CN108715867A - 一种Sanfilippo B综合症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种Sanfilippo B综合症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种Sanfilippo B综合症的慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，其中，所述慢病毒载体还包括NAGLU基因。本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入NAGLU基因，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得NAGLU基因在转基因的大脑相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成Sanfilippo B综合症基因治疗过程中正常基因的传递。

Description

一种Sanfilippo B综合症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种Sanfilippo B综合症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种应用改良后的慢病毒载体优化表达NAGLU基因用于制备治疗戈谢病的药物。
背景技术
Ⅲ型B类黏多糖积贮症综合症(Mucopolysaccharidosis(MPS)type III B，也称Sanfilippo B综合症)，此疾病会导致渐进性的认知功能障碍。这种疾病是由于只有部分降解的硫酸乙酰肝素寡糖堆积所造成的，Sanfilippo B的相关基因NAGLU突变，导致了α变N乙酰葡萄胺糖苷酶催化活性的失去。Sanfilippo B综合症的症状和病理特征与Sanfilippo-A类似，并且硫酸乙酰肝素寡糖的堆积不仅影响了组织和器官，尤其是CNS中的神经元和非神经元细胞，而且还会导致CNS的二级病理学特征的出现，包括大量的代谢损伤，神经炎症，氧化应激和神经性退化，不仅如此，对外周神经系统(PNS)也会造成深远的影响。SanfilippoB综合症多发于儿童，2-4岁之前症状不太明显，之后病情会有明显地发展，最终死亡。
Sanfilippo B是单基因突变造成的溶酶体堆积紊乱疾病(lysosomal storagedisorders，LSDs)，涉及基因NAGLU，因此基因治疗方法理论上可以实现对该病的彻底治疗。在脑部直接注射携带正常NAGLU基因的毒载体可以直接对基因缺陷细胞进行脑内转染，进而修复各种脑部细胞，分泌出所需要的硫酸胺酶，减少硫酸乙酰肝素的堆积，从而进行下一步的降解，并可以进过交叉校正(cross correction)方式修复周围细胞乃至整个脑部的细胞。体外对病毒载体进行修饰，直接注射入脑，此方法方便快捷，成本低廉，适用性很高，具有较好的临床基因治疗应用前景。
目前国内外应用病毒载体进行基因传递的基因治疗方法虽然有许多，但是不同病毒载体，甚至相同载体的不同制备方法引起的基因传递效率差异明显，而基因传递效率将直接影响疾病的治疗效果。现在大多应用细胞治疗对遗传病进行治疗的方法均存在效率过低以及仅针对血液干细胞进行修饰，使得疾病治疗的临床效果始终达不到预期，因此急需能够最大程度上提高病毒基因传递效率以及的方法来提高遗传疾病的疗效。
Abeona Therapeutics Inc.(纳斯达克股份代号：ABEO)是一家临床阶段的生物制药公司，致力于为危及生命的罕见遗传病研发基因疗法。该公司宣布，欧洲药物管理局(EMA)罕见医学产品委员会向Abeona用于治疗山菲利普综合症B型(MPS IIIB)儿童的基因疗法项目授予指定罕见病药物(EMA/OD/226/16)资格。此基因治疗项目此前已在美国获美国食品及药物管理局(FDA)的指定罕见病药品并获得指定罕见儿科疾病资格，作为FDA优先审核凭证(PRV)程序的先决条件。FDA已批准试验用新药(IND)进行1/2期临床试验，并预计从2017年第二季开始接受临床试验患者登记。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种Sanfilippo B综合症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述Sanfilippo B综合症慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：
(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；
(b)其仍具有病毒包装信号功能；
其中，所述慢病毒载体还包括NAGLU基因。
本发明中，通过将5’端的剪接供体位点进行删除或改造从而使得慢病毒载体pTYF剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点’，即其不再有致病性，使得HIV病毒丧失了自我复制的功能，因此大大提高了整个基因治疗使用的慢病毒载体自身的安全性能，这是其他所有慢病毒载体所不具备的一种安全机能改良，转染效率更高，稳定性更强，安全性更好，能够更高效的完成基因治疗过程中正常基因的传递，将改造后的慢病毒载体特异性地装载NAGLU基因，转导细胞后能够成功实现神经元细胞内NAGLU基因的稳定表达，使得慢病毒载体能够实现对Sanfilippo B综合症基因的治疗。
根据本发明，所述慢病毒载体的5’端的剪接供体位点被删除或改造的核苷酸序列举例如下：
在具体实施例中，野生型5’剪接供体位点GT突变为CA，具体序列如下：
野生型(SEQ ID NO.3)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
突变型(SEQ ID NO.4)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGCAGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA.
