CN113025618B

CN113025618B - 一种x连锁遗传性视网膜劈裂症的基因治疗方案与应用

Info

Publication number: CN113025618B
Application number: CN201911348929.2A
Authority: CN
Inventors: 罗学廷; 孙晓东; 李敏
Original assignee: Longxin Qisheng Suzhou Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Longxin Qisheng Suzhou Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN113025618A

Abstract

本发明提供了一种X连锁遗传性视网膜劈裂症的基因治疗方案与应用。具体地，本发明对RS1基因编码序列进行了针对性特殊优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞(如感光细胞、视神经细胞)中高效表达RS1蛋白的核苷酸序列，并构建了一种表达正常人源RS1蛋白的重组AAV病毒。相对于未优化的编码序列，经过特殊优化后的RS1编码序列(SEQ ID NO.:1)的表达量显著提高，非常适合在哺乳动物(尤其是人)细胞内表达，能有效治疗X连锁青少年视网膜劈裂症。

Description

一种X连锁遗传性视网膜劈裂症的基因治疗方案与应用

技术领域

本发明属于基因治疗领域，具体地，本发明涉及一种X连锁遗传性视网膜劈裂症(XLRS)的基因治疗方案与应用。

背景技术

X连锁视网膜劈裂症(X-Linked juvenile Retinoschisis，XLRS)是一种罕见的遗传性致盲性眼病,发病率约为1:5000～1:25000。XLRS主要累及双侧视网膜,在视网膜神经纤维层和神经节细胞层之间出现劈裂腔，导致严重的视力下降。此病常发于男性，是引起男性青少年黄斑变性的最主要原因,女性作为携带者无特征性临床表现。目前，临床上没有特异治疗XLRS青少年视网膜劈裂症的药物。

因此,本领域急需一种有效治疗XLRS同时安全可靠的治疗载体及组合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效治疗XLRS同时安全可靠的治疗载体及组合物。

本发明的第一方面，提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码人源RS1蛋白，且所述核苷酸序列选自下组：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％；和

(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括DNA序列、cDNA序列、或mRNA序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括单链序列和双链序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括与SEQ ID NO.:1完全互补的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列编码的氨基酸序列与人源RS1蛋白的氨基酸序列一致；优选地，所述的人源RS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明的第二方面，提供了一种融合核酸，所述融合核酸包含如本发明第一方面所述的编码人源RS1蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述融合核酸还包含UTR序列。

在另一优选例中，所述UTR序列包括3’UTR和/或5’UTR。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z0-Z1-Z2 (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z0为无、或5’UTR序列；

Z1为如本发明第一方面所述的核苷酸序列；和

Z2为无、或3’UTR序列。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’-3’端的结构为5’UTR-人源RS1蛋白-3’UTR。

在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为1-30nt，较佳地1-15nt，更佳地3-6nt。

在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列来源于限制性内切酶酶切形成的核苷酸接头序列。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为病毒颗粒的形式。

在另一优选例中，所述载体为腺相关病毒AAV载体。

在另一优选例中，所述AAV载体的血清型选自：AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、或其组合。较佳地，所述AAV载体的血清型为AAV2或AAV5。

在另一优选例中，所述载体为AAV2载体。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒载体、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸的AAV载体；较佳地为rAAV2载体。

在另一优选例中，所述载体的骨架为腺相关病毒载体质粒AAV.opti-hRS1。

在另一优选例中，所述载体用于表达人源RS1蛋白。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：HEK293细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞为(视网膜)神经节细胞。

本发明的第五方面，提供了如本发明第三方面所述的载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力、和/或治疗或预防眼部疾病。

在另一优选例中，所述眼部疾病为X连锁视网膜劈裂症(XLRS)。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗或预防X连锁视网膜劈裂症。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于减少患有或有风险形成X连锁视网膜劈裂症的受试者中的RS1蛋白水平下降和XLRS病情发展。

在另一优选例中，所述XLRS病情包括：视网膜结构变化和功能特征。

在另一优选例中，所述视网膜结构变化包括内层视网膜裂开和黄斑区微囊样车轮状改变。

在另一优选例中，所述功能特征是视网膜电图(ERG)b波显著减小，a波正常或轻度下降，b/a波比值下降。

本发明的第六方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体；更佳地为AAV2/8或AAV2/9载体。

在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升，较佳地1×10¹²-1×10¹³个病毒/毫升。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗或预防眼部疾病，较佳地治疗或预防X连锁视网膜劈裂症(XLRS)。

本发明的第七方面，提供了一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括将本发明第三方面所述的载体施用于需要的对象。

