CN111718947B

CN111718947B - 用于治疗ⅲa或ⅲb型粘多糖贮积症的腺相关病毒载体及用途

Info

Publication number: CN111718947B
Application number: CN202010562478.9A
Authority: CN
Inventors: 李萃; 李捧花
Original assignee: Beijing Solobio Genetechnology Co Ltd; Staidson Beijing Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Beijing Solobio Genetechnology Co Ltd; Staidson Beijing Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2040-06-18
Also published as: CN111718947A

Abstract

本发明公开了一种重组核酸分子，其包含可操作的依次连接的启动子和编码SGSH蛋白或NAGLU蛋白的核酸序列。本发明还公开了一种重组腺相关病毒，其包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含编码功能性SGSH蛋白或NAGLU蛋白的核酸序列和引导SGSH蛋白的核酸序列或NAGLU蛋白的核酸序列在宿主细胞中表达的表达控制序列。本发明还公开了所述重组腺相关病毒用于更有效地治疗ⅢA或ⅢB型粘多糖贮积症的用途。

Description

用于治疗ⅢA或ⅢB型粘多糖贮积症的腺相关病毒载体及用途

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及用于治疗ⅢA或ⅢB型粘多糖贮积症的腺相关病毒体载体及其应用。

背景技术

粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)是一类因溶酶体内相关的酸性水解酶缺乏或活性降低使酸性黏多糖(也称糖胺聚糖，GAG)无法降解或降解不完全，导致GAG及其中间代谢产物在体内堆积引起的严重致残、致死的单基因遗传性代谢病。

根据溶酶体分解酶缺陷及贮积粘多糖种类的不同，目前可将MPS分为7大型17种亚型，包括：MPSⅠ型(含ⅠH、ⅠS、ⅠH/S三种亚型)，MPSⅡ型(含ⅡA、ⅡB两种亚型)，MPSⅢ型(含ⅢA、ⅢB、ⅢC、ⅢD四种亚型)，MPSⅣ型(含ⅣA、ⅣB两种亚型)，MPSⅥ型(含ⅥA、ⅥB两种亚型)，MPSⅦ型，MPSⅨ型(含HYAL1、HYAL2、HYAL3三种亚型)。国内以MPSⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ四型较常见。除MPSⅡ型为X染色体连锁隐性遗传(XR)外，其余均为常染色体隐性遗传(AR)。

MPSⅢ型(又称Sanffilippo综合征)根据缺乏的酶的不同及成纤维细胞混合培养结果将本病分为A、B、C、D四种亚型。A型为乙酰肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)缺乏，B型为α-N-乙酰葡糖胺酶(NAGLU)缺乏，C型为N-乙酰基转移酶缺乏，D型为葡糖胺-6-硫酸酯酶缺乏。以上酶的缺乏均可引起硫酸(类)肝素(HS)在体内无法正常降解从而蓄积。

MPSⅢA是由于患者体内缺乏SGSH酶造成的疾病。MPSⅢA的症状发生于生命前几年内，其特征为严重的神经退化并导致深度智能不足、具攻击性、过动，及睡眠改变。患者渐地丧失说话、吞咽及基本动作协调的能力。除了神经方面症状，MPSⅢA患者也有非神经性的改变，包括肝脾肿大、骨骼和关节畸形，以及频繁腹泻和呼吸道感染。症状的渐进恶化造成患者在青春期间死亡。

MPSⅢB是患者体内NAGLU酶缺乏导致的疾病，所产生的症状表现为儿章期进展性神经病变。该临床过程通常可以分成3个阶段。在该疾病的第一阶段，在生命的第一个月无症状期后，精神发育变得延缓。其后在疾病的第二阶段，发生严重的行为问题和渐进性的智力下降。最后，所有的运动功能开始下降，从而逐渐导致吞咽困难、移动的完全丧失。除了神经性症状以外，MPSⅢB患者的非神经学的改变，包括复发的耳、鼻、喉和胸的感染，频繁腹泻和便秘，以及肝脏和脾肿大。患者通常在20-30岁死亡。

MPSⅢA和MPSⅢB目前尚没有有效的治疗方法，只能通过辅助治疗来控制疾病的症状，以改善患者的生存质量。治疗MPSⅢA和MPSⅢB关键是是患者体内得到足够的SGSH酶和NAGLU酶来降解积累的GAG。

在研的方法包括酶替代疗法，酶替代疗法是指为患者补充重组酶，通过蛋白的寡糖链结合细胞表面受体，介导蛋白被细胞摄取至溶酶体。酶替代疗法的缺点是，首先，不能提供足够的酶来分解患者的粘多糖，只能减少粘多糖在患者体内的积累，控制和改善病情发展。第二，目前的酶替代治疗的酶尚不能通过脑血管屏障(blood brain barrier,BBB)和骨细胞(bone cells)，对于改善中枢神经系统病变(cns pathway)和骨骼病变效果不佳。第三，大部分接受治疗的患者出现酶抗体和免疫系统反应。且患者需要终生给药，价格昂贵。

因此需要用更有效的手段来治疗MPSⅢA或MPSⅢB，基因治疗具有单次给药可以永久提供缺失酶的优点，从而使患者实现单次给药终生受益。腺相关病毒(AAV)载体因具有高转导效率和低免疫原性的优势，在基因治疗领域成为广泛应用的基因递送载体，并且多种临床数据已显示AAV病毒载体递送外源基因的有效性和安全性。因此通过AAV载体携带编码SGSH或NAGLU核酸的基因治疗是实现MPSⅢA或MPSⅢB的行之有效的方法。虽然目前国际上有些MPSⅢA或MPSⅢB基因治疗药物已上临床，但仍存在诸多不足，如AAV载体递送至中枢神经系统效率不高，启动子表达水平弱等。目前尚未有相关基因治疗药物上市，国内相关基因治疗药物研究甚少。

基于以上问题，我国迫切需要开发出关于MPSⅢA和MPSⅢB新的更有效的基因治疗药物。

发明内容

基于以上现有技术缺陷，本发明提供了更高效的基因治疗药物，候选药物用单链腺相关病毒载体携带正常的SGSH或NAGLU基因进入脑室，同时选择了一个高效的启动子对上述基因进行表达，产生适应体内环境的正常SGSH或NAGLU蛋白。

在一方面，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含可操作的依次连接本发明的高效启动子、和编码SGSH蛋白或NAGLU蛋白的核酸序列。其中所述高效启动子为CAG启动子，其序列如SEQ ID NO:5所示。

在一方面，本发明提供了一种重组载体，其包含本文所述的重组核酸分子。

在另一方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包括AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含AAV反向末端重复(ITR)、编码乙酰肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)或α-N-乙酰葡糖胺酶(NAGLU)蛋白的核酸序列与引导SGSH或NAGLU在宿主细胞中高效表达的表达控制序列。

在某些实施方案中，腺相关病毒载体(AAV)是单链腺相关病毒(ssAAV)。

在某些实施方案中，腺相关病毒载体(AAV)是重组的AAV2/9腺相关病毒。

在另一方面，本发明涉及适于脑室内施用于动物受试者的具有AAV衣壳的重组腺相关病毒(rAAV)，所述AAV衣壳内包封含有AAV ITR(反向末端重复)及受调节元件控制的编码SGSH或NAGLU的核酸，所述调节元件引导SGSH或NAGLU在宿主细胞中高效表达(“rAAV.SGSH”或“rAAV.NAGLU”)。此类rAAV.SGSH或rAAV.NAGLU是复制缺陷型的，并有利地可用于将SGSH或NAGLU递送至诊断患有SGSH或NAGLU缺陷的受试者的CNS；特别是诊断患有MPSⅢA或MPSⅢB的人受试者。在一个优选实施方案中，本发明的rAAV.SGSH或rAAV.NAGLU未被可能存在于待治疗的受试者中的AAV9衣壳的抗血清中和。在某些实施方案中，该核酸序列为SEQ ID NO:6或与其共享至少95％同一性的序列；在某些实施方案中，该核酸序列为SEQ ID NO:7或与其共享至少95％同一性的序列。

在某些实施方案中，编码该SGSH蛋白的核酸序列是SEQ ID NO:1，或与其共享至少70％同一性的序列；编码NAGLU的核酸序列是SEQ ID NO:3，或与其共享至少70％同一性的序列。其中所述编码人SGSH或NAGLU的核酸序列也可以是密码子优化的。

在另一方面，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其包含本文中所述的重组载体或重组腺相关病毒。

在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包括药学上可接受的载体和如本文中所述的重组腺相关病毒(rAAV)。

在另一方面，本发明提供了本文中所述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒(rAAV)、宿主细胞和/或药物组合物在制备用于预防或治疗ⅢA型或ⅢB型粘多糖贮积症的药物中的用途。

在又一方面，本发明提供了在受试者中治疗ⅢA型或ⅢB型粘多糖贮积症的方法。该方法包括向需要其的受试者施用如本文中所述的药物组合物。

本发明提供一种更有效地地用于治疗脊髓性肌萎缩的重组腺相关病毒。

本发明的积极效果在于：

本发明提供的重组核酸分子或重组腺相关病毒所采用的启动子可以调控SGSH或NAGLU更高效的表达，相比起现有技术中的CAG启动子，可以更有效地治疗ⅢA型或ⅢB型粘多糖贮积症。

下面结合附图和具体实施方式对本公开做进一步说明，并非对本公开的限制。凡是依照本专利申请公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本专利的保护范围。

附图说明

图1示出了scAAV2/9系统介导绿色荧光蛋白报告基因的表达。

图2示出了候选药物目的基因表达情况，其中图2a表示SGSH的表达，图2b表示NAGLU的表达。

图3示出了候选药物目的基因mRNA转录水平，其中图3a表示SGSH mRNA转录水平，图3b表示NAGLU mRNA转录水平。

图4示出了候选药物体外酶活检测结果，其中图4a表示SGSH酶活检测结果，图4b表示NAGLU酶活检测结果。

图5示出了ssAAV2/9-CAG-EGFP经尾静脉、颞浅静脉、脑室三种注射方式注射小鼠后在肝脏和大脑组织中分布的Q-PCR检测结果，其中图5A在肝脏中Q-PCR检测结果，图5B表示在大脑中Q-PCR检测结果。

图6示出了ssAAV2/9-CAG-SGSH药物经脑室注射MPSⅢA模型小鼠后，在大脑和肝脏组织中SGSH酶活和GAG含量检测结果。

图7示出了ssAAV2/9-CAG-NAGLU药物经脑室注射MPSⅢB模型小鼠后，在大脑和肝脏组织中NAGLU酶活和GAG含量检测结果。

图8示出了ssAAV2/9-CAG-SGSH药物经脑室注射MPSⅢA模型小鼠、ssAAV2/9-CAG-NAGLU经脑室注射MPSⅢB模型小鼠后，免疫组化检测大脑中LIMP2表达。

图9示出了ssAAV2/9-CAG-SGSH药物经脑室注射MPSⅢA模型小鼠、ssAAV2/9-CAG-NAGLU经脑室注射MPSⅢB模型小鼠后，免疫组化检测大脑中BSI-B4表达。