在具体的实施例中，野生型5’剪接供体位点GT突变为GG，具体序列如下：
野生型(SEQ ID NO.5)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
突变型(SEQ ID NO.6)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGGGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA.
根据本发明，所述NAGLU基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述NAGLU基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述NAGLU基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少82％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述NAGLU基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述NAGLU基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少88％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述NAGLU基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述NAGLU基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少92％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述NAGLU基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
本发明中，发明人发现与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列，是改造后的NAGLU基因其仍然具有NAGLU基因的功能，可能是对NAGLU蛋白长度的缩短或是只采用NAGLU中的功能域部分序列，将这些改造后的核苷酸序列装载到所述慢病毒载体中都可以实现NAGLU基因的功能，从而对NAGLU基因进行修复，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列如下：
atggaggcggtggcggtggccgcggcggtgggggtccttctcctggccggggccgggggcgcggcaggcgacgaggcccgggaggcggcggccgtgcgggcgctcgtggcccggctgctggggccaggccccgcggccgacttctccgtgtcggtggagcgcgctctggctgccaagccgggcttggacacctacagcctgggcggcggcggcgcggcgcgcgtgcgggtgcgcggctccacgggcgtggcggccgccgcggggctgcaccgctacctgcgcgacttctgtggctgccacgtggcctggtccggctctcagctgcgcctgccgcggccactgccagccgtgccgggggagctgaccgaggccacgcccaacaggtaccgctattaccagaatgtgtgcacgcaaagctactctttcgtgtggtgggactgggcccgctgggagcgagagatagactggatggcgctgaatggcatcaacctggcactggcctggagcggccaggaggccatctggcagcgggtgtacctggccttgggcctgacccaggcagagatcaatgagttctttactggtcctgccttcctggcctgggggcgaatgggcaacctgcacacctgggatggccccctgcccccctcctggcacatcaagcagctttacctgcagcaccgggtcctggaccagatgcgctccttcggcatgaccccagtgctgcctgcattcgcggggcatgttcccgaggctgtcaccagggtgttccctcaggtcaatgtcacgaagatgggcagttggggccactttaactgttcctactcctgctccttccttctggctccggaagaccccatattccccatcatcgggagcctcttcctgcgagagctgatcaaagagtttggcacagaccacatctatggggccgacactttcaatgagatgcagccaccttcctcagagccctcctaccttgccgcagccaccactgccgtctatgaggccatgactgcagtggatactgaggctgtgtggctgctccaaggctggctcttccagcaccagccgcagttctgggggcccgcccagatcagggctgtgctgggagctgtgccccgtggccgcctcctggttctggacctgtttgctgagagccagcctgtgtatacccgcactgcctccttccagggccagcccttcatctggtgcatgctgcacaactttgggggaaaccatggtctttttggagccctagaggctgtgaacggaggcccagaagctgcccgcctcttccccaactccaccatggtaggcacgggcatggcccccgagggcatcagccagaacgaagtggtctattccctcatggctgagctgggctggcgaaaggacccagtgccagatttggcagcctgggtgaccagctttgccgcccggcggtatggggtctcccacccggacgcaggggcagcgtggaggctactgctccggagtgtgtacaactgctccggggaggcctgcaggggccacaatcgtagcccgctggtcaggcggccgtccctacagatgaataccagcatctggtacaaccgatctgatgtgtttgaggcctggcggctgctgctcacatctgctccctccctggccaccagccccgccttccgctacgacctgctggacctcactcggcaggcagtgcaggagctggtcagcttgtactatgaggaggcaagaagcgcctacctgagcaaggagctggcctccctgttgagggctggaggcgtcctggcctatgagctgctgccggcactggacgaggtgctggctagtgacagccgcttcttgctgggcagctggctagagcaggcccgagcagcggcagtcagtgaggccgaggccgatttctacgagcagaacagccgctaccagctgaccttgtgggggccagaaggcaacatcctggactatgccaacaagcagctggcggggttggtggccaactactacacccctcgctggcggcttttcctggaggcgctggttgacagtgtggcccagggcatccctttccaacagcaccagtttgacaaaaatgtcttccaactggagcaggccttcgttctcagcaagcagaggtaccccagccagccgcgaggagacactgtggacctggccaagaagatcttcctcaaatattacccccgctgggtggccggctcttggtg.