在另一优选例中，所述方法为治疗或预防眼部疾病的方法。

在另一优选例中，所述眼部疾病为X连锁视网膜劈裂症(XLRS)。

在另一优选例中，所述方法为在患有或有风险形成X连锁视网膜劈裂症的患者中减少RS1蛋白水平下降和XLRS病情发展的方法。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体；更佳地为AAV2载体。

在另一优选例中，将所述载体引入到需要的对象的眼睛内。

在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述方法包括通过视网膜下，直接视网膜注射或玻璃体内注射来将本发明第三方面所述的载体施用至需要的对象的眼。

在另一优选例中，所述方法可使由于X连锁视网膜劈裂症引起的RS1蛋白水平下降和XLRS病情发展在需要的对象的一生中基本上得以阻止。

在另一优选例中，所述方法在处理的眼中视觉功能基本得以恢复或维持。

本发明的第八方面，提供了一种人源RS1蛋白的体外制备方法，包括步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而得到人源RS1蛋白。

本发明的第九方面，提供了一种病毒载体生产系统，其包含一组编码所述病毒载体生产所需要的组分的多核苷酸，其中所述病毒载体基因组包含本发明第一方面所述的核苷酸序列。

本发明的第十方面，提供了用于本发明第九方面所述的病毒载体生产系统的DNA构建体，其包含本发明第一方面所述的核苷酸序列。

本发明的第十一方面，提供了一种病毒载体生产细胞，其包含本发明第一方面所述的核苷酸序列、或本发明第九方面所述的病毒载体生产系统、或本发明第十方面所述的DNA构建体。

本发明的第十二方面，提供了一种生产病毒载体的方法，其包括将本发明第一方面所述的核苷酸序列引入细胞并在适合于所述病毒载体生产的条件下培养所述细胞。

在另一优选例中，所述细胞是HEK293或HEK293T细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了AAV.opti-hRS1质粒示意图。

图2显示了注射14天后，采用western blot检测WT小鼠hRS1蛋白表达。

图3显示了注射14天后，采用视网膜铺片检测WT小鼠hRS1蛋白表达。

图4显示了在P35采用光学相干层析技术(Optical Coherence tomography,OCT)检测显示基因治疗对视网膜有保护作用。

图5显示了在P40采用视网膜电图(electroretinogram；ERG)检测显示基因治疗对视力有恢复作用。

图6显示了注射AAV-CBA-RS1 2/2病毒的RS1-KO模式小鼠P53时进行视网膜免疫组化检测。

图7显示了注射AAV-CBA-RS1 2/2病毒的RS1-KO模式小鼠P53时进行视网膜HE染色检测。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现通过直接给予受试动物一种表达正常人源RS1蛋白的重组AAV病毒，在模型中可以有效地促进人类视网膜感光细胞分泌的RS1蛋白。在此基础上，发明人完成了本发明，提供了一种表达正常人源RS1蛋白的重组AAV病毒，从而证实其有效保护RS1敲除小鼠的视网膜结构。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。

X连锁青少年视网膜劈裂症

X连锁青少年视网膜劈裂症(XLRS)是引起男性青少年黄斑变性的主要原因，发病率为1：5000-1：25000。XLRS的表型特征是视网膜结构变化，包括内层视网膜裂开和黄斑区微囊样车轮状改变，功能特征是视网膜电图(ERG)b波显著减小，a波正常或轻度下降，b/a波比值下降。光学相干层析技术(Optical Coherence tomography,OCT)表现为视网膜囊样改变，视网膜内核层、外核层和外从状层早期可见劈裂。其临床表现为视力中度下降，晚期玻璃体出血、视网膜脱离和新生血光性青光眼，严重导致视力下降。与大多数其他视网膜退化一样，目前对XLRS尚无明确的治疗方法。

基于此，我们开发了一种表达正常人源RS1蛋白的重组AAV病毒，并在RS1敲除小鼠模型中证实其有效保护视网膜结构。

RS1基因及蛋白

如本文所述，“RS1基因”、“XLRS1”均代指先天性视网膜劈裂症基因。RS1基因(retinoschisin 1)是XLRS的致病基因，该基因位于Xp22，由6个外显子组成，genbank登录号为NC_000023。RS1基因的编码224个氨基酸，称为RS1蛋白。该蛋白有一个盘状结构域(由4-6外显子编码)，存在于大量的分泌或膜结合蛋白家族中，与细胞黏附和细胞相互作用有关，在物种间高度保守。RS蛋白主要分泌于视网膜外层，其缺失导致视网膜空腔、突触功能障碍、视力下降和视网膜易于脱离。