具体实施方式

Ⅰ.定义

除非另外指出，本发明的实践将采用本领域技术中的常规化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的方法。这样的技术在文献中有充分解释(参见例如FundamentalVirology，第二版，vol.I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；Handbook ofExperimentalImmunology，VoIs.I-FV(D.M.Weir和CC.Blackwell编，BlackwellScientificPublications)；T.E.Creighton，Proteins:Structures and MolecularProperties(W.H.Freeman和Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(WorthPublishers,Inc.，current addition)；Sambrook,等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，AcademicPress,Inc.)。

为了便于理解本公开内容的各个实施方案，提供了特定术语的以下解释：

腺相关病毒(AAV)：感染人和其他一些灵长类物种的小的复制缺陷性无包膜病毒。已知AAV不造成疾病并且引起非常轻微的免疫应答。使用AAV的基因疗法载体可以感染分裂细胞和静止期细胞，并且可以保持染色体外状态而不整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使得AAV成为用于基因疗法的有吸引力的病毒载体。

给药/给予：通过有效的途径向受试者提供或给予药剂，例如治疗剂(例如，重组AAV)。示例性给药途径包括但不限于注射(例如，皮下、肌内、真皮内、腹膜内和静脉内)、口服、导管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。

密码子优化的：“密码子优化的”核酸是指已经被改变以使得密码子最适于特定系统(例如，特定物种或物种的组)中的表达的核酸序列。例如，核酸序列可以优化用于在哺乳动物细胞或特定哺乳动物物种(例如人细胞)中表达。密码子优化不改变所编码蛋白质的氨基酸序列。

增强子：通过提高启动子的活性来提高转录速率的核酸序列。

反向末端重复(ITR)：有效复制所需的腺相关病毒基因组中的对称核酸序列。ITR序列位于AAV DNA基因组的每一端。ITR充当病毒DNA合成的复制起点，并且是产生AAV整合型载体的必要的顺式元件。

分离的：“分离的”生物组分(例如，核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)已经被从其中所述组分天然存在的生物体的细胞或组织中或者生物体本身中的其他生物组分(例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞)中基本上分离或纯化。已经“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的那些。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子和蛋白质。

可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列被放置为具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且当有必要连接两个蛋白质编码区时，其在相同阅读框中。

可药用载体：本公开内容中可以使用的可药用载体(溶剂(vehicle))是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,MackPublishing Co.,Easton,PA,15th Edition(1975)描述了适合一种或更多种治疗性化合物、分子或试剂的药物递送的组合物和制剂。

通常，载体的性质取决于所使用的特定给药方式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射流体，其包括药学和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖、甘油等作为溶剂。对于固体组合物(例如，粉末剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，可以包含常规无毒固体载体，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体外，待给予的药物组合物还可以包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯.

预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发生。“治疗”是指在疾病开始发生后改善疾病或病理病症的体征或症状的治疗性介入。“改善”是指降低疾病的体征或症状的数目或严重性。

启动子：指导/引起核酸(例如，基因)的转录的DNA区域。启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列。通常，启动子位于其转录的基因附近。启动子区域还任选地包括远端增强子或阻遏物元件，其可以位于距转录起始位点数千个碱基对远。通常而言，即便在同一区域，所选取的不同长度的启动子区域，启动基因表达的效率都不相同。

重组：重组核酸分子是指这样的核酸分子，其具有非天然存在的序列，或者具有通过两个序列片段的人为组合(否则地话，其将是分开的)制备的序列。这种人为组合可以通过化学合成或者通过分离的核酸分子片段的人为操作(如通过基因工程技术)实现。

同样地，重组病毒是包含非天然存在的序列或通过至少两个不同来源的序列的人为组合制备的序列的病毒。术语“重组”还包括仅通过天然核酸分子、蛋白质或病毒的一部分的添加、置换或缺失改变的核酸、蛋白质和病毒。本文使用的“重组AAV”是指其中包装有重组核酸分子(例如，编码G6Pase-α的重组核酸分子)的AAV颗粒。

血清型：通过抗原的特征组区分的一类密切相关的微生物(例如，病毒)。

受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的类别。

合成：通过人工手段在实验室产生，例如合成核酸可以在实验室化学合成。

治疗有效量：足以在用试剂治疗的受试者或者细胞中取得所需效果的特定药物或治疗试剂(例如重组AAV)的量。试剂的有效量取决于多种因素，包括但不限于被治疗的受试者或细胞，以及治疗性组合物的给药方式。

载体：载体是允许插入外源核酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或更多种选择性标记基因和其他遗传元件。表达载体是包含必要的调控序列以允许插入的基因转录和翻译的载体。在本文的一些实施方案中，载体是AAV载体。序列同一性：两个或更多个核酸序列之间或者两个或更多个氨基酸序列之间的同一性或相似性是根据序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以根据百分比同一性测量；百分比越高，序列越相同。序列相似性可以根据百分比相似性测量(考虑保守性氨基酸置换)；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高的序列同一性/相似性程度。与来自相关性更远的物种(例如，人和线虫(C.elegans)序列)相比，当直系同源蛋白质或cDNA来自更紧密相关的物种(例如，人和小鼠序列)时，这种同源性更显著。

序列同一性比较的长度可在基因组的全长上，基因编码序列的全长，或至少大约500至5000个核苷酸的片段是期望的。但是，在较小片段(例如具有至少大约9个核苷酸，通常至少大约20至24个核苷酸、至少大约28至32个核苷酸、至少大约36或更多个核苷酸)中的同一性也可以是期望的。

可在全长的蛋白、多肽、大约32个氨基酸、大约330个氨基酸或其肽片段或相应的核酸序列编码序列上容易地测定氨基酸序列的百分比同一性。合适的氨基酸片段的长度可以为至少大约8个氨基酸，并可以为至最多大约700个氨基酸。通常，当提到两种不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，参照“比对”序列确定“同一性”、“同源性”或“相似性”。“比对”序列或“比对”是指多个核酸序列或蛋白(氨基酸)序列，其通常含有与参考序列相比缺失或额外的碱基或氨基酸的校正。

使用任何公共或市售可得的多序列比对程序来进行比对。序列比对程序可用于氨基酸序列，例如“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。通常，这些程序中的任一种以默认设置使用，尽管本领域技术人员可以按需改变这些设置。或者，本领域技术人员可以采用至少提供如参考算法或程序所提供的同一性或比对水平的另一算法或计算机程序。参见例如J.D.Thomson等人,Nucl.Acids.Res.,“Acomprehensive comparison of multiple sequence alignments”,27(13):2682-2690(1999)。

多序列比对程序还可用于核酸序列。此类程序的实例包括“Clustal W”、“CAPSequence Assembly”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”，其可以通过互联网上的Web服务器来访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。或者，还使用Vector NTI应用程序。还存在许多可用于测量核苷酸序列同一性的本领域已知的算法，包括在上述程序中包含的那些。作为另一实例，可以使用Fasta^TM(GCG Version 6.1中的一个程序)来比较多核苷酸序列。Fasta^TM提供了询问与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。例如，可以使用Fasta^TM以其在GCG Version 6.1(经此引用并入本文)中提供的默认参数(字长为6，和用于打分矩阵的NOPAM因子)来确定核酸序列之间的百分比序列同一性。

在一方面，提供了编码功能性SGSH和NAGLU蛋白的编码序列。各种SGSH和NAGLU分子的核苷酸和氨基酸序列是已知的，在NCBI中可以查到。在一个实施方案中，功能性SGSH的编码多核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的序列或与其共享95％同一性的序列。在另一个实施方案中NAGLU的编码多核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的序列或与其共享95％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了修饰的hSGSH或hNAGLU编码序列。优选地，修饰的hSGSH或hNAGLU编码序列与全长天然hSGSH或hNAGLU编码序列具有小于大约80％的同一性，优选大约75％或更小的同一性。在一个实施方案中，修饰的hSGSH或hNAGLU编码序列的特征在于在AAV介导的递送之后与天然hSGSH或hNAGLU相比改进的翻译速率。在一个实施方案中，修饰的hSGSH或hNAGLU编码序列与全长天然hSGSH或hNAGLU编码序列共享小于大约80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或更小的同一性。

在一个实施方案中，修饰的hSGSH或hNAGLU编码序列是密码子优化的序列，针对受试物种中的表达而进行了优化。本文中所用的“受试者”是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人灵长类，如猴子、黑猩猩、狒狒或大猩猩。在一个优选实施方案中，该受试者是人。在一个实施方案中，该序列经密码子优化用于在人内表达。

密码子优化的编码区可以通过各种不同的方法来设计。可以使用可在线获得的方法(例如GeneArt)、公开的方法、或提供密码子优化服务的公司，例如DNA2.0(Menlo Park,CA)来进行这种优化。例如，在美国国际专利公开号WO 2015/012924中描述了一种密码子优化方法，其经此引用全文并入本文。还参见例如美国专利公开号2014/0032186和美国专利公开号2006/0136184。适当地，修改该产品的开放阅读框(ORF)的整个长度。但是，在一些实施方案中，可以仅改变ORF的片段。通过使用这些方法中的一种，可以对任意给定的多肽序列施加所述频率，并生产编码该多肽的密码子优化的编码区的核酸片段。

许多选择可用于对密码子进行实际改变或用于合成如本文中所述设计的密码子优化的编码区。可以使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规的分子生物学操作来进行此类修饰或合成。在一种方法中，通过标准方法合成了各自长度为80-90个核苷酸并跨越所需序列长度的一系列互补寡核苷酸对。合成这些寡核苷酸对，使得它们在退火时形成含有粘性末端的80-90个碱基对的双链片段，例如合成该对中的各寡核苷酸以超出与该对中另一寡核苷酸互补的区域延伸3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。各寡核苷酸对的单链末端被设计为与另一寡核苷酸对的单链末端退火。使该寡核苷酸对退火，并随后使这些双链片段中的大约五至六个经由粘性单链末端一起退火，和随后它们连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如可获自Invitrogen Corporation,Carlsbad,Calif的

载体。随后通过标准方法对该构建体进行测序。制备数个由连接在一起的5至6个80至90个碱基对的片段(即大约500个碱基对的片段)组成的这些构建体，以使整个所需序列显示为一系列的质粒构建体。随后用适当的限制酶切割这些质粒的插入物，并连接在一起以形成最终构建体。最终构建体随后克隆到标准细菌克隆载体中，并进行测序。另外的方法对本领域技术人员会是显而易见的。此外，基因合成容易购得。

在一个实施方案中，将本文中描述的hSGSH或hNAGLU基因工程化为可用于生成病毒载体和/或递送至宿主细胞的合适的遗传元件(载体)，例如裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、游离基因等等，其传送在其上携带的hSGSH或hNAGLU序列。所选载体可以通过任何合适的方法来递送，包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包覆小球、病毒感染和原生质体融合。用于制造此类构建体的方法是核酸操作领域技术人员已知的，并包括基因工程、重组工程和合成技术。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY。

在一方面，提供了包含该hSGSH或hNAGLU核酸序列的表达盒。本文中所用的“表达盒”是指包含启动子hSGSH或hNAGLU序列的核酸分子，并为此可以包括其它调节序列，该盒可以包装到病毒载体(例如病毒粒子)的衣壳中。通常，用于生成病毒载体的此类表达盒含有本文中描述的hSGSH或hNAGLU序列，其侧接病毒基因组的包装信号，以及其它表达控制序列，如本文中描述的那些。例如，对于AAV病毒载体而言，包装信号是5’反向末端重复(ITR)和3’ITR。当包装到AAV衣壳中时，与该表达盒结合的ITRs在本文中被称为“重组AAV(rAAV)基因组”或“载体基因组”。

