CN115710585A - 编码nd4的核酸及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码ND4的核酸及其用途。本发明对ND4的编码核酸序列进行了密码子优化，实验表明，采用本发明优化后序列制备获得的药物处理可以显著改善ND4突变导致的病人细胞的线粒体功能紊乱病变。

Description

编码ND4的核酸及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码ND4的核酸及其用途。

背景技术

NADH泛醌氧化还原酶4号亚基(NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 4，ND4)是线粒体complex I(1号复合体)的核心亚基，它与其他六个亚基共同构成了complex I的疏水区段。Complex I在线粒体呼吸链中扮演重要角色，它能够氧化三羧酸循环和β-氧化产生的NADH，还原泛醌，提供质子运输的动力，从而帮助质子跨过线粒体内膜。线粒体DNA11778位点突变由线粒体DNA(mtDNA)第11778位核苷酸发生突变引起的，此突变使呼吸链上ND4基因编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸。虽然它们均为碱性氨基酸，但这一位置的精氨酸是高度保守的。由于突变可能降低电子流动效率影响酶的活性从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生Leber遗传性视神经病变LHON。

Leber遗传性视神经病变(LHON)是一种由线粒体基因组点突变引起的母系遗传性疾病，全球发病率为1/30000。LHON患者的特征为：一般20-30岁发病，随着病程发展，患者的双侧视力急剧下降，直至最终失明。主要病因是由于患者视网膜神经节细胞(RGCs)死亡，而RGC细胞的死亡要归因于患者的线粒体基因突变。大多数与LHON相关的突变发生在complexI各亚基的编码基因内，其中超过一半的突变发生于ND4的G11778A位点上。该突变占中国LHON患者的89.2％，且预后最差。

目前传统的药物对治疗LHON患者作用有限，而AAV介导的基因治疗在针对这类单基因突变的遗传疾病方面展现出巨大的潜力。但AAV介导的基因治疗的效果依赖于基因序列，野生型AAV基因序列在以往的治疗中表现出的疗效仍存在提高空间。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供编码ND4(NADH泛醌氧化还原酶4号亚基)的核酸及其用途，以期提高ND4的表达水平，提高治疗效果。

本发明提供了编码NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的核酸，包括I)～III)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；

II)、与如I)所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的序列且编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的核酸；优选为具有至少80％同源性；更优选为具有至少85％同源性；更优选为具有至少90％同源性；更优选为具有至少95％同源性；更优选为具有至少96％同源性；更优选为具有至少97％同源性；更优选为具有至少98％同源性；更优选为具有至少99％同源性；

III)、与I)或II)部分互补或完全互补的核酸。

本发明还提供了NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的转录单元，其包括：启动子、本发明所述的编码NADH泛醌氧化还原酶4号亚基(ND4)的核酸和终止子。

本发明所述转录单元的其5’端至3’端依次包括：启动子、编码ND4的核酸、调控片段和终止子。本发明中，所述调控片段选自COX10 UTR或SV40信号片段。一些实施例中，所述转录单元的5’端至3’端依次包括CMV增强子、CMV启动子、Chimeric intron、MTS片段、SEQID NO:1所示序列的核酸片段、标签片段和SV40信号片段。

本发明所述的重组载体，其包括骨架载体和本发明所述的核酸。

本发明所述的重组载体为病毒载体；所述病毒载体选自DNA病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9。本发明所述重组载体的骨架载体为pAAV2。

一些实施例中，所述重组载体包括顺序连接的：包括顺序连接的AAV2 5’ITR、CMV增强子、CMV启动子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的核酸片段、标签片段、SV40信号片段、AAV2 3’ITR。

本发明所述的核酸、转录单元、所述的重组载体在制备防治线粒体功能紊乱病变的药物中的应用。本发明所述的防治包括预防和/或治疗。本发明所述防治线粒体功能紊乱病变为视神经病变；一些实施例中，所述视神经病变为遗传性视神经病变。一些具体实施例中，本发明提供了所述的核酸、转录单元、所述的重组载体在制备防治Leber遗传性视神经病变的药物中的应用。

本发明还提供了一种药物，其包括：本发明所述的核酸、转录单元或所述的重组载体，还可以包括药学上可接受的载体和赋形剂。

本发明所述的药物中包括：所述重组载体、Lipofectamine 2000试剂和无血清DMEM培养基。一些实施例中，所述重组载体的浓度为0.8μg/100μL～1.0μg/100μL。

本发明还提供了一种药物的递送方法，其将本发明所述的药物制剂注射至眼部，优选地为玻璃体腔注射。

本发明还提供了一种防治治疗Leber遗传性视神经病变的方法，其为给予本发明所述的药物。所述给予的方式为玻璃体腔注射。

本发明对ND4的编码核酸序列进行了密码子优化，实验表明，采用本发明优化后序列制备获得的药物处理可以显著改善ND4突变导致的病人细胞的线粒体功能紊乱病变。用AAV2-CMV-ND4opt3药物处理293细胞，优化后ND4可以在该细胞系中高效表达，且表达效率高于未优化的ND4序列。同时，病人细胞经AAV2-CMV-ND4opt3药物处理后，恢复了在半乳糖培养基生长的能力，产生ATP的能力得到了改善并接近野生型细胞，证明其线粒体功能紊乱得到了修正。因此此AAV2-CMV-ND4opt3药物具有预防或治疗Leber遗传性视神经病变的作用。

