はビヒクルを投与した。注射の日にクリーンベンチ（laminar flow hood）において無菌条件下でシリンジを搭載した。１Ｍケタミン４０ｍｇ／ｋｇ、及びキシラジン３ｍｇ／ｋｇでウサギを麻酔した。無菌の手術器具を使用し、注射前に動物を無菌で準備した。ポビドンヨード（５％ポビドンヨード、９５％ＢＳＳ−灌流液）を使用して眼瞼縁及び睫毛を消毒した。ＢＳＳ溶液を使用して、瞼を洗浄し、角膜の大気暴露及びその結果生じる擦過傷を最小にするために２分毎に洗眼した。眼の操作（manipulating）を回避するため、また瞼及び睫毛に針が接触するのを回避するため、開瞼器を適用した。各眼の縁からおよそ２ｍｍ後ろの上側頭四分円の毛様体扁平部を通って、５０マイクロリットルのベクター又はビヒクルの溶液を注射した。硝子体の中心において針先により注射を行い、適度に低速でベクターを送達した。その後、眼から針を注意深く抜き、ベクター及び硝子体の両方の逆流を防ぐため滅菌綿球アプリケーターを適用した。注射後に３種類の抗生物質を含む眼軟膏（ネオマイシン、ポリミキシン及びバシトラシンの「ｎｅｏ−ｐｏｌｙ−ｂａｃ」）を注射部位に塗布し、ウサギをケージに戻した。

注射前、注射の１４日後並びに１ヶ月後、２ヶ月後及び３ヶ月後に全てのウサギに臨床検査をした。各ウサギは、眼の外部視診及び瞳孔散大（両眼に局所アトロピン１％１滴を１０分間隔で２回）の後、細隙灯生体顕微鏡検査（前眼部）及び倒像検眼鏡（後眼部）による十分な眼検診を経た。処理の特性又は用量を知らない２名の検査官により、臨床変化を５段階の重症度スケール（なし、わずか、＋１、＋２、＋３）を使用して採点した。

本研究による結果を図１０に示す。注射（Ｉｎｊ．）及び非注射（Ｕｎｉｎｊ）の眼の両方による知見を、上記研究の間５つの時間点（０週目、２週目、４週目、８週目、１２週目）における各動物について示す。（１群当たりｎ＝４匹〜７匹のウサギ）。上記データは、ウサギの眼に注射された発現ベクターの二つの高用量（２×１０^１０ｖｇ／眼、又は２×１０^１１ｖｇ／眼）において、少数の試験動物で注射後に最小の炎症（わずか又は軽度）のみが検出されたことを実証する。軽度の炎症は、いずれの投薬量でも経時的に大半の動物において解決した。

本発明の上記実施例は例示及び説明目的で提示されている。さらに、これらの実施例は本発明を本明細書に開示される形態に限定することを意図していない。結果として、本明細書の教示に応じた変更及び修正、並びに関連分野の技術又は知識が本発明の範囲内となる。本明細書で与えられる実施例に記載される特定の実施形態は、本発明を実施するのに知られるベストモードを更に説明するものであり、他の当業者がかかる又は他の実施形態において本発明の特定用途又は使用に要求される様々な変更を加えて本発明を利用することが可能であることを意図している。添付の特許請求の範囲は従来技術によって許容される程度に代替的な実施形態を包含するように解釈されることを意図している。

Claims (13)

1. 眼特異的レチノスキシン遺伝子プロモーター及びレチノスキシン遺伝子プロモーターからの発現を増強するように配置された光受容体間レチノイド結合遺伝子エンハンサー要素を含み、前記眼特異的レチノスキシン遺伝子プロモーター及び光受容体間レチノイド結合遺伝子エンハンサー要素はレチノスキシンタンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結された発現カセットを含む発現ベクターであって、
   前記レチノスキシンタンパク質をコードする核酸配列はレチノスキシン遺伝子の第１イントロンのレチノスキシン転写開始部位に対して＋９５〜＋３５５及び＋１４３９６〜＋１４４４５の塩基対からなる３１９ｂｐ部分を少なくとも含み、
   該発現ベクターを個体の眼に投与した場合、該発現ベクターはレチノスキシンタンパク質を眼において発現する、発現ベクター。
2. 前記発現カセットが、アデノ随伴ウイルス逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列に隣接する、請求項１に記載の発現ベクター。
3. ウイルスに由来するキャプシドタンパク質及び請求項１に記載の発現ベクターを含む、ウイルスベクター。
4. 前記キャプシドタンパク質が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する、請求項３に記載のウイルスベクター。
5. 前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９のキャプシドタンパク質、または、その部分若しくは変異体であって、その部分若しくは変異体がウイルス様粒子を形成可能なものである、請求項３または４に記載のウイルスベクター。
6. 個体におけるＸ連鎖性網膜分離症を治療するための医薬を製造するための、請求項１または２に記載の発現ベクターまたは請求項３〜５のいずれか１項に記載のウイルスベクターの使用。
7. ５’ＩＴＲが１３０ｂｐの長さであり、野生型ＩＴＲ配列中、パリンドロームのＡ領域におけるＩＴＲ配列の１５塩基対の欠失を有する、請求項２に記載の発現ベクター。
8. ５’ＩＴＲが、野生型ＩＴＲ配列のｒｅｐニッキング部位を含むＤ領域の除去により修飾された、請求項７に記載の発現ベクター。
9. ３’ＩＴＲが全長の野生型ＩＴＲ配列である、請求項２、７または８のいずれか１項に記載の発現ベクター。
10. 自己相補型ＡＡＶベクターゲノムである、請求項１、２または７〜９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
11. ヒトベータ−グロビン３’非翻訳領域及びポリアデニル化部位をさらに含む、請求項１、２、または７〜１０のいずれか１項に記載の発現ベクター。
12. 前記光受容体間レチノイド結合遺伝子エンハンサー要素が、前記レチノスキシン遺伝子プロモーターにおけるＡｌｕ反復配列を置き換えるように配置されている、請求項１、２、または７〜１１のいずれか１項に記載の発現ベクター。
13. 前記レチノスキシンタンパク質をコードする核酸配列が、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードし、野生型レチノスキシンタンパク質の少なくとも一つの機能を有するタンパク質をコードする、請求項１、２、または７〜１２のいずれか１項に記載の発現ベクター。