由此，在一方面，提供了腺相关病毒载体，其包含AAV衣壳和至少一种表达盒，其中所述至少一种表达盒包含编码SGSH或NAGLU的核酸序列和引导SGSH或NAGLU序列在宿主细胞中表达的表达控制序列。该AAV载体还包含AAV ITR序列。在一个实施方案中，该ITRs来自于与提供衣壳的不同的AAV。在一个优选实施方案中，该ITR序列来自AAV2，或其缺失版本(ΔITR)，其可能因方便起见而使用并加速调节许可(regulatory approval)。但是，可以选择来自其它AAV源的ITR。当ITR的源是来自AAV2且AAV衣壳来自另一AAV源时，所得载体可以被称为是假型的。通常，AAV载体基因组包含AAV 5’ITR(hSGSH或hNAGLU编码序列和任何调节序列)以及AAV 3’ITR。但是，这些元件的其它构造可能是合适的。已经描述了其中缺失D-序列和末端解析位点(trs)的5’ITR的缩短版本(称为ΔITR)。在一些实施方案中，使用全长AAV 5’和3’ITRs。

在一方面，提供了一种构建体，其是可用于生成病毒载体的DNA分子(例如质粒)。该构建体所含元件包括本发明的CAG启动子(SEQ ID NO：5)，hSGSH(SEQ ID NO：1)或hNAGLU(SEQ ID NO:3)，以及bGHpolyA元件。

在一方面，提供了一种构建体，其是可用于生成病毒载体的DNA分子(例如质粒)。含有所需载体元件的说明性质粒包含如SEQ ID NO:6或7所示的多核苷酸序列。该SEQ IDNO:6所示的多核苷酸序列包含以下的核酸序列：CAG启动子(SEQ ID NO:6的nt 1-941)，hSGSH(SEQ ID NO:6的nt 954-2462，共计1509bp)，牛生长激素(bGH)基因的多聚腺苷酸(polyA)(SEQ ID NO:6的nt 2481-2711)。该SEQ ID NO:7所示的多核苷酸序列包含以下的核酸序列：CAG启动子(SEQ ID NO:7的nt 1-941)，hNAGLU(SEQ ID NO:7的nt 954-3185，共计2232bp)，牛生长激素(bGH)基因的多聚腺苷酸(polyA)(SEQ ID NO:7的nt 3192-3422)。

使用本文中所述的其它合成hSGSH或hNAGLU编码序列和本文中所述的其它表达控制元件可以生成其它表达盒。

该表达盒通常含有启动子序列作为表达控制序列的一部分，例如位于所选5’ITR序列与该hSGSH或hNAGLU编码序列之间。本文中描述的载体使用CAG启动子。

除了启动子之外，表达盒和/或载体可以含有一种或多种其它合适的转录起始、终止、增强子序列、有效RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列，例如WPRE；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时，增强编码产物分泌的序列。合适的polyA序列的实例包括例如SV40、SV50、牛生长激素(bGH)、人生长激素和合成polyA。合适的增强子的一个实例是CMV增强子。其它合适的增强子包括适于CNS指示的那些。在一个实施方案中，该表达盒包含一种或多种表达增强子。在一个实施方案中，该表达盒含有两种或更多种表达增强子。这些增强子可以是相同的，或可以彼此不同。例如，增强子可以包括CMV即时早期增强子。这种增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。或者，该增强子的双拷贝可以通过一个或多个序列分隔。在又一实施方案中，该表达盒进一步含有内含子，例如鸡β肌动蛋白内含子。其它合适的内含子包括本领域中已知的那些，例如描述在WO 2011/126808中。任选地，可以选择一种或多种序列以稳定mRNA。此类序列的一个实例是修饰的WPRE序列，其可以在该polyA序列的上游和该编码序列的下游工程化[参见例如MA Zanta-Boussif等人,Gene Therapy(2009)16:605-619]。

这些控制序列“可操作地连接”到hSGSH或hNAGLU基因序列上。本文中所用的术语“可操作地连接”是指与相关基因邻接的表达控制序列和以反式或在一定距离上起作用以控制相关基因的表达控制序列两者。

腺相关病毒(AAV)病毒载体是用于递送至靶细胞的具有核酸序列包装至其中的AAV蛋白衣壳的AAV DNase抗性粒子。AAV衣壳由60个衣壳(帽)蛋白亚基VP1、VP2和VP3组成，其根据所选AAV以大约1:1:10至1:1:20的比以二十面体对称排列。该AAV衣壳可以选自本领域已知的那些，包括其变体。在一个实施方案中，该AAV衣壳选自有效转导神经元细胞的那些。在一个实施方案中，该AAV衣壳选自AAV1、AAV2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV5、AAVhu.11、AAV8DJ、AAVhu.32、AAVhu.37、AAVpi.2、AAVrh.8、AAVhu.48R3及其变体。参见Royo等人,Brain Res,2008年1月,1190:15-22；Petrosyan等人,Gene Therapy,2014年12月,21(12):991-1000；Holehonnur等人,BMC Neuroscience,2014,15:28；以及Cearley等人,MolTher.2008年10月,16(10):1710–1718，其各自经此引用并入本文。本文中可用的其它AAV衣壳包括AAVrh.39、AAVrh.20、AAVrh.25、AAV10、AAVbb.1和AAV bb.2及其变体。作为AAV病毒载体(DNase抗性病毒粒子)的衣壳的源，可以选择其它AAV血清型，包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8、rh.10、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV。参见例如美国公开专利申请号2007-0036760-A1；美国公开专利申请号2009-0197338-A1；EP 1310571。还参见WO 2003/042397(AAV7和其它猿猴AAV)、美国专利7790449和美国专利7282199(AAV8)、WO2005/033321和US7,906,111(AAV9)、以及WO 2006/110689和WO 2003/042397(rh.10)。或者，基于任何所述AAV的重组AAV可以用作AAV衣壳的源。这些文献还描述了可以选择用于生成AAV的其它AAV，并经此引用并入。在一些实施方案中，用于该病毒载体的AAV帽可以通过前述AAV帽之一或其编码核酸的诱变(即通过插入、缺失或取代)来产生。在一些实施方案中，该AAV衣壳是嵌合的，包含来自两种或三种或四种或更多种前述AAV衣壳蛋白的结构域。在一些实施方案中，该AAV衣壳是来自两种或三种不同的AAV或重组AAV的Vpl、Vp2和Vp3单体的嵌合体。在一些实施方案中，rAAV组合物包含超过一种的前述帽。如本文中所用，关于AAV，术语变体是指衍生自已知AAV序列的任何AAV序列，包括在氨基酸或核酸序列上共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更大的序列同一性的那些。在另一实施方案中，该AAV衣壳包括与任何所述或已知AAV衣壳序列包含至最多大约10％变异的变体。也就是说，该AAV衣壳与本文中提供的和/或本领域已知的AAV衣壳共享大约90％的同一性至大约99.9％的同一性、大约95％至大约99％的同一性、或大约97％至大约98％的同一性。在一个实施方案中，该AAV衣壳与AAV衣壳共享至少95％的同一性。当确定AAV衣壳的百分比同一性时，可以对任何可变蛋白(例如vp1、vp2或vp3)进行该比较。在一个实施方案中，该AAV衣壳与AAV8 vp3共享至少95％的同一性。在另一实施方案中，使用自身互补型AAV。

在一个实施方案中，该衣壳是AAV9衣壳或其变体。

在一个实施方案中，提供了单链AAV(ssAAV)。

生成和分离适于递送至受试者的AAV病毒载体的方法在本领域中是已知的。参见例如美国公开专利申请号2007/0036760(2007年2月15日)；美国专利7790449；美国专利7282199；WO 2003/042397；WO 2005/033321；WO 2006/110689和US 7588772B2。在一种系统中，用编码侧接ITR的转基因的构建体和编码rep与cap的构建体瞬时转染生产细胞系。在第二系统中，用编码侧接ITR的转基因的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的包装细胞系。在各自这些系统中，AAV病毒体响应于感染辅助腺病毒或疱疹病毒而产生，其中需要从污染病毒中分离rAAV。近来，开发了不需要用辅助病毒感染以回收AAV的系统，由该系统以反式还提供了所需辅助功能(即腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29以及疱疹病毒聚合酶)。在这些较新的系统中，辅助功能可以通过用编码所需辅助功能的构建体瞬时转染该细胞来提供，或者该细胞可以被工程化以稳定含有编码该辅助功能的基因，其表达可以以转录水平或转录后水平来控制。在又一种系统中，通过用基于杆状病毒的载体感染将侧接ITR的转基因和rep/cap基因引入到昆虫细胞中。对于这些生产系统的概述，通常参见例如Zhang等人,2009,“Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production”,Human Gene Therapy 20:922-929，其各自的内容经此引用全文并入本文。制造和使用这些和其它AAV生产系统的方法还描述在下列美国专利中，其各自的内容经此引用全文并入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823和7,439,065。

任选地，本文中所述的hSGSH或NAGLU基因可用于产生除rAAV之外的病毒载体。此类其它病毒载体可以包括适于可采用的基因疗法的任何病毒，包括但不限于腺病毒；疱疹病毒；慢病毒；逆转录病毒等等。合适地，当产生这些其它载体中的一种时，其作为复制缺陷型病毒载体产生。

“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指合成或人工病毒粒子，其中含有相关基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中，其中也包装在该病毒衣壳或包膜中的任何病毒基因组序列是复制缺陷的；即它们不能产生子代病毒体，但是保留了感染靶细胞的能力。在一个实施方案中，该病毒载体的基因组不包括编码复制所需的酶的基因(该基因组可以被工程化为仅含有侧接扩增和包装人工基因组所需信号的相关转基因)，但是这些基因可以在生产过程中提供。因此，其被认为对用于基因疗法是安全的，因为除了在复制所需病毒酶的存在下，复制和被子代病毒体感染不会发生。此类复制缺陷型病毒可以是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒(整合或非整合)或另一合适的病毒源。

本文中还提供的是药物组合物。本文中描述的药物组合物设计为通过任何合适的途径或不同途径的组合递送至需要其的受试者。在一个实施方案中，该组合物经由脑室内病毒注射来递送。在一个实施方案中，需要直接递送至CNS并可经由鞘内注射来进行。术语“鞘内施用”是指靶向脑脊液(CSF)的递送。这可以通过直接注射到脑室或腰椎CSF中、通过枕下穿刺或通过其它合适的方法来完成。在另一实施方案中，该组合物经由腰椎注射来递送。

通常，这些递送方法被设计为避免直接全身递送含有本文中所述的AAV组合物的悬浮液。合适地，这可以具有与全身施用相比减少剂量、降低毒性和/或减少对AAV和/或转基因产物的不期望的免疫反应的益处。

或者，可以选择其它施用途径(例如口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内和其它肠胃外(parental)途径)。

本文中描述的hSGSH或hNAGLU递送构建体可以以单一组合物或多种组合物递送。任选地，可以递送两种或多种不同的AAV[参见例如WO 2011/126808和WO 2013/049493]。在另一实施方案中，此类多种病毒可以含有不同的复制缺陷型病毒(例如AAV、腺病毒和/或慢病毒)。或者，可以通过非病毒构建体，例如“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA来介导递送；与各种递送组合物和纳米粒子结合，包括例如胶束、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、聚多糖(poly-glycan)组合物和其它聚合物、基于脂质和/或胆固醇-核酸缀合物，以及如本文中所述的其它构建体。参见例如X.Su等人,Mol.Pharmaceutics,2011,8(3),第774-787页；网络出版:2011年3月21日；WO2013/182683、WO 2010/053572和WO 2012/170930，其均经此引用并入本文，此类非病毒hSGSH或hNAGLU递送构建体可以通过前述途径施用。