人源RS1基因cDNA的核酸序列如SEQ ID NO.:3所示：

atgagccggaagatcgagggcttcctgctgctgctgctgtttggatacgaggccaccctgggactgtcctccaccgaggacgagggcgaggacccctggtaccagaaggcctgcaagtgcgactgccagggcgggcctaacgccctgtggagcgctggagctaccagcctggactgcattcccgagtgcccatatcacaagcccctgggattcgagagcggagaggtgaccccagaccagattacatgcagtaacccagaacagtatgtgggatggtattcaagctggaccgccaacaaggccagactgaacagccagggcttcggctgcgcctggctgagcaagttccaggacagcagccagtggctgcagattgacctgaaggagatcaaggtgatctcagggatcctgacccagggaagatgcgacatcgatgagtggatgaccaagtacagcgtgcagtacagaaccgacgaaagactgaactggatctactacaaagaccagacaggaaacaacagagtgttctacggcaacagcgacagaaccagcaccgtgcagaacctgctgagaccccccatcatcagcagattcatcagactgatccccctggggtggcacgtgagaatcgcaatcagaatggagctgctggaatgcgtgagcaagtgcgcc。

人源RS1蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示：

MSRKIEGFLLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQGGPNALWSAGATSLDCIPECPYHKPLGFESGEVTPDQITCSNPEQYVGWYSSWTANKARLNSQGFGCAWLSKFQDSSQWLQIDLKEIKVISGILTQGRCDIDEWMTKYSVQYRTDERLNWIYYKDQTGNNRVFYGNSDRTSTVQNLLRPPIISRFIRLIPLGWHVRIAIRMELLECVSKCA。

本发明的一个优选实施例中，使用的人源RS1优化核酸序列如SEQ ID NO.:1所示：

RS1-KO小鼠

在本发明中，在“RS1-KO小鼠”、“RS1-KO非人哺乳动物”、“RS1-KO”均指在模型动物中将基因组的RS1基因转录本(序列如SEQ ID NO.:4所示)的第一个外显子切除内源性RS1基因约200bp左右片段，从而达到基因敲除效果。

RS1-KO小鼠的特点是

鼠源RS1基因序列如SEQ ID NO.:4所示：

attatcataagtaacgtgaacactgcacattcttccatataactgagccaccactaccaaagtcaatg ttttccagagcaggcagatgtcaacatgacaagttcttctgggagaaaacactctgttgtaccattcccctacaaa tagaggttatttactcagcaggaacctgttcaaggtcactccctaggaaatgatgtcggagaaagaattaggggcc cacatcttccaactctactttctatttcatcctattactcgccttacagttaaagatggtagaacatcagcacctc ccttgctaaaccaacctatgtcAACAATACCTCCCCAGACTGCTTGTTGAGGCAGGGGACTATGTGGCTTAATTGG ATGGGGGCTGAGTGAAAGACCTAAGAACTAAATGAAATAAGATGCTTAAGTTAATCGCCTGCTCCTATGCCAGCTC TCCACTTCACTTAGATCTTGCTGTGACCAAGGACAAGGAGAAAATGCCACACAAGATTGAAGGCTTCTTCTTGTTACTTCTCTTTGGCTATGAAGgtatgtactattctactattggcatttattaatgtatttaataatgtgatttaatat agaaatatatagaaaatagttgataaatagaaatgcaacctgagtaataaaaattgttggatgacaacatgccaat tagttcacaggttattaatttaaaaggtcactgttgtgtggctctttgtcactgtcttgctcctggcttcctggtt tcatgaggaaccttctaaagttcaaatgatattgaaactcaacagaaagaaggaagggcctcagagtttctataaa aacaactttaaattgcaacaattaatgagaagtcatgtttcttggaaattttaggaggcaaagttgaagcaattgt agaattta。

上述基因序列中大写下划线部分代表编码区；大写无下划线部分代表非编码区，小写下划线部分代表内含子区。

腺相关病毒

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。

因腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)较其他病毒载体小，无致病性，可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性，基于AAV载体的针对眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的基因治疗方法受到了广泛的关注。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利No.6,596,535中有所描述。

表达载体和宿主细胞

载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replication defective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。

病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。

载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、内含子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。

可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。本发明的一个优选实施例中，用于向视网膜靶细胞引入编码RS1蛋白的核酸序列的病毒载体是AAV2，较佳地，所述腺相关病毒为单链AAV2。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自：L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。

然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。本发明的一个优选例中，选择CBA启动子，所述CBA启动子是一种CAG启动子。CBA启动子与其他CAG启动子相似，也是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。

