CN110506115A - 使用CRISPR/Cas9和三重指导序列进行外显子跳读修饰的优化策略 - Google Patents

使用CRISPR/Cas9和三重指导序列进行外显子跳读修饰的优化策略 Download PDF

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埃里克·奥尔松
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University of Texas System
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Abstract

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑具有治疗遗传性疾病例如由肌养蛋白基因中的突变引起的迪谢内肌营养不良(DMD)的临床潜力。本文中，使用三个启动子来驱动相同DMD指导RNA的表达，在外显子50缺失的DMD的人源化小鼠模型中和在ΔEx50‑MD狗中实现了更稳健和安全的基因组编辑方式。

Description

使用CRISPR/Cas9和三重指导序列进行外显子跳读修饰的优 化策略
优先权声明
本申请要求2017年12月8日提交的美国临时申请序列号62/596,298、2017年8月11日提交的美国临时申请序列号62/544,499、和2017年1月5日提交的美国临时申请序列号62/442,606的优先权权益，其全部内容通过引用整体并入本文。
联邦资助支持条款
本发明是在美国国立卫生研究院授予的基金号U54 HD 087351的政府支持下作出的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。在2018年1月5日创建的所述ASCII拷贝命名为UTFD_P3178WO.txt，大小为1,316,974字节。
技术领域
本公开内容涉及分子生物学、医学和遗传学领域。更具体地，本公开内容涉及用于基因组编辑的组合物及其在使用外显子跳读方法校正体内突变中的用途。
背景技术
肌营养不良(muscular dystrophy，MD)是超过30种遗传性疾病的组，其特征在于控制运动的骨骼肌的进行性无力和退行。迪谢内肌营养不良(Duchenne musculardystrohpy，DMD)是最严重的MD形式之一，其影响约五千分之一的男孩，并且特征在于进行性肌肉无力和早夭。心肌病和心力衰竭是DMD的常见、无法治愈和致死的特征。该疾病是由编码肌养蛋白(dystrophin)(DMD)的基因中的突变引起的，肌养蛋白是一种大的细胞内蛋白，其将细胞表面的肌养蛋白聚糖(dystroglycan)复合物与下面的细胞骨架连接起来，从而在收缩过程中保持肌细胞膜的完整性。肌养蛋白基因的突变导致肌养蛋白的表达丧失，导致肌肉膜脆性和进行性肌肉萎缩。
发明内容
尽管通过多种方法(包括成肌细胞转移、病毒递送和寡核苷酸介导的外显子跳读)寻求治愈的努力，但仍然无法治愈任何类型的肌营养不良。本发明人最近使用成簇规律间隔短回文重复/Cas9(CRISPR/Cas9)介导的基因组编辑来校正出生后mdx小鼠(DMD模型)中的肌养蛋白基因(DMD)突变。体内AAV介导的基因编辑组分的递送在mdx小鼠的心肌和骨骼肌细胞中通过外显子跳读成功地去除了突变基因组序列。使用不同的AAV9递送模式，发明人恢复了mdx小鼠的心肌和骨骼肌中的肌养蛋白表达。mdx小鼠模型和使用肌编辑(myoediting)机制的AAV递送校正外显子23已经用于在体内显示使用包含突变的基因组区域中的多个切割进行的外显子跳读方法的概念证明。然而，更高效和安全的基因组编辑和DMD方法将提供更有力的方法来干预这种疾病。
在一些实施方案中，核酸包含编码靶向第一基因组靶序列的第一DMD指导RNA的序列，编码靶向第二基因组靶序列的第二DMD指导RNA的序列，编码第一启动子的序列，其中第一启动子驱动编码第一DMD指导RNA的序列的表达，和编码第二启动子的序列，其中第二启动子驱动编码第二DMD指导RNA的序列的表达，其中第一基因组靶序列和第二基因组靶序列各自包含肌养蛋白剪接接纳体(splice acceptor)位点。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列和编码第二启动子的序列相同。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列和编码第二启动子的序列不相同。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列和编码第二启动子的序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。在一些实施方案中，第一基因组靶序列与第二基因组靶序列相同。在一些实施方案中，第一基因组靶序列与第二基因组靶序列不相同。在一些实施方案中，第一基因组靶序列与第二基因组靶序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。在一些实施方案中，第一基因组靶序列与第二基因组靶序列是互补的。在一些实施方案中，核酸还包含编码靶向第三基因组靶序列的第三DMD指导RNA的序列，和编码第三启动子的序列，其中第三启动子驱动编码第三DMD指导RNA的序列的表达，并且其中第三基因组靶序列包含肌养蛋白剪接接纳体位点。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列和编码第三启动子的序列中的至少两个相同。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列和编码第三启动子的序列中的至少两个不相同。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列和编码第三启动子的序列中的至少两个具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列和第三基因组靶序列中的至少两个相同。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列和第三基因组靶序列中的至少两个不相同。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列和第三基因组靶序列中的至少两个具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列和第三基因组靶序列中的至少两个是互补的。在一些实施方案中，核酸还包含编码靶向第四基因组靶序列的第四DMD指导RNA的序列，和编码第四启动子的序列，其中第四启动子驱动编码第四DMD指导RNA的序列的表达，其中第四基因组靶序列包含肌养蛋白剪接接纳体位点。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列和编码第四启动子的序列中的至少两个相同。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列和编码第四启动子的序列中的至少两个不相同。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列和编码第四启动子的序列中的至少两个具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列和第四基因组靶序列中的至少两个相同。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列和第四基因组靶序列中的至少两个不相同。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列和第四基因组靶序列中的至少两个具有至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％的序列同一性。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列和第四基因组靶序列中的至少两个是互补的。在一些实施方案中，核酸还包含编码靶向第五基因组靶序列的第五DMD指导RNA的序列，和编码第五启动子的序列，其中第五启动子驱动编码第五DMD指导RNA的序列的表达，其中第五基因组靶序列包含肌养蛋白剪接接纳体位点。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少两个相同。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少两个不相同。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少两个具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列、第四基因组靶序列和第五基因组靶序列中的至少两个相同。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列、第四基因组靶序列和第五基因组靶序列中的至少两个不相同。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列、第四基因组靶序列和第五基因组靶序列中的至少两个具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。在一些实施方案中，第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列、第四基因组靶序列和第五基因组靶序列中的至少两个是互补的。在一些实施方案中，核酸还包含至少一个编码靶向基因组靶序列的另外的DMD指导RNA的序列，和至少一个另外的启动子，其中另外的启动子驱动编码另外的DMD指导RNA的序列的表达，其中另外的基因组靶序列包含肌养蛋白剪接接纳体位点。在一些实施方案中，肌养蛋白剪接接纳体位点包含外显子51的5’剪接接纳体位点。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列或编码第二启动子的序列包含编码组成型启动子的序列。在一些实施方案中，第一启动子或第二启动子包含组成型启动子。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含编码组成型启动子的序列。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子和第五启动子中的至少一个包含组成型启动子。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列或编码第二启动子的序列包含编码诱导型启动子的序列。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子和第五启动子中的至少一个包含诱导型启动子。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列或编码第二启动子的序列包含编码细胞类型特异性启动子的序列。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含细胞类型特异性启动子。在一些实施方案中，细胞类型特异性启动子包含肌肉特异性启动子。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列或编码第二启动子的序列包含编码U6启动子、H1启动子或7SK启动子的序列。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含U6启动子、H1启动子或7SK启动子。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含U6启动子。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含H1启动子。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含7SK启动子。在一些实施方案中，编码第一DMD指导RNA的序列、编码第二DMD指导RNA的序列和编码第三DMD指导RNA的序列相同，并且5’剪接接纳体位点包含外显子51的5’剪接接纳体位点。在一些实施方案中，编码第一启动子的序列包含编码U6启动子的序列，编码第二启动子的序列包含编码H1启动子的序列，并且编码第三启动子的序列包含7SK启动子。在一些实施方案中，核酸包含DNA序列。在一些实施方案中，核酸包含RNA序列。在一些实施方案中，核酸还包含一个或更多个编码反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)的序列。在一些实施方案中，核酸还包含编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含分离或衍生自腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含分离或衍生自血清型2的腺相关病毒(AAV)(AAV2)的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列包含分离或衍生自AAV2的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含分离或衍生自血清型4的腺相关病毒(AAV)(AAV4)的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列包含分离或衍生自AAV4的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含145个核苷酸或由145个核苷酸组成。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含115个核苷酸或由115个核苷酸组成。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含141个核苷酸或由141个核苷酸组成。在一些实施方案中，核酸还包含聚腺苷(poly A)序列。在一些实施方案中，poly A序列是微型poly A(mini poly A)序列。在一些实施方案中，编码第一DMD指导RNA的序列或编码第二DMD指导RNA的序列包含SEQ ID No.60-382、706-708和712-719中任一个的序列。在一些实施方案中，编码第一DMD指导RNA的序列或编码第二DMD指导RNA的序列包含SEQ ID NO：714的序列。
还提供了包含核酸的载体，所述核酸包含编码靶向第一基因组靶序列的第一DMD指导RNA的序列，编码靶向第二基因组靶序列的第二DMD指导RNA的序列，编码第一启动子的序列，其中第一启动子驱动编码第一DMD指导RNA的序列的表达，和编码第二启动子的序列，其中第一启动子驱动编码第二DMD指导RNA的序列的表达，其中第一基因组靶序列和第二基因组靶序列各自包含肌养蛋白剪接接纳体位点。在一些实施方案中，载体还包含编码转座元件的反向末端重复的序列。在一些实施方案中，转座元件是转座子。在一些实施方案中，转座子是Tn7转座子。在一些实施方案中，载体是非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，AAV载体是复制缺陷型(replication-defective)或条件性复制缺陷型的(conditionally replication defective)。在一些实施方案中，AAV载体是重组AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体包含分离或衍生自以下血清型的AAV载体的序列：血清型1(AAV1)、2(AAV2)、3(AAV3)、4(AAV4)、5(AAV5)、6(AAV6)、7(AAV7)、8(AAV8)、9(AAV9)、10(AAV10)、11(AAV11)或其任何组合。在一些实施方案中，AAV载体包含分离或衍生自血清型9的AAV载体(AAV9)的序列。在一些实施方案中，AAV载体包含分离或衍生自血清型2的AAV载体(AAV2)的序列。在一些实施方案中，AAV载体包含分离或衍生自AAV2的序列和分离或衍生自AAV9的序列。在一些实施方案中，AAV载体包含分离或衍生自AAV4的序列和分离或衍生自AAV9的序列。在一些实施方案中，载体被优化成在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，载体被优化成在人细胞中表达。在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO.914、SEQ ID NO.915、SEQ ID NO.916或SEQ ID NO.917的核酸序列。
还提供了包含编码启动子的序列和编码Cas9或其核酸酶结构域的序列的核酸，其中编码启动子的序列包含编码肌肉特异性启动子的序列。在一些实施方案中，编码肌肉特异性启动子的序列包含编码CK8启动子的序列。在一些实施方案中，编码肌肉特异性启动子的序列包含编码CK8e启动子的序列。在一些实施方案中，编码Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列分离或衍生自编码化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列。在一些实施方案中，编码Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列分离或衍生自编码金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列。在一些实施方案中，编码Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列被密码子优化成在哺乳动物中表达。在一些实施方案中，编码Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列被密码子优化成在人中表达。在一些实施方案中，核酸还包含polyA序列。在一些实施方案中，polyA序列是微型polyA序列。在一些实施方案中，核酸还包含编码还包含一个或更多个编码反向末端重复(ITR)的序列。在一些实施方案中，核酸还包含编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3'ITR的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含分离或衍生自腺相关病毒(AAV)的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3'ITR的序列包含分离或衍生自血清型2的腺相关病毒(AAV)(AAV2)的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3'ITR的序列包含分离或衍生自AAV2的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3'ITR的序列包含分离或衍生自血清型4的腺相关病毒(AAV)(AAV4)的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3'ITR的序列包含分离或衍生自AAV4的序列。在一些实施方案中，编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3'ITR的序列包含145个核苷酸、115个核苷酸或141个核苷酸，或由其组成。在一些实施方案中，核酸还包含核定位信号。在一些实施方案中，核酸被优化成在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，核酸被优化成在人细胞中表达
还提供了包含核酸的载体，所述核酸包含编码启动子的序列和编码Cas9或其核酸酶结构域的序列，其中编码启动子的序列包含编码肌肉特异性启动子(例如CK8或CK8e启动子)的序列。在一些实施方案中，载体还包含编码转座元件的反向末端重复(ITR)的序列。在一些实施方案中，转座元件是转座子。在一些实施方案中，转座子是Tn7转座子。在一些实施方案中，载体还包含编码T7转座子的5'ITR的序列和编码T7转座子的3’ITR的序列。在一些实施方案中，载体是非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，AAV载体是复制缺陷型或条件性复制缺陷型的。在一些实施方案中，AAV载体是重组AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体包含分离或衍生自以下血清型的AAV载体的序列：血清型1(AAV1)、2(AAV2)、3(AAV3)、4(AAV4)、5(AAV5)、6(AAV6)、7(AAV7)、8(AAV8)、9(AAV9)、10(AAV10)、11(AAV11)或其任何组合。在一些实施方案中，AAV载体分离或衍生自血清型9的AAV载体(AAV9)的序列。在一些实施方案中，AAV载体包含分离或衍生自血清型2的AAV载体(AAV2)的序列。在一些实施方案中，AAV载体包含分离或衍生自AAV2的序列和分离或衍生自AAV9的序列。在一些实施方案中，AAV载体包含分离或衍生自血清型4的AAV载体(AAV4)的序列。在一些实施方案中，AAV载体包含分离或衍生自AAV4的序列和分离或衍生自AAV9的序列。在一些实施方案中，其中载体被优化成在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，载体被优化成在人细胞中表达。在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO.899、SEQ IDNO.900、SEQ ID NO.901或SEQ ID NO.902的核酸序列。
还提供了包含一种或更多种本公开内容的核酸的细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肌细胞或卫星细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干(induced pluripotent stem，iPS)细胞。
还提供了包含一种或更多种本公开内容的核酸的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。
还提供了包含细胞的组合物，所述细胞包含一种或更多种本公开内容的核酸。在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。
还提供了包含一种或更多种本公开内容的载体的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。
还提供了包含组合物的细胞，所述组合物包含一种或更多种本公开内容的载体。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肌细胞或卫星细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干(iPS)细胞。
在一些实施方案中，组合物包含(i)第一核酸序列，所述第一核酸序列包含编码靶向第一基因组靶序列的第一DMD指导RNA的序列，编码靶向第二基因组靶序列的第二DMD指导RNA的序列，编码第一启动子的序列，其中第一启动子驱动编码第一DMD指导RNA的序列的表达，和编码第二启动子的序列，其中第一启动子驱动编码第二DMD指导RNA的序列的表达，其中第一基因组靶序列和第二基因组靶序列各自包含肌养蛋白剪接接纳体，和(ii)第二核酸序列，所述第二核酸序列包含编码启动子的序列和编码Cas9或其核酸酶结构域的序列，其中编码启动子的序列包含编码肌肉特异性启动子(例如CK8或CK8e启动子)的序列。在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。
在一些实施方案中，组合物包含(i)第一载体，所述第一载体包含核酸序列，所述核酸序列包含编码靶向第一基因组靶序列的第一DMD指导RNA的序列，编码靶向第二基因组靶序列的第二DMD指导RNA的序列，编码第一启动子的序列，其中第一启动子驱动编码第一DMD指导RNA的序列的表达，和编码第二启动子的序列，其中第一启动子驱动编码第二DMD指导RNA的序列的表达，其中第一基因组靶序列和第二基因组靶序列各自包含肌养蛋白剪接接纳体和(ii)第二载体，所述第二载体包含核酸序列，所述核酸序列包含编码启动子的序列和编码Cas9或其核酸酶结构域的序列，其中编码启动子的序列包含编码肌肉特异性启动子(例如CK8或CK8e启动子)的序列。在一些实施方案中，第一载体和第二载体中的至少一种是AAV。在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。