根据本发明，所述NAGLU基因之前还包括启动子序列，所述启动子序列为EF1α和/或CMV，优选为EF1α。
本发明中，只要能够启动NAGLU基因表达的启动子都是可行的，发明人发现采用EF1α全长启动子，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递。
根据本发明，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或与其具有至少90％同源性，优选至少95％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述EF1α的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述EF1α的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少92％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述EF1α的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
本发明中，发明人发现与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的序列，是改造后的EF1α其仍然具有启动子的功能，可能是对EF1α长度的缩短，将这些改造后的核苷酸序列装载到所述慢病毒载体中都可以实现启动子的功能，从而启动ARSA基因的表达，所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：
gcggccgctagcatgcctaggtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaaaactctagagcggccgcggaggccgaattccgtcga.
第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的慢病毒载体pTYF与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSV-G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞。
第三方面，本发明提供一种制备如第二方面所述慢病毒的方法，包括如下步骤：
(1)将慢病毒载体pTYF进行改造；
(2)全基因合成启动子及NAGLU基因序列并插入步骤(1)点突变的慢病毒载体中；
(3)将构建的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到重组慢病毒。
根据本发明，步骤(2)所述插入的位点可以是任何基因工程可合成的酶切位点，本发明优选采用BamHI和SpeI酶切位点之间。
根据本发明，步骤(3)所述的包装辅助质粒为pNHP和pHEF-VSV-G。
根据本发明，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞。
根据本发明，所述共转染哺乳细胞后的培养时间为24-72h，例如可以是24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、50h、52h、55h、58h、60h、62h、65h、68h、70h或72h。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞包括如第一方面所述的慢病毒载体和/或如第二方面所述的重组慢病毒。
根据本发明，所述重组细胞为重组干细胞，优选为外周血干细胞和/或间充质干细胞。
本发明中，所述经慢病毒转染后的干细胞能够稳定大量表达NAGLU基因，通过将重组慢病毒导入外周血干细胞和间充质干细胞，形成双重干细胞系，可以进一步提高NAGLU基因在脑部的传递效率与表达量活，能够实现更快的Sanfilippo B综合症症状缓解以及更全面持久的基因治疗。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第四方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的重组慢病毒、如第四方面所述的重组细胞或如第五方面所述的药物组合物在制备Sanfilippo B综合症治疗的药物和/或试剂中的用途。
在一个具体的实施例中，所述干细胞为通过收集患者外周血后分离其中干细胞，再将慢病毒载体转染干细胞后，以静脉注射的方式回输入患者体内进行Sanfilippo B综合症疾病的治疗。
在一个具体的实施例中，可以通过将慢病毒载体直接注射至病变细胞部位进行Sanfilippo B综合症疾病的治疗。
在一个具体的实施例中，可以通过将慢病毒载体转染血液进行Sanfilippo B综合症疾病的治疗。
根据本发明，所述组合物还包括药学上接受的辅料，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本申请慢病毒载体进行了特异改造，使得HIV病毒丧失了自我复制的功能，大大提高了整个基因治疗使用的慢病毒载体自身的安全性能，改造后的慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好，能够更高效的完成基因治疗过程中正常基因的传递；
(2)本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入NAGLU基因，在EF1α启动子的启动下，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得NAGLU基因在转基因的大脑相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成Sanfilippo B综合症基因治疗过程中正常基因的传递；
(3)本申请慢病毒载体可以直接修复细胞中受损的NAGLU基因，可以有效的提高NAGLU基因在脑部的传递效率与表达量活，这对保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的Sanfilippo B综合症症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。
附图说明
图1为慢病毒载体pTYF的改造示意图；
图2为慢病毒载体的结构示意图；
图3为慢病毒载体的纯化流程示意图；
图4为慢病毒载体携带正常NAGLU直接注射入脑治疗Sanfilippo B综合症疾病的治疗流程示意图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1慢病毒载体的构建
本实施例提供一种慢病毒载体的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)慢病毒载体pTYF的改造示意图如图1所示，具体的突变为将野生型5’剪接供体位点GT突变为CA，将U3中的增强子删除，具体的改造方法可以参见“Contributions ofViral Splice Sites and cis-Regulatory Elements to Lentivirus Vector Function,YAN CUI,JOURNAL OF VIROLOGY,July 1999,p.6171–6176”，具体如下：