本发明的一个优选实施例中，使用腺相关病毒作为表达载体，如图1所示，所述的载体为AAV.opti-hRS1，其核酸序列如SEQ ID NO.:5所示：

cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtggaattcgctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattccaccatgagccggaagatcgagggcttcctgctgctgctgctgtttggatacgaggccaccctgggactgtcctccaccgaggacgagggcgaggacccctggtaccagaaggcctgcaagtgcgactgccagggcgggcctaacgccctgtggagcgctggagctaccagcctggactgcattcccgagtgcccatatcacaagcccctgggattcgagagcggagaggtgaccccagaccagattacatgcagtaacccagaacagtatgtgggatggtattcaagctggaccgccaacaaggccagactgaacagccagggcttcggctgcgcctggctgagcaagttccaggacagcagccagtggctgcagattgacctgaaggagatcaaggtgatctcagggatcctgacccagggaagatgcgacatcgatgagtggatgaccaagtacagcgtgcagtacagaaccgacgaaagactgaactggatctactacaaagaccagacaggaaacaacagagtgttctacggcaacagcgacagaaccagcaccgtgcagaacctgctgagaccccccatcatcagcagattcatcagactgatccccctggggtggcacgtgagaatcgcaatcagaatggagctgctggaatgcgtgagcaagtgcgcctgaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtagatctacgggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtccttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagacaacctgtagggcctgcggggtctattgggaaccaagctggagtgcagtggcacaatcttggctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagttgttgggattccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtttttttggtagagacggggtttcaccatattggccaggctggtctccaactcctaatctcaggtgatctacccaccttggcctcccaaattgctgggattacaggcgtgaaccactgctcccttccctgtccttctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccctgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgt

在另一优选例中，本发明所述的携带RS1优化编码序列的质粒的序列如SEQ IDNO.:5所示。其中，所述L-ITR序列如SEQ ID NO:5所示序列的第1-141位所示；CMV增强子序列如如SEQ ID NO:5所示序列的第164-528位所示；鸡β-actin启动子序列如SEQ ID NO:5所示序列的第531-806位所示；嵌合内含子序列如SEQ ID NO:5所示序列的第807-1815位所示；人源RS1蛋白优化编码序列如SEQ ID NO:3所示，位于SEQ ID NO:5所示序列的第1874-2545位；WPRE(转录后调控序列)如SEQ ID NO:5所示序列的第2560-3148位所示；hGHpA序列如SEQ ID NO:5所示序列的第3160-3683位所示；R-ITR序列如SEQ ID NO:5所示序列的第3684-3824位所示；KanR卡那霉素抗性序列如SEQ ID NO:5所示序列的第4741-5556位所示。

基因治疗载体

本发明使用的基因治疗载体是一种病毒表达载体，优选地是一种腺相关病毒(AAV)载体。常见的用作基因治疗载体的AAV选自血清型AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或其衍生的嵌合AAV，包括AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAVHSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone 32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45，AAV2或AAV5。在转染时，AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应(如果有的话)。在本发明的一个优选实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型2载体。

可根据标准技术生产重组病毒载体。例如，重组腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在10⁷-10¹³个病毒颗粒/mL范围内的滴度。在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法，诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。用于人的AAV的合适剂量在约1×10¹⁰-1×10¹⁴个病毒颗粒的范围内。

候选药物或治疗剂

本发明中，使用RS1-KO小鼠动物模型作为XLRS的候选药物或治疗剂的筛选模型。候选药物或治疗剂是指已知具有某种药理学活性或正在被检测的可能具有某种药理学活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白、糖类、化学合成的小分子或大分子化合物、细胞等。候选药物或治疗剂的给药方式可以是口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、椎管给药、视网膜下腔注射、玻璃体腔注射或直接脑内注射。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的基因治疗载体可以通过眼内局部给药，具体地，通过视网膜下腔或玻璃体腔注射给药。本发明中，一个优选实施例是将本发明提供的重组病毒制剂经玻璃体直接注射给成年患病小鼠，使小鼠的视网膜表达人源的RS1蛋白，从而实现对劈裂症状缓解、外核层保护作用。

本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达RS1蛋白。本发明中，宿主细胞包括小鼠细胞。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)，提高RS1蛋白的表达量。

制剂和组合物

本发明提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗X连锁视网膜劈裂症。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。

在本发明中，所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明提供的编码人源RS1蛋白的核酸，可以体外或体内生产人源RS1蛋白蛋白，可应用于制备治疗视网膜色素变性的药物。