还提供了用于校正肌养蛋白缺陷的方法，所述方法包括使细胞与一种或更多种本公开内容的组合物在适于表达第一DMD指导RNA、第二DMD指导RNA和Cas9蛋白或核酸酶结构域的条件下接触，其中第一DMD指导RNA或第二DMD指导RNA中的至少一种与Cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合物以形成至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物，其中所述至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物破坏肌养蛋白剪接位点并诱导DMD外显子的选择性跳读。
还提供了用于校正肌养蛋白缺陷的方法，所述方法包括使细胞与一种或更多种本公开内容的组合物在适于表达第一DMD指导RNA、第二DMD指导RNA和Cas9蛋白或核酸酶结构域的条件下接触，其中第一DMD指导RNA或第二DMD指导RNA中的至少一种与Cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合物以形成至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物，其中所述至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物诱导肌养蛋白阅读框的重构(reframing)。在一些实施方案中，肌养蛋白阅读框的重构诱导插入。在一些实施方案中，插入包含单个腺苷核苷酸或由单个腺苷核苷酸组成。
还提供了用于诱导DMD外显子的选择性跳读的方法，所述方法包括使细胞与一种或更多种本公开内容的组合物在适于表达第一DMD指导RNA、第二DMD指导RNA和Cas9蛋白或其核酸酶结构域的条件下接触，其中第一DMD指导RNA或第二DMD指导RNA中的至少一种与Cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合物以形成至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物，其中所述至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物破坏肌养蛋白剪接位点并诱导DMD外显子的择性跳读。
还提供了用于在肌养蛋白阅读框中诱导重构事件的方法，所述方法包括使细胞与一种或更多种本公开内容的组合物在适于表达第一DMD指导RNA、第二DMD指导RNA和Cas9蛋白或其核酸酶结构域的条件下接触，其中第一DMD指导RNA或第二DMD指导RNA中的至少一种与Cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合物以形成至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物，其中所述至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物破坏肌养蛋白剪接位点并诱导DMD外显子的选择性跳读。在一些实施方案中，所述至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物破坏肌养蛋白剪接位点并诱导人DMD基因的外显子51的选择性跳读。
还提供了在有需要的对象中治疗肌营养不良的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的一种或更多种本公开内容的组合物。在一些实施方案中，组合物局部施用。在一些实施方案中，组合物直接施用于肌组织。在一些实施方案中，组合物通过肌内输注或注射施用。在一些实施方案中，肌组织包括胫骨前肌组织(tibialis anterior tissue)、四头肌组织(quadricep tissue)、比目鱼肌组织(soleus tissue)、膈肌组织(diaphagm tissue)或心脏组织。在一些实施方案中，组合物通过心内注射施用。在一些实施方案中，组合物全身施用。在一些实施方案中，组合物通过静脉内输注或注射施用。在一些实施方案中，在施用组合物后，对象表现出正常肌养蛋白阳性肌纤维和含有集中核(centralized nuclei)的嵌合(mosaic)肌养蛋白阳性肌纤维或其组合。在一些实施方案中，在施用组合物之后，当与施用组合物之前正常肌养蛋白阳性肌纤维不存在或丰度水平相比，对象表现出正常肌养蛋白阳性肌纤维出现或丰度水平升高。在一些实施方案中，在施用组合物之后，当与施用组合物之前含有集中核的嵌合肌养蛋白阳性肌纤维不存在或丰度水平相比，对象表现出含有集中核的嵌合肌养蛋白阳性肌纤维出现或丰度水平升高。在一些实施方案中，在施用组合物之后，当与施用组合物之前的血清CK水平相比，对象表现出降低的血清CK水平。在一些实施方案中，在施用组合物之后，当与施用组合物之前的握力(grip strength)相比，对象表现出改善的握力。在一些实施方案中，对象是新生儿、婴儿、儿童、年轻成人或成人。在一些实施方案中，对象患有肌营养不良。在一些实施方案中，对象是肌营养不良的遗传携带者。在一些实施方案中，对象是男性。在一些实施方案中，对象是女性。在一些实施方案中，对象表现为无症状，并且其中遗传学诊断(genetic diagnosis)揭示DMD基因的一个或两个拷贝中的损害DMD基因产物功能的突变。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的早期体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的早期体征或症状包括肌肉量(muscle mass)损失或近端肌无力。在一些实施方案中，肌肉量损失或近端肌无力发生在一条或两条腿和/或骨盆中，接着是一个或更多个上身(upper body)肌肉中。在一些实施方案中，肌营养不良的早期体征或症状还包括假性肥大、低耐力、站立困难、行走困难、攀登楼梯困难或其组合。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的进行性体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的进行性体征或症状包括肌组织萎缩(muscle tissue wasting)、肌组织被脂肪代替、或肌组织被纤维化组织代替。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的晚期体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的晚期体征或症状包括骨发育异常、脊柱弯曲(curvature of thespine)、运动丧失和瘫痪(paralysis)。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的神经学体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的神经学体征或症状包括智力受损(intellectual impairment)和瘫痪。在一些实施方案中，组合物的施用发生在对象呈现肌营养不良的一种或更多种进行性、晚期或神经学体征或症状之前。在一些实施方案中，对象小于10岁、小于5岁或小于2岁。
还提供了治疗有效量的一种或更多种本公开内容的组合物用于在有需要的对象中治疗肌营养不良的用途。
如本说明书中所使用的，未用数量词限定的名词可以表示一个/种或更多个/种。如本文在权利要求中所使用的，当与词语“包括”结合使用时，未用数量词限定的名词可以表示一个/种或多于一个/种。
权利要求中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅涉及替代方案的定义和“和/或”。如本文所用，“另外的”可以表示至少第二个或更多个。
在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括装置的误差、用于确定值的方法、或者存在于研究对象之间的固有变化。这种固有变化可以是所述值的±10％的变化。
在整个申请中，除非另有说明，否则核苷酸序列以5’至3’方向列出，并且氨基酸序列以N端至C端方向列出。
从以下详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应该理解的是，详细描述和具体实例虽然表明了本发明的优选实施方案，但其仅以说明的方式给出，因为从该详细描述中，本发明的精神和范围内的多种变化和修改对于那些人将变得明显。
附图简述
专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由主管局提供。
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过结合本文给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个，可以更好地理解本公开内容。
图1A-F.“人源化”-ΔEx50小鼠模型。(图1A)显示CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法以产生人源化小鼠模型的策略。(图1B)RT-PCR分析以验证外显子50的缺失(ΔEx50)。(图1C)RT-PCR产物的序列，以验证外显子50缺失和框外序列的产生(核酸序列＝SEQ IDNO：1；氨基酸序列＝SEQ ID NO：2)。(图1E)胫骨前肌和心脏组织中肌养蛋白和黏着斑蛋白表达的Western印迹分析。(图1F)在野生型(WT)、ΔEx50和mdx小鼠中测量血清CK的水平，其是反映肌肉损伤和膜渗漏的肌肉营养不良的标志物。(图1D)通过苏木精和伊红(H&E)染色的心肌和骨骼肌的组织化学，以及使用肌养蛋白抗体的免疫组织化学。比例尺：50μm。
图2A-B.外显子51跳读。(图2A)肌内注射后3周来自ΔEx50小鼠的RNA的RT-PCR表明外显子51的缺失(称为ΔEx50-51，下方的带)。(图2B)ΔEx50-51带的RT-PCR产物的序列证实外显子49直接剪接到外显子52，不包含外显子51(核酸序列＝SEQ ID NO：3；氨基酸序列＝SEQ ID NO：4)。
图3A-G.在肌内注射后3周使用三重gRNA策略校正肌养蛋白表达。(图3A)显示CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法以校正ΔEx50小鼠模型中的阅读框的策略。(图3B)靶向剪接接纳体位点的sgRNA(sgRNA-ex51-SA)序列和sgRNA结合位置的示意图。图3B按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 954-957。(图3C)AAV注射质粒和策略的示意图。使用用于sgRNA-ex51-SA和sgRNA-ex51-SD的rAAV9-sgRNA质粒的双重指导策略。使用含有3个拷贝的sgRNA-ex51-SA的rAAV9-sgRNA质粒的三重指导。肌肉肌酸激酶8(CK8)启动子表达SpCas9。用于RNA聚合酶III的U6、H1和7SK启动子表达sgRNA。(图3D)胫骨前肌的肌养蛋白免疫组织化学染色。(图3E)通过面积归一化的肌养蛋白阳性纤维的定量。(图3F)肌内注射后3周肌养蛋白(DMD)和黏着斑蛋白(VCL)表达的Western印迹分析。(图3G)相对于黏着斑蛋白归一化之后肌养蛋白表达的定量。数据表示为平均值±SEM。**P＜0.005。比例尺：50μm。
图4A-B.3周后经注射肌肉的组织学改善。(图4A)通过苏木精和伊红(H&E)染色的胫骨前肌的组织化学。(图4B)纤维尺寸和频率百分比的定量。数据表示为平均值±SEM。比例尺：50μm。给定纤维尺寸的每组四个数据点从左至右为Δ50-CTL、WT-CTL、Δ50-AAV-TriSA和Δ50-AAV-SA+SD。
图5.在293细胞和小鼠10T细胞中筛选人sgRNA。2％琼脂糖凝胶上的未消化的PCR产物(上图)和T7E1消化物(下图)。M表示尺寸标记带。bp表示标记带的长度。
图6.整个胫骨前肌的肌养蛋白免疫组织化学染色。
图7A-B.ΔEx50小鼠中CRISPR/Cas9介导的基因组编辑的策略。(图7A)显示CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法以校正ΔEx50小鼠模型中的阅读框的策略。(图7B)靶向剪接接纳体位点的sgRNA(sgRNA-ex51-SA2)序列和sgRNA结合位置的示意图。图7B按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 958-959。
图8A-F.小鼠和人细胞中的sgRNA基因组分析(图8A)在10T1/2细胞中存在或不存在小鼠sgRNA-sgRNA-51-SA2的情况下表达Cas9，并且在基于荧光的分选细胞(FACS)(+)和未分选细胞(-)中通过T7E1测定监测基因编辑。GFP用作对照。未消化的PCR产物(上图)和T7E1消化物(下图)显示在2％琼脂糖凝胶上。黑色箭头表示未消化的771bp PCR带。下图中的绿色箭头表示通过T7E1测定的切割带。M表示尺寸标记带。bp表示标记带的长度。(图8B)在10T1/2细胞中跨外显子51靶位点产生的PCR扩增子的基因组深度测序分析。显示插入(以绿色突出显示)和缺失(以红色突出显示)的与sgRNA序列(以蓝色表示)比对的代表性插入缺失序列(分别为SEQ ID NO 960-966，按出现的顺序)。线表示位于sgRNA位点的预测的外显子剪接增强子(ESE)序列。黑色箭头表示切割位点。(图8C)具有位于sgRNA位点的预测的外显子剪接增强子(ESE)的小鼠外显子51序列(SEQ ID NO：967)用红色表示。具有位于sgRNA位点的预测的外显子剪接增强子(ESE)的人外显子51序列(SEQ ID NO：968)用红色表示。(图8D)使用ESEfinder3预测的外显子51的小鼠和人ESE位点。(图8E)在293T人细胞中存在或不存在小鼠sgRNA-sgRNA-51-SA2的情况下表达Cas9，并且在基于荧光的分选细胞(FACS)(+)和未分选细胞(-)中通过T7E1测定监测基因编辑。GFP用作对照。未消化的PCR产物(上图)和T7E1消化物(下图)显示在2％琼脂糖凝胶上。黑色箭头表示未消化的771bp PCR带。下图中的绿色箭头表示通过T7E1测定的切割带。M表示尺寸标记带。bp表示标记带的长度。(图8F)显示缺失和插入的与sgRNA序列(以蓝色表示)比对的代表性插入缺失序列(分别为SEQ ID NO 969-978，按出现的顺序)。黑色箭头表示切割位点。
图9A-B.AAV注射质粒和策略的示意图。(图9A)肌肉肌酸激酶8(CK8)启动子表达SpCas9。(图9B)使用含有3个拷贝的sgRNA-ex51-SA2的rAAV9-sgRNA质粒的三重指导。用于RNA聚合酶III的U6、H1和7SK启动子表达sgRNA。
图10A-B.体内Dmd基因编辑。(图10A)在用AAV9-sgRNA-SA2和AAV9-Cas9表达载体肌内注射后3周，来自WT和ΔEx50小鼠的TA(胫骨前肌)肌肉样品的2％琼脂糖凝胶上显示未消化的PCR产物(上图)和T7E1消化物(下图)。对照仅注射AAV9-Cas9而不注射AAV9-sgRNA-SA2。上图中的黑色箭头表示771bp PCR带。下图中的绿色箭头表示通过T7E1测定的切割带。M表示尺寸标记带。bp表示标记带的长度。N＝4。(图1OB)注射AAV9-sgRNA-51-SA2和AAV9-Cas9的ΔEx50小鼠中跨外显子51靶位点产生的PCR扩增子的基因组深度测序分析。显示插入(以绿色突出显示)和缺失(以红色突出显示)的与sgRNA序列(以蓝色表示)比对的代表性插入缺失序列。(分别为SEQ ID NO 979-1014，按出现的顺序)。黑色箭头表示切割位点。n＝3。
图11A-D。阅读框校正的RT-PCR分析。(图11A)在肌内注射sgRNA-51-SA2和Cas9表达载体后3周，来自野生型(WT)和ΔEx50小鼠的胫骨前肌的RNA的RT-PCR。下方的肌养蛋白带指示外显子51的缺失。指示了外显子48和53中的引物位置(Fw，Rv)。(图11B)使用TOPO-TA产生的克隆的RT-PCR序列分析，在AAV9-sgRNA-51-SA2处理后在外显子51处检测到的事件的百分比。对于4种不同样品中的每一种，我们产生并测序了40个克隆。RT-PCR产物分为4组：未编辑(NE)、外显子51-跳读(SK)、重构框(RF)和框外(OF)。(图11C)ΔEx50-51小鼠肌养蛋白下方带的RT-PCR产物的序列证实外显子49直接剪接到外显子52，不包含外显子51。ΔEx50重构框(ΔEx50-RF)的RT-PCR产物的序列。图11C按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO1015-1022。(图11D)来自包含ΔEx50未编辑(NE)和ΔEx50-RF的上方带的RT-PCR产物的深度测序分析。显示插入(以绿色突出显示)和缺失(以红色突出显示)的RT-PCR产物的序列。N＝4。数据表示为平均值±SEM。图11D按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 1023-1026。
图12A-D.肌内注射AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA-51-SA2校正肌养蛋白的表达。(图12A)向ΔEx50小鼠的胫骨前肌注射编码sgRNA和Cas9的AAV9载体，并在3周后通过免疫染色分析肌养蛋白。野生型对照(WT-CTL)小鼠和ΔEx50小鼠对照(ΔEx50-CTL)仅注射AAV9-Cas9而不注射sgRNA。在每个组中显示了与WT-CTL相比，ΔEx50-CTL小鼠和经处理的ΔEx50小鼠(ΔEx50-AAV9-sgRNA-51-SA2和AAV9-Cas9)中肌养蛋白阳性肌纤维的百分比。(图12B)胫骨前肌的苏木精和伊红(H&E)染色。(图12C)肌内注射后3周胫骨前肌中肌养蛋白(DMD)和黏着斑蛋白(VCL)表达的Western印迹分析。(图12D)在相对于黏着斑蛋白归一化之后，来自印迹的肌养蛋白表达的定量。星号表示非特异性免疫反应带。对于AAV9-sgRNA-51-SA2，n＝5。比例尺：50μm
图13.在ΔEx50小鼠模型中肌内注射AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA-51-SA2后拯救肌养蛋白的表达。整个胫骨前肌的肌养蛋白免疫组织化学。CTL小鼠仅注射AAV9-Cas9而不注射AAV9-sgRNA-51-SA2。n＝5。
图14. 3周后经注射肌肉的组织学改善。通过苏木精和伊红(H&E)染色的胫骨前肌的组织化学。
图15A-B.在ΔEx50小鼠模型中肌内注射AAV9-Cas9与表达单拷贝或三拷贝sgRNA的不同AAV9的组合后拯救肌养蛋白表达。(图15A)用于RNA聚合酶III的U6、H1和7SK启动子各自单独用于表达单拷贝(AAV9-U6-sgRNA-51-SA2；AAV9-H1-sgRNA-51-SA2；AAV9-7SK-sgRNA-51-SA2)或三拷贝sgRNA。(图15B)整个胫骨前肌的肌养蛋白免疫组织化学。对照(CTL)小鼠仅注射AAV9-Cas9而不注射AAV9-sgRNA-51-SA2。
图16A-B.在ΔEx50小鼠中全身递送AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA-51-SA2后4周拯救肌养蛋白表达。(图16A)全身注射AAV9-sgRNA-51后8周，胫骨前肌(TA)、三头肌、膈肌和心肌的肌养蛋白免疫染色。(图16B)TA、三头肌、膈肌和心脏中肌养蛋白(DMD)和黏着斑蛋白(VCL)表达的Western印迹分析。每组n＝5。比例尺：50μm。
图17A-B.在ΔEx50小鼠中全身递送AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA-51-SA2后8周拯救肌养蛋白表达。(图17A)全身注射AAV9-sgRNA-51后8周，胫骨前肌(TA)、三头肌、膈肌和心肌的肌养蛋白免疫染色。(图17B)TA、三头肌、膈肌和心脏中肌养蛋白(DMD)和黏着斑蛋白(VCL)表达的Western印迹分析。每组n＝5。比例尺：50μm。
图18A-B。在ΔEx50小鼠中全身递送AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA-51-SA2后4周的功能改善。(图18A)对野生型(WT)小鼠、对照ΔEx50小鼠和用AAV9-sgRNA-51处理的ΔEx50小鼠(ΔEx50-AAV9-sgRNA-51)进行握力测试以测量肌肉性能(克力)。(图18B)在WT、ΔEx50和ΔEx50-AAV9-sgRNA-51小鼠中测量血清肌酸激酶(CK)。N＝5。星号表示非特异性免疫反应带。数据表示为平均值±SEM。
图19.在ΔEx50-MD狗中肌内注射后6周校正肌养蛋白表达。野生型狗(Nathan)、未经处理的ΔEx50-MD狗和两只对侧未注射和AAV9-Cas9-sgRNA注射颅胫骨肌的ΔEx50-MD狗(Norman和Newton)的颅胫骨肌的肌养蛋白免疫组织化学染色。比例尺：50μm。
图20A-B.在ΔEx50-MD狗中肌内注射后6周校正肌养蛋白表达。(图20A)野生型狗(Nathan)、未经处理的ΔEx50-MD狗和两只对侧未注射和AAV9-Cas9-sgRNA注射颅胫骨肌的ΔEx50-MD狗(Norman和Newton)的颅胫骨肌的肌养蛋白(DMD)和黏着斑蛋白(VCL)的Western印迹分析。(图20B)在相对于黏着斑蛋白归一化之后来自两个独立印迹的肌养蛋白表达的定量。
图21.在ΔEx50-MD狗中6周后经注射肌肉的组织学改善。野生型狗(Nathan)、对侧未注射和AAV9-Cas9-sgRNA注射颅胫骨肌的ΔEx50-MD狗(Norman和Newton)的颅胫骨肌的通过苏木精和伊红(H&E)染色的组织化学。比例尺：50μm。
发明详述
DMD是一种新的突变综合征，已经在人类中发现了超过4,000种独立突变(万维网dmd.nl)。大多数患者突变包括聚集在热点中的缺失，因此跳读某些外显子的治疗方法适用于大量患者。外显子跳读方法的基本原理是基于DMD和贝克尔肌营养不良(Beckermuscular dystrophy，BMD)患者之间的遗传差异。在DMD患者中，肌养蛋白mRNA的阅读框被破坏，导致过早截短的无功能的肌养蛋白。BMD患者在DMD基因中具有突变，其维持阅读框以允许产生内部缺失但具有部分功能的肌养蛋白，导致比DMD患者轻得多的疾病症状。
本文提供了用于治疗DMD的组合物和方法。在一些实施方案中，提供了AAV构建体，其中AAV构建体包含编码三个启动子的核酸，每个启动子驱动DMD指导RNA的表达。使用本文公开的组合物和方法，在具有外显子50缺失的DMD的人源化小鼠模型和在ΔEx50-MD狗中实现了更稳健和安全的基因组编辑形式。以下再现了本公开内容的这些和其他方面。
I.迪谢内肌营养不良
A.背景
迪谢内肌营养不良(DMD)是一种隐性的X连锁形式的肌营养不良，影响约五千分之一的男孩，导致肌肉变性和早夭。该疾病由位于人X染色体上的编码蛋白质肌养蛋白(GenBank登录号AAA53189；SEQ ID NO：5)的肌养蛋白基因(参见GenBank登录号NC_000023.11)中的突变引起，其序列如下：
在人中，肌养蛋白mRNA含有79个外显子。已知肌养蛋白mRNA可选择地剪接，产生多种同种型。示例性肌养蛋白同种型列于表1中。
表1：肌养蛋白同种型
鼠肌养蛋白具有以下氨基酸序列(Uniprot登录号P11531，SEQ.ID.NO：869)：
肌养蛋白是肌组织中的重要组分，其为细胞膜的肌养蛋白聚糖复合物(dystroglycan complex，DGC)提供结构稳定性。虽然两性都可以携带突变，但女性很少受到该疾病的骨骼肌形式的影响。
突变的性质和频率各不相同。在约60-70％的病例中发现大的遗传缺失，在约10％的病例中发现大的重复，并且点突变体或其他小的变化占病例的约15-30％。Bladen等人(2015)检查了大约7000个突变，共编目了5,682个大突变(占总突变的80％)，其中4,894个(86％)为缺失(1个外显子或更大)并且784个(14％)为重复(1个外显子或更大)。有1,445个小突变(小于1个外显子，占所有突变的20％)，其中358个(25％)是小缺失并且132个(9％)是小插入，而199个(14％)影响剪接位点。点突变总计756个(小突变的52％)，其中726个(50％)无义突变和30个(2％)错义突变。最后，观察到22个(0.3％)内含子中(mid-intronic)突变。此外，在数据库中鉴定出可能潜在受益于DMD的新遗传疗法包括终止密码子通读疗法(总突变的10％)和外显子跳读疗法(缺失的80％和总突变的55％)的突变。
B.症状