5’剪接供体位点的改造：
野生型(SEQ ID NO.3)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
突变型(SEQ ID NO.4)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGCAGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
(2)启动子以及NAGLU基因的插入：
通过全基因合成正常NAGLU基因序列(如SEQ ID NO.1所示)以及人类EF1α启动子(如SEQ ID NO.2所示)序列，将其经限制性酶切位点连接入慢病毒载体TYF中，通过测序及双酶切(最佳反应条件参照NEB原厂建议)，5’用BamHI克隆位点(ggatccacc)–AUG；3’用SpeI克隆位点(actagt)，对所获产物进行鉴定以获得正确连接的hEF1α启动下携带正常NAGLU基因插入慢病毒载体，具体的连接位置以及慢病毒载体构成如图2所示。
具体的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列如下：
atggaggcggtggcggtggccgcggcggtgggggtccttctcctggccggggccgggggcgcggcaggcgacgaggcccgggaggcggcggccgtgcgggcgctcgtggcccggctgctggggccaggccccgcggccgacttctccgtgtcggtggagcgcgctctggctgccaagccgggcttggacacctacagcctgggcggcggcggcgcggcgcgcgtgcgggtgcgcggctccacgggcgtggcggccgccgcggggctgcaccgctacctgcgcgacttctgtggctgccacgtggcctggtccggctctcagctgcgcctgccgcggccactgccagccgtgccgggggagctgaccgaggccacgcccaacaggtaccgctattaccagaatgtgtgcacgcaaagctactctttcgtgtggtgggactgggcccgctgggagcgagagatagactggatggcgctgaatggcatcaacctggcactggcctggagcggccaggaggccatctggcagcgggtgtacctggccttgggcctgacccaggcagagatcaatgagttctttactggtcctgccttcctggcctgggggcgaatgggcaacctgcacacctgggatggccccctgcccccctcctggcacatcaagcagctttacctgcagcaccgggtcctggaccagatgcgctccttcggcatgaccccagtgctgcctgcattcgcggggcatgttcccgaggctgtcaccagggtgttccctcaggtcaatgtcacgaagatgggcagttggggccactttaactgttcctactcctgctccttccttctggctccggaagaccccatattccccatcatcgggagcctcttcctgcgagagctgatcaaagagtttggcacagaccacatctatggggccgacactttcaatgagatgcagccaccttcctcagagccctcctaccttgccgcagccaccactgccgtctatgaggccatgactgcagtggatactgaggctgtgtggctgctccaaggctggctcttccagcaccagccgcagttctgggggcccgcccagatcagggctgtgctgggagctgtgccccgtggccgcctcctggttctggacctgtttgctgagagccagcctgtgtatacccgcactgcctccttccagggccagcccttcatctggtgcatgctgcacaactttgggggaaaccatggtctttttggagccctagaggctgtgaacggaggcccagaagctgcccgcctcttccccaactccaccatggtaggcacgggcatggcccccgagggcatcagccagaacgaagtggtctattccctcatggctgagctgggctggcgaaaggacccagtgccagatttggcagcctgggtgaccagctttgccgcccggcggtatggggtctcccacccggacgcaggggcagcgtggaggctactgctccggagtgtgtacaactgctccggggaggcctgcaggggccacaatcgtagcccgctggtcaggcggccgtccctacagatgaataccagcatctggtacaaccgatctgatgtgtttgaggcctggcggctgctgctcacatctgctccctccctggccaccagccccgccttccgctacgacctgctggacctcactcggcaggcagtgcaggagctggtcagcttgtactatgaggaggcaagaagcgcctacctgagcaaggagctggcctccctgttgagggctggaggcgtcctggcctatgagctgctgccggcactggacgaggtgctggctagtgacagccgcttcttgctgggcagctggctagagcaggcccgagcagcggcagtcagtgaggccgaggccgatttctacgagcagaacagccgctaccagctgaccttgtgggggccagaaggcaacatcctggactatgccaacaagcagctggcggggttggtggccaactactacacccctcgctggcggcttttcctggaggcgctggttgacagtgtggcccagggcatccctttccaacagcaccagtttgacaaaaatgtcttccaactggagcaggccttcgttctcagcaagcagaggtaccccagccagccgcgaggagacactgtggacctggccaagaagatcttcctcaaatattacccccgctgggtggccggctcttggtg；
具体的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：
gcggccgctagcatgcctaggtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaaaactctagagcggccgcggaggccgaattccgtcga.