本发明的优点在于：

1.本发明提供了一种高效且稳定的人源RS1蛋白重组载体，所述的重组载体整合并表达了经过大量筛选获得的优化RS1编码序列，获得的人源RS1蛋白结构稳定、表达量高。

2.本发明提供的人源RS1蛋白重组载体能直接作用于视网膜下腔，能有效促进视网膜细胞中的人源RS1蛋白的表达，并能有效预防和改善RS1-KO小鼠的视力缺陷。

3.本发明提供的人源RS1蛋白重组载体的优点还表现在起效快、作用时间长，在小鼠模型中测试到重组载体在注射入视网膜下腔后2周就表现出人源RS1蛋白的表达升高，3周表现出病情的改善，注射后3个月仍能有效发挥作用。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1正常表达人源RS1蛋白的质粒筛选与构建

为了获得能高效表达人源RS1蛋白的质粒，通过优化人源RS1蛋白编码序列，并筛选合适的启动子及特异性增加基因表达的增强子。

结果：为了提高质粒元件的表达效率，设计了一套最优化的调控序列组合，包括编码序列上游的L-ITR序列、CMV增强子、鸡β-actin启动子序列、嵌合的内含子序列，RS1蛋白优化编码序列，以及下游的WPRE结构、hGHpA序列、R-ITR序列，且保证RS1蛋白优化编码序列编码的氨基酸序列与人源RS1蛋白的氨基酸序列完全一致，以保证其完整功能。本发明筛选质粒的结构图如图1所示。质粒的核酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

实施例2正常表达人源RS1蛋白的重组AAV-CBA-RS1 2/2病毒及其表达效率

2.1质粒导入病毒的实验步骤

病毒载体是通过质粒共转染方法获得的。将含有AAV2外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV-CBA-RS1质粒与HEK 293T细胞共转染，初步形成重组腺相关病毒载体。经碘克丁醇初步纯化后，经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化，使用仪器为Pharmacia AKTA FPLC system(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。之后用pH8.0，215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组病毒载体进行收集。收集的液体通过浓缩器(100K concentrater,Millipore)后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组病毒载体进行浓缩。再用DNase I消化掉病毒颗粒以外DNA，并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度。最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装零下80度储存。

经纯化，得到的病毒滴度为2.91×10¹²。

2.2在出生6周的WT小鼠左眼接受AAV.opti-hRS1注射，右眼为对照，具体步骤：小鼠经充分散瞳后全身麻醉，在眼科专用手术显微镜直视下，在角巩膜缘内侧瞳孔范围内用301/2gauge的一次性尖针头穿刺角膜，避免伤及虹膜和晶状体，然后逐渐进针至玻璃体腔并缓慢推注，注射量为1ul。注射载体悬浊液中添加0.1％荧光素钠染料(安全浓度)，方便观察注射是否成功。术毕涂1％阿托品眼膏和四环素可的松眼膏，以后每隔1天重复一次，共三次，以减少炎症反应、防止感染。

本发明所有动物实验的饲养环境均为清洁级，予以国家标准饲料、过滤无菌水饲养，温度、湿度恒定，光照接近自然光，强度18lux，12h/12h昼/夜循环交替光照。

2.3 hRS1蛋白表达检测:用标准Western Blot实验方法和免疫组化对结果进行检测；Western Blot蛋白样品用蛋白提取试剂盒(购自天根)处理，人源RS1(ab167579，1:1000稀释)抗体检测；免疫组化采用TUJ1(ab195880)和hRS1(1:1000稀释)检测。

结果：WT小鼠左眼接受玻璃体腔注射实施例2.1中得到的AAV.opti-hRS1载体，在注射2周后，采用western blot检测到hRS1蛋白表达(如图2),在视网膜采用铺片检测hRS1蛋白表达(如图3)。右眼无注射，不表达。

实施例3重组AAV-CBA-RS1 2/2病毒在RS1-KO小鼠的病情改善

在RS1-KO小鼠出生14天(P14)，单眼注射玻璃体腔重组AAV-CBA-RS1 2/2病毒。实验操作如实施例2中所述。在P35采用光学相干层析技术(Optical Coherence Tomography,OCT)检测RS1-KO小鼠，在P40采用视网膜电图(Electroretinogram；ERG)检测RS1-KO小鼠。

结果：P35进行的OCT检测结果如图4所示，基因治疗对视网膜有保护。P40进行的ERG检测结果如图5所示，基因治疗对视力有恢复作用。

实施例4重组AAV-CBA-RS1 2/2病毒在RS1-KO小鼠的病理改善

在出生53天(P53)采用免疫组化和HE检测hRS1的表达是否对劈裂症状缓解、外核层保护作用，所述方法包括以下步骤：

4.1眼球冰冻切片制备：采用新鲜配制4％多聚甲醛溶液心脏灌注，取出眼球前用大头针在小鼠眼球角巩缘上方顶点12：00处留烙印作标记。用弯镊快速取出眼球，立即放入0.01mol/L PBS中；将眼球即刻浸泡在新鲜配制4％多聚甲醛溶液中，并用5ml一次性注射器上的16.19号粗针头在角膜缘穿刺，4℃过夜；分别使用含梯度为10％、20％、30％蔗糖的PBS溶液脱水；剪去角膜，分离出晶状体，冷冻包埋剂(Optimal cuttingtemperaturecompound，OCT)进行组织包埋2h，用液氮速冻；冰冻切片机制备12μm的眼球冰冻切片置于粘附载玻片上，储存于-80℃冰箱中备用。