附图说明

图1、图1续示rND4和ND4 opt3序列比对：优化后差异性的密码子序列加粗并用下划线标注；

图2示质粒载体图谱，其中,A示pAAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40载体图谱，B示pAAV2-CMV-ND4opt3-SV40载体图谱，载体包含AAV2 5’ITR，CMV增强子，CMV启动子，嵌合内含子，MTS(线粒体靶向序列)，密码子优化后的ND4opt3或rND4 cDNA，COX10 UTR元件，SV40polyA元件序列和AAV2 3’ITR；

图3示pAAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40和pAAV2-CMV-ND4 opt3-SV40质粒在HEK293细胞中的表达效率；在HEK293细胞中分别转染pAAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40和pAAV2-CMV-ND4opt3-SV40质粒，48小时后裂解细胞分别提取RNA和蛋白质，利用qPCR和Western Blot检测ND4 mRNA和蛋白表达水平,发现密码子优化后ND4opt3与rND4 mRNA和蛋白表达存在显著差异，优化后mRNA(A)和蛋白水平(B)升高；

图4示半乳糖筛选培养基中LHON细胞活力测定结果：在ND4突变的LHONfibroblast细胞中分别感染AAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40和AAV2-CMV-ND4opt3-SV40病毒，设一组不感染病毒，对照组为正常fibroblast细胞。感染48hr后用DMEM(galactose)和DMEM(glucose)培养基换液，培养3天后收取细胞并计数，以细胞数的比例(galactose/glucose)为存活率

图5示LHON细胞线粒体合成ATP测定结果：在ND4突变的LHON fibroblast细胞中分别感染AAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40和AAV2-CMV-ND4 opt3-SV40病毒，设一组不感染病毒，对照组为正常fibroblast细胞。感染48hr后收集等量的细胞用添加特定底物(5mM 2-deoxy-D-glucose+5mM pyruvate)的ATP synthesis buffer重悬并在37℃孵育2hr，裂解细胞测定ATP含量。

具体实施方式

本发明提供了编码ND4的核酸及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

所述“密码子”是由三个核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)组成的序列，这三个核苷酸一起构成编码氨基酸的遗传密码单元。本发明所述的密码子优化包括优化影响基因表达和蛋白定位的序列片段，这些序列片段包括但不限于，密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。

本发明针对ND4的cDNA序列进行密码子优化，野生型ND4基因为人源ND4基因的cDNA序列(SEQ ID NO:3)；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体为：MLKLIVPTIMLLPLTWLSKKHMIWINTTTHSLIISIIPLLFFNQINNNLFSCSPTFSSDPLTTPLLMLTTWLLPLTIMASQRHLSSEPLSRKKLYLSMLISLQISLIMTFTATELIMFYIFFETTLIPTLAIITRWGNQPERLNAGTYFLFYTLVGSLPLLIALIYTHNTLGSLNILLLTLTAQELSNSWANNLMWLAYTMAFMVKMPLYGLHLWLPKAHVEAPIAGSMVLAAVLLKLGGYGMMRLTLILNPLTKHMAYPFLVLSLWGMIMTSSICLRQTDLKSLIAYSSISHMALVVTAILIQTPWSFTGAVILMIAHGLTSSLLFCLANSNYERTHSRIMILSQGLQTLLPLMAFWWLLASLANLALPPTINLLGELSVLVTTFSWSNITLLLTGLNMLVTALYSLYMFTTTQWGSLTHHINNMKPSFTRENTLMFMHLSPILLLSLNPDIITGFSS。

经过优化后的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：atgctgaagcttatcgtgcccactattatgcttctccctctgacctggctttccaagaaacacatgatctggatcaacaccaccacccacagcctcatcatatctattattcctctgttgtttttcaatcagattaacaacaacctgtttagttgttcacccacattttcaagtgacccgctgaccacgccgctccttatgcttaccacttggctgcttcctctcaccatcatggcaagtcagcgacacctttcctcagaacccctcagcaggaaaaaactgtacctgtctatgttgatctctctgcagatatcattgatcatgacattcactgccacggagctgattatgttctacatctttttcgaaaccaccctgattccaacgctggcaattattacccgctgggggaaccagcctgaaaggttgaacgctgggacctatttcctgttttacacacttgtcggttcacttccgctcctcatcgcactgatctacactcacaacacactcggatcacttaacatcctcctccttactctgactgcccaagagctgagcaactcttgggctaacaatcttatgtggctggcatatacaatggccttcatggtgaagatgccgctttacggattgcatctctggctcccaaaggcacacgtggaagcccccattgctgggtccatggttctggcagccgtacttctgaaactgggagggtatggaatgatgcggctcacccttatattgaatcctttgaccaaacacatggcctacccctttctggttctcagcctttggggcatgattatgacatcttcaatttgcctgagacaaacagacctgaagtcattgatcgcgtactctagcattagccatatggcgcttgttgtgaccgctatcttgatccagactccttggagtttcacaggggccgtcatcttgatgatcgcacacggcctgacatcaagcctgctgttttgcctcgccaactccaactatgaaaggacccacagccgcattatgattctgagtcagggacttcagacacttctgccactgatggcattttggtggctcctcgcctctctcgcaaatctcgccctcccccctacgataaatttgttgggagagctgagcgtattggtaacaacattctcatggtccaacatcacacttctgcttacaggccttaatatgctggtgactgctctttattcattgtacatgtttaccacaacccaatggggctctctgacccaccatatcaataatatgaagccatcatttaccagagaaaacacactgatgttcatgcacctgtcacccatcttgctcctgtcactgaaccctgacatcattaccggtttcagcagctga