症状通常出现在2岁至3岁的男孩中，并且在婴儿早期可见。即使症状直到婴儿早期仍不出现，实验室测试也可鉴定出生时携带活跃突变的儿童。首先观察到与肌肉重量损失相关的腿和骨盆的进行性近端肌无力。最终这种无力蔓延到手臂、颈部和其他区域。早期体征可包括假性肥大(腓肠肌和三角肌的增大)、低耐力以及无辅助下站立的困难或无法上楼梯。随着病症发展，肌组织经历萎缩，并最终被脂肪和纤维化组织(纤维化)替代。到10岁时，可能需要支具来帮助行走，但是大多数患者到12岁时仍然依赖轮椅。随后的症状可包括导致骨骼畸形(包括脊柱弯曲)的异常骨发育。由于肌肉的进行性地恶化，发生运动的丧失，最终导致瘫痪。智力障碍可存在也可不存在，但是如果存在，不会随着儿童年龄而进行性地恶化。患有DMD的男性的平均寿命期望为约25岁。
迪谢纳肌营养不良(一种进行性神经肌肉疾病)的主要症状是与肌肉萎缩相关的肌无力，其中首先受影响的是随意肌，特别是臀部、骨盆区域、大腿、肩膀和小腿的那些。随后在手臂、颈部和其他区域也发生肌无力。腓肠肌经常增大。症状通常在6岁以前出现，并且可能出现在婴儿早期。另一些身体症状有：
1.不便的行走、踏步或跑步方式-(患者倾向于靠其前趾行走，原因是腓肠肌张力增加。而且，脚趾行走是对膝伸肌无力的补偿性适应)。
2.频繁跌倒。
3.疲劳。
4.运动技能(跑步、跳跃、跳高)困难。
5.腰椎脊柱前凸过度(lumbar hyperlordosis)，可能导致髋-屈肌缩短。这对整体姿势以及步行、踏步或跑步的方式有影响。
6.跟腱和腘旁腱(hamstring)的肌肉挛缩损害功能，原因是肌纤维缩短和结缔组织中的纤维化。
7.进行性行走困难。
8.肌纤维畸形。
9.舌和腓肠肌的假性肥大(增大)。肌组织最终被脂肪和结缔组织替代，因此称为假性肥大。
10.神经行为障碍(例如，ADHD)、学习障碍(诵读困难)和特定认知技能(特别是短期言语记忆)的非进行性虚弱的较高风险，这被认为是脑缺乏肌养蛋白或肌养蛋白功能障碍的结果。
11.最终丧失行走能力(通常在12岁时)。
12.骨骼畸形(包括某些情况下的脊柱侧凸)。
13.由躺卧或坐姿站起来困难。
通常在临床上可从患者迈出他的第一步的那一刻起就可观察到该病症，并且行走的能力通常在男孩9至12岁之间完全丧失。大多数受DMD影响的男性到21岁时基本上“从颈部以下瘫痪”。肌肉萎缩始于腿和骨盆，随后发展到肩膀和颈部的肌肉，随后丧失手臂肌肉和呼吸肌。腓肠肌增大(假性肥大)相当明显。心肌病特别是(扩张型心肌病)是常见的，但是充血性心力衰竭或心律失常(不规则心跳)的发生只是偶尔的。
阳性高尔斯征(Gowers’sign)反映下肢肌肉更严重的损伤。儿童用上肢帮助自己站起来：首先靠他的胳膊和膝盖立起来，随后用手沿着他的腿向上“走”以直立。受影响的儿童通常比同龄儿童更容易疲倦并且总体力量更小。血流中的肌酸激酶(CPK-MM)水平极高。肌电图(electromyography，EMG)示出无力是由肌组织的破坏而不是由神经的损伤引起的。遗传学测试可以揭示Xp21基因中的遗传错误。肌肉活检(免疫组织化学或免疫印迹)或遗传学测试(血液测试)证实缺乏肌养蛋白，虽然遗传学测试的改进通常使得这不必要。
DMD患者可能患有：
1 心肌异常(心肌病)
2 充血性心力衰竭或不规则的心律(心律失常)
3 胸部和背部的畸形(脊柱侧凸)
4 腓肠肌、臀部和肩膀的肌肉增大(约4或5岁)。这些肌肉最终被脂肪和结缔组织替代(假性肥大)。
5 肌肉重量损失(萎缩)
6 脚跟、腿部肌肉挛缩
7 肌肉畸形
8 呼吸系统病症，包括肺炎和吞咽食物或流体进入肺中(在疾病的晚期)
C.原因
迪谢纳肌营养不良(DMD)由位于X染色体短臂上的基因座Xp21处的肌养蛋白基因突变引起。肌养蛋白负责通过含有许多亚基的蛋白质复合体连接每个肌纤维的细胞骨架与下面的基板(basal lamina)(胞外基质)。肌养蛋白的缺乏允许过量的钙穿透肌膜(细胞膜)。钙和信号转导通路的改变导致水进入线粒体中，随后破裂。
在骨骼肌营养不良中，线粒体功能障碍引起应激诱导的胞质钙信号的放大和应激诱导的活性氧类(reactive-oxygen species，ROS)产生的放大。在涉及几种途径并且尚未清楚理解的复杂级联过程中，细胞内提高的氧化应激损害肌膜，并最终导致细胞死亡。肌纤维经历坏死并最终被脂肪和结缔组织替代。
DMD以X连锁隐性模式遗传。女性通常是疾病的携带者，而男性将受到影响。通常，女性携带者不知道她们携带突变，直到她们生了一个受影响的儿子。携带者母亲的儿子有50％的机会从他的母亲遗传有缺陷的基因。携带者母亲的女儿有50％的机会成为携带者，而有50％的机会具有两个正常的基因拷贝。在所有情况下，一个未受影响的父亲将一个正常的Y传给他的儿子或将正常的X传给他的女儿。X连锁隐性病症(例如DMD)的女性携带者可显示出根据其X失活模式的症状。
人DMD基因外显子51之前的外显子缺失通过并置外框外显子破坏开放阅读框(ORF)，代表了最常见的人DMD突变类型。原则上，外显子51的跳读可以恢复13％具有外显子缺失的DMD患者的DMD ORF。
迪谢纳肌营养不良在男性婴儿中发病率为1/5,000。肌养蛋白基因内的突变可以遗传或者在种系传递过程中自发发生。下面列出了示例性但非限制性突变和相应模型的表：
表2：肌养蛋白突变和相应的小鼠模型
缺失、小插入和无义突变 小鼠模型的名称
外显子44 ΔEx44
外显子52 ΔEx52
外显子43 ΔEx43
D.诊断
建议有该病家族史的人进行遗传咨询。迪谢纳肌营养不良可通过在妊娠期间进行的遗传研究以约95％的准确度检测。
DNA测试.肌养蛋白基因的肌肉特异性同工型由79个外显子构成，DNA测试和分析通常可鉴定外显子突变的特定类型或受影响的外显子。在大多数情况下DNA测试证实了诊断。
肌肉活检.如果DNA测试未能发现突变，可以进行肌肉活检测试。提取小份肌组织样品(通常用手术刀而不是针)，并且使用显示肌养蛋白存在的染料。完全缺失该蛋白质表明患有该病症。
在过去几年中，已经开发了检测更多的导致该病症之许多突变的DNA测试，并且不需要频繁地进行肌肉活检以确认迪谢纳肌营养不良的存在。
产前检查.DMD由X连锁隐性基因携带。男性只有一个X染色体，所以一个拷贝的突变基因将导致DMD。父亲不能将X连锁的性状传递给他们的儿子，所以突变由母亲传递。
如果母亲是携带者，因此她的两个X染色体之一具有DMD突变，那么女孩有50％的机会遗传该突变作为她的两个X染色体之一，并且成为携带者。男孩有50％的机会遗传该突变作为他的一个X染色体，因此患有DMD。
产前测试可以判断他们未出生的孩子是否有最常见的突变。有许多突变导致DMD，一些还没有被鉴定出来，所以遗传学测试只有当患有DMD的家庭成员具有已经被鉴定的突变时才起作用。
在侵入性测试(invasive testing)之前，重要的是确定的胎儿性别；尽管男性有时受这种X连锁疾病的影响，但女性DMD极为罕见。这可通过在16周时的超声扫描或最近通过胎儿游离DNA测试来实现。绒毛膜绒毛采样(chorion villus sampling，CVS)可在11至14周进行，并具有1％的流产风险。羊膜腔穿刺术可在15周后进行，并具有0.5％的流产风险。胎儿血液采样可在约18周进行。在不清楚的基因测试结果的情况下，另一个选择是胎儿肌肉活检。
E.治疗
目前无法治愈DMD，并且管理机构已经认识到存在持续的医疗需求。对于某些突变使用外显子跳读治疗的1-2a期试验已经阻止其下降并且在步行方面产生小的临床改善。治疗通常旨在控制症状的发作以最大限度地提高生活质量，并且包括以下：
1.皮质类固醇(例如泼尼松龙和地夫可特)提高了能量和力量，并推迟某些症状的严重程度。
2.随机对照试验(randomised control trial)已示出β-2-激动剂提高肌肉力量，但不改变疾病进展。大多数RCT对β2激动剂的随访时间仅约12个月，因此在超过该时间范围外不能外推结果。
3.鼓励轻度、不刺激(non-jarring)的身体活动例如游泳。不活动(例如卧床休息)可使肌肉疾病恶化。
4.物理治疗有助于维持肌肉力量、灵活性和功能。
5.矫形器具(例如支具和轮椅)可改善移动性和自我护理能力。在睡眠期间将脚踝保持在适当位置的合身可移动的腿部支具可推迟挛缩的发生。
6.随着疾病的进展，适当的呼吸支持是重要的。
DMD的综合性多学科护理标准/指南已经由疾病控制和预防中心(the Centersfor Disease Control and Prevention，CDC)制定，并且可在www.treat-nmd.eu/dmd/care/diagnosis-management-DMD获取。
DMD一般通过五个阶段进展，如Bushby et al.，Lancet Neurol.，9(1)：77-93(2010)and Bushby et al.，Lancet Neurol.，9(2)：177-198(2010)中概述的，其通过引用整体并入本文。在症状前阶段，患者通常表现出发育迟缓，但没有步态障碍。在早期能走动阶段，患者通常会显示高尔斯征、步态蹒跚和脚趾走路。在晚期能走动阶段，患者通常表现出越来越吃力的步态，并开始失去攀爬楼梯和从地板起立的能力。在早期不能走动阶段，患者通常能够自行推进一段时间，能够保持姿势，并且可能发展脊柱侧凸。在后期不能走动阶段，上肢功能和姿势维持越来越有限。
在一些实施方案中，治疗在疾病的症状前阶段开始。在一些实施方案中，治疗在早期能走动阶段开始。在一些实施方案中，治疗在晚期能走动阶段开始。在一些实施方案中，治疗在早期不能走动阶段开始。在一些实施方案中，治疗在晚期不能走动阶段开始。
1.物理治疗
物理治疗师关注使患者能够达到其最大身体潜能。他们的目的是：
1.通过制定适当的伸展和锻炼计划，使挛缩和畸形的发生最小化
2.通过推荐支具和耐用的医疗设备，期望并最小化物理性质的其他继发性并发症，以及
3.监测呼吸功能并对辅助呼吸训练的技术和清除分泌物的方法提供建议。
2.呼吸辅助
现代的“体积通气机/呼吸机(volume ventilator/respirator)”每次呼吸向人递送可调节体积(量)的空气，其对于治疗患有肌营养不良相关呼吸问题的人是有价值的。通气机可需要通过其直接递送空气的侵入性气管内管或气管切开插管，但是对于一些人来说，通过面罩或口器(mouthpiece)的非侵入性递送就足够了。在后一种方式中，有时使用气道正压力机(Positive airway pressure machine)，特别是双水平的压力机。呼吸设备可容易地安装在具有外部电池的电动轮椅底部或背部上的通气机托盘上以便携带。
通气机治疗可从当呼吸肌开始衰竭的青少年中后期开始。如果肺活量降至低于正常值的40％，则可在睡眠时间(即人最可能在低通气(“通气不足”)的时候)期间使用体积通气机/呼吸机。在睡眠期间的通气不足是由睡眠障碍的详尽病史以及血氧定量(oximetry)研究和毛细血管血气决定的(参见肺功能测试)。咳嗽辅助装置可通过用正气压的肺过度充气，随后用负压使黏液上升来帮助处理肺中的过多黏液。如果肺活量继续下降到少于正常值的30％，白天还可能需要体积通气机/呼吸机以获得更多帮助。人们将根据需要在白天逐渐增加使用通气机/呼吸机的时间量。
F.预后
迪谢纳肌营养不良是一种进行性疾病，其最终影响所有的随意肌并在后期涉及心肌和呼吸肌。目前估计寿命期望为25岁左右，但这随患者而异。最近在医学上的进展正在延长那些患病者的生命。肌营养不良运动(Muscular Dystrophy Campaign)是关注所有肌肉疾病的主要的英国慈善机构，其指出“随着高标准的医疗护理，迪谢纳肌营养不良的年轻人通常在他们30多岁后仍生活得很好。
在极少数情况下，如果需要，使用在轮椅和床上适当的定位、通气机支持(通过气管切开术或口罩)、气道清除和心脏药物，已看到患有DMD的人能够生存到四十多岁或五十多岁出头。对于晚年护理所需支持的早期计划已经表明患有DMD的人寿命更长了。
奇怪的是，在迪谢纳肌营养不良的mdx小鼠模型中，肌养蛋白的缺乏与提高的钙水平和骨骼肌肌坏死相关。喉内肌(intrinsic laryngeal muscle，ILM)受到保护，不会发生肌坏死。ILM具有钙调节系统谱，表明与其他肌肉相比，处理钙变化的能力更好，并且这可为其独特的病理生理学性质提供机理性启示。ILM可促进开发用于在多种临床情景下预防和治疗肌肉萎缩的新策略。
II.受益于基因组编辑的其他疾病
除了用于治疗DMD之外，发明人的多指导方法可以有利地应用于其中这种干预可以导致潜在的因果遗传缺陷校正的其他疾病状态。其中一些在下面简要描述。
肢带肌营养不良。肢带肌营养不良(Limb-gerdle muscular dystrophy，LGMD)或Erb肌营养不良是一种遗传和临床异质性的罕见肌营养不良。其特征在于进行性肌肉萎缩，主要影响臀部和肩部肌肉。LGMD具有常染色体遗传模式，目前没有已知的治愈方法。患有肢带肌营养不良(LGMD)的个体的症状通常是行走、上下楼梯和从椅子上站起困难。弯腰困难和经常跌倒也很常见。难以提升某些物体以及难以将臂伸出去或高于头部也是LGMD的常见表现。最终行走/跑步的能力恶化。
随着时间的推移，这种疾病不可避免地恶化，尽管某些患者的进展比另一些患者更快。最终疾病会影响其他肌肉，例如位于面部的肌肉。该疾病通常在症状出现的几年内导致对轮椅的依赖，但是患者间的变异性很高，一些患者保持运动性。
肌肉无力通常是对称的、近端的和缓慢进展的。在大多数情况下，LGMD不存在疼痛，并且心理功能不受影响。LGMD可以在儿童期、青春期、青年期甚至更晚期开始，发病年龄通常在10至30岁之间。两性受到同样的影响，当肢带肌营养不良在儿童期开始时，进展似乎更快且疾病更加致残。当疾病在青春期或成年期开始时，疾病通常不那么严重并且进展更慢。在表现出时，没有感觉神经病或自主神经或内脏功能障碍。
就遗传学而言LGMD是一种遗传性疾病，尽管它可能作为显性或隐性遗传缺陷遗传。缺陷的结果是肌肉不能正常形成正常肌肉功能所需的某些蛋白质。几种不同的蛋白质可能受到影响，并且缺乏或缺陷的特定蛋白质鉴定特定类型的肌营养不良。在LGMD中受影响的蛋白质是α、β、γ和δ肌聚糖蛋白(sarcoglycan)。肌聚糖病(sarcoglycanopathy)可能适合基因治疗。
远端型肌营养不良(dysferlinopathy)。远端型肌营养不良是由于dysferlin基因突变导致的功能性dysferlin蛋白缺乏引起的常染色体隐性神经肌肉疾病。远端型肌营养不良的特点是进行性肌肉萎缩，并且最常被临床诊断为肢带肌营养不良2B型(LGMD2B)或Miyoshi肌营养不良1(MMD1；一种远端肌营养不良)，这取决于诊断时肌肉受累的初始模式。远端型肌营养不良是一种罕见的疾病，其确切的发病率尚未确定。
远端型肌营养不良的症状通常在16至25岁之间的成年早期表现，并且主要影响肢体和肢带(臀部和肩部)的骨骼肌，而诸如心脏和膈肌的关键肌肉基本上不受影响。大多数远端型肌营养不良患者在诊断后10-20年内变得不能走动，但预期寿命正常。该疾病的发病年龄和进展之间存在大量变化。
虽然LGMD2B和MMD1两者都是由dysferlin缺乏引起的，但是当最初在近端肌肉(大腿和上臂)出现无力时会给出LGMD2B的诊断，而当最初出现在远端肌肉(小腿和下臂)出现无力时会给出MMD1的诊断。在这两种情况下，无力最终都会进展到包括远端和近端肌肉两者。LGMD2B和MMD1两者都难以诊断，患者在被成功诊断为远端型肌营养不良之前经常被误诊多次。
虽然“远端型肌营养不良”仅指缺乏dysferlin蛋白，但只有当可检测到dysferlin基因突变时，才确诊LGMD2B和Miyoshi肌病1。重要的是，患者接受基因诊断以参与远端型肌营养不良特异的临床研究和试验。耆那教基金会是一个非盈利的家庭组织(www.jain-foundation.org)，其通过组织测试和支付费用来帮助患有肢带肌营养不良的患者实现基因诊断。
肌巨蛋白肌病。肌巨蛋白(Titin)也称为连接蛋白，是一种在人类中由TTN基因编码的蛋白质。肌巨蛋白是一种巨大的蛋白质，长度大于1微米，起到分子弹簧的作用以负责肌肉的被动弹性。其由通过非结构化肽序列连接的244个单独折叠的蛋白质结构域组成。当蛋白质被拉伸时这些结构域展开，并且当去除张力时重新折叠。
肌巨蛋白在横纹肌组织的收缩中很重要。其在肌节中将Z线连接到M线。该蛋白质有助于Z线处的力传递和I带区域中的静止张力。其限制了肌节在张力下的运动范围，从而有助于肌肉的被动僵硬。不同类型肌肉(例如，心脏或骨骼)之间的肌巨蛋白序列的变化已经与这些肌肉的机械性质的差异相关联。
肌巨蛋白是大的丰富的横纹肌蛋白质。肌巨蛋白的主要功能是稳定厚丝，将其置于细丝之间，防止肌节过度拉伸，并在拉伸后像弹簧一样使肌节退缩。N末端Z-盘区域和C-末端M-线区域分别结合肌节的Z-线和M-线，使得单个肌巨蛋白分子跨越肌节的一半长度。肌巨蛋白还含有肌肉相关蛋白质的结合位点，因此其作为肌肉细胞中装配收缩机器的黏附模板。其也被鉴定为染色体的结构蛋白。在肌巨蛋白的I-带、M-线和Z-盘区域存在相当大的可变性。I-带区域的可变性导致不同的肌巨蛋白同种型的弹性差异，并因此导致不同肌肉类型的弹性差异。在鉴定的许多肌巨蛋白变体中，描述了五种具有完整的转录信息。
在该基因异常长的序列内的任何位置的突变都可导致过早终止密码子或其他缺陷。肌巨蛋白突变与伴有早期呼吸衰竭的遗传性肌病、伴有致命性心肌病的早发性肌病、伴有心脏病的轴空病、中心核肌病、肢带肌营养不良2J型、家族性扩张型心肌病9、肥厚性心肌病和胫骨肌营养不良有关。进一步的研究还表明，任何营养不良或肌病的遗传相关形式都不能安全地排除在TTN基因突变引起之外。扩张型心肌病患者的截断突变最常见于A区；尽管可预期上游I区域中的截短会完全阻止A区域的翻译，但是可选择剪接产生了一些不会遇到过早终止密码子的转录物，从减轻了其影响。在患有自身免疫性疾病硬皮病的患者中产生针对肌巨蛋白的自身抗体。
由兰尼碱受体中的突变(假外显子突变)引起的先天性肌病“集中核心病”。中央轴空病(central core disease，CCD)，也称为中央轴空肌病，是常染色体显性先天性肌病(先天性肌肉疾病)。其首先由Shy和Magee于1956年描述。其特征在于显微镜下肌原纤维的外观。
CCD的症状是可变的，但通常包括出生时肌张力减退(肌张力降低)、儿童发育轻度延迟(病例间差异很大)、面部肌肉无力、以及骨骼畸形如脊柱侧凸和髋关节脱位。
症状可能在出生时出现，或者可能在生命的任何阶段出现。似乎越来越多的人直到成年至中年才出现症状。虽然通常不是进行性的，但似乎越来越多的人确实经历了缓慢的临床上显著的症状学进展。这些病例可假设是由于兰尼碱受体功能失常的大量基因突变，并且事实上可能发现持续研究可能是临床变异。
诊断是基于典型症状和来自肌肉活检(组织样本)的外观的组合。该名称源于光学显微镜活检的典型外观，其中肌肉细胞具有缺乏线粒体和特定酶的核心。在一小部分病例中发生呼吸功能不全。肌酸激酶和肌电图(EMG)往往是正常的。
中央轴空病以常染色体显性遗传方式遗传。大多数病例在兰尼碱受体1型(RYR1)基因中具有可证明的突变，其通常是从头开始的(新开发的)。患有CCD的人在接受全身麻醉时有发生恶性高热(malignant hyperthermia，MH)的风险。
没有特定的治疗方法，但避免触发麻醉剂，并对亲属进行RYR1突变筛查，因为这些可能使他们对MH敏感。
强直性肌营养不良。强直性肌营养不良是一种影响肌肉功能的长期遗传性疾病。症状包括逐渐恶化的肌肉损失和虚弱。肌肉经常收缩并且无法放松。其他症状可能包括白内障、智力障碍和心脏传导问题。在男性中，可能会出现早期秃顶和无法生育的问题。
强直性肌营养不良是一种常染色体显性疾病，其通常遗传自人的父母。有两种主要类型：由于DMPK基因突变导致的1型(DM1)和由于CNBP基因突变导致的2型(DM2)。这种疾病通常在每一代都会恶化。DM1类型在出生时即可出现。DM2通常较温和。它们是肌营养不良的类型。通过遗传测试确认诊断。
其没有治愈方法。治疗可包括支具或轮椅、心脏起搏器和非侵入性正压通气。药物美西律或卡马西平偶尔有用。如果发生疼痛，可以用三环类抗抑郁药和非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAID)治疗。
强直性肌营养不良影响全世界人群中的8,000分之1以上。虽然强直性肌营养不良可以在任何年龄发生，但发病通常在20和30岁。其是在成年其开始的最常见的肌营养不良。其首次描述于1909年，在1992年确定了1型的潜在原因。
症状和体征的表现因形式(DM1/DM2)、严重程度甚至非常见的DM2表型而有很大差异。DM2的DM1症状包括执行功能(例如，组织、集中、发现词语)的问题和睡眠过度。传导异常在DM1中比DM2更常见，但建议所有人每年进行ECG。两种类型也与胰岛素抵抗有关。强直性肌营养不良可能有具有蓝点外观的皮质白内障、或后囊下白内障。
DM2通常比DM1更温和，通常需要辅助装置的DM2人数比DM1人少。此外，在DM2中未发现影响DM1婴儿的严重先天性形式，并且在医学文献中很少发现在年轻人中出现症状的早期出现。
症状可能在从婴儿期到成年期的任何时间出现。DM导致全身无力，通常开始于手、脚、颈部或面部肌肉。其慢慢地进展到涉及其他肌肉群，包括心脏。DM也影响多种其他器官系统。
强直性肌营养不良是以常染色体显性模式遗传的遗传性疾病，因此平均会传递给50％的携带者后代。强直性肌营养不良是多种已知的三核苷酸重复疾病之一。某些DNA区域具有两个或三个核苷酸的重复序列。
强直性肌营养不良(myotonic dystrophy，DM)是遗传性疾病。DM的一种严重形式是先天性强直性肌营养不良，其可能出现在患有DM的母亲的新生儿中。先天性强直性肌营养不良也可以通过父系基因遗传，但是据说相对罕见。先天性意味着从出生开始就存在这种疾病。
在DM1中，受影响的基因被称为DMPK，其编码强直性肌营养不良蛋白激酶，一种主要在骨骼肌中表达的蛋白质。该基因位于19号染色体的长臂上。
在DM1中，存在DMPK基因中胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤(CTG)三联体重复的扩增。5至37个重复被认为是正常的，而具有38至49个重复的个体被认为具有预突变(pre-mutation)并且存在获得带有进一步扩增的重复并因此具有症状性疾病的孩子的风险。具有大于50个重复的个体几乎总是有症状，有一些例外。较长的重复通常与较早发作和较严重的疾病相关。
具有超过37个重复的DMPK等位基因是不稳定的，并且在有丝分裂和减数分裂中在细胞分裂期间可能有额外的三核苷酸重复插入。因此，具有预突变或突变的个体的孩子遗传了比其父母更长的DMPK等位基因，因此更可能受到影响或显示出更早的发病和更严重的病症，这种现象称为遗传早现(anticipation)。有趣的是，这种情况的父系传递非常罕见，可能是由于对具有扩增重复的精子的选择压力，但遗传早现往往不如母系遗传的情况严重。
来自扩增的三核苷酸重复区域的RNA由于C-G碱基对之间的广泛氢键而形成核质内发夹环，并且已经证明这些通过用GFP标记其以及用红色荧光染料Cyanine5(Cy5)标记探针寡核苷酸来扣留剪接调节剂MBNL1以形成独特的焦点。
DM2由3号染色体上ZNF9基因的缺陷引起。特定缺陷是ZNF9基因中胞嘧啶-胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤(CCTG)四核苷酸的重复。由于其涉及四个核苷酸的重复，其不是三核苷酸重复疾病，而是四核苷酸重复疾病。
DM2的重复扩增比DM1大得多，为75到超过11,000个重复。与DM1不同，DM2中重复DNA扩增的大小似乎不会在发病年龄或疾病严重程度上产生差异。遗传早现似乎在DM2中不太显著，并且大多数当前的评论仅报告作为DM2的特征的轻微遗传早现。
弗里德赖希共济失调。弗里德赖希共济失调是一种常染色体隐性遗传性疾病，会导致神经系统的进行性损害。其最初表现为协调能力差的症状，例如步态紊乱；去还可以导致脊柱侧凸、心脏病和糖尿病，但不影响认知功能。该疾病进展直到需要轮椅移动。其在一般人群中的发病率为约50,000分之一。
特定的基因突变(FXN基因中基因内GAA三联体重复的扩增)导致线粒体蛋白质共济蛋白(frataxin)的表达降低。随着时间的推移，这种缺陷导致上述损伤，以及由于对细胞代谢的影响而导致的频繁疲劳。
弗里德赖希共济失调的共济失调是由脊髓中神经组织，特别是指挥臂和腿的肌肉运动必需的觉神经元的的退行引起的。脊髓变薄，神经细胞失去其一些髓鞘(一些神经细胞上的绝缘覆盖物，其有助于传导神经冲动)。
症状通常在5至15岁之间的某个时间开始，但在晚期发作FA可能在20或30岁发生。症状包括以下的任何组合，但未必是全部：臂和腿部肌肉无力、失去协调、视力受损、听力受损、言语不清、脊柱弯曲、高足弓(足弓畸形)、糖尿病(约20％的弗里德赖希共济失调患者发生碳水化合物不耐受，10％患有糖尿病)和心脏疾病(例如心房颤动，以及由此导致的心动过速(心率加快)和肥厚性心肌病)。
其在22岁之前出现，伴有进行性的惊人或蹒跚的步态和频繁跌倒。下肢更严重地涉及。症状是缓慢和进行性的。长期观察显示，许多患者在患者成年早期症状达到平台。平均而言，患有该疾病10至15年后，患者通常受轮椅限制，并所有日常生活活动需要协助。