该病毒载体，或非病毒DNA或RNA转移部分，可以用生理可接受载体配制以用于基因转移和基因疗法应用。可以选择多种合适的纯化方法。描述适于从载体粒子中分离空衣壳的纯化方法的实例，例如2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/65976及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,098和2015年12月11日提交的且题为“Scalable Purification Method for AAV8”的美国专利申请号62/266,341中描述的方法，其经此引用并入本文。还参见以下文献中描述的纯化方法：2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/65974，及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,083，和2015年12月11日提交的62/266,351(AAV1)；2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/66013，及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国临时申请号62/322,055和2015年12月11日提交的62/266,347(AAVrh10)；和2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/65970，及其优先权申请美国临时申请号62/266,357和62/266,357(AAV9)，其经此引用并入本文。简而言之，描述了两步骤纯化方案，其从rAAV生产细胞培养物的澄清浓缩上清液中选择性捕获并分离含有基因组的rAAV载体粒子。该方法利用了在高盐浓度下进行的亲和捕获方法，随后是在高pH下进行的阴离子交换树脂方法，以提供基本不含rAAV中间体的rAAV载体粒子。

在AAV病毒载体的情况下，病毒基因组(vg)的定量可以用作制剂中所含剂量的量度。以本文公开的方法施用的rAAV的剂量将根据例如特定的rAAV、施用方式、治疗目标、个体和靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域标准方法确定。剂量可以以病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别为1×10⁷vg、1×10⁸vg、1×10⁹vg、1×10¹⁰vg、1×10¹¹vg、1×10¹²vg、1×10¹³vg、1×l0¹⁴vg、1×10¹⁵vg)。剂量也可以以每千克(kg)体重的病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别为1×10¹⁰vg/kg、1×10¹¹vg/kg、1×10¹²vg/kg、1×10¹³vg/kg、1×10¹⁴vg/kg、1×10¹⁵vg/kg)。滴定AAV的方法描述于Clark等人《人类基因治疗(Hum.GeneTher.)》1999年；10:1031-1039。

这些上述剂量可以在各种体积的载体、赋形剂或缓冲剂制剂中施用，所述体积在大约25至大约1000μL的范围内，包括该范围内的所有数字，取决于待处理的区域的尺寸、所用病毒滴度、施用途径和该方法的预期效果。在一个实施方案中，载体、赋形剂或缓冲剂的体积为至少大约25μL。在一个实施方案中，该体积为大约50μL。在另一实施方案中，该体积为大约75μL。在另一实施方案中，该体积为大约100μL。在另一实施方案中，该体积为大约125μL。在另一实施方案中，该体积为大约150μL。在另一实施方案中，该体积为大约175μL。在又一实施方案中，该体积为大约200μL。在另一实施方案中，该体积为大约225μL。在又一实施方案中，该体积为大约250μL。在又一实施方案中，该体积为大约275μL。在又一实施方案中，该体积为大约300μL。在又一实施方案中，该体积为大约325μL。在另一实施方案中，该体积为大约350μL。在另一实施方案中，该体积为大约375μL。在另一实施方案中，该体积为大约400μL。在另一实施方案中，该体积为大约450μL。在另一实施方案中，该体积为大约500μL。在另一实施方案中，该体积为大约550μL。在另一实施方案中，该体积为大约600μL。在另一实施方案中，该体积为大约650μL。在另一实施方案中，该体积为大约700μL。在另一实施方案中，该体积在大约700和1000μL之间。

在其它实施方案中，可以选择大约1μL至150mL的体积，对成人选择更高的体积。通常，对新生婴儿，合适的体积为大约0.5mL至大约10mL，对年龄较大的婴儿可以选择大约0.5mL至大约15mL。对于学步的幼儿，可以选择大约0.5mL至大约20mL的体积。对于儿童，可以选择至最高大约30mL的体积。对于青春期前和青春期的儿童，可以选择至最高大约50mL的体积。在又一实施方案中，患者可以接受鞘内施用，选择大约5mL至大约15mL，或大约7.5mL至大约10mL的体积。可以确定其它合适的体积和剂量。将调节该剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可以根据使用该重组载体的治疗应用而变。

上述重组载体可以根据公开的方法递送至宿主细胞。该rAAV，优选悬浮在生理相容性载体中，可以施用于人或非人哺乳动物患者。在另一实施方案中，该组合物包括载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。合适的载体可以由本领域技术人员鉴于转移病毒针对的适应症容易地选择。例如，合适的载体包括盐水，其可以用多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。其它示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。该缓冲剂/载体应包括防止rAAV附着到输注管但不会干扰rAAV体内结合活性的组分。

任选地，本发明的组合物除了rAAV与载体之外可以含有其它常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯类、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。

本发明的组合物可以包含如上定义的药学上可接受的载体。合适地，本文中描述的组合物包含悬浮在药学上合适的载体中和/或与合适的赋形剂混合的有效量的一种或多种AAV，其设计为经由注射、渗透泵、鞘内导管递送至受试者，或通过另一装置或途径递送。在一个实例中，该组合物配制用于鞘内递送。在一个实施方案中，鞘内注射包括注入椎管，例如蛛网膜下隙。

本文中描述的病毒载体可用于制备药物以便将hSGSH或hNAGLU递送至需要其的受试者(例如人患者)、向受试者提供功能性SGSH/NAGLU和/或治疗MPSⅢA/MPSⅢB。治疗过程可以任选包括重复施用相同的病毒载体(例如AAV9载体)或不同的病毒载体(例如AAV9和AAV10)。仍可以使用本文中描述的病毒载体和非病毒递送系统选择其它组合。

本文中描述的hSGSH cDNA序列或hNAGLU cDNA序列可以使用本领域中熟知的技术体内合成产生。例如，可以采用长DNA序列方法的基于PCR的精确合成(PAS)，如Xiong等人,PCR-basedaccurate synthesis of long DNA sequences,Nature Protocols 1,791-797(2006)所述。由Young和Dong描述了结合双不对称PCR和重叠延伸PCR法的方法，Two-steptotalgene synthesis method,Nucleic Acids Res.2004；32(7):e59。还参见Gordeeva等人,J Microbiol Methods.Improved PCR-based gene synthesis method anditsapplication to the Citrobacter freundii phytase gene codonmodification.2010年5月；81(2):147-52.Epub 2010年3月10日；还参见关于寡核苷酸合成和基因合成的以下专利，Gene Seq.2012年4月；6(1):10-21；US8008005和US 7985565。这些文献各自经此引用并入本文。此外，经由PCR生成DNA的试剂盒与方案是市售可得的。这些包括使用聚合酶，包括但不限于Taq聚合酶；

(New England Biolabs)；

High-Fidelity DNA聚合酶(New England Biolabs)；和

G2聚合酶(Promega)。还可以由用含有本文中所述的hSGSH或hNAGLU序列的质粒转染的细胞生成DNA。试剂盒和方案是已知和市售可得的，并包括但不限于QIAGEN质粒试剂盒；

Pro Filter质粒试剂盒(Invitrogen)；和GenElute^TM质粒试剂盒(Sigma Aldrich)。在本文中可用的其它技术包括序列特异性等温扩增方法，其消除了对热循环的需要。这些方法通常使用链置换DNA聚合酶如Bst DNA聚合酶、大片段(Large Fragment)(New England Biolabs)而非加热来分离双链体DNA。DNA还可以经由使用逆转录酶(RT)通过扩增由RNA分子生成，所述逆转录酶是RNA依赖性DNA聚合酶。RT聚合与原始RNA模板互补的DNA链，并被称为cDNA。这种cDNA随后可以通过PCR或如上所述的等温法进一步扩增。定制DNA也可以经商业途径由公司生成，所述公司包括但不限于GenScript；

(Life Technologies)和IntegratedDNATechnologies。

术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并包括生产RNA或RNA和蛋白。就RNA而言，术语“表达”或“翻译”特别涉及生产肽或蛋白。表达可以是瞬时的，或可以是稳定的。

在本发明上下文中的术语“翻译”涉及在核糖体处的过程，其中mRNA链控制氨基酸序列的组装以生成蛋白或肽。

术语“有效量”是指足以达到预期目的的物质的量。例如增加NAGLU活性的AAV9载体的有效量为足以减少糖胺聚糖累积的量。治疗疾病或紊乱的表达载体的“治疗有效量’为足以减轻或根除疾病或紊乱的迹象或症状的表达载体的量。给定物质的有效量将随着诸如物质的本性、给药的途径、受试者年龄、以及给予所述的物质的目的之类的因素而改变。在各种个体情况下的有效量可以由技术人员根据本领域建立的方法凭经验确定。

通过本文描述的方法或组合物治疗的受试者包括成人(18岁或更大)和儿童(小于18岁)。儿童的年龄范围为1-2岁、或2-4岁、4-6岁、6-18岁、8-10岁、10-12岁、12-15岁和15-18岁。儿童也包括婴儿。婴儿的年龄通常为1-12个月。

在另一实施方案中，该构建体在晚些时候重新施用。任选地，允许超过一次的重新施用。此类重新施用可以具有相同类型的载体、不同的病毒载体、或经由本文中所述的非病毒递送。例如，如果用编码SGSH或NAGLU的rAAV9治疗患者，并需要二次治疗的话，可以随后施用rAAV10，并且反之亦然。

MPSⅢA或MPSⅢB患者的治疗可能需要联合疗法，如在用本发明的组合物治疗之前、期间和/或之后用免疫抑制剂瞬时共治疗。用于此类共疗法的免疫抑制剂包括但不限于类固醇、抗代谢物、T细胞抑制剂和烷化剂。例如，此类瞬时治疗可以包括以递减剂量每日一次服用类固醇(例如泼尼松(prednisole))7天，开始为大约60毫克的量，且每天减少10毫克(第7天无剂量)。可以选择其它剂量和免疫抑制剂。

“功能性hSGSH”是指编码天然SGSH蛋白的基因，如SEQ ID NO:1所示的基因，或提供乙酰肝素-N-硫酸酯酶蛋白天然存活的至少大约50％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约90％或大致相同、或超过100％的生物活性水平的另一SGSH蛋白，或其与疾病无关的天然变体或多形体。

“功能性hNAGLU”是指编码天然NAGLU蛋白的基因，如SEQ ID NO:3所示的基因，或提供α-N-乙酰葡糖胺酶蛋白天然存活的至少大约50％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约90％或大致相同、或超过100％的生物活性水平的另一SGSH蛋白，或其与疾病无关的天然变体或多形体。

在一个实施方案中，此类功能性SGSH或NAGLU具有与天然蛋白或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示基因编码的蛋白的全长序列具有大约95％或更大的同一性的序列，或在氨基酸水平与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示基因编码的蛋白具有大约97％或更大，或大约99％或更大的同一性。此类功能性SGSH或NAGLU蛋白还可以包括天然多形体。可以通过制备序列的比对并通过使用多种本领域中已知或市售可得的算法和/或计算机程序来确定该同一性[例如BLAST、ExPASy；ClustalO；FASTA；使用例如Needleman-Wunsch算法、Smith-Waterman算法]。