本发明首先对ND4cDNA序列进行密码子优化(codon optimization)得到ND4opt3，使用CMV启动子并对转录后调控元件进行了修饰。

本发明中，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(A)信号等。一些实施例中，在转录单元中添加COX10 UTR元件(SEQ ID NO:4)或者SV40 polyA元件(SEQ ID NO:5)，或者使用COX10 UTR和SV40polyA 元件组合，一些具体实施例中，构建获得的表达载体质粒为pAAV2-CMV-ND4opt3-SV40。

在本领域，外源基因的表达通常通过将目的基因编码区序列(CDS)克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用骨架上构建的启动子驱动目的基因表达来实现。所述骨架载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。载体优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如：抗性蛋白标记、氨基酸筛选标记或绿色荧光蛋白等。在本发明实施例中，选用的启动子为CMV启动子，终止子为CMV终止子。本发明中，所述重组载体中，还包括CMV增强子、Chimeric intron、MTS片段和标签片段。本发明实施例中，所述标签片段为3×FLAG标签。

一些实施例中，所述重组载体包括顺序连接的：AAV2 5’ITR、CMV增强子、CMV启动子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的核酸片段、3×FLAG标签、SV40信号片段、AAV2 3’ITR；

在本申请中，术语“腺相关病毒载体”或“AAV”通常是指腺病毒本身或其衍生物。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)通常是指一类属于微小病毒科、依赖病毒属的单链DNA病毒。AAV基因组可以包含DNA链两端的反向末端重复序列(ITR)和两个开放阅读框(ORF)。所述开放的阅读框可以包括rep和cap。rep由编码AAV生命周期所需的Rep蛋白的多个重叠基因组成，cap包含编码衣壳蛋白的重叠核苷酸序列，所述核苷酸序列可以包括VP1，VP2和VP3。所述衣壳蛋白相互作用形成衣壳。AAV具有多种常见血清型,100多种病毒变种。在本申请中，AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组件选自任何AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV或其变体或混合物。

在本申请中，术语“血清型”通常是指通过血清学方法对腺相关病毒衣壳表面的表位进行检测，并对腺相关病毒进行分型。腺相关病毒具有多种常见血清型，100多种病毒变种。在本申请中，AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组件选自任何AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV或其变体或混合物。

本发明构建重组载体采用的骨架载体中AAV为AAV2。具体的，骨架载体为pAAV2。本发明还涉及包含本发明的重组核酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达ND4蛋白，以及表达ND4蛋白的方法。

本发明将优化前后的表达载体质粒瞬时转染HEK293细胞，从RNA水平和蛋白水平同时检测ND4的表达，发现优化后的载体ND4表达效率显著提高。随后将AAV2-CMV-ND4opt3病毒药物感染LHON病人细胞，一方面将感染后的细胞培养条件更换为半乳糖选择培养基，对细胞生长进行监测，证明其恢复氧化磷酸化的能力；另一方面测定感染后细胞线粒体合成ATP的含量，确定感染组细胞线粒体合成ATP的能力显著高于对照组，AAV2-CMV-ND4opt3药物能够恢复LHON病人细胞complex I的催化活性。综上证明AAV2-CMV-ND4opt3药物具有预防或治疗Leber遗传性视神经病变的作用。

本发明提供的药物包括本发明所述的核酸、转录单元或所述的重组载体。一些实施例中，本发明所述的药物中包括：所述重组载体和药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料包括药学中可接受的载体、赋形剂或渗透压调节剂。“药学上可接受的载体(carrier)或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。一些具体实施例中，所述药物包括本发明所述重组载体、Lipofectamine 2000试剂和无血清DMEM培养基。其中，所述重组载体的浓度为0.8μg/100μL～1.0μg/100μL。其中，所述Lipofectamine 2000试剂的浓度为1μL/100μL～3μL/100μL。

本发明所述的药物中，还包括其他具有改善ND4水平或活性的药物。所述其他具有改善ND4蛋白水平或活性的药物包括ND4其他变体或调控ND4表达的药物。在本发明中，所述药物制剂施用至眼部，优选地，可通过玻璃体腔或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，药物作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体以胶囊、安剖瓶或预充式注射器被提供。