在体格检查中可以检测到以下身体体征：小脑体征，例如眼球震颤、快速扫视眼球运动、躯干性共济失调、构音障碍、辩距不良；下运动神经元病变，例如缺少深腱反射；辨距困难(dysmetria)，例如通常发现的伸肌足底反应和远端无力；背柱方面，例如发生振动和本体感觉的损失。心脏受累发生在91％的患者中，包括心脏扩大(直至扩张型心肌病)、对称性肥大、心脏杂音和传导缺陷。死亡的中值年龄为35岁，而女性具有较好预后，20年生存率为100％，而男性为63％。发现百分之二十的病例与糖尿病相关。
弗里德赖希共济失调是一种常染色体隐性疾病，当FXN基因含有扩增的基因内GAA重复(三核苷酸重复扩增的一个例子)时就会发生。FXN基因编码蛋白质共济蛋白。GAA重复扩增导致共济蛋白水平降低。共济蛋白是一种铁结合蛋白，负责形成铁硫簇。共济蛋白缺乏的一个结果是线粒体铁超载，可导致许多蛋白质的损害。共济蛋白在正常生理学中的确切作用仍不清楚。该基因位于9号染色体上。
突变基因在第一个内含子中含有扩增的GAA三联体重复；在几个谱系中，已经检测到点突变。因为缺陷位于内含子(其在转录和翻译之间从mRNA转录物中除去)，所以该突变不会导致异常的共济蛋白蛋白的产生。相反，突变通过以类似于位置效应杂色的方式诱导异染色质结构引起基因沉默(即，突变降低基因的转录)。
除了减少共济蛋白的表达外，长束的GAA重复序列在体内酵母研究中诱导染色体断裂。
亨廷顿病。亨廷顿病(Huntington's disease，HD)也称为亨廷顿舞蹈病，是一种导致脑细胞死亡的遗传性疾病。最早的症状通常是情绪或智力方面的细微问题。通常是缺乏协调性，随后通常是步态不稳定。随着疾病的进展，不协调、不稳定的身体运动变得更加明显。身体能力逐渐恶化，直到协调运动变得困难并且人无法说话。心智能力通常会下降为痴呆症。具体症状在人之间有些变化。症状通常在30至50岁之间开始，但可以从任何年龄开始。这种疾病可能在每一连续代中在生命中更早发生。大约8％的病例在20岁之前开始，并且通常表现出与帕金森病更相似的症状。患有HD的人经常低估他们问题的程度。
HD通常遗传自其父母，有10％病例是由于新突变。这种疾病是由个体的称为亨廷顿蛋白(Huntingtin)的基因的两个拷贝中任一个中的常染色体显性突变引起的。这意味着受影响人的孩子通常有50％的几率遗传这种疾病。亨廷顿基因为也称为“亨廷顿”的蛋白质提供遗传信息。编码亨廷顿蛋白的基因中CAG(胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤)三联体重复的扩增导致异常蛋白质，其通过尚未完全理解的机制逐渐损害脑中的细胞。无论症状是否存在，通过遗传测试进行诊断，可以在任何时间点进行。这一事实引发了一些伦理争论：个体被认为足够成熟以选择测试的年龄；父母是否有权让孩子进行测试；以及管理机密性和测试结果的公开。
HD无法治愈。在该疾病的后期阶段需要全时护理。治疗可以缓解一些症状，并在某些方面改善生活质量。用于治疗运动问题的最佳证据是利用丁苯那嗪。HD影响了欧洲人后裔中的十万分之4到15。其在日本很少见，在非洲以不明的几率发生。这种疾病同样影响男性和女性。诸如肺炎、心脏病和跌倒造成的身体伤害等并发症降低预期寿命。在约9％的病例中，自杀是导致死亡的原因。死亡通常发生在首次检测到疾病后的15至20年。
亨廷顿病的症状最通常35至44岁之间变得明显，但其可以在从婴儿到老年的任何年龄开始。在早期阶段，人格、认知和身体技能有微妙的变化。通常首先注意到身体症状，因为认知和行为症状在早期阶段通常没有严重到被独自识别。几乎所有患有亨廷顿病的人最终都表现出类似的身体症状，但认知和行为症状的发作、进展和程度在个体之间存在显著差异。
最具特征的初始身体症状是急动、随机和无法控制的运动，称为舞蹈病。舞蹈病最初可能表现为一般的不安，小的无意引发或未完成的运动，缺乏协调或减慢的扫视眼运动。这些轻微的运动异常通常发生在运动功能障碍的更明显体征之前至少三年。随着疾病的进展，出现症状的明显表现，例如僵硬、扭动运动或异常姿势。这些体征表明脑中负责运动的系统受到了影响。精神运动功能变得越来越受损，因此任何需要肌肉控制的运动都受到影响。常见的后果是身体不稳定、异常的面部表情以及咀嚼、吞咽和说话困难。进食困难通常会导致体重减轻，并可能导致营养不良。睡眠障碍也是相关的症状。青少年HD与这些症状的不同之处在于其通常进展得更快并且舞蹈病短暂表现，如果有的话，以僵硬为主要症状。癫痫发作也是这种形式的HD的常见症状。
认知能力逐渐受损。特别受影响的是执行功能，包括计划、认知灵活性、抽象思维、规则获取、启动适当的行动以及抑制不当行为。随着疾病的进展，往往会出现记忆缺陷。报告的损伤范围从短期记忆缺陷到长期记忆困难，包括偶发性记忆(人的生命记忆)、程序性(记忆身体如何进行活动)和工作记忆。随着时间的推移，认知问题往往恶化，最终导致痴呆症。这种缺陷模式被称为皮质下痴呆综合征，以区别于皮质痴呆的典型效应，例如阿尔茨海默病。
报告的神经精神症状表现为焦虑、抑郁、情绪表现降低(情绪迟钝)、自我中心、攻击行为和强迫行为，后者可导致或加重成瘾，包括酗酒、赌博和性欲亢进。还观察到识别其他人的负面表达的困难。这些症状的患病率在研究之间差异很大，精神疾病终生患病率估计为33％至76％。对于许多患者及其家属而言，这些症状是该疾病中最令人痛苦的方面，通常影响日常功能并构成制度化的原因。自杀念头和自杀企图比一般人群更常见。通常，个人具有降低的对舞蹈病、认知和情绪障碍的认识。
突变体亨廷顿在整个身体中表达并且与外周组织中的异常相关，所述外周组织中的异常由脑外的这种表达引起。这些异常包括肌肉萎缩、心力衰竭、葡萄糖耐量降低、体重减轻、骨质疏松症和睾丸萎缩。
所有人有两个拷贝的亨廷顿基因(HTT)，其编码亨廷顿蛋白(HTT)。该基因也被称为HD和IT15，代表“目的转录物15(interesting transcript 15)”。该基因的一部分是称为三核苷酸重复的重复部分，其长度在个体之间不同并且在世代之间可以改变长度。如果在健康基因存在重复，则动态突变可能增加重复计数并导致缺陷基因。当该重复部分的长度达到一定阈值时，其产生蛋白质的改变形式，称为突变体亨廷顿蛋白(mHTT)。这些蛋白质的不同功能是病理变化的原因，其反过来引起疾病症状。亨廷顿病突变在遗传上是显性的并且几乎完全渗透：任一个人HTT等位基因突变都导致疾病。其不是根据性别遗传，但是基因重复部分的长度及其严重程度可能受到受影响父母性别的影响。
HD是多种三核苷酸重复疾病之一，其由基因重复部分的长度超过正常范围引起。HTT基因位于4号染色体4的短臂上4p16.3处。HTT包含三个DNA碱基-胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)-重复多次的的序列(即，...CAGCAGCAG...)，称为三核苷酸重复。CAG是氨基酸谷氨酰胺的3字母遗传密码(密码子)，因此它们的系列导致产生称为聚谷氨酰胺束(或polyQ束)的谷氨酰胺链，以及该基因的重复部分，PolyQ区域。
通常，人们在polyQ区域中具有少于36个重复的谷氨酰胺，这导致产生细胞质蛋白质亨廷顿蛋白。然而，36个或更多个谷氨酰胺的序列导致产生具有不同特征的蛋白质。这种被称为突变亨廷顿蛋白(mHTT)的改变形式增加了某些类型神经元的衰变速率。脑区域具有不同的量的神经元并且依赖于这些类型的神经元，并因此受到影响。通常，CAG重复的数量与该过程受影响的程度有关，并且占症状发作年龄变化的约60％。其余变异归因于环境和其他改变HD机制的基因。36-39个重复导致疾病的降低的外显率形式，晚得多的发病和缓慢的症状进展。在某些情况下，发病可能是如此晚，以至于症状从未被注意到。由于具有非常大的重复计数，HD具有完全的外显率并且可以在20岁时发生，此时其被称为青少年HD、不能运动的僵硬或Westphal变体HD。这占HD携带者的约7％。
共济失调毛细血管扩张症。共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia，AT或A-T)也称为共济失调毛细血管扩张综合征或Louis-Bar综合征，是一种罕见的神经退行性常染色体隐性疾病，导致严重残疾。共济失调是指差的协调性，毛细血管扩张是指小的扩张血管，这两者都是该疾病的标志。
A-T影响身体的许多部位。其损害脑的某些区域，包括小脑，导致运动和协调困难。其削弱免疫系统，导致感染的倾向。其妨碍破坏的DNA的修复，增加癌症风险。
症状最常出现在儿童早期(幼儿阶段)孩子开始走路时。虽然他们通常在正常年龄开始行走，但他们在行走、站立不动或坐着时摇摆或摇晃，并且可能看起来几乎就像喝醉了一样。在学龄前晚期和学龄初期，他们开始难以自然的方式将其眼睛从一个地方移动到另一个地方(动眼神经失用症)。他们出现含糊或扭曲的言语和吞咽问题。一些人具有增加数量的呼吸道感染(耳部感染、鼻窦炎、支气管炎和肺炎)。由于并非所有儿童都以相同的方式或相同的速度发育，因此可能需要几年时间才能正确诊断出A-T。大多数患有A-T的儿童在出生后的4-5年内具有稳定的神经系统症状，但在学龄初期开始出现越来越多的问题。
A-T由ATM基因中的缺陷引起，该基因负责管理细胞对多种应激形式的反应，包括DNA中的双链断裂。简单来说，ATM基因产生的蛋白质识别出DNA断裂，募集其他蛋白质来修复断裂，并阻止细胞产生新的DNA直到修复完成。
受影响的个体并且在不同年龄的A-T特征的严重程度存在很大差异。以下症状或问题是A-T的常见或重要特征：
在早期显现并且在学龄至青春期前恶化的共济失调(控制运动困难)。
动眼神经失用(当将视线从一个地方转移到另一个地方时难以协调头部和眼睛的运动)。
不自主运动。
眼睛的眼白(巩膜)上的毛细血管扩张(扩张的血管)，使它们看起来充满血丝。这些在婴儿期不显现，并且可能在5-8岁首次显现。毛细血管扩张也可能在阳光暴露的皮肤区域显现。
感染问题，特别是耳、鼻窦和肺部感染。
癌症发病率升高(主要是但不仅仅是淋巴瘤和白血病)。
青春期发育迟缓或不完全，并且绝经期非常早。
生长(重量和/或高度)速度减慢。
流口水，特别是在幼儿期当他们疲倦或专注于活动时。
构音障碍(语音含糊、缓慢或扭曲)。
青春期或以后的糖尿病。
头发和皮肤过早变化。
许多儿童最初被误诊为患有共济失调性脑瘫。A-T的诊断可能要到学龄前时才能进行，此时受损的步态、手部协调、言语和眼运动的神经系统症状出现或恶化，并且首先出现毛细血管扩张。由于A-T非常罕见，医生可能不熟悉症状或诊断方法。毛细血管扩张的晚期出现可能是诊断的障碍。由于症状和体征的早期稳定性，医生可能需要一段时间才能将A-T视为可能。
A-T由ATM(ATM丝氨酸/苏氨酸激酶或共济失调毛细血管扩张症突变)基因突变引起，该基因于1995年克隆。ATM位于人类11号染色体上(11q22.3)，并且由跨越基因组DNA的150kb的69个外显子组成。
A-T的遗传方式是常染色体隐性。每个父母是携带者，意味着他们有一个拷贝的正常A-T基因(ATM)和一个拷贝的突变。如果孩子从每位父母遗传了突变的A-T基因，就会发生A-T，所以在具有两个携带者父母的家庭中，则认为父母所生的孩子有四分之一几率患有疾病。如果已经确定受影响儿童的两个ATM基因中的错误(突变)，则可以在家庭中进行产前诊断(和携带者检测)。完成这项工作的过程可能很复杂并且因为需要时间，应该在受孕前安排。
寻找无关人员(例如，已知A-T携带者的配偶)的ATM基因中的突变具有重大挑战。基因通常具有不影响功能的变异拼写(spelling)(多态性)。在像ATM这样大的基因中，这种变异拼写可能会发生，医生不能总是预测特定变异是否会引起疾病。遗传咨询可以帮助A-T患者的家庭成员了解可以或不可以测试的内容，以及如何解释测试结果。
A-T的携带者，例如患有A-T的人的父母，具有一个突变拷贝的ATM基因和一个正常拷贝。他们通常是健康的，但女性患乳腺癌的风险增加。这一发现已经以多种不同的方式得到证实，并且是当前研究的主题。建议进行标准监测(包括每月的乳房自我检查和通常按照年龄表进行的乳房X光检查)，除非因为个体有其他危险因素(例如乳腺癌家族史)而需要进行额外检查。
神经纤维瘤病1型和2型。神经纤维瘤病(neurofibromatosis，NF)是肿瘤在神经系统中生长的一组三种病症。三种类型是神经纤维瘤病1型(NF1)、神经纤维瘤病2型(NF2)和神经鞘瘤病。在NF1中，症状包括皮肤上的浅褐色斑点、腋窝和腹股沟中的雀斑、神经内的小肿块和脊柱侧凸。在NF2中，可能存在听力丧失、年轻时的白内障、平衡问题、肉色皮瓣和肌肉萎缩。肿瘤通常是非癌性的。
其原因是某些基因的基因突变。在一半的情况下，这些遗传来自个人的父母，而其余的则是在早期发育期间发生的。肿瘤涉及神经系统中的支持细胞而不是神经元。在NF1中，肿瘤是神经纤维瘤(外周神经的肿瘤)，而在NF2和神经鞘瘤病中，雪旺细胞的肿瘤更常见。诊断通常基于体征和症状，偶尔由遗传测试支持。
没有已知的预防或治愈方法。可以进行手术以去除引起问题或已经癌变的肿瘤。如果发生癌症，也可以使用放射和化学疗法。耳蜗植入物或听觉脑干植入物可以帮助一些听力损失的人。
在美国，约3,500分之1的人患有NF1，25,000分之1的人患有NF2。男性和女性以相等的频率受影响。在NF1中，症状通常在出生时存在，否则在10岁之前发展。虽然病情通常会随着时间的推移而恶化，但大多数患有NF1的人具有正常的预期寿命。在NF2中，症状可能直到成年早期才会变得明显。NF2增加了早死的风险。这种情况的描述可以追溯到1世纪。
早期的神经纤维瘤病(NF1)可导致学习和行为问题——大约60％的患有NF1的儿童在学校中有轻微的困难。就体征而言，个体可具有以下体征：六个或更多浅棕色皮肤病学斑点(“cafe-au-lait斑点”)、至少两个神经纤维瘤、至少在两个眼睛虹膜上的生长物，以及脊柱的异常生长(脊柱侧弯)。
神经纤维瘤病是一种常染色体显性遗传病，这意味着病症的发展只需要一个拷贝的受影响基因的即可。因此，如果只有父母只有一人患有神经纤维瘤病，则他或她的孩子50％的几率也患神经纤维瘤病。即使从患有严重形式的疾病的父母遗传，受影响的孩子也可能患有轻微的NF1。有两种类型的神经纤维瘤病。神经纤维瘤病I型的特征在于神经组织生长成肿瘤(神经纤维瘤)，其可能是良性的并且可能通过压迫神经和其他组织而导致严重损伤。神经纤维瘤病II型表现为双侧听神经瘤(前庭神经或颅神经肿瘤8(CN VIII)，也称为神经鞘瘤)，常导致听力丧失。
神经鞘瘤病，在脊髓和周围神经上出现疼痛的神经鞘瘤。
Leber先天性黑朦中的CEP290突变。290kDa的中心体蛋白质是在人中由CEP290基因编码的蛋白质。CEP290位于12号染色体的Q臂上。基因CEP290是中心体蛋白质，在中心体和纤毛发育中起重要作用。这种基因在初级纤毛的形成中起着至关重要的作用，初级纤毛是细胞膜的小天线状突起，在视网膜背面的光感受器(其检测光和颜色)中以及在肾、脑和身体的许多其他器官中起重要作用。敲低CEP290基因转录物的水平导致培养物中视网膜色素上皮细胞中纤毛发生的显著抑制，证明CEP290对纤毛形成的重要性。
在分子水平上，已显示CEP290在初级纤毛形成中发挥关键的调节和结构作用。最近的研究表明CEP290是微管和膜结合蛋白，可能作为纤毛微管核心与上覆纤毛膜之间的结构连接。在CEP290疾病的rd16小鼠模型中破坏CEP290的微管结合结构域已经显示导致快速和显著的视网膜变性，证明了CEP290微管结合在疾病中的重要性。CEP290在促进纤毛生成中的作用受到CEP290蛋白任一端发现的自身调节结构域和CEP290与抑制蛋白CP110相互作用两者抑制。
CEP290基因的发现使研究人员找到了另一种对视网膜功能起重要作用的基因LCA5。涉及这两种基因的基因置换的临床试验已经在费城开始，研究人员希望Leber先天性黑矇(Leber's congenital amaurosis)有一天能够得到治愈。
该基因编码具有13个推定的卷曲螺旋结构域、与SMC染色体分离ATP酶具有同源性的区域、6个KID基序、3个原肌球蛋白同源结构域和ATP/GTP结合位点基序A的蛋白质。蛋白质定位于中心体和纤毛中并具有N-糖基化、酪氨酸硫酸化、磷酸化、N-豆蔻酰化和酰胺化的位点。
该基因中的突变与Joubert综合征和肾消耗病(nephronophthisis)有关，最近有一种常见形式的Leber先天性黑矇，称为LCA10。针对这种蛋白质的抗体的存在与多种形式的癌症有关。
该基因中的突变导致婴儿和儿童失明，这种疾病称为Leber先天性黑矇。截至今天，CEP290中的35种不同突变导致LCA。CEP290中的其他突变也被鉴定为引起Meckel综合征和Joubert综合征，这是许多综合征中的一些。有缺陷的CEP290基因通常是由于纤毛异常引起的这些疾病的原因。目前尚不清楚基因中的一个突变如何导致如此多的不同类型的综合征，特别是其中许多影响中枢神经系统。
III.CRISPR系统
A.CRISPR
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)是包含碱基序列的短重复的DNA基因座。每个重复之后是来自先前暴露于病毒的“间隔区DNA”的短区段。在约40％测序的真细菌基因组和90％测序的古细菌中发现CRISPR。CRISPR通常与编码与CRISPR相关的蛋白质的Cas基因相关。CRISPR/Cas系统是原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件(例如质粒和噬菌体)的抗性并提供获得性免疫的形式。CRISPR间隔区识别并沉默真核生物体中的这些外源遗传元件例如RNAi。
CRISPR重复序列的大小为24至48个碱基对。它们通常显示一些二重对称，这意味着形成二级结构例如发夹，但不是真正的回文结构。重复序列被相似长度的间隔区分开。一些CRISPR间隔区序列与来自质粒和噬菌体的序列完全匹配，尽管一些间隔区与原核生物的基因组匹配(自靶向间隔区)。响应于噬菌体感染，可以迅速添加新的间隔区。
B.Cas核酸酶
CRISPR相关(cas)基因通常与CRISPR重复-间隔区阵列相关。截至2013年，已描述了超过四十个不同的Cas蛋白家族。在这些蛋白家族中，Cas1似乎在不同的CRISPR/Cas系统中是普遍存在的。cas基因和重复序列结构的特定组合已用于限定8种CRISPR亚型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube)，其中一些与编码重复序列相关神秘蛋白(repeat-associated mysterious protein，RAMP)的另外的基因模块相关。在单个基因组中可存在多于一种CRISPR亚型。CRISPR/Cas亚型的散发性分布(sporadicdistribution)表明该系统在微生物进化过程中经历水平基因转移。
外源DNA明显地由Cas基因编码的蛋白质加工成小元件(长度为约30个碱基对)，随后以某种方式将其插入靠近前导序列的CRISPR基因座中。来自CRISPR基因座的RNA组成型表达，并且被Cas蛋白加工成由具有侧翼重复序列的单独外源衍生序列元件构成的小RNA。RNA引导其他Cas蛋白在RNA或DNA水平上沉默外源遗传元件。证据表明CRISPR亚型之间的功能多样性。Cse(Cas亚型Ecoli)蛋白(在大肠杆菌(E.coli)中称为CasA-E)形成功能复合体Cascade，其将CRISPR RNA转录本加工成保留Cascade的间隔区-重复序列单元。在另一些原核生物中，Cas6加工CRISPR转录本。有趣的是，大肠杆菌中基于CRISPR的噬菌体灭活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1和Cas2。在激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和另一些原核生物中发现的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白与小的CRISPR RNA形成功能性复合体，其识别和切割互补靶RNA。RNA引导的CRISPR酶被分类为V型限制酶。
Cas9是核酸酶(一种专用于切割DNA的酶)，具有两个活性切割位点，双螺旋的每条链各一个。该团队证明他们可使一个或这两个位点失效，同时保留Cas9定位其靶DNA的能力。Jinek等(2012)将tracrRNA和间隔区RNA合并成“单引导RNA”分子，其与Cas9混合，可找到并切割正确的DNA靶标并且这样的合成引导RNA可能能够用于基因编辑。
Cas9蛋白在致病和共生细菌中高度富集。CRISPR/Cas介导的基因调节可以有助于内源细菌基因的调节，特别是在与真核宿主的细菌相互作用期间。例如，新凶手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)的Cas蛋白Cas9使用独特的小的CRISPR/Cas相关RNA(scaRNA)来抑制编码细菌脂蛋白的内源性转录本，所述细菌脂蛋白对于新凶手弗朗西斯氏菌(F.novicida)抑制宿主应答和促进毒力是至关重要的。Wang等(2013)示出Cas9mRNA和sgRNA共注射到种系(合子)产生的具有突变的小鼠中。也构想了Cas9 DNA序列的递送。
系统CRISPR/Cas分为三类。1类使用多个Cas蛋白与CRISPR RNA
(crRNA)一起构建功能性内切核酸酶。2类CRISPR系统使用单个Cas蛋白和crRNA。最近已将Cpf1鉴定为含有1,300个氨基酸蛋白质的II类V型CRISPR/Cas系统。还参见美国专利公开2014/0068797，其通过引用整体并入。
在一些实施方案中，本公开内容的组合物包含来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(UniProt登录号J7RUA5)的小版本Cas9。小版本Cas9提供了优于野生型或全长Cas9的优势。在一些实施方案中，Cas9是spCas9(AddGene)。
C.Cpf1核酸酶
来自普氏菌属(Prevotella)和弗朗西斯菌属1(Francisella 1)的成簇规律间隔短回文重复或CRISPR/Cpf1是与CRISPR/Cas9系统具有一些相似性的DNA编辑技术。Cpf1是II类CRISPR/Cas系统的RNA指导的核酸内切酶。这种获得性免疫机制存在于普氏菌和弗朗西斯菌中。其阻止防止病毒的遗传损害。Cpf1基因与CRISPR基因座相关，编码使用指导RNA来发现和切割病毒DNA的核酸内切酶。Cpf1是比Cas9更小和更简单的内切核酸酶，克服了一些CRISPR/Cas9系统的限制。
Cpf1出现在许多细菌物种中。被开发成基因组编辑工具的最终的Cpf1内切核酸酶取自最早已知携带它的16种物种之一。
在一些实施方案中，Cpf1是来自氨基酸球菌属(Acidaminococcus)(物种BV3L6，UniProt登录号U2UMQ6；SEQ ID NO：870)的Cpf1酶，其具有如下所示的序列：
在一些实施方案中，Cpf1是来自毛螺菌科(Lachnospiraceae)(物种ND2006，UniProt登录号AOA182DWE3；SEQ ID NO：871)的Cpf1酶，具有如下所示的序列：
在一些实施方案中，Cpf1被密码子优化成在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，Cpf1被密码子优化成在人细胞或小鼠细胞中表达。
Cpf1基因座包含混合的α/β结构域、RuvC-I、其后是螺旋区、RuvC-II和锌指状结构域。Cpf1蛋白具有RuvC样内切核酸酶结构域，其类似于Cas9的RuvC结构域。此外，Cpf1不具有HNH内切核酸酶结构域，并且Cpf1的N末端不具有Cas9的α-螺旋识别叶。
Cpf1 CRISPR-Cas结构域结构显示Cpf1在功能上是独特的，被归类为2类V型CRISPR系统。Cpf1基因座编码Cas1、Cas2和Cas4蛋白，与II型系统相比更类似于I和III。数据库检索表明许多细菌物种中Cpf1家族蛋白丰富。
功能性Cpf1不需要tracrRNA，因此仅需要crRNA。这有利于基因组编辑，因为Cpf1不仅比Cas9小，而且还具有较小的sgRNA分子(核苷酸数为Cas9的约一半)。
Cpf1-crRNA复合物通过鉴定前间隔区相邻基序5’-YTN-3’(其中“Y”是嘧啶而“N”是任何核碱基)或5’-TTN-3’来切割靶DNA或RNA，与Cas9靶向的富含G的PAM相反。在鉴定PAM后，Cpf1引入了4或5个核苷酸突出端的黏性末端样DNA双链断裂。
CRISPR/Cpf1系统由Cpf1酶和指导RNA组成，该指导RNA发现复合物并定位在双螺旋上的正确位点以切割靶DNA。CRISPR/Cpf1系统活动分为三个阶段：
改编(adaptation)，在此期间Cas1和Cas2蛋白促进DNA小片段改编成CRISPR阵列；
crRNA的形成：处理产生成熟crRNA的pre-cr-RNA以指导Cas蛋白；和
干扰，其中Cpf1与crRNA结合形成二元复合物以识别和切割靶DNA序列。
D.gRNA
作为RNA指导的蛋白质，Cas9需要短RNA来指导DNA靶标的识别。尽管Cas9优先询问含有PAM序列NGG的DNA序列，但其可以在没有前间隔区靶标的情况下进行结合。然而，Cas9-gRNA复合物需要与gRNA紧密匹配以产生双链断裂。细菌中的CRISPR序列在多RNA中表达，随后加工以产生RNA的引导链。因为真核系统缺少加工CRISPR RNA所需的一些蛋白质，所以产生合成构建体gRNA以将用于Cas9靶向的RNA的基本片段组合成用RNA聚合酶III型启动子U6表达的单个RNA。合成的gRNA的最小长度略微超过100bp，并含有靶向紧邻PAM序列NGG之前的20个前间隔区核苷酸的部分；gRNA不含PAM序列。