要注意的是，术语“一种”或“一个”是指一种(个)或多种(个)。由此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可互换使用。

词语“包含(comprise、comprises和comprising)”应解释为包含性的而非排他性的。词语“组成(consist、consisting)”及其变体应解释为排他性的而非包含性的。虽然说明书中的各种实施方案出现使用“包含”的语言，但是在其它情况下，相关实施方案也意在使用“由……组成”或“基本由……组成”的语言来解释和描述。

本文中所用的术语“大约”是指与给定的参考值相差10％(±10％)，除非另行规定。

本文中所用的“疾病”、“障碍”和“病症”可互换使用，以指示受试者体内的异常状态。

除非在本说明书中另行定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员，并且通过参照公开文本通常理解的相同的含义，其向本领域技术人员提供了对许多本申请中使用的术语的一般指导。

II.具体实施方式

在一方面，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含可操作连接的启动子、编码功能性SGSH或NAGLU的核酸序列。

优选地，所述启动子是CAG启动子，其序列如SEQ ID NO:5所示。

优选地，所述编码功能性SGSH或NAGLU的核酸序列具有选自以下的多核苷酸序列：

1)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示多核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或

3)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO：3具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列；

更优选地，所述多核苷酸序列是密码子优化的序列。

优选地，所述核酸分子还包含多聚腺苷酸、Kozak序列、WPRE和转录后调节元件中的一种或多种。

优选地，所述重组核酸分子具有选自以下的多核苷酸序列：

1)SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示多核苷酸序列；

2)SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或

3)与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列。

优选地，所述重组核酸分子还包含AAV反向末端重复序列；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自不同血清型的AAV；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自进化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其杂交/嵌合型中的任意一个；更优选地，所述AAV反向末端重复序列来自AAV2型。

在一方面，本发明提供了一种重组载体，其包含前述的重组核酸分子。其中所述重组载体选自质粒载体、噬菌体载体和病毒载体组，其中病毒载体组选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体和杂合病毒载体组。

在一方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒，其包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含AAV反向末端重复、编码SGSH蛋白或NAGLU的核酸序列和引导SGSH或NAGLU在宿主细胞中表达的表达控制序列；优选地，所述腺相关病毒优选AAV2/9。

在一方面，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其包含前述的重组核酸分子、重组载体或重组腺相关病毒。

在一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含前述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒和/或宿主细胞以及药学上可接受的赋形剂；优选地，其被配制用于脑室内给药。

在一方面，本发明提供了前述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/药物组合物在制备用于预防或治疗MPSⅢA或MPAⅢB的药物中的用途。

根据前一方面的用途，其中所述重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以与另一疗法结合施用。

根据前一方面的用途，其中，所述重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以以大约1×10⁶vg/kg至大约1×10¹⁸vg/kg的剂量施用；优选地，所述重组腺相关病毒可以以大约5×10¹²vg/kg的剂量施用；优选地，所述重组腺相关病毒可以以大约5×10¹¹vg/kg的剂量施用；优选地，所述载体或组合物可以施用超过一次。

在一方面，本发明提供了在受试者中治疗MPSⅢA或MPSⅢB的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用前述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物。优选地，所述组合物脑室内施用；优选地，所述受试者是哺乳动物，更优选地，所述受试者是人。

下面的实施例仅仅是说明性的，而非意在限制本发明。

实施例1载体构建

利用本发明的启动子序列，根据本领域的常规方法构建病毒包装载体。

实施例2病毒包装及基因组滴度检测

本发明采用昆虫细胞SF9(购于ATCC，其编号为CRL-1711)作为生产细胞系，BestBac杆状病毒包装系统生产重组AAV病毒载体。所使用实验方法参见ExpressionSystem公司BestBac杆状病毒包装系统操作说明书。

取适量纯化AAV样品，按下表(表1)配制DNase I消化反应混合液，37℃孵育30min,75℃孵育10min，失活DNase I。

表1

AAV sample	5ul
		10×DnaseI buffer	5ul
DnaseI	1ul
		Rnase-free water	39ul
total	50ul

处理后的AAV纯化样品稀释适当的倍数后，参照下表(表2)配置Q-PCR反应体系。

表2

并按照下列程序(表3)进行检测：

表3

其中使用的引物列表如下(表4)：

表4

Forward primer(5’-3’)	GGCTGTAATTAGCGCTTGGTTT
		Reverse primer(5’-3’)	GCTTTCACGCAGCCACAGA

包装产量结果见下表(表5)：

表5

质粒名称	重组病毒名称	基因组滴度(vg/ml)
			pVL1393-CAG-SGSH	ssAAV2/9-CAG-SGSH	1.9E+13vg/ml
pVL1393-CAG-NAGLU	ssAAV2/9-CAG-NAGLU	1.5E+13vg/ml
			pVL1393-CAG-EGFP	ssAAV2/9-CAG-EGFP	3.2E+12vg/ml

实施例3候选药物体外表达及酶活检测

3.1报告基因体外表达水平检测

为了确认ssAAV2/9介导外源基因表达的效果，将包装成的ssAAV2/9-CAG-EGFP病毒分别以不同的感染复数(MOI)感染293T细胞，感染MOI分别为30000和90000，24h后检测绿色荧光表达水平，结果如图1所示，结果表明ssAAV2/9介导的绿色荧光蛋白获得较好表达，且呈剂量依赖关系。

3.2候选药物目的基因体外表达水平检测

接下来检测ssAAV2/9系统介导目的基因表达情况，将构建包装的重组病毒ssAAV2/9-CAG-SGSH和ssAAV2/9-CAG-NAGLU病毒分别以不同的MOI感染293T细胞，其中ssAAV2/9-CAG-SGSH感染293T细胞的MOI分别为3300、10000、30000、90000；ssAAV2/9-CAG-NAGLU感染293T细胞的感染指数(MOI)分别为30000和90000，病毒感染48h后，收取细胞，提取蛋白及BCA测定浓度，然后通过Western-Blot方法检测细胞中SGSH和NAGLU的蛋白表达。结果如图2所示，表明基于AAV2/9系统介导的SGSH(图2a)和NAGLU(图2b)两种目的基因均获得较好表达，且呈现一定的剂量依赖关系。

3.3候选药物目的基因体外mRNA表达水平检测

将重组病毒ssAAV2/9-CAG-SGSH和ssAAV2/9-CAG-NAGLU分别感染293T细胞，其中ssAAV2/9-CAG-SGSH的感染指数(MOI)为10000，30000，90000；ssAAV2/9-CAG-NAGLU的感染指数(MOI)为10000，90000，感染48h后，提取总的RNA，进行Real-time PCR反应。

根据总RNA浓度，将模板量统一稀释到50ng/ul，然后每管加入2ul，即模板量为100ng，GAPDH作为内参定量标准，引物序列具体见下表(表6)：

表6

每个反应体系如下表(表7)：

表7

反应体系
		2X One Step RT-PCR BufferⅢ	10ul
TakaRa Ex Taq HS(5U/ul)	0.4ul
		PrimeScript RT Enzyme Mix II	0.4ul
上游引物(10uM)	0.4ul
		下游引物(10uM)	0.4ul
TaqMan Probe	0.8ul
		总RNA	2ul(100ng)
RNase Free dH2O	5.6ul
		总体积	20ul

以上每样设3个重复，并设置3管阴性对照(RNase Free dH₂O为模板)，按以下反应程序(表8)进行反应：

表8

检测结果如图3所示，重组病毒ssAAV2/9-CAG-SGSH或/ssAAV2/9-CAG-NAGLU感染293T细胞后，目的基因SGSH(图3a)和NAGLU(图3b)的mRNA得以转录，且呈现明显的剂量依赖关系。

3.4候选药物体外酶活检测

重组病毒ssAAV2/9-SGSH或ssAAV2/9-CAG-NAGLU以感染指数(MOI)为90000感染293T细胞48h后，分别采用RIPA裂解液和反复冻融法提取总蛋白，目的蛋白SGSH和NAGLU进行酶活性检测，未处理组作为对照；其中SGSH组为两步法酶解，NAGLU组为直接酶解。具体酶解方法如下：

SGSH组：采用4-MU-αGlcNS两步底物荧光酶催测定方法，分别在96孔荧光板中加入20ul样品，再分别加入40ul浓度为5mM的4-MU-αGlcNS底物混匀，并设阴性(0.1％BSA)及空白对照(只加酶不加底物)各做2个复孔，置于37℃避光孵育17h后，从37℃取出，分别加入20ul SGSH酶活性测定反应液2(0.2M Na2HPO4/0.1M柠檬酸，PH 6.7)及10ul a-葡萄糖苷酶(用1ml 0.2％BSA溶解，BSA用去离子水配制)，置于37℃避光孵育24h，酶催化结束后，加入170ul的终止液终止反应，以不同摩尔浓度的4-甲基伞形酮标准品作为定量指标，进行荧光度数(以标准品绘制标准曲线计算不同样品酶活性值)(参见Karpova EA等人，J.Inherit.Metab.Dis,1996,19:278-285)。

NAGLU组：在96孔荧光板中加入20ul样品，再分别加入40ul浓度为0.25mM的底物4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-glucosaminide混匀，并设阴性(0.1％BSA)及空白对照(只加酶不加底物)各做2个复孔，置于37℃避光孵育1h，酶催化结束后，加入170ul的终止液终止反应，以不同摩尔浓度的4-甲基伞形酮标准品作为定量指标，进行荧光度数(以标准品绘制标准曲线计算不同样品酶活性值)(参见Li HH等人,PNAS,1999,96：14505-14510)。

SGSH和NAGLU酶活检测结果如图4所示，结果表明：SGSH(图4a)和NAGLU(图4b)这两种酶均能有效降解相应底物，与对照组相比具有显著性差异。

实施例4候选药物体内评价

4.1不同给药方式下AAV2/9-eGFP对CNS的靶向性研究

本实验将重组病毒ssAAV2/9-CAG-EGFP输送至野生型C57BL/6小鼠体内，采用静脉注射、脑室注射及颞浅静脉注射3种给药方式，然后采用Q-PCR法定性和定量评价主要脏器中EGFP的表达水平。

其中静脉注射组和颞浅静脉注射组的给药分为三个剂量组，分别为2.5×10¹⁰vg/只、2.5×10¹¹vg/只、2.5×10¹²vg/只，脑室注射组的给药剂量分别为2.5×10¹⁰vg/只、2.5×10¹¹vg/只，并设置PBS给药对照组，每个给药组的每个剂量为4只小鼠，给药4周后对小鼠进行安乐死，取材各组动物的大脑和肝脏，按照QIAGEN试剂盒标准化操作步骤提取组织基因组DNA，然后通过Q-PCR检测各组织中病毒基因组含量。

检测结果如图5A和5B所示，其中图5A表示对肝脏中的病毒基因组的检测结果，可以看出经尾静脉注射后病毒基因组在肝脏中的分布最高，经颞浅静脉注射后肝脏中病毒基因组含量居中，经脑室注射后病毒基因组在肝脏中的含量相对较低。图5B表示对大脑中的病毒基因组的检测结果，可以看出经脑室注射后病毒基因组在大脑中的含量最高，而经尾静脉和颞浅静脉注射后，大脑中病毒基因组含量极低，几乎检测不到。