本发明用AAV2-CMV-ND4opt3药物处理293细胞，优化后ND4可以在该细胞系中高效表达，且表达效率高于未优化的ND4序列。同时，病人细胞经AAV2-CMV-ND4opt3药物处理后，恢复了在半乳糖培养基生长的能力，产生ATP的能力得到了改善并接近野生型细胞，证明其线粒体功能紊乱得到了修正。因此此AAV2-CMV-ND4opt3药物具有预防或治疗Leber遗传性视神经病变的作用。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1密码子优化和转录后调控元件修饰的ND4具有更高的表达效率

一、质粒载体构建

1.合成密码子优化的ND4序列(记做ND4 opt3)并克隆至pUC57质粒骨架上，将ND4opt3编码序列从该骨架上用BamH I和Cla I切下来。将pAAV2-CMV-SV40质粒骨架分别用BamH I和Cla I双酶切，然后将酶切后的片段分别与骨架进行连接，得到pAAV2-CMV-ND4opt3-SV40质粒。另以此前构建的含有野生型片段的质粒pAAV2-CMV-rND4-COX10 URT-SV40作为对照。

2.连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落进行酶切验证与测序验证。

二、质粒转染细胞

1.转染前一天，胰酶消化HEK293细胞并计数，细胞铺板，使其在转染当天汇聚度达到70％-80％。

2.对于每孔细胞，使用50μl无血清DMEM培养基稀释0.8μg-1.0μg质粒DNA；使用50μl DMEM培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。

3.混合稀释的DNA和稀释的LIPOFECTAMINE 2000，在室温保温20分钟。

4.直接将上述复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

5.在37℃，5％的CO ₂中培养48小时。

6.弃掉培养基后用PBS冲洗，胰酶消化后离心收集细胞待用。

三、qPCR测定mRNA含量

1、总RNA抽提

1)收取10⁵个细胞，加入1ml裂解液裂解，13000g离心10min后取上清。

3)加入250μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min；4℃下13000g离心8min。

4)将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀；-20℃放置15min；4℃下13000g离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

5)吸除液体，加入75％乙醇1.5ml洗涤沉淀；4℃下13000g离心5min；将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min；加入20μl无RNA酶的水溶解RNA；55℃孵育5min。

2、反转录

1)取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液；加入1μl oligo(dT)；用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

2)于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却；依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mMdNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl反转录酶，用枪抽吸混匀；于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

3、定量PCR

1)取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。2×qPCR Mix12.5μl；7.5μM基因引物；2.0μl反转录产物；2.5μL ddH₂O；8.0μl。

2)取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。2×qPCR Mix12.5μl；7.5μM内参引物2.0μl反转录产物2.5μL ddH₂O 8.0μl。

靶基因flag扩增引物：

正向引物5’-AGACCATGACGGTGAT-3’

反向引物5’-CTTGTCATCGTCATCCT-3’

内参基因actin扩增引物：

正向引物5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’

反向引物5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’

3)PCR扩增

预变性95℃，5min,

40个循环95℃，15s→60℃，60s，

溶解曲线60℃→95℃，每20s升温1℃

4)结果处理^ΔΔCT法：A＝CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)；B＝CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本)；K＝A-B；表达倍数＝2^-K。

四、Western Blot

1.蛋白样品制备，按1:100的比例在裂解液中加入PMSF。

2.使用强裂解液冰上裂解细胞30min；4℃，12000rpm离心15min，收集上清液待用。

3.使用BCA法测定蛋白浓度。

4.电泳：

a、根据所检测蛋白大小配制相应的分离胶(5ml/块)，待分离胶凝固。

b、配制5％的浓缩胶(2ml/块)，加满玻璃板，插入梳子。

c、将5μl预染蛋白质分子marker SDS-PAGE加入加样孔内，使用1x的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液10μl上样到样品孔边上的空白加样孔内。

5.转膜：将转膜白夹子上面放上湿的垫层，垫层上面铺三张叠在一起的湿滤纸，滤纸上面依次放置湿pvdf膜、胶、滤纸、垫层、黑夹板，将装好的夹板放入装有转膜缓冲液的电泳槽，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜2h。

6.封闭：转膜完毕后，漂洗1-2分钟，用滴管吸尽缓冲液，加入5％的脱脂奶粉，在侧摆摇床上缓慢摇动，室温封闭15-60min。加入TBS洗涤液洗涤5分钟。共洗涤3次。

7.一抗孵育:按照比例使用5％的脱脂奶粉/PBS+2％BSA稀释适量的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜或室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。孵育后洗涤。

8.二抗孵育:加入稀释好的二抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育40min-1h。孵育后洗涤。