在一些实施方案中，gRNA靶向野生型肌养蛋白基因内的位点。在一些实施方案中，gRNA靶向突变肌养蛋白基因内的位点。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白内含子。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白外显子。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白外显子中的位点，外显子表达并存在于表1中所示的一种或更多种肌养蛋白同种型中。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白剪接位点。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白基因上的剪接供体位点。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白基因上的剪接接纳体位点。
在一些实施方案中，指导RNA靶向突变DMD外显子。在一些实施方案中，突变外显子是外显子23或51。在一些实施方案中，指导RNA靶向肌养蛋白基因的外显子1、23、41、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55中的至少一个。在一些实施方案中，指导RNA靶向肌养蛋白基因的内含子44、45、50、51、52、53、54或55中的至少一个。在一些优选的实施方案中，引导RNA被设计为诱导外显子51或外显子23的跳读。在一些实施方案中，gRNA靶向外显子51或外显子23的剪接接纳体位点。
用于本文公开的多种组合物和方法的合适的gRNA作为SEQ ID NO.383-705、709-711、715-717、790-862、864(表7、9、11、13和15)提供。在一些优选的实施方案中，gRNA选自SEQ ID NO：790至SEQ ID NO：862中的任一个。
在一些实施方案中，本公开内容的gRNA包含与对应于DMD基因的编码序列或非编码序列内的靶序列互补并因此与靶序列杂交的序列。在一些实施方案中，Cpf1的gRNA包含单个crRNA，其含有直接重复骨架序列，随后是24个核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，crRNA的“指导”序列包含与靶序列互补的gRNA序列。在一些实施方案中，本公开内容的crRNA包含与靶序列不互补的gRNA序列。本公开内容的“骨架”序列使gRNA与Cpf1多肽连接。本公开内容的“骨架”序列不等同于gRNA-Cas9构建体的tracrRNA序列。
在一些实施方案中，核酸可包含一个或更多个编码gRNA的序列。在一些实施方案中，核酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个编码gRNA的序列。在一些实施方案中，所有序列编码相同的gRNA。在一些实施方案中，所有序列编码不同的gRNA。在一些实施方案中，至少2个序列编码相同的gRNA，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个序列编码相同的gRNA。
E.Cas9对比Cpf1
Cas9需要两个RNA分子来切割DNA，而Cpf1需要一个。这些蛋白质还在不同的地方切割DNA，为研究人员在选择编辑位点时提供了更多选择。Cas9在相同位置切割DNA分子中的两条链，留下“平”末端。Cpf1留下一条长于另一条的链，产生更容易使用的“黏性”末端。与Cas9相比，Cpf1似乎更能够在切割位点插入新序列。虽然CRISPR/Cas9系统可以高效地使基因失效，但插入基因或产生敲入是具有挑战性的。Cpf1缺乏tracrRNA，利用富含T的PAM并通过交错的DNA DSB切割DNA。
总之，Cpf1和Cas9系统之间的重要差异在于Cpf1识别不同的PAM，实现了新的靶向可能性，其产生4-5个核苷酸长的黏性末端，而不是Cas9产生的平末端，提高了NHEJ或HDR期间遗传插入的效率和特异性，并在远离PAM并进一步远离Cas9切割位点的地方切割DNA，为切割DNA提供了新的可能性。
表3：Cas9和Cpf1之间的差异
F.CRISPR介导的基因编辑
使用CRISPR/Cpf1或CRISPR/Cas9编辑DMD基因的第一步是鉴定基因组靶序列。本公开内容的gRNA的基因组靶标可以是任何约24个核苷酸的DNA序列，前提是该序列与基因组的其余部分相比是独特的。在一些实施方案中，基因组靶序列对应于人肌养蛋白基因的外显子51、外显子45、外显子44、外显子53、外显子46、外显子52、外显子50、外显子43、外显子6、外显子7、外显子8和/或外显子55内的序列。在一些实施方案中，基因组靶细胞是人肌养蛋白基因的外显子51、外显子45、外显子44、外显子53、外显子46、外显子52、外显子50、外显子43、外显子6、外显子7、外显子8和/或外显子55的5’或3’剪接位点。在一些实施方案中，基因组靶细胞对应于人肌养蛋白基因的外显子51、外显子45、外显子44、外显子53、外显子46、外显子52、外显子50、外显子43、外显子6、外显子7、外显子8和/或外显子55立即上游或下游的内含子内的序列。示例性基因组靶序列可以见于表6、8、10、12和14中。
编辑DMD基因的下一步是鉴定待靶向的遗传区域内的所有前间隔区邻近基序(PAM)序列。靶序列必须在PAM的立即上游。一旦确定了所有可能的PAM序列和推定的靶位点，下一步是选择哪个位点可导致最高效的靶向切割。gRNA靶向序列需要与靶序列匹配，并且gRNA靶向序列必须不与基因组内的其他位点匹配。在一些优选的实施方案中，gRNA靶向序列与靶标具有完美的同源性，而与基因组的其他地方没有同源性。在一些实施方案中，给定的gRNA靶向序列将在整个基因组中具有存在部分同源性的额外位点。这些位点被称为“脱靶”，并且在设计gRNA时应予以考虑。通常，当在PAM序列附近发生错配时，脱靶位点不会被同样高效地切割，因此没有同源性的gRNA或具有与PAM序列接近的错配的gRNA将具有最高的特异性。除了“脱靶活性”之外，必须考虑使所需靶序列切割最大化的因子(“靶上活性”)。本领域技术人员已知，各自与靶DNA具有100％同源性的两种gRNA靶向序列可能不会产生相等的切割效率。事实上，根据所选靶序列内的特定核苷酸，切割效率可能升高或降低。仔细检查每个潜在的gRNA靶向序列的预测的靶上和脱靶活性是设计最佳gRNA所必需的。已经开发了多种gRNA设计程序，其能够定位潜在的PAM和靶序列，并基于其预测的靶上和脱靶活性对相关的gRNA进行排名(例如CRISPRdirect，可在www.crispr.dbcls.jp获得)。
下一步是合成和克隆期望的gRNA。靶向寡核苷酸可以被合成、退火并使用标准限制性连接克隆插入含有gRNA骨架的质粒中靶向寡核苷酸。然而，确切的克隆策略将取决于所选择的gRNA载体。Cpf1的gRNA明显比Cas9的gRNA简单，并且仅由包含直接重复骨架序列随后是指导序列的约24个核苷酸的单个crRNA组成。
随后应在一种或更多种靶细胞系中验证每种gRNA。例如，在将Cas9或Cpf1和gRNA递送至细胞后，可以根据本领域技术人员已知的方法使用PCR扩增基因组靶区域并测序。
在一些实施方案中，基因编辑可以在体外或离体进行。在一些实施方案中，细胞在体外或离体与Cas9或Cpf1和靶向肌养蛋白剪接位点的gRNA接触。在一些实施方案中，使细胞与编码Cas9或Cpf1和指导RNA的一种或更多种核酸接触。在一些实施方案中，使用例如脂质转染或电穿孔将一种或更多种核酸引入细胞中。基因编辑也可以在受精卵中进行。在一些实施方案中，可以用编码Cas9或Cpf1和靶向肌养蛋白剪接位点的gRNA一种或更多种核酸注射受精卵。随后可将受精卵注射到宿主体内。
在一些实施方案中，Cas9或Cpf1在载体上提供。在一些实施方案中，载体含有衍生自化脓性链球菌的Cas9(SpCas9，SEQ ID NO.872)。在一些实施方案中，载体含有衍生自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9，SEQ ID NO.873)。在一些实施方案中，载体含有衍生自毛螺菌科细菌的Cpf1序列。参见，例如，Uniprot登录号A0A182DWE3；SEQ ID NO.871。在一些实施方案中，载体含有衍生自氨基酸球菌属细菌的Cpf1序列。参见，例如，Uniprot登录号U2UMQ6；SEQ ID NO.870。在一些实施方案中，Cas9或Cpf1序列被密码子优化以用于在人细胞或小鼠细胞中表达。在一些实施方案中，载体还含有编码荧光蛋白(例如GFP)的序列，其允许使用荧光激活细胞分选(FACS)来分选表达Cas9或Cpf1的细胞。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体。
在一些实施方案中，gRNA在载体上提供。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体。在一些实施方案中，Cas9或Cpf1和指导RNA在同一载体上提供。在一些实施方案中，Cas9或Cpf1和指导RNA在不同载体上提供。
在一些实施方案中，使细胞另外与单链DMD寡核苷酸接触以实现同源定向修复。在一些实施方案中，小的插失(INDEL)恢复肌养蛋白的蛋白质阅读框(“重构框”策略)。当使用重构框策略时，可以使细胞与单个gRNA接触。在一些实施方案中，剪接供体或剪接接纳体位点被破坏，这导致外显子跳读和蛋白质阅读框的恢复(“外显子跳读”策略)。当使用外显子跳读策略时，可以使细胞与两种或更多种gRNA接触。
可以使用本领域技术人员已知的技术(例如T7E1测定)来评估体外或离体Cas9或Cpf1介导的DNA切割的效率。可以使用本领域技术人员已知的技术(例如RT-PCR、western印迹和免疫细胞化学)确认DMD表达的恢复。
在一些实施方案中，在肌肉或卫星细胞中进行体外或离体基因编辑。在一些实施方案中，在iPSC或iCM细胞中进行基因编辑。在一些实施方案中，iPSC细胞在基因编辑后分化。例如，iPSC细胞在编辑后可以分化成肌细胞或卫星细胞。在一些实施方案中，iPSC细胞分化成心肌细胞、骨骼肌细胞或平滑肌细胞。在一些实施方案中，iPSC细胞分化成心肌细胞。可以根据本领域技术人员已知的方法诱导iPSC细胞分化。
在一些实施方案中，使细胞与Cas9或Cpf1和gRNA接触恢复肌养蛋白的表达。在一些实施方案中，已经在体外或离体编辑的细胞或由其来源的细胞显示出与野生型细胞相当的肌养蛋白蛋白水平。在一些实施方案中，编辑的细胞或由其来源的细胞以野生型肌养蛋白表达水平的50％、60％、70％、80％、90％、95％或其间任何百分比表达肌养蛋白。在一些实施方案中，已经在体外或离体编辑的细胞或由其来源的细胞具有与野生型细胞相当的线粒体数。在一些实施方案中，编辑的细胞或由其来源的细胞具有为野生型细胞的50％、60％、70％、80％、90％、95％或其间任何百分比的线粒体数。在一些实施方案中，与基线处的未编辑细胞相比，编辑的细胞或由其来源的细胞显示氧消耗速率(OCR)增加。
G.RNA Pol III和Pol III启动子
在真核生物中，RNA聚合酶III(也称为Pol III)转录DNA以合成核糖体5S rRNA、tRNA和其他小RNA。RNA Pol III转录的基因属于“管家”基因类别，其表达在所有细胞类型和大多数环境条件下都是必需的。因此，Pol III转录的调节主要与细胞生长和细胞周期的调节有关，因此比RNA聚合酶II需要更少的调节蛋白。然而，在胁迫条件下，蛋白质Maf1抑制Pol III活性。
在转录(通过任何聚合酶)过程中，有三个主要阶段：(i)起始，需要在基因启动子上构建RNA聚合酶复合物；(ii)延伸，RNA转录物的合成；和(iii)终止，完成RNA转录并且RNA聚合酶复合物的分解。
RNA Pol III控制下的启动子包括核糖体5S rRNA、tRNA和少数其他小RNA，例如U6剪接体RNA、RNase P和RNase MRP RNA、7SL RNA(信号识别颗粒的RNA组分)、Vault RNA、YRNA、SINE(短散在重复元件)、7SK RNA、两种microRNA、几种小核仁RNA和几种调节反义RNA。
IV.核酸递送
如上所述，在某些实施方案中，表达盒(expression cassette)用于表达转录因子产物，以用于随后纯化和递送至细胞/对象，或直接用于基于遗传的递送方法。本文中提供了表达载体，其包含编码Cas9或Cpf1和至少一种靶向肌养蛋白剪接位点的DMD指导RNA的一种或更多种核酸。在一些实施方案中，在相同载体上提供编码Cas9或Cpf1的核酸和编码至少一种指导RNA的核酸。在另一些实施方案中，在分开的载体上提供编码Cas9或Cpf1的核酸和编码至少一种指导RNA的核酸。
表达需要在载体中提供适当的信号，并且包括多种来自病毒和哺乳动物来源二者的驱动目的基因在细胞中表达的调节元件(例如增强子/启动子)。还定义了设计用于优化宿主细胞中信使RNA稳定性和可翻译性的元件。还提供了使用多种显性药物选择标志物以建立表达产物的永久稳定细胞克隆的条件，以及将药物选择标志物的表达与多肽的表达联系起来的元件。
A.调节元件
在整个本申请中，术语“表达盒”意在包括含有编码基因产物的核酸的任何类型遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录和翻译，即，在启动子的控制下。“启动子”是指由起始基因的特异性转录所需的细胞的合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。短语“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向中以控制RNA聚合酶起始和基因的表达。“表达载体”意在包括包含在遗传构建体中能够复制的表达盒，并因此包括一个或更多个复制起点、转录终止信号、poly-A区、可选择标志物和多用途克隆位点。
术语启动子在本文中用于指在RNA聚合酶II的起始位点周围簇集的一组转录控制模块。关于如何组织启动子的大多数想法来自几种病毒启动子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单位的那些。通过更新的工作加强的这些研究已经示出启动子由离散的功能模块构成，各自由约7-20bp的DNA组成，并含有一个或更多个转录激活蛋白或阻遏蛋白的识别位点。
每个启动子中至少一个模块用于定位RNA合成的起始位点。其最著名的实例是TATA盒(TATA box)，但是在缺少TATA盒的一些启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于确定起始位置。
在一些实施方案中，本公开内容的Cas9或Cpf1构建体由肌细胞特异性启动子表达。该肌细胞特异性启动子可以是组成型活性的或者可以是诱导型启动子。
另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，但是最近已经示出许多启动子在起始位点下游也包含功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，以使得当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔在活性开始下降之前可以增加至相距50bp。根据启动子，似乎单个元件可以协同地或独立地起作用以激活转录。
在某些实施方案中，病毒促进例如人巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(Rous sarcoma viruslong terminal repeat)、大鼠胰岛素启动子且甘油醛-3-磷酸脱氢酶可用于获得目的编码序列的高水平表达。还考虑使用本领域公知的另一些病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现目的编码序列的表达，前提是表达水平对于给定目的足够。通过使用具有公知性质的启动子，可以优化转染或转化后目的蛋白质的表达水平和模式。此外，选择响应于特定生理信号而被调节的启动子可允许基因产物的诱导型表达。
增强子是增加来自位于相同DNA分子上的远端位置之启动子的转录的遗传元件。增强子的组织很像启动子。也就是说，它们由许多单个元件构成，其各自结合一个或更多个转录蛋白。增强子和启动子之间的基本区别是可操作性。增强子区域作为整体必须能够在一定距离处刺激转录；对于启动子区或其组成元件不需要这样。另一方面，启动子必须具有在特定位点和特定方向上指导RNA合成起始的一种或更多种元件，而增强子缺乏这些特异性。启动子和增强子通常是重叠和连续的，通常看起来具有非常相似的模块化组织。
下面是可与表达构建体中编码目的基因的核酸组合使用的启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表。另外地，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动基因的表达。如果提供合适的细菌聚合酶作为递送复合体的一部分或作为另外的遗传表达构建体，则真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的细胞质转录。
启动子和/或增强子可以是例如：免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、T细胞受体、HLA DQ a和/或DQβ、β-干扰素、白介素-2、白介素-2受体、MHC II类5、MHC II类HLA-Dra、β-肌动蛋白、肌肉肌酸激酶(muscle creatine kinase，MCK)、前清蛋白(甲状腺素视黄质运载蛋白(transthyretin))、弹性蛋白酶I、金属硫蛋白(MTII)、胶原酶、白蛋白、甲胎蛋白、t-珠蛋白、β-球蛋白、c-fos、c-HA-ras、胰岛素、神经细胞黏附分子(neural cell adhesionmolecule，NCAM)、α1-胰蛋白酶抑制剂(α1-antitrypain)、H2B(TH2B)组蛋白、小鼠和/或I型胶原、葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白A(serumamyloid A，SAA)、肌钙蛋白I(TN I)、血小板源性生长因子(platelet-derived growthfactor，PDGF)、迪谢内肌营养不良、SV40、多瘤(polyoma)、逆转录病毒、乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus)。
在一些实施方案中，可以使用诱导型元件。在一些实施方案中，诱导型元件是例如：MTII、MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)、β-干扰素、腺病毒5E2、胶原酶、溶基质蛋白酶、SV40、鼠MX基因、GRP78基因、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、MHC I类基因H-2κb、HSP70、增殖蛋白(proliferin)、肿瘤坏死因子和/或促甲状腺激素α基因。在一些实施方案中，诱导物是佛波酯(TFA)、重金属、糖皮质激素、聚(rI)x、聚(rc)、E1A、佛波酯(TPA)、干扰素、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)、A23187、IL-6、血清、干扰素、SV40大T抗原、PMA和/或甲状腺激素。本文中描述的任何诱导型元件可以与本文中描述的任何诱导物一起使用。
特别感兴趣的是肌肉特异性启动子。这些包括：肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋白启动子、肌钙蛋白1启动子；Na+/Ca2+交换体(exchanger)启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑钠肽启动子和αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子和ANF启动子。在一些实施方案中，肌肉特异性启动子是CK8启动子。CK8启动子具有以下序列(SEQ ID NO：874)
在一些实施方案中，肌细胞特异性启动子是CK8启动子的变体，称为CK8e。CK8e启动子具有以下序列(SEQ ID NO.875)：
在使用cDNA插入物的情况下，通常期望包含多腺苷酸化信号以实现基因转录物的适当多腺苷酸化。可以使用任何多腺苷酸化序列，例如人生长激素和SV40多腺苷酸化信号。还考虑作为表达盒元件的是终止子。这些元件可以用于增强信息水平并使从盒到其他序列中的通读最小化。
B.2A肽
在一些实施方案中，使用来自昆虫病毒明脉扁刺蛾(Thosea asigna)β四体病毒(Thosea asigna)的2A样自切割结构域(TaV 2A肽)(SEQ ID NO.876，EGRGSLLTCGDVEENPGP)。已经显示这些2A样结构域在整个真核生物中起作用并导致氨基酸的切割在2A样肽结构域内共翻译地发生。因此，包含TaV 2A肽允许从单个mRNA转录物表达多种蛋白质。重要的是，当在真核系统中测试时，TaV的结构域表现出大于99％的切割活性(Donnelly et al.，2001)。其他可接受的2A样肽包括但不限于：马鼻炎病毒(equinerhinitis A virus，ERAV)2A肽(SEQ ID NO.877；QCTNYALLKLAGDVESNPGP)、猪捷申病毒1(porcine teschovirus-1，PTV1)2A肽(SEQ ID NO.878；ATNFSLLKQAGDVEENPGP)和口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，FMDV)2A肽(SEQ ID NO.879；PVKQLLNFDLLKLAGDVESNPGP)或其经修饰形式。
在一些实施方案中，2A肽用于同时表达报道分子和Cas9或Cfp1。报道分子可以是例如GFP。
可以使用的其他自切割肽包括但不限于：核内含物蛋白a(nuclear inclusionprotein a，Nia)蛋白酶、P1蛋白酶、3C蛋白酶、L蛋白酶、3C样蛋白酶或其经修饰形式。
C.表达载体的递送
存在许多将表达载体引入细胞中的方式。在某些实施方案中，表达构建体包含病毒或衍生自病毒基因组的工程构建体。某些病毒通过受体介导的胞吞作用进入细胞，整合到宿主细胞基因组中并稳定和高效地表达病毒基因的能力使得其成为将外源基因转移到哺乳动物细胞中的有吸引力的候选物。这些对外来DNA序列具有相对低的容纳力，并且具有受限的宿主谱。此外，它们在允许细胞中的致癌潜力和细胞病变效应引起了安全性问题。它们只能容纳达8kB的外来遗传物质，但可容易地引入多种细胞系和实验动物中。
用于体内递送的一种优选方法涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意在包括含有足以(a)支持构建体包装和(b)表达其中已克隆的反义多核苷酸的腺病毒序列的那些构建体。在本发明上下文中，表达不需要合成基因产物。
表达载体包括基因工程形式的腺病毒。对腺病毒(36kB的线性双链DNA病毒)的遗传组织的了解允许用达7kB的外来序列取代大片段腺病毒DNA。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，原因是腺病毒DNA可以以附加体方式复制而没有潜在的遗传毒性。此外，腺病毒在结构上是稳定的，并且在大量扩增后没有检测到基因组重排。腺病毒可感染几乎所有上皮细胞，而不论其细胞周期阶段如何。迄今为止，腺病毒感染似乎仅与轻度疾病(例如人的急性呼吸系统疾病)相关。
腺病毒特别适合用作基因转移载体，原因是其具有中等大小的基因组、易于操作、高滴度、宽靶细胞范围和高感染性。病毒基因组的两端均含有100-200个碱基对的反向重复(ITR)，其是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域包含不同的转录单位，其被病毒DNA复制的起始分开。E1区(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组和少数细胞基因的转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白质的合成。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭。晚期基因的产物(包括大多数病毒衣壳蛋白)仅在由主要晚期启动子(major late promoter，MLP)产生的单一初级转录物的显著加工后表达。在感染的晚期期间MLP(位于16.8m.u.)特别高效，并且从该启动子产生的所有mRNA具有5’-三联前导(tripartite leader，TPL)序列，使其成为用于翻译的优选mRNA。在一个系统中，重组体腺病毒由穿梭载体和原病毒载体之间的同源重组产生。由于两种原病毒载体之间可能的重组，因此可以从该过程产生野生型腺病毒。因此，从单个噬斑(plaque)分离单个病毒克隆并检查其基因组结构是至关重要的。