综合以上结果可知，静脉给药，肝脏的基因强度良好，大脑内几乎检测不到病毒基因表达；而脑室给药，肝脏的表达量约为外周给药的1/3～1/2，大脑内表达良好。所以，综合考虑以上结果体内给药方式选择脑室注射给药。

4.2施用候选药物后检测酶活及GAG累积水平

体内实验测试给药后体内酶活及GAG累积水平，分MPSⅢA组和MPSⅢB组两个大组别。MPSⅢA组模型鼠为MPSⅢA，施用药物分别为ssAAV2/9-CAG-SGSH，ssAAV2/9-CAG2-SGSH；MPSⅢB组模型鼠为MPSⅢB，施用药物为ssAAV2/9-CAG-NAGLU，ssAAV2/9-CAG2-NAGLU。两个大组也分别增设两个未给药对照组，即野生型小鼠对照组及空白模型鼠对照组，给药方式均为脑室注射，给药剂量均为1E+10vg/只，模型鼠8周龄时给药。给药1个月后处死所有组别动物，提取肝脏和大脑组织，对组织蛋白进行提取及浓度测定，然后检测酶活和GAG累积水平，其中SGSH和NAGLU的酶活测定方法见3.4候选药物体外酶活检测中的方法。

其中对照药物重组病毒ssAAV2/9-CAG2-SGSH和ssAAV2/9-CAG2-NAGLU基因组中CAG2启动子序列，选自Genebank HG530137.1，4284至5960位置。对照药物质粒的构建及病毒包装过程同候选药物，构建以上两种对照药物的目的是为了比较本发明的CAG启动子与现有技术中的启动子对体内药效结果的影响。

GAG累积水平的检测方法参见A Blyscan sulfated glycosaminoglycan kit试剂盒(厂家为Biocolor，货号为B1000)说明书：首先采用过量木瓜蛋白酶(Papain)消化法对组织GAG进行提取，具体如下：称取组织，剪碎，之后按照20ul消化液/mg组织的比例加入消化液65℃孵育过夜，96℃孵育1min终止反应，冷却，加入6％三氯乙酸，在冰上沉淀蛋白2h后，4℃离心去除蛋白。取上清，加入4倍体积100％乙醇至上清液中，-20℃过夜放置。离心弃上清，收获沉淀的GAG，加入去离子H2O溶解后即可进行含量检测。

4.2.1 MPSⅢA组中施用候选药物后检测酶活及GAG累积水平

MPSⅢA组中SGSH酶活及GAG含量检测结果如图6所示，相对于空白模型鼠对照组，施用重组病毒ssAAV2/9-CAG-SGSH和对照药物ssAAV2/9-CAG2-SGSH的MPSⅢA模型鼠，在大脑和肝脏中SGSH酶活都得到明显提高，GAG累积水平明显降低，但从SGSH酶活提高和GAG降低水平来看，重组病毒ssAAV2/9-CAG-SGSH均比对照ssAAV2/9-CAG2-SGSH的效果好。

在大脑组织检测中，注射ssAAV2/9-CAG-SGSH药物的MPSⅢA小鼠，1个月后左脑和右脑SGSH酶活均与正常野生鼠相当，而注射对照药物ssAAV2/9-CAG2-SGSH的MPSⅢA小鼠，左脑和右脑SGSH酶活均低于野生鼠；注射ssAAV2/9-CAG-SGSH药物的MPSⅢA小鼠在1个月后GAG含量已经降到正常水平，而注射ssAAV2/9-CAG2-SGSH对照药物的MPSⅢA小鼠GAG含量虽然相对于MPSⅢA模型鼠有明显下降，但仍高于正常野生鼠。

在肝脏组织检测中，注射ssAAV2/9-CAG-SGSH药物的小鼠中，1个月后SGSH酶活已经超过野生鼠，而注射对照药物ssAAV2/9-CAG2-SGSH的小鼠，SGSH酶活仅为野生鼠的一半；注射ssAAV2/9-CAG-SGSH的小鼠，在1个月后GAG含量已降到正常水平，而注射对照药物ssAAV2/9-CAG2-SGSH的小鼠GAG含量略高于正常野生鼠。

4.2.2 MPSⅢB组中施用候选药物后检测酶活及GAG累积水平

MPSⅢB组中NAGLU酶活及GAG含量检测结果如图7所示，相对于空白模型鼠对照组，施用ssAAV2/9-CAG-NAGLU药物和ssAAV2/9-CAG2-NAGLU对照药物的MPSⅢB模型鼠，在大脑和肝脏中NAGLU酶活明显提高，GAG累积水平明显降低。但在NAGLU酶活提高和GAG降低水平上，ssAAV2/9-CAG-NAGLU药物均比ssAAV2/9-CAG2-NAGLU对照药物效果好。

在大脑组织检测中，注射ssAAV2/9-CAG-NAGLU药物和注射ssAAV2/9-CAG2-NAGLU对照药物的MPSⅢB小鼠，1个月后左脑和右脑NAGLU酶活的提高都接近并超过了野生鼠，但注射ssAAV2/9-CAG-NAGLU药物的小鼠比注射ssAAV2/9-CAG2-NAGLU对照药物的小鼠NAGLU酶活提高更多；注射ssAAV2/9-CAG-NAGLU药物和注射ssAAV2/9-CAG2-NAGLU对照药物的MPSⅢB小鼠中，1个月后左脑和右脑GAG含量都接近正常水平，但注射ssAAV2/9-CAG-NAGLU药物的小鼠中GAG含量略低于正常野生鼠，注射ssAAV2/9-CAG2-NAGLU对照药物的小鼠中GAG含量略高于正常野生鼠。

在肝脏组织检测中，注射ssAAV2/9-CAG-NAGLU药物和注射ssAAV2/9-CAG2-NAGLU对照药物的MPSⅢB小鼠中，1个月后NAGLU酶活超过了野生鼠对照组，但注射ssAAV2/9-CAG-NAGLU药物的小鼠比注射ssAAV2/9-CAG2-NAGLU对照药物的小鼠中NAGLU酶活提高更多；1个月后注射这两种药物的模型鼠肝脏中GAG含量接近正常水平，但注射ssAAV2/9-CAG-NAGLU药物的小鼠中GAG含量略低于正常野生鼠，注射ssAAV2/9-CAG2-NAGLU药物的小鼠中GAG含量略高于正常野生鼠。

由此可见，分别施用药物ssAAV2/9-CAG-SGSH和ssAAV2/9-CAG-NAGLU后，相应的MPSⅢA模型鼠和MPSⅢB模型鼠中SGSH酶活和NAGLU酶活都明显提高，累积物GAG含量都明显降低并接近正常水平，并且在提高酶活水平和降低GAG含量上，候选药物ssAAV2/9-CAG-SGSH和ssAAV2/9-CAG-NAGLU的治疗效果好于对照药物ssAAV2/9-CAG2-SGSH和ssAAV2/9-CAG2-NAGLU。

4.3施用候选药物后免疫组化检测大脑中LIMP2及BSI-B4的表达

LIMP2(Lysosomal-Associated Membrane Protein 2)是提示细胞膜完整性的一个指标，高表达说明细胞膜破损。Ⅲ型粘多糖疾病检测大脑LIMP2。BSI-B4是一种植物凝集素，可以标记痛觉相关神经C纤维末端的半乳糖残基，其信号强提示神经损伤。

本试验包括MPSⅢA模型对照组、供试品S组(ssAAV2/9-CAG-SGSH药物)、MSPⅢB模型对照组、供试品N组(ssAAV2/9-CAG-NAGLU)和野生型对照组，共五组。收集各组动物的脑组织，根据一抗不同，分为3组，具体信息详见下表(表9)：

表9

对脑组织进行免疫组织染色，切片用显微镜进行观察，并用NIS-Elements软件在同一放大倍数及曝光时间下选取各组小鼠脑组织3-5个相同部位进行拍照，Image ProPlus 6.0软件对照片中LIMP2、BSI-B4 Lectin阳性染色面积进行测定。

LIMP2表达检测结果如图8所示，在MPSⅢA和MPSⅢB模型对照组中LIMP2高表达，说明细胞膜破损严重，而在供试品S组和供试品N组给药组中LIMP2表达很低，并与野生型小鼠相近，说明施药后MPSⅢA和MPSⅢB小鼠大脑细胞膜破损情况已恢复到正常水平。

BSI-B4表达检测结果如图9所示，在MPSⅢA和MPSⅢB模型对照组中BSI-B4表达量高，提示神经损伤严重，而在供试品S组和供试品N组给药组中BSI-B4表达量降低，并接近野生小鼠水平，说明施用药物后MPSⅢA和MPSⅢB小鼠严重损伤的脑神经已被修复。

序列表

<110> 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司

北京三诺佳邑生物技术有限责任公司

<120> 用于治疗ⅢA或ⅢB型粘多糖贮积症的腺相关病毒载体及用途

<130> 2020061801

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 1

atgagctgcc ccgtgcccgc ctgctgcgcg ctgctgctag tcctggggct ctgccgggcg 60

cgtccccgga acgcactgct gctcctcgcg gatgacggag gctttgagag tggcgcgtac 120

aacaacagcg ccatcgccac cccgcacctg gacgccttgg cccgccgcag cctcctcttt 180

cgcaatgcct tcacctcggt cagcagctgc tctcccagcc gcgccagcct cctcactggc 240

ctgccccagc atcagaatgg gatgtacggg ctgcaccagg acgtgcacca cttcaactcc 300

ttcgacaagg tgcggagcct gccgctgctg ctcagccaag ctggtgtgcg cacaggcatc 360

atcgggaaga agcacgtggg gccggagacc gtgtacccgt ttgactttgc gtacacggag 420

gagaatggct ccgtcctcca ggtggggcgg aacatcacta gaattaagct gctcgtccgg 480

aaattcctgc agactcagga tgaccggcct ttcttcctct acgtcgcctt ccacgacccc 540

caccgctgtg ggcactccca gccccagtac ggaaccttct gtgagaagtt tggcaacgga 600

gagagcggca tgggtcgtat cccagactgg accccccagg cctacgaccc actggacgtg 660

ctggtgcctt acttcgtccc caacaccccg gcagcccgag ccgacctggc cgctcagtac 720

accaccgtag gccgcatgga ccaaggagtt ggactggtgc tccaggagct gcgtgacgcc 780

ggtgtcctga acgacacact ggtgatcttc acgtccgaca acgggatccc cttccccagc 840

ggcaggacca acctgtactg gccgggcact gctgaaccct tactggtgtc atccccggag 900

cacccaaaac gctggggcca agtcagcgag gcctacgtga gcctcctaga cctcacgccc 960

accatcttgg attggttctc gatcccgtac cccagctacg ccatctttgg ctcgaagacc 1020

atccacctca ctggccggtc cctcctgccg gcgctggagg ccgagcccct ctgggccacc 1080

gtctttggca gccagagcca ccacgaggtc accatgtcct accccatgcg ctccgtgcag 1140

caccggcact tccgcctcgt gcacaacctc aacttcaaga tgccctttcc catcgaccag 1200

gacttctacg tctcacccac cttccaggac ctcctgaacc gcactacagc tggtcagccc 1260

acgggctggt acaaggacct ccgtcattac tactaccggg cgcgctggga gctctacgac 1320

cggagccggg acccccacga gacccagaac ctggccaccg acccgcgctt tgctcagctt 1380

ctggagatgc ttcgggacca gctggccaag tggcagtggg agacccacga cccctgggtg 1440

tgcgcccccg acggcgtcct ggaggagaag ctctctcccc agtgccagcc cctccacaat 1500

gagctgtga 1509

<210> 2

<211> 502

<212> PRT

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ser Cys Pro Val Pro Ala Cys Cys Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly

1 5 10 15

Leu Cys Arg Ala Arg Pro Arg Asn Ala Leu Leu Leu Leu Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Gly Phe Glu Ser Gly Ala Tyr Asn Asn Ser Ala Ile Ala Thr Pro

35 40 45

His Leu Asp Ala Leu Ala Arg Arg Ser Leu Leu Phe Arg Asn Ala Phe

50 55 60

Thr Ser Val Ser Ser Cys Ser Pro Ser Arg Ala Ser Leu Leu Thr Gly

65 70 75 80

Leu Pro Gln His Gln Asn Gly Met Tyr Gly Leu His Gln Asp Val His

85 90 95

His Phe Asn Ser Phe Asp Lys Val Arg Ser Leu Pro Leu Leu Leu Ser

100 105 110

Gln Ala Gly Val Arg Thr Gly Ile Ile Gly Lys Lys His Val Gly Pro

115 120 125

Glu Thr Val Tyr Pro Phe Asp Phe Ala Tyr Thr Glu Glu Asn Gly Ser

130 135 140

Val Leu Gln Val Gly Arg Asn Ile Thr Arg Ile Lys Leu Leu Val Arg

145 150 155 160

Lys Phe Leu Gln Thr Gln Asp Asp Arg Pro Phe Phe Leu Tyr Val Ala

165 170 175

Phe His Asp Pro His Arg Cys Gly His Ser Gln Pro Gln Tyr Gly Thr

180 185 190

Phe Cys Glu Lys Phe Gly Asn Gly Glu Ser Gly Met Gly Arg Ile Pro

195 200 205

Asp Trp Thr Pro Gln Ala Tyr Asp Pro Leu Asp Val Leu Val Pro Tyr

210 215 220

Phe Val Pro Asn Thr Pro Ala Ala Arg Ala Asp Leu Ala Ala Gln Tyr

225 230 235 240

Thr Thr Val Gly Arg Met Asp Gln Gly Val Gly Leu Val Leu Gln Glu

245 250 255

Leu Arg Asp Ala Gly Val Leu Asn Asp Thr Leu Val Ile Phe Thr Ser

260 265 270

Asp Asn Gly Ile Pro Phe Pro Ser Gly Arg Thr Asn Leu Tyr Trp Pro

275 280 285

Gly Thr Ala Glu Pro Leu Leu Val Ser Ser Pro Glu His Pro Lys Arg

290 295 300

Trp Gly Gln Val Ser Glu Ala Tyr Val Ser Leu Leu Asp Leu Thr Pro

305 310 315 320

Thr Ile Leu Asp Trp Phe Ser Ile Pro Tyr Pro Ser Tyr Ala Ile Phe

325 330 335

Gly Ser Lys Thr Ile His Leu Thr Gly Arg Ser Leu Leu Pro Ala Leu

340 345 350

Glu Ala Glu Pro Leu Trp Ala Thr Val Phe Gly Ser Gln Ser His His

355 360 365

Glu Val Thr Met Ser Tyr Pro Met Arg Ser Val Gln His Arg His Phe

370 375 380

Arg Leu Val His Asn Leu Asn Phe Lys Met Pro Phe Pro Ile Asp Gln

385 390 395 400

Asp Phe Tyr Val Ser Pro Thr Phe Gln Asp Leu Leu Asn Arg Thr Thr

405 410 415

Ala Gly Gln Pro Thr Gly Trp Tyr Lys Asp Leu Arg His Tyr Tyr Tyr

420 425 430

Arg Ala Arg Trp Glu Leu Tyr Asp Arg Ser Arg Asp Pro His Glu Thr

435 440 445

Gln Asn Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Ala Gln Leu Leu Glu Met Leu

450 455 460

Arg Asp Gln Leu Ala Lys Trp Gln Trp Glu Thr His Asp Pro Trp Val

465 470 475 480

Cys Ala Pro Asp Gly Val Leu Glu Glu Lys Leu Ser Pro Gln Cys Gln

485 490 495

Pro Leu His Asn Glu Leu

500

<210> 3

<211> 2232

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 3

atggaggcgg tggcggtggc cgcggcggtg ggggtccttc tcctggccgg ggccgggggc 60

gcggcaggcg acgaggcccg ggaggcggcg gccgtgcggg cgctcgtggc ccggctgctg 120

gggccaggcc ccgcggccga cttctccgtg tcggtggagc gcgctctggc tgccaagccg 180

ggcttggaca cctacagcct gggcggcggc ggcgcggcgc gcgtgcgggt gcgcggctcc 240

acgggcgtgg cggccgccgc ggggctgcac cgctacctgc gcgacttctg tggctgccac 300

gtggcctggt ccggctctca gctgcgcctg ccgcggccac tgccagccgt gccgggggag 360

ctgaccgagg ccacgcccaa caggtaccgc tattaccaga atgtgtgcac gcaaagctac 420

tccttcgtgt ggtgggactg ggcccgctgg gagcgagaga tagactggat ggcgctgaat 480

ggcatcaacc tggcactggc ctggagcggc caggaggcca tctggcagcg ggtgtacctg 540

gccttgggcc tgacccaggc agagatcaat gagttcttta ctggtcctgc cttcctggcc 600

tgggggcgaa tgggcaacct gcacacctgg gatggccccc tgcccccctc ctggcacatc 660

aagcagcttt acctgcagca ccgggtcctg gaccagatgc gctccttcgg catgacccca 720

gtgctgcctg cattcgcggg gcatgttccc gaggctgtca ccagggtgtt ccctcaggtc 780

aatgtcacga agatgggcag ttggggccac tttaactgtt cctactcctg ctccttcctt 840

ctggctccgg aagaccccat attccccatc atcgggagcc tcttcctgcg agagctgatc 900

aaagagtttg gcacagacca catctatggg gccgacactt tcaatgagat gcagccacct 960

tcctcagagc cctcctacct tgccgcagcc accactgccg tctatgaggc catgactgca 1020

gtggatactg aggctgtgtg gctgctccaa ggctggctct tccagcacca gccgcagttc 1080

tgggggcccg cccagatcag ggctgtgctg ggagctgtgc cccgtggccg cctcctggtt 1140

ctggacctgt ttgctgagag ccagcctgtg tatacccgca ctgcctcctt ccagggccag 1200

cccttcatct ggtgcatgct gcacaacttt gggggaaacc atggtctttt tggagcccta 1260

gaggctgtga acggaggccc agaagctgcc cgcctcttcc ccaactccac catggtaggc 1320

acgggcatgg cccccgaggg catcagccag aacgaagtgg tctattccct catggctgag 1380

ctgggctggc gaaaggaccc agtgccagat ttggcagcct gggtgaccag ctttgccgcc 1440

cggcggtatg gggtctccca cccggacgca ggggcagcgt ggaggctact gctccggagt 1500

gtgtacaact gctccgggga ggcctgcagg ggccacaatc gtagcccgct ggtcaggcgg 1560

ccgtccctac agatgaatac cagcatctgg tacaaccgat ctgatgtgtt tgaggcctgg 1620

cggctgctgc tcacatctgc tccctccctg gccaccagcc ccgccttccg ctacgacctg 1680

ctggacctca ctcggcaggc agtgcaggag ctggtcagct tgtactatga ggaggcaaga 1740

agcgcctacc tgagcaagga gctggcctcc ctgttgaggg ctggaggcgt cctggcctat 1800

gagctgctgc cggcactgga cgaggtgctg gctagtgaca gccgcttctt gctgggcagc 1860

tggctagagc aggcccgagc agcggcagtc agtgaggccg aggccgattt ctacgagcag 1920

aacagccgct accagctgac cttgtggggg ccagaaggca acatcctgga ctatgccaac 1980

aagcagctgg cggggttggt ggccaactac tacacccctc gctggcggct tttcctggag 2040

gcgctggttg acagtgtggc ccagggcatc cctttccaac agcaccagtt tgacaaaaat 2100

gtcttccaac tggagcaggc cttcgttctc agcaagcaga ggtaccccag ccagccgcga 2160

ggagacactg tggacctggc caagaagatc ttcctcaaat attaccccgg ctgggtggcc 2220

ggctcttggt ga 2232

<210> 4

<211> 743

<212> PRT

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 4

Met Glu Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Val Gly Val Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val

20 25 30

Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe

35 40 45

Ser Val Ser Val Glu Arg Ala Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser

65 70 75 80

Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe

85 90 95

Cys Gly Cys His Val Ala Trp Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg

100 105 110

Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg

115 120 125

Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val Cys Thr Gln Ser Tyr Ser Phe Val Trp

130 135 140

Trp Asp Trp Ala Arg Trp Glu Arg Glu Ile Asp Trp Met Ala Leu Asn

145 150 155 160

Gly Ile Asn Leu Ala Leu Ala Trp Ser Gly Gln Glu Ala Ile Trp Gln

165 170 175

Arg Val Tyr Leu Ala Leu Gly Leu Thr Gln Ala Glu Ile Asn Glu Phe

180 185 190

Phe Thr Gly Pro Ala Phe Leu Ala Trp Gly Arg Met Gly Asn Leu His

195 200 205

Thr Trp Asp Gly Pro Leu Pro Pro Ser Trp His Ile Lys Gln Leu Tyr

210 215 220

Leu Gln His Arg Val Leu Asp Gln Met Arg Ser Phe Gly Met Thr Pro

225 230 235 240

Val Leu Pro Ala Phe Ala Gly His Val Pro Glu Ala Val Thr Arg Val

245 250 255

Phe Pro Gln Val Asn Val Thr Lys Met Gly Ser Trp Gly His Phe Asn

260 265 270

Cys Ser Tyr Ser Cys Ser Phe Leu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Ile Phe

275 280 285

Pro Ile Ile Gly Ser Leu Phe Leu Arg Glu Leu Ile Lys Glu Phe Gly

290 295 300

Thr Asp His Ile Tyr Gly Ala Asp Thr Phe Asn Glu Met Gln Pro Pro

305 310 315 320

Ser Ser Glu Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Tyr Glu

325 330 335

Ala Met Thr Ala Val Asp Thr Glu Ala Val Trp Leu Leu Gln Gly Trp

340 345 350

Leu Phe Gln His Gln Pro Gln Phe Trp Gly Pro Ala Gln Ile Arg Ala

355 360 365

Val Leu Gly Ala Val Pro Arg Gly Arg Leu Leu Val Leu Asp Leu Phe

370 375 380

Ala Glu Ser Gln Pro Val Tyr Thr Arg Thr Ala Ser Phe Gln Gly Gln

385 390 395 400

Pro Phe Ile Trp Cys Met Leu His Asn Phe Gly Gly Asn His Gly Leu

405 410 415

Phe Gly Ala Leu Glu Ala Val Asn Gly Gly Pro Glu Ala Ala Arg Leu

420 425 430

Phe Pro Asn Ser Thr Met Val Gly Thr Gly Met Ala Pro Glu Gly Ile

435 440 445

Ser Gln Asn Glu Val Val Tyr Ser Leu Met Ala Glu Leu Gly Trp Arg

450 455 460

Lys Asp Pro Val Pro Asp Leu Ala Ala Trp Val Thr Ser Phe Ala Ala

465 470 475 480

Arg Arg Tyr Gly Val Ser His Pro Asp Ala Gly Ala Ala Trp Arg Leu

485 490 495

Leu Leu Arg Ser Val Tyr Asn Cys Ser Gly Glu Ala Cys Arg Gly His

500 505 510

Asn Arg Ser Pro Leu Val Arg Arg Pro Ser Leu Gln Met Asn Thr Ser

515 520 525

Ile Trp Tyr Asn Arg Ser Asp Val Phe Glu Ala Trp Arg Leu Leu Leu

530 535 540

Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu

545 550 555 560

Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala Val Gln Glu Leu Val Ser Leu Tyr Tyr