9.蛋白检测：使用ECL类试剂来检测蛋白，各取1ml混匀后，滴加在蛋白膜表面，避光孵育1-2min。用镊子将蛋白膜整齐的摆放在塑料纸上，放入凝胶成像仪上曝光。

五、实验结果和讨论

通过优化密码子使用偏好，DNA重复序列，mRNA二级结构，GC含量等多个参数，我们得到了和rND4序列显著不同的优化序列，记做ND4 opt3(图1)。随后将ND4opt3构建到AAV2载体骨架上，同时添加转录后调控元件SV40 ployA(图2)，然后在HEK293细胞中转染相同量的质粒。首先我们从mRNA水平检测了ND4的表达情况，结果发现：密码子优化的ND4(pAAV2-CMV-ND4opt3-SV40)在细胞中的水平显著高于rND4，是rND4的80倍(图3中的A)。以上结果说明通过密码子优化和添加转录后调控元件，我们获得了在细胞中表达更稳定的ND4。其次，我们将不同质粒转染的HEK293细胞提取蛋白并检测，获得了与mRNA水平基本一致的结果：rND4在HEK293细胞中的表达量较低，而密码子优化和表达元件修饰的ND4载体(pAAV2-CMV-ND4opt3-SV40)在免疫印迹实验中可检测到较强的信号(图3中的B)。综上，经过优化后的ND4在细胞中半衰期更长，更稳定，且翻译效率更高。

实施例2 AAV2-CMV-ND4opt3药物能有效恢复LHON病人细胞的线粒体功能缺陷表型

一、病毒包装

1.聚合度90％以上的HEK293T细胞按1：3比例传盘。

2.转质粒前1-2h左右，换成无血清培养基，用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒转入HEK293T中。

3.质粒转化24h后，换新的无血清培养基

4.转染72h收毒。带着培养基，吹下细胞，离心；然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒，沉淀过夜后收集病毒沉淀。

5.将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化，然后用超滤管进行浓缩。

二、葡萄糖/半乳糖培养实验

1.消化ND4突变LHON患者fibroblast细胞，计数。

2.按照1×10⁵cells/孔的密度接种6孔板，DMEM(glucose)、37℃、5％CO₂培养。

分组如下(每组3个平行孔)：

实验组	细胞处理
		1	Control fibroblast
2	LHON fibroblast
		3	LHON fibroblast+AAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40
4	LHON fibroblast+AAV2-CMV-ND4opt3-SV40
		5	Control fibroblast
6	LHON fibroblast
		7	LHON fibroblast+AAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40
8	LHON fibroblast+AAV2-CMV-ND4opt3-SV40

3.细胞铺板16hr后，实验组按照上表实验要求分别感染病毒。

4.感染病毒48hr后，1-8实验组先用DMEM(glucose)培养基洗一遍，然后5-8实验组用DMEM(galactose)培养基换液，1-4实验组用DMEM(glucose)换液，继续培养。

5.培养3天后，胰酶消化细胞，200g离心5min，弃上清，PBS重悬。细胞计数并统计。

二、线粒体合成的ATP检测

1.消化ND4突变LHON患者fibroblast细胞，计数。

2.按照2×10⁵cells/孔的密度接种6孔板，DMEM(glucose)、37℃、5％CO₂培养。

分组如下(每组3个平行孔)：

3.细胞铺板16hr后，3-4实验组按照实验要求分别感染病毒。

4.感染病毒48hr后，胰酶消化细胞，200g离心5min，弃上清，将2E6个细胞用PBS洗一次并弃上清。

5.配置ATP synthesis buffer(SB)：156mM NaCl,3mM KCl,2mM MgSO₄,1.25mM

KH₂PO₄,2mM CaCl₂,20mM HEPES,pH 7.35

6.用SB重悬细胞，添加5mM 2-deoxy-D-glucose+5mM pyruvate，37℃孵育2hr，细胞裂解检测ATP。

7.ATP检测

7.1ATP标曲配置

4μM ATP：取8μl的500μM的ATP标准品加992μl的Tris-acetate buffer，混匀。

2μM ATP：取500μL的4μM的ATP加500μl的Tris-acetate buffer，混匀。

1μM ATP：取500μL的2μM的ATP加500μl的Tris-acetate buffer，混匀。

0.5μM ATP：取500μL的1μM的ATP加500μl的Tris-acetate buffer，混匀。

0.25μM ATP：取500μL的0.5μM的ATP加500μl的Tris-acetate buffer，混匀。

0.125μM ATP：取500μL的0.25μM的ATP加500μl的Tris-acetate buffer，混匀。

0.0625μM ATP：取500μL的0.125μM的ATP加500μl的Tris-acetate buffer，混匀。

8、0μM ATP:Tris-acetate buffer。

7.2工作液配置

按照1：9的比例配置ATP检测试剂和ATP检测稀释液，混匀。

7.3使用全黑酶标板，每孔加入100μl的工作液，避光静置几分钟，减少ATP背景。

7.4将待测样品与标准品分装280μl到另外的96孔板中，用排枪吸取100μl的样品或标准品加入工作液中，混匀。立即检测化学发光。

三、实验结果和讨论

之前的实验已经证实了密码子优化以及转录后调控元件修饰的ND4载体在体外表达效率优于rND4载体，为了进一步测试AAV2-CMV-ND4opt3药物表达蛋白的功能，我们对药物处理的ND4突变LHON患者fibroblast细胞进行了药效学验证。