产生和扩增复制缺陷型的现有腺病毒载体依赖于独特辅助细胞系，其称为293，其通过Ad5DNA片段从人胚肾细胞转化并组成型表达E1蛋白质。由于E3区是腺病毒基因组所必需的，因此现有腺病毒载体在293细胞的帮助下在E1、D3或这两个区域中携带外来DNA。在自然界中，腺病毒可以包装大约105％的野生型基因组，提供额外约2kb DNA的容量。加上在E1和E3区域中可替代的约5.5kb的DNA，现有腺病毒载体的最大容量为7.5kb或载体总长度的约15％。载体骨架中保留超过80％的腺病毒病毒基因组并且是载体携带的细胞毒性的来源。此外，E1缺失的病毒的复制缺陷是不完全的。
辅助细胞系可衍生自人细胞，例如人胚胎肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或者其他人胚胎间充质或上皮细胞。或者，辅助细胞可衍生自允许人腺病毒的其他哺乳动物物种的细胞。这样的细胞包括例如Vero细胞或其他猴胚胎间充质或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。
用于培养293细胞和繁殖腺病毒的改进方法是本领域中已知的。在一种方式中，通过将单独细胞接种到含有100-200ml培养基的1升硅化旋转瓶(Techne，Cambridge，UK)中来培养天然细胞聚集体。在以40rpm搅拌后，用台盼蓝估计细胞生存力。在另一种方式中，如下使用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。将悬浮在5ml培养基中的细胞接种物添加到250ml锥形瓶中的载体(50ml)并静置1至4小时，偶尔进行搅拌。随后用50ml新鲜培养基更换培养基并开始摇动。对于病毒产生，允许细胞生长至约80％汇合，此后更换培养基(至最终体积的25％)，并添加0.05MOI的腺病毒。将培养物静置过夜，随后将体积增加至100％，并再开始摇动72小时。
本公开内容的腺病毒是复制缺陷型或至少条件性复制缺陷型的。腺病毒可以是已知的42种不同血清型或A-F亚组中的任一种。将亚组C的5型腺病毒作为优选的起始材料以获得用于本公开内容的条件性复制缺陷型腺病毒载体。
如上所述，根据本公开内容的典型载体是复制缺陷型的，并且不具有腺病毒E1区。因此，最方便的是在E1编码序列已被去除的位置处引入编码目的基因的多核苷酸。然而，构建体在腺病毒序列内的插入位置不是关键的。如Karlsson et al.(1986)所述，编码目的基因的多核苷酸也可插入E3替代载体中来代替缺失的E3区，或者其中插入辅助细胞系或辅助病毒补充E4缺陷的E4区。
腺病毒易于生长和操作并在体外和体内展示广泛的宿主范围。这组病毒可以以高滴度获得，例如，每毫升109-1012噬斑形成单位，并且它们是高度感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外来基因是附加体，因此对宿主细胞的遗传毒性低。在用野生型腺病毒疫苗接种的研究中未报道有副作用，表明了它们作为体内基因转移载体的安全性和治疗潜力。
腺病毒载体已经用于真核基因表达和疫苗开发。动物研究表明，重组体腺病毒可用于基因治疗。将重组体腺病毒施用于不同组织的研究包括气管滴注(tracheainstillation)、肌肉注射、外周静脉内注射以及脑内立体定向(stereotactic)接种。
逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征在于通过逆转录过程将其RNA转化为感染细胞中双链DNA的能力。随后所得DNA稳定整合到细胞染色体中作为原病毒(provirus)并指导病毒蛋白的合成。整合导致在接受细胞及其后代中保留病毒基因序列。逆转录病毒基因组含有分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分的三个基因gag、pol和env。在gag基因上游发现的序列含有用于将基因组包装到病毒体中的信号。病毒基因组的5’和3’端有两个长末端重复(long terminal repeat，LTR)序列。这些含有强启动子和增强子序列，并且也是整合到宿主细胞基因组中所必需的。
为了构建逆转录病毒载体，将编码目的基因的核酸插入病毒基因组某些病毒序列位置处以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建了含有gag、pol和env基因但无LTR的包装细胞系和包装组分。当将含有cDNA的重组体质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起引入(例如通过磷酸钙沉淀)该细胞系中时，包装序列使重组体质粒的RNA转录物包装成病毒颗粒，随后其分泌到培养基中。随后收集含有重组体逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂。
基于逆转录病毒的化学修饰，通过将乳糖残基化学添加至病毒包膜，最近开发了设计为使逆转录病毒载体特异性靶向的新方法。这种修饰可使得通过唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。
可以使用重组体逆转录病毒靶向的不同方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特定细胞受体的生物素化抗体。该抗体通过使用链霉亲和素通过生物素组分偶联。使用针对主要组织相容性复合体I类和II类抗原的抗体，其已经证明在体外用同向性病毒感(ecotropic virus)染带有那些表面抗原的多种人细胞(Roux et al.，1989)。
在本公开内容的所有方面中使用逆转录病毒载体存在某些限制。例如，逆转录病毒载体通常整合到细胞基因组中的随机位点中。这可通过中断宿主基因或通过插入可以干扰侧翼基因功能的病毒调节序列而导致插入诱变(insertional mutagenesis)。使用缺陷型逆转录病毒载体的另一个问题是在包装细胞中潜在出现有复制能力的野生型病毒。这可能由其中来自重组体病毒的完整序列插入整合在宿主细胞基因组中的gag、pol、env序列的上游的重组事件引起。然而，现在已有的新的包装细胞系可大大降低重组的可能性(参见，例如，Markowitz et al.，1988；Hersdorffer et al.，1990)。
另一些病毒载体可用作本公开内容中的表达构建体。可采用例如衍生自以下病毒的载体：痘苗病毒(vaccinia virus)、腺相关病毒(AAV)和疱疹病毒。它们为多种哺乳动物细胞提供了数个有吸引力的特征。
在一些实施方案中，AAV载体是复制缺陷型的或条件性复制缺陷型的。在一些实施方案中，AAV载体是重组体AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体包含分离自或衍生自以下血清型的AAV载体的序列：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任意组合。
在一些实施方案中，使用单一病毒载体将编码Cas9或Cpf1和至少一种gRNA的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，使用第一病毒载体向细胞提供Cas9或Cpf1，并使用第二病毒载体向细胞提供至少一种gRNA。
在一些实施方案中，使用单一病毒载体将编码Cas9或Cpf1和至少一种gRNA的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，使用第一病毒载体向细胞提供Cas9或Cpf1，并使用第二病毒载体向细胞提供至少一种gRNA。为了实现有义或反义基因构建体的表达，必须将表达构建体递送到细胞中。细胞可以是肌细胞、卫星细胞、成血管细胞(mesoangioblast)、骨髓来源的细胞、基质细胞或间充质干细胞。在一些实施方案中，细胞是心肌细胞、骨骼肌细胞或平滑肌细胞。在一些实施方案中，细胞是胫骨前肌、四头肌、比目鱼肌、膈肌或心脏中的细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)或内细胞团细胞(inner cell mass cell，iCM)。在另一些实施方案中，细胞是人iPSC或人iCM。在一些实施方案中，本公开内容的人iPSC或人iCM可衍生自培养的干细胞系、成体干细胞、胎盘干细胞，或来自成体干细胞或胚胎干细胞的另一来源，其不需要破坏人胚胎。递送至细胞可以在体外实现，如在用于转化细胞系的实验室过程中，或者在体内或离体实现，如在某些疾病状态的治疗中。一种递送机制是通过病毒感染，其中表达构建体被包封在感染性病毒颗粒中。
本公开内容也考虑了用于将表达构建体转移到培养的哺乳动物细胞中的数种非病毒方法。这些包括磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔、直接显微注射、负载DNA的脂质体和lipofectamine-DNA复合体、细胞超声、使用高速微粒的基因轰击和受体介导的转染。这些技术中的一些可成功地适于体内或离体使用。
一旦表达构建体已被递送到细胞中，编码目的基因的核酸可在不同位点定位和表达。在某些实施方案中，编码基因的核酸可以稳定整合到细胞的基因组中。这种整合可以通过同源重组(基因置换)处于同源的位置和方向，或者其可整合到随机的非特异性位置中(基因增强)。在另一些实施方案中，核酸可以作为单独的DNA的附加体区段稳定地保持在细胞中。这样的核酸区段或“附加体”编码这样的序列，所述序列足以允许独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步地维持和复制。如何将表达构建体递送至细胞以及在细胞中核酸保留在何处取决于所使用的表达构建体的类型。
在另一个实施方案中，表达构建体可以简单地由裸重组体DNA或质粒组成。构建体的转移可以通过上述的物理或化学渗透细胞膜的任何方法进行。这尤其适用于体外转移，但也可以应用于体内使用。Dubensky等(1984)成功地将磷酸钙沉淀形式的多瘤病毒DNA注射到成年和新生小鼠的肝和脾中，证明活性病毒复制和急性感染。Benvenisty and Neshif(1986)也证明直接腹膜内注射磷酸钙沉淀的质粒导致所转染基因的表达。编码目的基因的DNA也可以以类似的方式在体内转移并表达基因产物。
在用于将裸DNA表达构建体转移到细胞中的另一个实施方案中，可以涉及粒子轰击。这种方法取决于将DNA包被的微粒加速到高速以使其穿刺细胞膜并进入细胞而不杀伤它们的能力。已经开发了用于加速小颗粒的几种装置。一种这样的装置依赖于高电压放电以产生电流，其进而提供动力。所用的微粒由生物惰性物质(例如钨或金珠)组成。
在一些实施方案中，表达构建体直接递送至对象的肝、皮肤和/或肌组织。这可能需要组织或细胞的手术暴露以消除枪和靶器官之间的任何中介组织，即离体处理。同样，编码特定基因的DNA可以通过该方法递送，并且仍通过本公开内容并入。
在另一个实施方案中，表达构建体可以包载(entrap)在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊状结构。多层脂质体具有通过水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自身重排，并且在脂质双层之间包载水和溶解的溶质。还考虑了lipofectamine-DNA复合体。
脂质体介导的体外核酸递送和外来DNA的表达已经非常成功。称为Lipofectamine2000TM的试剂被广泛使用并可商购。
在某些实施方案中，脂质体可以与血凝病毒(hemagglutinating virus，HVJ)复合以促进与细胞膜的融合和促进脂质体包封的DNA的细胞进入。在另一些实施方案中，脂质体可以与核的非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或联合使用。在另一些实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1二者复合或联合使用。由于这种表达构建体已经成功地用于体外和体内核酸的转移和表达，因此它们适用于公开内容。当在DNA构建体中使用细菌启动子时，也期望在脂质体内包括合适的细菌聚合酶。
可用于将编码特定基因的核酸递送到细胞中的另一些表达构建体是受体介导的递送载剂。其利用在几乎所有真核细胞中通过受体介导的胞吞作用选择性摄取大分子。由于多种受体的细胞类型特异性分布，因此递送可以是高度特异性的。
受体介导的基因靶向载剂通常由两种组分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。几种配体已经用于受体介导的基因转移。最广泛表征的配体是无唾液酸血清类黏蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)和运铁蛋白(transferrin)。与ASOR识别相同的受体的合成拟糖蛋白(neoglycoprotein)已经用作基因递送载体，而表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)也已经用于递送基因至鳞状癌细胞。
D.AAV-Cas9载体
在一些实施方案中，Cas9可以包装到AAV载体中。在一些实施方案中，AAV载体是野生型AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体含有一个或更多个突变。在一些实施方案中，AAV载体分离或衍生以下血清型的AAV载体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任何组合。
示例性AAV-Cas9载体含有两个ITR(反向末端重复)序列，其位于包含Cas9序列的中心序列区域的侧翼。在一些实施方案中，ITR分离或衍生自以下血清型的AAV载体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任何组合。在一些实施方案中，ITR包含AAV血清型的全长和/或野生型序列或由其组成。在一些实施方案中，ITR包含AAV血清型的截短序列或由其组成。在一些实施方案中，ITR包含AAV血清型的延长序列或由其组成。在一些实施方案中，ITR包含与相同AAV血清型的野生型序列相比含有序列变异的序列或由其组成。在一些实施方案中，序列变异包括取代、缺失、插入、倒位或转座中的一种或更多种。在一些实施方案中，ITR包含至少100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个碱基对或由其组成。在一些实施方案中，ITR包含100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个碱基对或由其组成。在一些实施方案中，ITR具有110±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有120±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有130±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有140±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有150±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有115、145或141个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有选自SEQ.ID.NO：880、SEQ IDNO：881、SEQ ID NO；882、SEQ ID NO：883和SEQ ID.NO：946的序列。
在一些实施方案中，AAV-Cas9载体可含有一个或更多个核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，AAV-Cas9载体包含1、2、3、4或5个核定位信号。示例性NLS包括c-myc NLS(SEQID NO：884)、SV40 NLS(SEQ ID NO：885)、hnRNPAI M9 NLS(SEQ ID NO：886)、核质蛋白NLS(SEQ ID NO：887)、来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO：888)、肌瘤(myoma)T蛋白的序列VSRKRPRP(SEQ ID NO：889)和PPKKARED(SEQ ID NO：890)、人p53的序列PQPKKKPL(SEQ ID NO：891)、小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO：892)、流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQ ID NO：893)和PKQKKRK(SEQ ID NO：894)、肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQ ID NO：895)和小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO：896)。进一步可接受的核定位信号包括二部分核定位序列，例如人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO：897)或类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO：898)。
在一些实施方案中，AAV-Cas9载体可包含额外的元件以促进载体的包装和Cas9的表达。在一些实施方案中，AAV-Cas9载体可包含polyA序列。在一些实施方案中，polyA序列可以是微型polyA序列。在一些实施方案中，AAV-CAs9载体可包含转座元件。在一些实施方案中，AAV-Cas9载体可包含调节元件。在一些实施方案中，调节元件是活化剂或阻遏物。
在一些实施方案中，AAV-Cas9可包含一个或更多个启动子。在一些实施方案中，一个或更多个启动子驱动Cas9的表达。在一些实施方案中，一个或更多个是肌肉特异性启动子。示例性肌肉特异性启动子包括肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋白启动子、肌钙蛋白1启动子、Na+/Ca2+交换体启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑利尿钠肽(natriuretic peptide)启动子、αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子、ANF启动子、CK8启动子和CK8e启动子。
在一些实施方案中，可优化AAV-Cas9载体用于在酵母、细菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞中生产。在一些实施方案中，可优化AAV-Cas9载体以在人细胞中表达。在一些实施方案中，可优化AAV-Cas9载体以在杆状病毒表达系统中表达。
在一些实施方案中，AAV-Cas9载体包含选自如表4中所示的SEQ ID NO：899、SEQID NO：900、SEQ ID NO：901或SEQ ID NO：902的序列。
表4：示例性基因编辑构建体(从ITR到ITR以用于通过AAV载体递送)
在本公开内容的基因编辑构建体的一些实施方案中(包括包含SEQ ID NO：899-902的那些实施方案)，构建体包含启动子和核酸酶或由其组成。在一些实施方案中，构建体包含CK8e启动子和Cas9核酸酶或由其组成。在一些实施方案中，构建体包含CK8e启动子和分离或衍生自化脓性葡萄球菌的Cas9核酸酶(“SpCas9”)或由其组成。在一些实施方案中，CK8e启动子包含以下的核苷酸序列或由其组成：
在一些实施方案中，SpCas9核酸酶包含以下的核苷酸序列或由其组成：
在一些实施方案中，包含启动子和核酸酶的构建体还包含至少两个反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，包含启动子和核酸酶的构建体还包含至少两个分离自或衍生自血清型2的AAV(AAV2)的ITR序列。在一些实施方案中，包含启动子和核酸酶的构建体还包含至少两个ITR序列，每个ITR序列包含以下的核苷酸序列或由其组成：
在一些实施方案中，包含启动子和核酸酶的构建体还包括至少两个ITR序列，其中所述第一ITR序列包含以下的核苷酸序列或由其组成：
并且所述第二ITR序列包含以下的核苷酸序列或由其组成：
在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码核酸酶的序列和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一AAV2 ITR、编码CK8e启动子的序列、编码SpCas9核酸酶的序列和第二AAV2 ITR，或由其组成。在一些实施方案中，从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码核酸酶的序列和第二ITR或由其组成的构建体还包含poly A序列。在一些实施方案中，polyA序列包含微型polyA序列或由其组成。本公开内容的示例性微型polyA序列包含以下的核苷酸序列或由其组成：
在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码核酸酶的序列、poly A序列和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码核酸酶的序列、微型poly A序列和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一AAV2 ITR、编码CK8e启动子的序列、编码SpCas9核酸酶的序列、微型poly A序列和第二AAV2 ITR，或由其组成。在一些实施方案中，从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码核酸酶的序列、poly A序列和第二ITR的构建体还包含至少一个核定位信号。在一些实施方案中，从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码核酸酶的序列、poly A序列和第二ITR的构建体还包含至少两个核定位信号。本公开内容的示例性核定位信号包含AAGCGTCCTGCTGCTACTAAGAAAGCTGGTCAAGCTAAGAAAAAGAAA(SEQ IDNO.887)的核苷酸序列或ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCC(SEQID NO.885)的核苷酸序列，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码第一核定位信号的序列、编码核酸酶的序列、poly A序列和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码第一核定位信号的序列、编码核酸酶的序列、编码第二核定位信号的序列、poly A序列和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一AAV2 ITR、编码CK8e启动子的序列、具有SEQ ID NO：885序列的核定位信号、编码SpCas9核酸酶的序列、微型polyA序列和第二AAV2 ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一AAV2ITR、编码CK8e启动子的序列、编码SpCas9核酸酶的序列、具有SEQ ID NO：887序列的核定位信号、微型poly A序列和第二AAV2 ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一AAV2 ITR、编码CK8e启动子的序列、具有SEQ ID NO.885序列的核定位信号、编码SpCas9核酸酶的序列、具有SEQ ID NO：887序列的核定位信号、微型poly A序列和第二AAV2ITR，或由其组成。在一些实施方案中，从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码第一核定位信号的序列、编码核酸酶的序列、编码第二核定位信号的序列、poly A序列和第二ITR构建体还包含终止密码子。终止密码子可以具有TAG(SEQ ID NO：904)、TAA(SEQ ID NO：905)或TGA(SEQ ID NO：906)的序列。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码第一核定位信号的序列、编码核酸酶的序列、编码第二核定位信号的序列、终止密码子、poly A序列和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一AAV2 ITR、编码CK8e启动子的序列、具有SEQ ID NO：885序列的核定位信号、编码SpCas9核酸酶的序列、终止密码子、微型poly A序列和第二AAV2 ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一AAV2 ITR、编码CK8e启动子的序列、编码SpCas9核酸酶的序列、具有SEQ ID NO：887序列的核定位信号、终止密码子、微型poly A序列和第二AAV2 ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一AAV2 ITR、编码CK8e启动子的序列、具有SEQ ID NO.885序列的核定位信号、编码SpCas9核酸酶的序列、具有SEQID NO：887序列的核定位信号、终止密码子，微型poly A序列和第二AAV2ITR，或由其组成。在一些实施方案中，从5’至3’包含第一ITR、编码启动子的序列、编码第一核定位信号的序列、编码核酸酶的序列、编码第二核定位信号的序列、终止密码子、poly A序列和第二ITR或由其组成的构建体还包含转座元件反向重复。本公开内容的示例性转座元件反向重复包含