实施例2慢病毒的制备和鉴定
1)慢病毒的制备
将实施例1制备得到的慢病毒载体进一步包装、纯化和浓缩，得到所述慢病毒，具体过程如图3所示，具体步骤如下：
(1)将实施例1中构建的慢病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSV-G共转染哺乳细胞HEK293T中培养24-72h；
(2)将培养得到的慢病毒进行纯化和浓缩，得到所述慢病毒。
2)慢病毒的鉴定
将收集的携带正常NAGLU基因慢病毒转染后神经元细胞和胶质细胞进行蛋白质表达量鉴定，以明确NAGLU基因在神经元细胞中的表达情况。
从结果看来，未经慢病毒转染的神经元细胞阴性对照细胞中不存在NAGLU蛋白的表达，而经携带正常NAGLU基因慢病毒转染后神经元细胞中可见明显较大量的NAGLU蛋白表达。
说明本发明能够成功通过慢病毒使神经元细胞大量表达NAGLU蛋白，具有较好的疾病治疗潜能。
实施例3慢病毒的治疗效果
将实施例2制备得到的携带正常NAGLU的慢病毒对大脑进行直接注射治疗Sanfilippo B综合症疾病，治疗流程示意图如图4所示，通过脑部的MRI或CT确定注射慢病毒载体的位点和脑部具体坐标，以携带正常NAGLU基因的慢病毒载体在颅内进行直接注射的方式，输入到患者脑部进行疾病治疗。
从结果可以看出，直接注射慢病毒后，有效的提高NAGLU基因在脑部的传递效率与表达量活。
综上所述，本申请慢病毒载体可以直接修复细胞中受损的NAGLU基因，可以有效的提高NAGLU基因在脑部的传递效率与表达量活，这对保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的Sanfilippo B综合症症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市免疫基因治疗研究院
<120> 一种Sanfilippo B综合症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
<130> 2018
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2231
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
atggaggcgg tggcggtggc cgcggcggtg ggggtccttc tcctggccgg ggccgggggc 60
gcggcaggcg acgaggcccg ggaggcggcg gccgtgcggg cgctcgtggc ccggctgctg 120
gggccaggcc ccgcggccga cttctccgtg tcggtggagc gcgctctggc tgccaagccg 180
ggcttggaca cctacagcct gggcggcggc ggcgcggcgc gcgtgcgggt gcgcggctcc 240
acgggcgtgg cggccgccgc ggggctgcac cgctacctgc gcgacttctg tggctgccac 300
gtggcctggt ccggctctca gctgcgcctg ccgcggccac tgccagccgt gccgggggag 360
ctgaccgagg ccacgcccaa caggtaccgc tattaccaga atgtgtgcac gcaaagctac 420
tctttcgtgt ggtgggactg ggcccgctgg gagcgagaga tagactggat ggcgctgaat 480
ggcatcaacc tggcactggc ctggagcggc caggaggcca tctggcagcg ggtgtacctg 540
gccttgggcc tgacccaggc agagatcaat gagttcttta ctggtcctgc cttcctggcc 600
tgggggcgaa tgggcaacct gcacacctgg gatggccccc tgcccccctc ctggcacatc 660
aagcagcttt acctgcagca ccgggtcctg gaccagatgc gctccttcgg catgacccca 720
gtgctgcctg cattcgcggg gcatgttccc gaggctgtca ccagggtgtt ccctcaggtc 780
aatgtcacga agatgggcag ttggggccac tttaactgtt cctactcctg ctccttcctt 840
ctggctccgg aagaccccat attccccatc atcgggagcc tcttcctgcg agagctgatc 900
aaagagtttg gcacagacca catctatggg gccgacactt tcaatgagat gcagccacct 960
tcctcagagc cctcctacct tgccgcagcc accactgccg tctatgaggc catgactgca 1020
gtggatactg aggctgtgtg gctgctccaa ggctggctct tccagcacca gccgcagttc 1080
tgggggcccg cccagatcag ggctgtgctg ggagctgtgc cccgtggccg cctcctggtt 1140
ctggacctgt ttgctgagag ccagcctgtg tatacccgca ctgcctcctt ccagggccag 1200
cccttcatct ggtgcatgct gcacaacttt gggggaaacc atggtctttt tggagcccta 1260
gaggctgtga acggaggccc agaagctgcc cgcctcttcc ccaactccac catggtaggc 1320
acgggcatgg cccccgaggg catcagccag aacgaagtgg tctattccct catggctgag 1380
ctgggctggc gaaaggaccc agtgccagat ttggcagcct gggtgaccag ctttgccgcc 1440
cggcggtatg gggtctccca cccggacgca ggggcagcgt ggaggctact gctccggagt 1500
gtgtacaact gctccgggga ggcctgcagg ggccacaatc gtagcccgct ggtcaggcgg 1560
ccgtccctac agatgaatac cagcatctgg tacaaccgat ctgatgtgtt tgaggcctgg 1620
cggctgctgc tcacatctgc tccctccctg gccaccagcc ccgccttccg ctacgacctg 1680
ctggacctca ctcggcaggc agtgcaggag ctggtcagct tgtactatga ggaggcaaga 1740
agcgcctacc tgagcaagga gctggcctcc ctgttgaggg ctggaggcgt cctggcctat 1800
gagctgctgc cggcactgga cgaggtgctg gctagtgaca gccgcttctt gctgggcagc 1860
tggctagagc aggcccgagc agcggcagtc agtgaggccg aggccgattt ctacgagcag 1920
aacagccgct accagctgac cttgtggggg ccagaaggca acatcctgga ctatgccaac 1980
aagcagctgg cggggttggt ggccaactac tacacccctc gctggcggct tttcctggag 2040
gcgctggttg acagtgtggc ccagggcatc cctttccaac agcaccagtt tgacaaaaat 2100
gtcttccaac tggagcaggc cttcgttctc agcaagcaga ggtaccccag ccagccgcga 2160
ggagacactg tggacctggc caagaagatc ttcctcaaat attacccccg ctgggtggcc 2220
ggctcttggt g 2231
<210> 2
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
gcggccgcta gcatgcctag gtcgaccaat tctcatgttt gacagcttat catcgataag 60