4.2免疫荧光染色：

(1)将冰冻切片从-80℃冰箱取出，37℃水域烘干1小时。

(2)1*PBS漂洗OCT(Optimal cutting temperaturecompound)5min 1次，边缘擦拭干净。

(3)免疫组化笔画圈，加封闭液(1ml山羊血清、1ml 20*PBS、0.3ml 20％TritionX-100、17.7ml蒸馏水)封闭1小时。

(4)吸去封闭液，用移液枪加小鼠抗RS1一抗(1：1000)，4℃孵育过夜；

(5)1*PBS漂洗5min 3次，暗室中滴加抗RS1的小鼠二抗(1：1000)，湿盒内室温孵育1h。

(6)最后滴加DAPI稀释液(1：2000)，每个标本30ul，孵育10min，1*PBS漂洗5min2次.

(7)用移液枪加少许抗荧光淬灭液，盖玻片封片，盖玻片四角滴加指甲油固定。

结果：

(1)RS1表达检测结果如图6所示，RS1-KO模式小鼠P14天单眼接受玻璃体腔注射AAV.opti-hRS1载体，P53时进行视网膜免疫组化检测。检测到RS1抗体表达，劈裂症状缓解，外核层得到保护。

(2)HE染色检测结果如图7所示，RS1-KO模式小鼠P14天单眼接受玻璃体腔注射AAV.opti-hRS1载体，P53时进行视网膜HE染色检测,检测到外核层厚度增加。

讨论

目前，临床上没有特异治疗XLRS青少年视网膜劈裂症的药物。随着人类基因图谱成功构建、分子生物学技术迅猛发展，病毒载体成功应用，使得XLRS的基因治疗方面已经取得了一定进展。很多实验研究为XLRS的基因疗法应用于临床做了很多铺垫和前期工作。因腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)较其他病毒载体小，无致病性，可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性，因此本发明涉及基于AAV载体的针对眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的基因治疗方法。

由于RS1基因突变所致的X连锁青少年视网膜劈裂症(XLRS)遗传模式通常为X染色体隐性，因此本发明设计通过眼内注射表达正常人源RS1蛋白的重组AAV-CBA-RS1 2/2病毒，将正常RS1基因导入视网膜靶细胞，使其合成结构和功能正常的蛋白，并长期稳定表达，修复细胞功能缺陷，能从根本上或在疾病的早期阶段防止视网膜病变。结果证明，本发明提供的重组载体能提高视网膜靶细胞中的hRS1蛋白表达，且对视网膜有保护作用，且缓解劈裂症状、保护外核层。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市第一人民医院

<120> 一种X连锁遗传性视网膜劈裂症的基因治疗方案与应用

<130> P2019-1847

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 672

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 人源RS1优化序列

<400> 1

atgagccgga agatcgaggg cttcctgctg ctgctgctgt ttggatacga ggccaccctg 60

ggactgtcct ccaccgagga cgagggcgag gacccctggt accagaaggc ctgcaagtgc 120

gactgccagg gcgggcctaa cgccctgtgg agcgctggag ctaccagcct ggactgcatt 180

cccgagtgcc catatcacaa gcccctggga ttcgagagcg gagaggtgac cccagaccag 240

attacatgca gtaacccaga acagtatgtg ggatggtatt caagctggac cgccaacaag 300

gccagactga acagccaggg cttcggctgc gcctggctga gcaagttcca ggacagcagc 360

cagtggctgc agattgacct gaaggagatc aaggtgatct cagggatcct gacccaggga 420

agatgcgaca tcgatgagtg gatgaccaag tacagcgtgc agtacagaac cgacgaaaga 480

ctgaactgga tctactacaa agaccagaca ggaaacaaca gagtgttcta cggcaacagc 540

gacagaacca gcaccgtgca gaacctgctg agacccccca tcatcagcag attcatcaga 600

ctgatccccc tggggtggca cgtgagaatc gcaatcagaa tggagctgct ggaatgcgtg 660

agcaagtgcg cc 672

<210> 2

<211> 224

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Ser Arg Lys Ile Glu Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro

20 25 30

Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Pro Asn Ala

35 40 45

Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln

65 70 75 80

Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp

85 90 95

Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp

100 105 110

Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys

115 120 125

Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile

130 135 140

Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg

145 150 155 160

Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe

165 170 175

Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro

180 185 190

Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val

195 200 205

Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala

210 215 220

<210> 3

<211> 672

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

atgagccgga agatcgaggg cttcctgctg ctgctgctgt ttggatacga ggccaccctg 60

ggactgtcct ccaccgagga cgagggcgag gacccctggt accagaaggc ctgcaagtgc 120

gactgccagg gcgggcctaa cgccctgtgg agcgctggag ctaccagcct ggactgcatt 180

cccgagtgcc catatcacaa gcccctggga ttcgagagcg gagaggtgac cccagaccag 240

attacatgca gtaacccaga acagtatgtg ggatggtatt caagctggac cgccaacaag 300

gccagactga acagccaggg cttcggctgc gcctggctga gcaagttcca ggacagcagc 360

cagtggctgc agattgacct gaaggagatc aaggtgatct cagggatcct gacccaggga 420

agatgcgaca tcgatgagtg gatgaccaag tacagcgtgc agtacagaac cgacgaaaga 480

ctgaactgga tctactacaa agaccagaca ggaaacaaca gagtgttcta cggcaacagc 540

gacagaacca gcaccgtgca gaacctgctg agacccccca tcatcagcag attcatcaga 600

ctgatccccc tggggtggca cgtgagaatc gcaatcagaa tggagctgct ggaatgcgtg 660

agcaagtgcg cc 672

<210> 4

<211> 912

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 4

attatcataa gtaacgtgaa cactgcacat tcttccatat aactgagcca ccactaccaa 60

agtcaatgtt ttccagagca ggcagatgtc aacatgacaa gttcttctgg gagaaaacac 120

tctgttgtac cattccccta caaatagagg ttatttactc agcaggaacc tgttcaaggt 180

cactccctag gaaatgatgt cggagaaaga attaggggcc cacatcttcc aactctactt 240

tctatttcat cctattactc gccttacagt taaagatggt agaacatcag cacctccctt 300

gctaaaccaa cctatgtcaa caatacctcc ccagactgct tgttgaggca ggggactatg 360

tggcttaatt ggatgggggc tgagtgaaag acctaagaac taaatgaaat aagatgctta 420

agttaatcgc ctgctcctat gccagctctc cacttcactt agatcttgct gtgaccaagg 480

acaaggagaa aatgccacac aagattgaag gcttcttctt gttacttctc tttggctatg 540

aaggtatgta ctattctact attggcattt attaatgtat ttaataatgt gatttaatat 600

agaaatatat agaaaatagt tgataaatag aaatgcaacc tgagtaataa aaattgttgg 660

atgacaacat gccaattagt tcacaggtta ttaatttaaa aggtcactgt tgtgtggctc 720

tttgtcactg tcttgctcct ggcttcctgg tttcatgagg aaccttctaa agttcaaatg 780

atattgaaac tcaacagaaa gaaggaaggg cctcagagtt tctataaaaa caactttaaa 840

ttgcaacaat taatgagaag tcatgtttct tggaaatttt aggaggcaaa gttgaagcaa 900

ttgtagaatt ta 912

<210> 5

<211> 6376

<212> DNA

<213> 合成序列（Artificial sequence）

<220>

<223> AAV.opti-hRS1

<400> 5

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggaat tcgctagtta ttaatagtaa 180

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 240

gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 300

tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggactattta 360

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 480

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggg tcgaggtgag 540

ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt 600

atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg cgcgcgccag 660

gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca 720

atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct 780

ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgtt gccttcgccc cgtgccccgc 840

tccgcgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 900

gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagcg cttggtttaa tgacggctcg 960

tttcttttct gtggctgcgt gaaagcctta aagggctccg ggagggccct ttgtgcgggg 1020

gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggcccg 1080

cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc gcggcgcggg gctttgtgcg ctccgcgtgt 1140

gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc gggggggctg cgaggggaac 1200

aaaggctgcg tgcggggtgt gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcggcggtc 1260

gggctgtaac ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 1320

tgcggggctc cgtgcggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 1380

ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 1440

cggcggcccc ggagcgccgg cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta 1500

tggtaatcgt gcgagagggc gcagggactt cctttgtccc aaatctggcg gagccgaaat 1560

ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcgggcg aagcggtgcg gcgccggcag 1620

gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccatct 1680

ccagcctcgg ggctgccgca gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 1740

ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc 1800

ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc 1860

aaagaattcc accatgagcc ggaagatcga gggcttcctg ctgctgctgc tgtttggata 1920

cgaggccacc ctgggactgt cctccaccga ggacgagggc gaggacccct ggtaccagaa 1980

ggcctgcaag tgcgactgcc agggcgggcc taacgccctg tggagcgctg gagctaccag 2040

cctggactgc attcccgagt gcccatatca caagcccctg ggattcgaga gcggagaggt 2100

gaccccagac cagattacat gcagtaaccc agaacagtat gtgggatggt attcaagctg 2160

gaccgccaac aaggccagac tgaacagcca gggcttcggc tgcgcctggc tgagcaagtt 2220

ccaggacagc agccagtggc tgcagattga cctgaaggag atcaaggtga tctcagggat 2280

cctgacccag ggaagatgcg acatcgatga gtggatgacc aagtacagcg tgcagtacag 2340

aaccgacgaa agactgaact ggatctacta caaagaccag acaggaaaca acagagtgtt 2400

ctacggcaac agcgacagaa ccagcaccgt gcagaacctg ctgagacccc ccatcatcag 2460

cagattcatc agactgatcc ccctggggtg gcacgtgaga atcgcaatca gaatggagct 2520

gctggaatgc gtgagcaagt gcgcctgaag cttatcgata atcaacctct ggattacaaa 2580

atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac 2640

gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc 2700

ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt 2760

ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc 2820

tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc 2880

gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg 2940

gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt 3000

ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc 3060

cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt 3120

cggatctccc tttgggccgc ctccccgcat cgataccgta gatctacggg tggcatccct 3180

gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc 3240

ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta 3300

tggggtggag gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct 3360

gcggggtcta ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct 3420

ccgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg 3480

catgcatgac caggctcagc taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat 3540

tggccaggct ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat 3600

tgctgggatt acaggcgtga accactgctc ccttccctgt ccttctgatt ttgtaggtaa 3660

ccacgtgcgg accgagcggc cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct 3720

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 3780

ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcctg caggggcgcc tgatgcggta 3840

ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata cgtcaaagca accatagtac 3900

gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 3960

acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 4020

ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 4080

gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca 4140

tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 4200

ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg gctattcttt tgatttataa 4260

gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 4320

gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca attttatggt gcactctcag tacaatctgc 4380

tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga 4440

cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc 4500

atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata 4560

cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact 4620

tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 4680

tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 4740

atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc gattaaattc caacatggat 4800

gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 4860

tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 4920

gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 4980

cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 5040

atccctggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 5100

gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 5160

tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 5220

gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 5280

gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 5340

cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 5400

ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 5460

ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 5520

ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaactgt cagaccaagt ttactcatat 5580

atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 5640

tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 5700

cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 5760

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 5820

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta 5880

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 5940

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 6000

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 6060

acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 6120

tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 6180

gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 6240

cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 6300

cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 6360

ccttttgctc acatgt 6376

Claims

1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码人源RS1蛋白，且所述多核苷酸的序列选自下组：

(a)如SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；和

(b)与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.一种融合核酸，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z0-Z1-Z2 (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z0为无、或5’UTR序列；

Z1为如权利要求1所述的分离的多核苷酸；和

Z2为无、或3’UTR序列。

3.一种载体，所述载体含有如权利要求1所述的分离的多核苷酸或如权利要求2所述的融合核酸。

4.如权利要求3所述的载体，所述载体用于表达人源RS1蛋白。

5.如权利要求3所述的载体，所述载体为腺相关病毒AAV载体。

6.如权利要求3所述的载体，所述AAV载体的血清型为AAV2或AAV5。

7.一种体外培养的宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求3所述的载体，或其染色体中整合有外源的如权利要求1所述的分离的多核苷酸或权利要求2所述的融合核酸。

8.如权利要求7所述的体外培养的宿主细胞，所述宿主细胞选自下组：HEK293细胞、感光细胞、视觉细胞、神经细胞、或其组合。

9.如权利要求7所述的体外培养的宿主细胞，所述宿主细胞为视网膜神经节细胞。

10.一种如权利要求1所述的分离的多核苷酸或权利要求2所述的融合核酸、如权利要求3所述的载体、和/或如权利要求7所述的体外培养的宿主细胞的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力、和/或治疗或预防眼部疾病。

11.如权利要求10所述的用途，所述眼部疾病为X连锁视网膜劈裂症(XLRS)。

12.一种药物制剂，所述的制剂含有(a)如权利要求1所述的分离的多核苷酸或权利要求2所述的融合核酸、如权利要求3所述的载体、和/或如权利要求7所述的体外培养的宿主细胞，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

13.一种人源RS1蛋白的体外制备方法，包括步骤：培养权利要求7所述的体外培养的宿主细胞，从而得到人源RS1蛋白。