的核苷酸序列和/或 的核苷酸序列，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、编码启动子的序列、编码第一核定位信号的序列、编码核酸酶的序列、编码第二核定位信号的序列、终止密码子、poly A序列、第二ITR和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含具有SEQ ID NO.907序列的第一转座元件反向重复、第一AAV2 ITR、编码CK8e启动子的序列、具有SEQ ID NO.885序列的核定位信号、编码SpCas9核酸酶的序列、具有SEQ ID NO：887序列的核定位信号、终止密码子、微型poly A序列、第二AAV2 ITR和具有SEQ ID NO.908序列的第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、编码启动子的序列、编码第一核定位信号的序列、编码核酸酶的序列、编码第二核定位信号的序列、终止密码子、poly A序列、第二ITR和第二转座元件反向重复或由其组成的构建体还包含调节序列。本公开内容的示例性调节序列包含以下的核苷酸序列或由其组成：
在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、编码启动子的序列、编码第一核定位信号的序列、编码核酸酶的序列、编码第二核定位信号的序列、终止密码子、poly A序列、第二ITR、调节序列和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含具有SEQ ID NO.907的第一转座元件反向重复、第一AAV2 ITR、编码CK8e启动子的序列、具有SEQ ID NO.885序列的核定位信号、编码SpCas9核酸酶的序列、具有SEQ ID NO：887序列的核定位信号、终止密码子、微型poly A序列、第二AAV2 ITR，具有SEQ ID NO.909序列的调节序列、和具有SEQ ID NO.908序列的第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体可进一步包含一个或更多个间隔区序列。本公开内容的示例性间隔区序列具有1-1500个核苷酸(包括其间的所有范围)的长度。在一些实施方案中，间隔区序列可位于ITR、启动子、核定位序列、核酸酶、终止密码子、polyA序列、转座元件反向重复和/或调节元件的5’或3’。在一些实施方案中，构建体可具有包含SEQ ID NO：899、SEQ ID NO：900、SEQ ID NO：901或SEQ ID NO：902或其组成的序列。
E.AAV-sgRNA载体
在一些实施方案中，至少编码gRNA的第一序列和编码gRNA的第二序列可以包装到AAV载体中。在一些实施方案中，至少编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列和编码gRNA的第三序列可以包装到AAV载体中。在一些实施方案中，至少编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列、编码gRNA的第三序列和编码gRNA的第四序列可以包装到AAV载体中。在一些实施方案中，至少编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列、编码gRNA的第三序列、编码gRNA的第四序列和编码gRNA的第五序列可以包装到AAV载体中。在一些实施方案中，将编码gRNA的多个序列包装到AAV载体中。例如，可以将编码gRNA的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个序列包装到AAV载体中。在一些实施方案中，编码gRNA的每个序列是不同的。在一些实施方案中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个编码gRNA的序列相同。在一些实施方案中，所有编码gRNA的序列都相同。
在一些实施方案中，AAV载体是野生型AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体包含一个或更多个突变。在一些实施方案中，AAV载体分离或衍生自血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任何组合的AAV载体。
示例性AAV-sgRNA载体包含两个ITR(反向末端重复)序列，其位于包含sgRNA序列的中心序列区的侧翼。在一些实施方案中，ITR分离或衍生自血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任何组合的AAV载体。在一些实施方案中，ITR分离或衍生自第一血清型的AAV载体，并且编码AAV-sgRNA载体的衣壳蛋白的序列分离或衍生自第二血清型的AAV载体。在一些实施方案中，第一血清型和第二血清型相同。在一些实施方案中，第一血清型和第二血清型不相同。在一些实施方案中，第一血清型是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11。在一些实施方案中，第二血清型是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11。在一些实施方案中，第一血清型是AAV2，并且第二血清型是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11。在一些实施方案中，第一血清型是AAV2，并且第二血清型是AAV9。
示例性AAV-sgRNA载体包含两个ITR(反向末端重复)序列，其位于包含gRNA序列的中心序列区域的侧翼。在一些实施方案中，ITR分离或衍生自血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任何组合的AAV载体。在一些实施方案中，第一ITR分离或衍生自第一血清型的AAV载体，第二ITR分离或衍生自第二血清型的AAV载体，并且编码AAV-sgRNA载体的衣壳蛋白的序列分离或衍生自第三血清型的AAV载体。在一些实施方案中，第一血清型和第二血清型相同。在一些实施方案中，第一血清型和第二血清型不相同。在一些实施方案中，第一血清型、第二血清型和第三血清型相同。在一些实施方案中，第一血清型、第二血清型和第三血清型不相同。在一些实施方案中，第一血清型是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11。在一些实施方案中，第二血清型是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11。在一些实施方案中，第三血清型是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11。在一些实施方案中，第一血清型是AAV2，第二血清型是AAV4，并且第三血清型是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11。在一些实施方案中，第一血清型是AAV2，第二血清型是AAV4，并且第三血清型是AAV9。示例性AAV-sgRNA载体包含两个ITR(反向末端重复)序列，其位于包含sgRNA序列的中心序列区的侧翼。在一些实施方案中，ITR分离或衍生自血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任何组合的AAV载体。在一些实施方案中，ITR包含AAV血清型的全长和/或野生型序列或由其组成。在一些实施方案中，ITR包含AAV血清型的截短序列或由其组成。在一些实施方案中，ITR包含AAV血清型的延长序列或由其组成。在一些实施方案中，ITR包含与相同AAV血清型的野生型序列相比含有序列变异的序列或由其组成。在一些实施方案中，序列变异包括取代、缺失、插入、倒位或转座中的一种或更多种。在一些实施方案中，ITR包含至少100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个碱基对，或由其组成。在一些实施方案中，ITR包含100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个碱基对，或由其组成。在一些实施方案中，ITR具有110±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有120±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有130±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有140±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有150±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有115、145或141个碱基对的长度。在一些实施方案中，ITR具有选自SEQ ID NO：880、SEQ ID NO：881、SEQ ID NO：882或SEQ ID NO：883的序列。
在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体可包含额外的元件以促进载体的包装和sgRNA的表达。在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体可包含转座元件。在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体可包含调节元件。在一些实施方案中，调节元件包含活化剂或阻遏物。在一些实施方案中，AAV-sgRNA序列可包含非功能或“填充”序列。本公开内容的示例性填充序列可与哺乳动物(包括人)的基因组序列具有一些(非零百分比的)同一性或同源性。或者，本公开内容的示例性填充序列可不与哺乳动物(包括人)的基因组序列具有同一性或同源性。本公开内容的示例性填充序列可包含天然存在的非编码序列或在将AAV载体施用于对象之后既不转录也不翻译的序列，或由其组成。
在一些实施方案中，可优化AAV-sgRNA载体以在酵母、细菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞中生产。在一些实施方案中，可优化AAV-sgRNA载体以在人细胞中表达。在一些实施方案中，可优化AAV-Cas9载体以在杆状病毒表达系统中表达。
在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体包含至少一个启动子。在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体包含至少两个启动子。在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体包含至少三个启动子。在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体包含至少四个启动子。在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体包含至少五个启动子。示例性启动子包括，例如，免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、T细胞受体、HLA DQ a和/或DQβ、β-干扰素、白细胞介素-2、白细胞介素-2受体、MHC II类5、MHC II类HLA-Dra、β-肌动蛋白、肌肉肌酸激酶(MCK)、前清蛋白(运甲状腺素蛋白)、弹性蛋白酶I、金属硫蛋白(MTII)、胶原酶、白蛋白、甲胎蛋白、t-球蛋白、β-球蛋白、c-fos、c-HA-ras、胰岛素、神经细胞黏附分子(NCAM)、α1-抗胰蛋白酶、H2B(TH2B)组蛋白、小鼠和/或I型胶原、葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白A(SAA)、肌钙蛋白I(TN I)、血小板衍生生长因子(PDGF)、迪谢内肌营养不良、SV40、多瘤、逆转录病毒、乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒(CMV)和长臂猿白血病病毒。其他示例性启动子包括U6启动子、H1启动子和7SK启动子。
在一些实施方案中，编码gRNA的序列包含选自SEQ ID NO：383-705、709-711、715-717、790-862和864的序列。
在一些实施方案中，AAV载体包含编码gRNA的第一序列和编码gRNA的第二序列，第一启动子驱动编码gRNA的第一序列的表达，第二启动子驱动编码gRNA的第二序列的表达。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子相同。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子不相同。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子选自H1启动子、U6启动子和7SK启动子。在一些实施方案中，编码gRNA的第一序列和编码gRNA的第二序列相同。在一些实施方案中，编码gRNA的第一序列和编码gRNA的第二序列不相同。
在一些实施方案中，AAV载体包含编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列和编码gRNA的第三序列，第一启动子驱动编码gRNA的第一序列的表达，第二启动子驱动编码gRNA的第二序列的表达，并且第三启动子驱动编码gRNA的第三序列的表达。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子和第三启动子中的至少两个相同。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子和第三启动子中的每一个是不同的。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子和第三启动子选自H1启动子、U6启动子和7SK启动子。在一些实施方案中，第一启动子是U6启动子。在一些实施方案中，第二启动子是H1启动子。在一些实施方案中，第三启动子是7SK启动子。在一些实施方案中，第一启动子是U6启动子、第二启动子是H1启动子，并且第三启动子是7SK启动子。在一些实施方案中，编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列和编码gRNA的第三序列相同。在一些实施方案中，编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列和编码gRNA的第三序列不相同。
在一些实施方案中，AAV载体包含编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列、编码gRNA的第三序列和编码gRNA的第四序列，第一启动子驱动编码gRNA的第一序列的表达，第二启动子驱动编码gRNA的第二序列的表达，第三启动子驱动编码gRNA的第三序列的表达，并且第四启动子驱动编码gRNA的第四序列的表达。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子、第三启动子和第四启动子中的至少两个相同。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子、第三启动子和第四启动子中的每一个是不同的。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子、第三启动子和第四启动子中的每一个选自H1启动子、U6启动子和7SK启动子。在一些实施方案中，编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列、编码gRNA的第三序列和编码gRNA的第四序列相同。在一些实施方案中，编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列、编码gRNA的第三序列和编码gRNA的第四序列不相同。
在一些实施方案中，AAV载体包含编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列、编码gRNA的第三序列、编码gRNA的第四序列和编码gRNA的第五序列，第一启动子驱动编码gRNA的第一序列的表达，第二启动子驱动编码gRNA的第二序列的表达，第三启动子驱动编码gRNA的第三序列的表达，第四启动子驱动编码gRNA的第四序列的表达，并且第五启动子驱动编码gRNA的第五序列的表达。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子和第五启动子中的至少两个相同。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子和第五启动子中的每一个是不同的。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子、第三启动子和第四启动子中的每一个是不同的。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子和第五启动子中的每一个选自H1启动子、U6启动子和7SK启动子。在一些实施方案中，编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列、编码gRNA的第三序列、编码gRNA的第四序列和编码gRNA的第五序列相同。在一些实施方案中，编码gRNA的第一序列、编码gRNA的第二序列、编码gRNA的第三序列、编码gRNA的第四序列和编码gRNA的第五序列不相同。
在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体包含选自SEQ ID NO：910、SEQ ID NO：911、SEQID NO：912或SEQ ID NO：913的序列。在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体包含选自SEQ IDNO：914、SEQ ID NO：915、SEQ ID NO：916或SEQ ID NO：917的序列。在一些实施方案中，AAV-sgRNA载体包含选自SEQ ID NO：918、SEQ ID NO：919、SEQ ID NO：920或SEQ ID NO：921的序列。示例性AAV-sgRNA载体提供于表5中。
表5.示例性AAV-sgRNA载体。
在本公开内容的基因编辑构建体的一些实施方案中(包括包含SEQ ID NO：910至921的那些实施方案)，构建体包含第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子和编码gRNA的第二序列、第三启动子和编码gRNA的第三序列，或由其组成。编码本公开内容的gRNA的示例性序列是SEQ ID NO.383-705、709-711、715-717、790-862、864。在一些实施方案中，编码gRNA的序列是CACTAGAGTAACAGTCTGAC(SEQ ID NO.708)。在一些实施方案中，编码gRNA的序列是CACCAGAGTAACAGTCTGAG(SEQ ID NO.714)。在一些实施方案中，编码gRNA的序列是CACCAGAGTAACAGTCTGAC(SEQ ID NO.863)。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一启动子、编码SEQ ID NO.708的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO.708的gRNA的第二序列、第三启动子和编码SEQ ID NO.708的gRNA的第三序列。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一启动子、编码SEQ ID NO.714的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO.714的gRNA的第二序列、第三启动子和编码SEQ ID NO.714的gRNA的第三序列。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一启动子、编码SEQ ID NO.863的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO.863的gRNA的第二序列、第三启动子和编码SEQ ID NO.863的gRNA的第三序列。本发明的示例性启动子包括具有以下序列的U6启动子
具有以下序列的H1启动子
和
具有以下序列的7SK启动子
在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子和第三启动子各自独立地选自U6启动子(SEQ ID NO：922)、H1启动子(SEQ ID NO：923)和7SK启动子(SEQ ID NO：924)。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子和第三启动子各自独立地选自U6启动子(SEQ ID NO：922)和H1启动子(SEQ ID NO：923)。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含U6启动子、编码gRNA的第一序列、H1启动子、编码gRNA的第二序列、7SK启动子和编码gRNA的第三序列。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含U6启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的第二序列、7SK启动子和编码SEQ ID NO：708的gRNA的第三序列。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含U6启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ IDNO：714的gRNA的第二序列、7SK启动子和编码SEQ ID NO：714的gRNA的第三序列。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含U6启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的第二序列、7SK启动子和编码SEQ ID NO：863的gRNA的第三序列。在一些实施方案中，包含第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子和编码gRNA的第二序列、第三启动子和编码gRNA的第三序列的构建体还包含至少两个反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，包含第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子和编码gRNA的第二序列、第三启动子和编码gRNA的第三序列的构建体还包含至少两个分离或衍生自血清型2的AAV(AAV2)的ITR序列。在一些实施方案中，包含第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子和编码gRNA的第二序列、第三启动子和编码gRNA的第三序列的构建体还包含至少两个ITR序列，其中第一ITR序列分离或衍生自血清型4的AAV(AAV4)，并且第二ITR序列分离或衍生自血清型2的AAV(AAV2)。示例性ITR序列是