首先，我们用不同的病毒药物感染ND4突变LHON fibroblast细胞，随后在筛选培养基中培养细胞，一段时间后对细胞活力进行检测。结果发现：

1)对照组的正常fibroblast细胞活力基本未受筛选压力的影响，接近100％的细胞存活，而未经药物处理的ND4突变LHON fibroblast细胞在筛选条件下细胞活力显著下降，在培养结束时存活的细胞比例为49％左右；

2)AAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40药物处理的ND4突变LHON fibroblast细胞活力有一定程度的恢复，达到了65％；AAV2-CMV-ND4opt3-SV40药物处理的ND4突变LHONfibroblast细胞活力恢复则要高于AAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40，达到了80％(图4)。筛选培养基中去除了glucose，添加的galactose迫使细胞无法通过糖酵解途径产生足够的ATP，只能依赖于线粒体的氧化磷酸化来产生ATP维持细胞生存所需的能量；而ND4突变的LHON fibroblast细胞由于线粒体功能受损，因此在筛选培养基中的存活能力下降。以上结果证明优化后的药物不仅能够在一定程度上弥补因ND4突变的导致的线粒体功能损伤，而且效果要强于未优化前的rND4。

其次，我们用不同的病毒药物感染ND4突变LHON fibroblast细胞，随后添加complex I特异性底物和糖酵解抑制剂，检测细胞线粒体合成ATP的能力。结果发现：

1)与对照组相比，未经药物处理的ND4突变LHON fibroblast细胞线粒体合成ATP的能力显著下降；

2)AAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40药物处理的ND4突变LHON fibroblast细胞线粒体合成ATP的能力有一定程度的恢复；AAV2-CMV-ND4opt3-SV40药物处理的ND4突变LHONfibroblast细胞线粒体合成ATP的能力的恢复则要高于AAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40(图5)。细胞孵育时添加complex I特异性底物和糖酵解抑制剂，此时细胞产生的ATP一定程度上反映了细胞complex I的活性。以上结果证明优化后的药物效果强于未优化前的rND4，且能准确地恢复因ND4突变导致的complex I功能紊乱。

综合以上结果，我们证明了AAV2-CMV-ND4opt3-SV40基因治疗药物对ND4突变引起的Leber遗传性视神经病变的治疗作用，为进一步的临床应用开发奠定了基础。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 纽福斯（苏州）生物科技有限公司

<120> 编码ND4的核酸及其用途

<130> MP21008132

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctgaagc ttatcgtgcc cactattatg cttctccctc tgacctggct ttccaagaaa 60

cacatgatct ggatcaacac caccacccac agcctcatca tatctattat tcctctgttg 120

tttttcaatc agattaacaa caacctgttt agttgttcac ccacattttc aagtgacccg 180

ctgaccacgc cgctccttat gcttaccact tggctgcttc ctctcaccat catggcaagt 240

cagcgacacc tttcctcaga acccctcagc aggaaaaaac tgtacctgtc tatgttgatc 300

tctctgcaga tatcattgat catgacattc actgccacgg agctgattat gttctacatc 360

tttttcgaaa ccaccctgat tccaacgctg gcaattatta cccgctgggg gaaccagcct 420

gaaaggttga acgctgggac ctatttcctg ttttacacac ttgtcggttc acttccgctc 480

ctcatcgcac tgatctacac tcacaacaca ctcggatcac ttaacatcct cctccttact 540

ctgactgccc aagagctgag caactcttgg gctaacaatc ttatgtggct ggcatataca 600

atggccttca tggtgaagat gccgctttac ggattgcatc tctggctccc aaaggcacac 660

gtggaagccc ccattgctgg gtccatggtt ctggcagccg tacttctgaa actgggaggg 720

tatggaatga tgcggctcac ccttatattg aatcctttga ccaaacacat ggcctacccc 780

tttctggttc tcagcctttg gggcatgatt atgacatctt caatttgcct gagacaaaca 840

gacctgaagt cattgatcgc gtactctagc attagccata tggcgcttgt tgtgaccgct 900

atcttgatcc agactccttg gagtttcaca ggggccgtca tcttgatgat cgcacacggc 960

ctgacatcaa gcctgctgtt ttgcctcgcc aactccaact atgaaaggac ccacagccgc 1020

attatgattc tgagtcaggg acttcagaca cttctgccac tgatggcatt ttggtggctc 1080

ctcgcctctc tcgcaaatct cgccctcccc cctacgataa atttgttggg agagctgagc 1140

gtattggtaa caacattctc atggtccaac atcacacttc tgcttacagg ccttaatatg 1200

ctggtgactg ctctttattc attgtacatg tttaccacaa cccaatgggg ctctctgacc 1260

caccatatca ataatatgaa gccatcattt accagagaaa acacactgat gttcatgcac 1320

ctgtcaccca tcttgctcct gtcactgaac cctgacatca ttaccggttt cagcagc 1377

<210> 2

<211> 459

<212> PRT

<213> 人类(human)