ctttggagct aagccagcaa tggtagaggg aagattctgc acgtcccttc caggcggcct 120
ccccgtcacc acccccccca acccgccccg accggagctg agagtaattc atacaaaagg 180
actcgcccct gccttgggga atcccaggga ccgtcgttaa actcccacta acgtagaacc 240
cagagatcgc tgcgttcccg ccccctcacc cgcccgctct cgtcatcact gaggtggaga 300
agagcatgcg tgaggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 360
cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaagt ggcgcggggt 420
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 480
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 540
acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg 600
cgtgccttga attacttcca cgcccctggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc 660
gggttggaag tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg 720
cttgagttga ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc 780
gcgcctgtct cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg 840
cgacgctttt tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg cacactggta 900
tttcggtttt tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg 960
cgaggcgggg cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc 1020
ggcctgctct ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc 1080
tggcccggtc ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag 1140
ggagctcaaa atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa 1200
ggaaaagggc ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc 1260
cgtccaggca cctcgattag ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg 1320
aggggtttta tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag 1380
cttggcactt gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca 1440
ttctcaagcc tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgaaaac 1500
tctagagcgg ccgcggaggc cgaattccgt cga 1533
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
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<210> 4
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<212> DNA
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<400> 4
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<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
ggcaagaggc gaggggcggc gactggggag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta 60

Claims (10)

1.一种Sanfilippo B综合症慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：
(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；
(b)其仍具有病毒包装信号功能；
其中，所述慢病毒载体还包括NAGLU基因。
2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述NAGLU基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的慢病毒载体，其特征在于，所述NAGLU基因之前还包括启动子序列；
优选地，所述启动子序列为EF1α和/或CMV，优选为EF1α；
优选地，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或与其具有至少90％同源性，优选至少95％同源性的核苷酸序列。
4.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求1或2所述的慢病毒载体pTYF与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSV-G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞。
5.一种制备如权利要求4所述慢病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将慢病毒载体pTYF 5’端的剪接供体位点进行点突变；
(2)全基因合成启动子及NAGLU基因序列并插入步骤(1)点突变的慢病毒载体中；
(3)将构建的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到重组慢病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述插入的位点为BamHI和SpeI酶切位点之间。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的包装辅助质粒为pNHP和pHEF-VSV-G；
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞；
优选地，所述共转染哺乳细胞后的培养时间为24-72h。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体和/或如权利要求4所述的重组慢病毒；
优选地，所述重组细胞为重组干细胞，优选为外周血干细胞和/或间充质干细胞。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体、如权利要求4所述的重组慢病毒或如权利要求8所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
10.如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体、如权利要求4所述的重组慢病毒、如权利要求8所述的重组细胞或如权利要求9所述的药物组合物在制备Sanfilippo B综合症治疗的药物和/或试剂中的用途；
优选地，所述组合物还包括药学上接受的辅料；
优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
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