565 570 575

Glu Glu Ala Arg Ser Ala Tyr Leu Ser Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu

580 585 590

Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala Tyr Glu Leu Leu Pro Ala Leu Asp Glu

595 600 605

Val Leu Ala Ser Asp Ser Arg Phe Leu Leu Gly Ser Trp Leu Glu Gln

610 615 620

Ala Arg Ala Ala Ala Val Ser Glu Ala Glu Ala Asp Phe Tyr Glu Gln

625 630 635 640

Asn Ser Arg Tyr Gln Leu Thr Leu Trp Gly Pro Glu Gly Asn Ile Leu

645 650 655

Asp Tyr Ala Asn Lys Gln Leu Ala Gly Leu Val Ala Asn Tyr Tyr Thr

660 665 670

Pro Arg Trp Arg Leu Phe Leu Glu Ala Leu Val Asp Ser Val Ala Gln

675 680 685

Gly Ile Pro Phe Gln Gln His Gln Phe Asp Lys Asn Val Phe Gln Leu

690 695 700

Glu Gln Ala Phe Val Leu Ser Lys Gln Arg Tyr Pro Ser Gln Pro Arg

705 710 715 720

Gly Asp Thr Val Asp Leu Ala Lys Lys Ile Phe Leu Lys Tyr Tyr Pro

725 730 735

Gly Trp Val Ala Gly Ser Trp

740

<210> 5

<211> 941

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 60

cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 120

atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 180

cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 240

attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc 300

ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg 360

gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 420

cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 480

aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 540

cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 600

ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 660

tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg 720

ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 780

ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 840

agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct 900

ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattggat c 941

<210> 6

<211> 2711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 60

cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 120

atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 180

cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 240

attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc 300

ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg 360

gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 420

cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 480

aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 540

cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 600

ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 660

tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg 720

ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 780

ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 840

agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct 900

ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattggat cggtaccgaa ttcatgagct 960

gccccgtgcc cgcctgctgc gcgctgctgc tagtcctggg gctctgccgg gcgcgtcccc 1020

ggaacgcact gctgctcctc gcggatgacg gaggctttga gagtggcgcg tacaacaaca 1080

gcgccatcgc caccccgcac ctggacgcct tggcccgccg cagcctcctc tttcgcaatg 1140

ccttcacctc ggtcagcagc tgctctccca gccgcgccag cctcctcact ggcctgcccc 1200

agcatcagaa tgggatgtac gggctgcacc aggacgtgca ccacttcaac tccttcgaca 1260

aggtgcggag cctgccgctg ctgctcagcc aagctggtgt gcgcacaggc atcatcggga 1320

agaagcacgt ggggccggag accgtgtacc cgtttgactt tgcgtacacg gaggagaatg 1380

gctccgtcct ccaggtgggg cggaacatca ctagaattaa gctgctcgtc cggaaattcc 1440

tgcagactca ggatgaccgg cctttcttcc tctacgtcgc cttccacgac ccccaccgct 1500

gtgggcactc ccagccccag tacggaacct tctgtgagaa gtttggcaac ggagagagcg 1560

gcatgggtcg tatcccagac tggacccccc aggcctacga cccactggac gtgctggtgc 1620

cttacttcgt ccccaacacc ccggcagccc gagccgacct ggccgctcag tacaccaccg 1680

taggccgcat ggaccaagga gttggactgg tgctccagga gctgcgtgac gccggtgtcc 1740

tgaacgacac actggtgatc ttcacgtccg acaacgggat ccccttcccc agcggcagga 1800

ccaacctgta ctggccgggc actgctgaac ccttactggt gtcatccccg gagcacccaa 1860

aacgctgggg ccaagtcagc gaggcctacg tgagcctcct agacctcacg cccaccatct 1920

tggattggtt ctcgatcccg taccccagct acgccatctt tggctcgaag accatccacc 1980

tcactggccg gtccctcctg ccggcgctgg aggccgagcc cctctgggcc accgtctttg 2040

gcagccagag ccaccacgag gtcaccatgt cctaccccat gcgctccgtg cagcaccggc 2100

acttccgcct cgtgcacaac ctcaacttca agatgccctt tcccatcgac caggacttct 2160

acgtctcacc caccttccag gacctcctga accgcactac agctggtcag cccacgggct 2220

ggtacaagga cctccgtcat tactactacc gggcgcgctg ggagctctac gaccggagcc 2280

gggaccccca cgagacccag aacctggcca ccgacccgcg ctttgctcag cttctggaga 2340

tgcttcggga ccagctggcc aagtggcagt gggagaccca cgacccctgg gtgtgcgccc 2400

ccgacggcgt cctggaggag aagctctctc cccagtgcca gcccctccac aatgagctgt 2460

gagaattcgt cgacagatct gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2520

gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2580

aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2640

tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2700

tgggctctat g 2711

<210> 7

<211> 3422

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 60

cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 120

atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 180

cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 240

attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc 300

ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg 360

gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 420

cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 480

aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 540

cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 600

ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 660

tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg 720

ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 780

ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 840

agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct 900

ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattggat cggtaccgaa ttcatggagg 960

cggtggcggt ggccgcggcg gtgggggtcc ttctcctggc cggggccggg ggcgcggcag 1020

gcgacgaggc ccgggaggcg gcggccgtgc gggcgctcgt ggcccggctg ctggggccag 1080

gccccgcggc cgacttctcc gtgtcggtgg agcgcgctct ggctgccaag ccgggcttgg 1140

acacctacag cctgggcggc ggcggcgcgg cgcgcgtgcg ggtgcgcggc tccacgggcg 1200

tggcggccgc cgcggggctg caccgctacc tgcgcgactt ctgtggctgc cacgtggcct 1260

ggtccggctc tcagctgcgc ctgccgcggc cactgccagc cgtgccgggg gagctgaccg 1320

aggccacgcc caacaggtac cgctattacc agaatgtgtg cacgcaaagc tactccttcg 1380

tgtggtggga ctgggcccgc tgggagcgag agatagactg gatggcgctg aatggcatca 1440

acctggcact ggcctggagc ggccaggagg ccatctggca gcgggtgtac ctggccttgg 1500

gcctgaccca ggcagagatc aatgagttct ttactggtcc tgccttcctg gcctgggggc 1560

gaatgggcaa cctgcacacc tgggatggcc ccctgccccc ctcctggcac atcaagcagc 1620

tttacctgca gcaccgggtc ctggaccaga tgcgctcctt cggcatgacc ccagtgctgc 1680

ctgcattcgc ggggcatgtt cccgaggctg tcaccagggt gttccctcag gtcaatgtca 1740

cgaagatggg cagttggggc cactttaact gttcctactc ctgctccttc cttctggctc 1800

cggaagaccc catattcccc atcatcggga gcctcttcct gcgagagctg atcaaagagt 1860

ttggcacaga ccacatctat ggggccgaca ctttcaatga gatgcagcca ccttcctcag 1920

agccctccta ccttgccgca gccaccactg ccgtctatga ggccatgact gcagtggata 1980

ctgaggctgt gtggctgctc caaggctggc tcttccagca ccagccgcag ttctgggggc 2040

ccgcccagat cagggctgtg ctgggagctg tgccccgtgg ccgcctcctg gttctggacc 2100

tgtttgctga gagccagcct gtgtataccc gcactgcctc cttccagggc cagcccttca 2160

tctggtgcat gctgcacaac tttgggggaa accatggtct ttttggagcc ctagaggctg 2220

tgaacggagg cccagaagct gcccgcctct tccccaactc caccatggta ggcacgggca 2280

tggcccccga gggcatcagc cagaacgaag tggtctattc cctcatggct gagctgggct 2340

ggcgaaagga cccagtgcca gatttggcag cctgggtgac cagctttgcc gcccggcggt 2400

atggggtctc ccacccggac gcaggggcag cgtggaggct actgctccgg agtgtgtaca 2460

actgctccgg ggaggcctgc aggggccaca atcgtagccc gctggtcagg cggccgtccc 2520

tacagatgaa taccagcatc tggtacaacc gatctgatgt gtttgaggcc tggcggctgc 2580

tgctcacatc tgctccctcc ctggccacca gccccgcctt ccgctacgac ctgctggacc 2640

tcactcggca ggcagtgcag gagctggtca gcttgtacta tgaggaggca agaagcgcct 2700

acctgagcaa ggagctggcc tccctgttga gggctggagg cgtcctggcc tatgagctgc 2760

tgccggcact ggacgaggtg ctggctagtg acagccgctt cttgctgggc agctggctag 2820

agcaggcccg agcagcggca gtcagtgagg ccgaggccga tttctacgag cagaacagcc 2880

gctaccagct gaccttgtgg gggccagaag gcaacatcct ggactatgcc aacaagcagc 2940

tggcggggtt ggtggccaac tactacaccc ctcgctggcg gcttttcctg gaggcgctgg 3000

ttgacagtgt ggcccagggc atccctttcc aacagcacca gtttgacaaa aatgtcttcc 3060

aactggagca ggccttcgtt ctcagcaagc agaggtaccc cagccagccg cgaggagaca 3120

ctgtggacct ggccaagaag atcttcctca aatattaccc cggctgggtg gccggctctt 3180

ggtgaggatc tgcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 3240

ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 3300

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 3360

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 3420

tg 3422

Claims

1.一种重组腺相关病毒，其中，所述重组腺相关病毒包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含重组核酸分子，所述重组核酸分子包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的多核苷酸序列和选自AAV2型的AAV反向末端重复序列，所述重组腺相关病毒的衣壳来源于AAV9型的衣壳蛋白。

2.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求1所述的重组腺相关病毒。

3.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的重组腺相关病毒和/或权利要求2所述的宿主细胞，以及药学上可接受的赋形剂。

4.权利要求3所述的药物组合物，其被配制用于脑室内给药。

5.权利要求1所述的重组腺相关病毒、权利要求2所述的宿主细胞和/或权利要求3或4所述的药物组合物在制备用于预防或治疗MPSⅢA或MPSⅢB的药物中的用途。

6.权利要求5所述的用途，其中所述重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以与另一疗法结合施用。

7.权利要求5或6所述的用途，其中，所述重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以以大约1×10⁶vg/kg至大约1×10¹⁸vg/kg的剂量施用。

8.权利要求7所述的用途，其中，所述重组腺相关病毒可以以大约5×10¹²vg/kg的剂量施用。

9.权利要求7所述的用途，其中，所述重组腺相关病毒可以以大约5×10¹¹vg/kg的剂量施用。

10.权利要求7所述的用途，其中，所述重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以施用超过一次。