<400> 2

Met Leu Lys Leu Ile Val Pro Thr Ile Met Leu Leu Pro Leu Thr Trp

1 5 10 15

Leu Ser Lys Lys His Met Ile Trp Ile Asn Thr Thr Thr His Ser Leu

20 25 30

Ile Ile Ser Ile Ile Pro Leu Leu Phe Phe Asn Gln Ile Asn Asn Asn

35 40 45

Leu Phe Ser Cys Ser Pro Thr Phe Ser Ser Asp Pro Leu Thr Thr Pro

50 55 60

Leu Leu Met Leu Thr Thr Trp Leu Leu Pro Leu Thr Ile Met Ala Ser

65 70 75 80

Gln Arg His Leu Ser Ser Glu Pro Leu Ser Arg Lys Lys Leu Tyr Leu

85 90 95

Ser Met Leu Ile Ser Leu Gln Ile Ser Leu Ile Met Thr Phe Thr Ala

100 105 110

Thr Glu Leu Ile Met Phe Tyr Ile Phe Phe Glu Thr Thr Leu Ile Pro

115 120 125

Thr Leu Ala Ile Ile Thr Arg Trp Gly Asn Gln Pro Glu Arg Leu Asn

130 135 140

Ala Gly Thr Tyr Phe Leu Phe Tyr Thr Leu Val Gly Ser Leu Pro Leu

145 150 155 160

Leu Ile Ala Leu Ile Tyr Thr His Asn Thr Leu Gly Ser Leu Asn Ile

165 170 175

Leu Leu Leu Thr Leu Thr Ala Gln Glu Leu Ser Asn Ser Trp Ala Asn

180 185 190

Asn Leu Met Trp Leu Ala Tyr Thr Met Ala Phe Met Val Lys Met Pro

195 200 205

Leu Tyr Gly Leu His Leu Trp Leu Pro Lys Ala His Val Glu Ala Pro

210 215 220

Ile Ala Gly Ser Met Val Leu Ala Ala Val Leu Leu Lys Leu Gly Gly

225 230 235 240

Tyr Gly Met Met Arg Leu Thr Leu Ile Leu Asn Pro Leu Thr Lys His

245 250 255

Met Ala Tyr Pro Phe Leu Val Leu Ser Leu Trp Gly Met Ile Met Thr

260 265 270

Ser Ser Ile Cys Leu Arg Gln Thr Asp Leu Lys Ser Leu Ile Ala Tyr

275 280 285

Ser Ser Ile Ser His Met Ala Leu Val Val Thr Ala Ile Leu Ile Gln

290 295 300

Thr Pro Trp Ser Phe Thr Gly Ala Val Ile Leu Met Ile Ala His Gly

305 310 315 320

Leu Thr Ser Ser Leu Leu Phe Cys Leu Ala Asn Ser Asn Tyr Glu Arg

325 330 335

Thr His Ser Arg Ile Met Ile Leu Ser Gln Gly Leu Gln Thr Leu Leu

340 345 350

Pro Leu Met Ala Phe Trp Trp Leu Leu Ala Ser Leu Ala Asn Leu Ala

355 360 365

Leu Pro Pro Thr Ile Asn Leu Leu Gly Glu Leu Ser Val Leu Val Thr

370 375 380

Thr Phe Ser Trp Ser Asn Ile Thr Leu Leu Leu Thr Gly Leu Asn Met

385 390 395 400

Leu Val Thr Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Met Phe Thr Thr Thr Gln Trp

405 410 415

Gly Ser Leu Thr His His Ile Asn Asn Met Lys Pro Ser Phe Thr Arg

420 425 430

Glu Asn Thr Leu Met Phe Met His Leu Ser Pro Ile Leu Leu Leu Ser

435 440 445

Leu Asn Pro Asp Ile Ile Thr Gly Phe Ser Ser

450 455

<210> 3

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人类(human)

<400> 3

atgctaaaac taatcgtccc aacaattatg ttactaccac tgacatggct ttccaaaaaa 60

cacatgattt ggatcaacac aaccacccac agcctaatta ttagcatcat ccctctacta 120

ttttttaacc aaatcaacaa caacctattt agctgttccc caaccttttc ctccgacccc 180

ctaacaaccc ccctcctaat gctaactacc tggctcctac ccctcacaat catggcaagc 240

caacgccact tatccagtga accactatca cgaaaaaaac tctacctctc tatgctaatc 300

tccctacaaa tctccttaat tatgacattc acagccacag aactaatcat gttttatatc 360

ttcttcgaaa ccacacttat ccccaccttg gctatcatca cccgatgggg caaccagcca 420

gaacgcctga acgcaggcac atacttccta ttctacaccc tagtaggctc ccttccccta 480

ctcatcgcac taatttacac tcacaacacc ctaggctcac taaacattct actactcact 540

ctcactgccc aagaactatc aaactcctgg gccaacaact taatgtggct agcttacaca 600

atggctttta tggtaaagat gcctctttac ggactccact tatggctccc taaagcccat 660

gtcgaagccc ccatcgctgg gtcaatggta cttgccgcag tactcttaaa actaggcggc 720

tatggtatga tgcgcctcac actcattctc aaccccctga caaaacacat ggcctacccc 780

ttccttgtac tatccctatg gggcatgatt atgacaagct ccatctgcct acgacaaaca 840

gacctaaaat cgctcattgc atactcttca atcagccaca tggccctcgt agtaacagcc 900

attctcatcc aaaccccctg gagcttcacc ggcgcagtca ttctcatgat cgcccacggg 960

cttacatcct cattactatt ctgcctagca aactcaaact acgaacgcac tcacagtcgc 1020

atcatgatcc tctctcaagg acttcaaact ctactcccac taatggcttt ttggtggctt 1080

ctagcaagcc tcgctaacct cgccttaccc cccactatta acctactggg agaactctct 1140

gtgctagtaa ccacgttctc ctggtcaaat atcactctcc tacttacagg actcaacatg 1200

ctagtcacag ccctatactc cctctacatg tttaccacaa cacaatgggg ctcactcacc 1260

caccacatta acaacatgaa accctcattc acacgagaaa acaccctcat gttcatgcac 1320

ctatccccca ttctcctcct atccctcaac cccgacatca ttaccgggtt ttcctct 1377

<210> 4

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60

tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120

tcagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180

agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240

ttttatacat ctctcctcca accccaccct ctattctgtt tcttcctcct cacatggggg 300

tacacataca cagcttcctc ttttggttcc atccttacca ccacaccaca cgcacactcc 360

acatgcccag cagagtggca cttggtggcc agaaagtgtg agcctcatga tctgctgtct 420

gtagttctgt gagctcaggt ccctcaaagg cctcggagca cccccttcct tgtgactgag 480

ccagggcctg catttttggt tttccccacc ccacacattc tcaaccatag tccttctaac 540

aataccaata gctaggaccc ggctgctgtg cactgggact ggggattcca catgtttgcc 600

ttgggagtct caagctggac tgccagcccc tgtcctccct tcacccccat tgcgtatgag 660

catttcagaa ctccaaggag tcacaggcat ctttatagtt cacgttaaca tatagacact 720

gttggaagca gttccttcta aaagggtagc cctggactta ataccagccg gatacctctg 780

gcccccaccc cattactgta cctctggagt cactactgtg ggtcgccact cctctgctac 840

acagcacggc tttttcaagg ctgtattgag aagggaagtt aggaagaagg gtgtgctggg 900

ctaaccagcc cacagagctc acattcctgt cccttgggtg aaaaatacat gtccatcctg 960

atatctcctg aattcagaaa ttagcctcca catgtgcaat ggctttaaga gccagaagca 1020

gggttctggg aattttgcaa gttacctgtg gccaggtgtg gtctcggtta ccaaatacgg 1080

ttacctgcag ctttttagtc ctttgtgctc ccacgggtct acagagtccc atctgcccaa 1140

aggtcttgaa gcttgacagg atgttttcga ttactcagtc tcccagggca ctactggtcc 1200

gtaggattcg attggtcggg gtaggagagt taaacaacat ttaaacagag ttctctcaaa 1260

aatgtctaaa gggattgtag gtagataaca tccaatcact gtttgcactt atctgaaatc 1320

ttccctcttg gctgccccca ggtatttact gtggagaaca ttgcatagga atgtctggaa 1380

aaagcttcta caacttgtta cagccttcac atttgtagaa gctttgcggc cgct 1434

<210> 5

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60

tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120

tt 122

Claims (11)

1.编码ND4的核酸，包括I)～III)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；

II)、与如I)所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的序列且编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的核酸；

III)、与I)或II)完全互补的核酸。

2.ND4的转录单元，其包括：启动子、权利要求1所述的核酸和终止子。

3.根据权利要求2所述的转录单元，其特征在于，其5’端至3’端依次包括：启动子、权利要求1所述的核酸、调控片段和终止子。

4.重组载体，其包括骨架载体和权利要求1所述的核酸。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为病毒载体；

所述病毒载体选自DNA病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9。

6.根据权利要求4或5所述的重组载体，其特征在于，其骨架载体为pAAV2。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，包括顺序连接的AAV25’ITR、CMV增强子、CMV启动子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的核酸片段、标签片段、SV40信号片段、AAV2 3’ITR。

8.权利要求1所述的核酸、权利要求2或3所述的转录单元、权利要求4～7任一项所述的重组载体在制备防治线粒体功能紊乱病变的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述线粒体功能紊乱病变为视神经病变；优选的，所述视神经病变为遗传性视神经病变。

10.一种药物，其特征在于，包括：权利要求1所述的核酸、权利要求2或3所述的转录单元、权利要求4～7任一项所述的重组载体。

11.一种药物的递送方法，其特征在于，将如权利要求10所述的药物制剂注射至眼部，优选地为玻璃体腔注射。

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