在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子和编码gRNA的第二序列、第三启动子、编码gRNA的第三序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、U6启动子、编码gRNA的第一序列、H1启动子和编码gRNA的第二序列、7SK启动子、编码gRNA的第三序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第二启动子和编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ IDNO：708的gRNA的序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、第二启动子和编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第二启动子和编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、U6、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、H1启动子和编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、U6、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、H1启动子和编码SEQ IDNO：714的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子和编码gRNA的第二序列、第三启动子、编码gRNA的第三序列、和第二ITR的构建体还包含poly A序列。在一些实施方案中，polyA序列包含微型polyA序列或由微型polyA序列组成。本公开内容的示例性微型polyA序列包含以下的核苷酸序列或由其组成：
在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子和编码gRNA的第二序列、第三启动子、编码gRNA的第三序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、U6启动子、编码gRNA的第一序列、H1启动子、编码gRNA的第二序列、7SK启动子、编码gRNA的第三序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQID NO：863的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、U6启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、U6启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子和编码gRNA的第二序列、第三启动子、编码gRNA的第三序列、微型polyA序列、和第二ITR的构建体还包含转座元件反向重复。本公开内容的示例性转座元件反向重复包含核苷酸序列
和/或核苷酸序列
，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子、编码gRNA的第二序列、第三启动子、编码gRNA的第三序列、微型polyA序列、第二ITR、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、U6启动子、编码gRNA的第一序列、H1启动子、编码gRNA的第二序列、7SK启动子、编码gRNA的第三序列、微型polyA序列、第二ITR、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、微型poly A序列、第二ITR、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQID NO：714的gRNA的序列、微型polyA序列、第二ITR、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、微型poly A序列、第二ITR、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、U6启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、微型polyA序列、第二ITR、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、U6启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ IDNO：714的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、微型poly A序列、第二ITR、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子、编码gRNA的第二序列、第三启动子、编码gRNA的第三序列、微型polyA序列、第二ITR、第二转座元件反向的构建体还包含调节序列。本公开内容的示例性调节序列包含以下的核苷酸序列或由其组成：
在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子、编码gRNA的第二序列、第三启动子、编码gRNA的第三序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、U6启动子、编码gRNA的第一序列、H1启动子、编码gRNA的第二序列、7SK启动子、编码gRNA的第三序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向、第一ITR、U6启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向、第一ITR、U6启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，包含第一ITR、第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子和编码gRNA的第二序列、第三启动子、编码gRNA的第三序列、微型polyA序列、和第二ITR的构建体还包含填充序列。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、U6启动子、编码gRNA的第一序列、H1启动子、编码gRNA的第二序列、7SK启动子、编码gRNA的第三序列、填充序列、微型polyA序列和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、填充序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码SEQID NO：714的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、填充序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、填充序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、U6启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQID NO：708的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、填充序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一ITR、U6启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、填充序列、微型polyA序列、和第二ITR，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码gRNA的第一序列、第二启动子、编码gRNA的第二序列、第三启动子、编码gRNA的第三序列、填充序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、U6启动子、编码gRNA的第一序列、H1启动子、编码gRNA的第二序列、7SK启动子、编码gRNA的第三序列、填充序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、填充序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQID NO：714的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、填充序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、第一启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第二启动子、编码SEQ ID NO：863的gRNA的序列、第三启动子、编码SEQID NO：863的gRNA的序列、填充序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复，或由其组成。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、U6启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：708的gRNA的序列、填充序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复。在一些实施方案中，构建体从5’至3’包含第一转座元件反向重复、第一ITR、U6启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、H1启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、7SK启动子、编码SEQ ID NO：714的gRNA的序列、填充序列、微型polyA序列、第二ITR、调节序列、和第二转座元件反向重复。在一些实施方案中，构建体可还包含一个或更多个间隔区序列。本公开内容的示例性间隔区序列的长度为1-1500个核苷酸，包括其间的所有范围。在一些实施方案中，间隔区序列可位于ITR、启动子、编码gRNA的序列、polyA序列、转座元件反向重复、填充序列和/或调节元件的5’或3’位置。
V.药物组合物和递送方法
对于临床应用，药物组合物以适于预期应用的形式制备。通常，这需要制备基本上不含热原以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。
使用合适的盐和缓冲液以使药物、蛋白质或递送载体稳定并允许被靶细胞摄取。本公开内容的水性组合物包含溶解或分散在可药用载体或水性介质中的有效量的药物、载体或蛋白质。短语“可药用的或药理学上可接受的”是指当向动物或人施用时不产生不利的、变应性的或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文中所用，“可药用的载体”包括用于配制药物(例如适合向人施用的药物)的可接受的溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。可以使用与本公开内容的活性成分不相容的任何常规介质或试剂在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可并入组合物中，前提是它们不使组合物的载剂或细胞失活。
在一些实施方案中，本公开内容的活性组合物可包括经典的药物制剂。根据本公开内容的这些组合物的施用可通过任何常见途径，前提是可通过该途径达到靶组织，但通常包括全身施用。这包括经口、经鼻或口含(buccal)。或者，施用可以通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射，或通过直接注射到肌组织中进行。如上所述，这样的组合物通常作为可药用组合物施用。
活性化合物也可经肠胃外或腹膜内施用。例如，作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在水中与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当地混合而制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制备物通常含有防腐剂以防止微生物的生长。
可适于注射使用的药物形式包括例如无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。通常，这些制备物是无菌的和流动的，达到容易注射的程度。制备物在制造和储存条件下应当是稳定的，并且应当防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。合适的溶剂或分散介质可含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，和植物油。可通过例如使用包衣(例如卵磷脂)，通过在分散体的情况下维持所需的粒度并通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。微生物作用的预防可通过多种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
可通过将适量的活性化合物以及所期望的任何其他成分(例如如上所列的)一起并入溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将多种灭菌的活性成分并入含有基础分散介质和所需的其他成分(例如，如上面列举的)的无菌载体中制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生来自其之前无菌过滤溶液的活性成分的粉末以及任何另外的所需成分。
在一些实施方案中，本公开内容的组合物配制成中性或盐形式。可药用盐包括例如衍生自无机酸(例如，盐酸或磷酸)，或衍生自有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等)的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。与蛋白质的游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或衍生自有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。
在配制时，优选以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效量施用溶液。制剂可易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。对于水溶液中的肠胃外施用，例如，溶液通常进行适当地缓冲，并且首先例如用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这样的水溶液可用于例如静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。优选地，特别是根据本公开内容，使用本领域技术人员已知的无菌水性介质。例如，单剂量可溶解在1ml的等张NaCl溶液中，并且添加至1000ml的皮下输液流体(hypodermoclysis fluid)或在所推荐的输注部位注射(参见例如″Remington′s Pharmaceutical Sciences″15th Edition，pages 1035-1038 and1570-1580)。根据被治疗的对象的病症，剂量将必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定个体对象的适当剂量。此外，对于人施用，制备物应满足FDA生物制品标准办公室(FDA Office of Biologics standards)要求的无菌性、热原性、整体安全性和纯度标准。
在一些实施方案中，可使用过继细胞转移(adoptive cell transfer，ACT)将本文中所述的Cas9或Cpf1和gRNA递送至患者。在过继细胞转移中，一种或更多种表达构建体离体提供给源自患者(自体)或源自除患者之外的一个或更多个个体(同种异体)的细胞。随后将细胞引入或重新引入患者中。因此，在一些实施方案中，在将细胞引入或重新引入患者中之前，将一种或更多种编码Cas9或Cpf1和靶向肌养蛋白剪接位点的指导RNA的核酸离体提供给细胞。
以下的表提供了与本文公开的组合物和方法联合使用的示例性引物和基因组靶向序列。
表6-基因组靶序列
*在该表中，大写字母表示与基因的外显子序列对齐的核苷酸。小写字母表示与基因的内含子序列对齐的核苷酸。
表7-gRNA序列
*在该表中，大写字母表示与基因的外显子序列对齐的sgRNA核苷酸。小写字母表示与基因的内含子序列对齐的sgRNA核苷酸。
VI.序列表
表8：小鼠Dmd外显子51中sgRNA的基因组靶位点
表9：靶向小鼠Dmd外显子51的gRNA序列
表10：靶向人Dmd外显子51的sgRNA的基因组靶序列
表11：靶向人Dmd外显子51的sgRNA序列
表12：靶向多种人Dmd外显子中的位点的sgRNA的基因组靶序列
表13：靶向多种人Dmd外显子中的位点的gRNA序列
表14：靶向狗Dmd外显子51的sgRNA的基因组靶向序列
表15：靶向狗Dmd外显子51的gRNA序列
VII.实施例
包括以下实施例以说明本公开内容的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开内容的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。
实施例1-材料和方法
研究批准。本研究中涉及动物的所有实验程序均由德克萨斯大学西南医学中心(University of Texas Southwestern Medical Center)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)审查和批准。
小鼠中CRISPR/Cas9介导的外显子50缺失。使用以下引物将对小鼠Dmd基因座的外显子50序列周围的内在区域特异的两个单指导RNA(sgRNA)克隆到载体px330中：
对于sgRNA的体外转录，使用以下引物通过PCR将T7启动子序列添加至sgRNA模板：
使用MEGAshortscript T7 Kit(Life Technologies)将凝胶纯化的PCR产物用作体外转录的模板。通过MEGAclear kit(Life Technologies)纯化sgRNA，并用无核酸酶的水(Ambion)洗脱。通过NanoDrop仪器(Thermo Scientific)测量指导RNA的浓度。
ΔEx50小鼠的基因分型。使用包含靶向区域的引物对ΔEx50小鼠进行基因分型：
将尾部活组织检查物在100μL的25mM NaOH，0.2mM EDTA(pH12)中在95℃C下消化20分钟。将尾部短暂离心，随后添加100μL 40-mM Tris·HCl(pH 5)并混合均匀。用下述引物将2微升该反应用于随后的PCR反应，随后进行凝胶电泳。
质粒。含有具有2A-EGFP的人密码子优化的SpCas9基因和sgRNA骨架的pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒购自Addgene(质粒#48138)。AAV TRIPSR质粒获自Dirk Grimm博士(Heidelberg University Hospital)。使用BbsT位点进行sgRNA的克隆。pGL3-CK8e质粒获自Stephen Hauschka博士(Department of Biochemistry，University of Washington，Seattle，USA)。AAV-微型CMV-Cas9-shortPolyA质粒获自Dirk Grimm博士(HeidelbergUniversity Hospital)。为了产生本文中使用的最终AAV9-CK8-CRISPR/Cas9载体，用PacI和NheI酶消化AAV-微型CMV-Cas9-short-PolyA以除去微型CMV启动子。使用含有PacI和NheI位点序列的引物从pGL3-CK8e质粒扩增CK8启动子，并克隆到消化的载体中以产生AAV-CK8-Cas9-shortPolyA质粒。
sgRNA鉴定和克隆用于跳读外显子51。Dmd外显子51指导RNA使用crispr.mit.edu定义。使用以下引物将指导序列克隆到Addgene质粒##42230(6)(由Feng Zhang惠赠)中：
在克隆入AAV骨架之前，使用10T1/2细胞在培养物中测试指导序列
使用Golden Gate系统在AAV骨架中的三重sgRNA组装。AAV TRISPR骨架克隆系统的组装依赖于Golden Gate Assembly的两个连续步骤。第一步将gRNA组装到供体质粒中。通过使用加热块将含有2.5μl每种寡核苷酸(0.5μM)、5μl NEBuffer 2(NEB)和40μL ddH2O的反应加热至95℃5分钟来进行寡核苷酸的退火。对于进入供体质粒的组装反应，将40fmol(约100ng)目的骨架、1μL退火稀释的寡核苷酸、0.75μL Esp3I、1μL buffer tango(两者均为Thermo Scientific)、1μL T4 DNA连接酶(400U/μL)(NEB)以及在10μL总体积中终浓度为1mM的ATP和DTT混合。使用热循环仪，进行25至50个以下循环：37℃/3分钟，随后20℃/5分钟。通过加热至80℃20分钟使限制酶和连接酶变性。使用3μL该反应转化化学感受态细菌，在SOC(37℃，800rpm，40分钟)中回收并在含有氯霉素(25μg/mL)的LB-琼脂板上涂布。将编码sgRNA的退火寡核苷酸克隆到携带负选择标记ccdB(以减少克隆过程中的背景)以及氯霉素抗性基因的供体质粒中。为了测试正确的组装，使用引物Dono-R-5’-GTATGTTGTGTGGAATTGTGAG-3’(SEQ ID NO：948)对质粒进行测序。第二步是将在U6、H1或7SK启动子的转录控制下驱动一种sgRNA表达的三种这些供体质粒与携带AAV ITR的接纳体质粒一起在第二Golden Gate assembly中合并。组装反应包含所有四种质粒：供体质粒-#1-U6-sgRNA、供体质粒-#2-H1-sgRNA、供体质粒-#3-7SK-sgRNA和含有ITR的接纳体质粒。用BbsI消化将为每个片段(U6、H1、7SK、接纳体骨架)产生独特的突出端。在连接程序中，这些突出端退火，当三种盒彼此匹配时，仅获得环化质粒。
血清肌酸激酶(CK)测量。通过UT西南医学中心的代谢表型中心(the MetabolicPhenotyping Core at UT Southwestern Medical Center)测量小鼠血清CK。从下颌下静脉采集血液，并通过VITROS Chemistry 7 Products CK Slides测量血清CK水平，以使用VITROS 250化学系统定量测量CK活性。
体内犬科研究。在通气的全身麻醉下在1个月大的ΔE50MD狗中进行肌内(IM)注射。在左颅侧胫骨(cranial tibialis)肌的4个不同部位进行一次单次注射。所有狗均接受阿片类药物(丁丙诺啡)的术前用药、围手术期抗生素和4天术后镇痛(卡洛芬)。两只受影响的狗接受与肌编辑(myoediting)组分AAV-Cas9和AAV-sgRNA-ex51混合的rAAV，其在乳酸林格氏液中配制至每个注射肌肉的1E13vg的终浓度。
实施例2-结果
DMD的人源化的模型。DMD患者中最常见的热点突变区域是外显子45至51之间的区域，并且外显子51的跳读可用于对最大组(13-14％)的患者进行治疗。为了研究在体内CRISPR/Cas9介导的外显子51跳读，本发明人通过使用由2个sgRNA指导的CRISPR/Cas9系统使外显子50缺失来产生模拟人“热点”区域的小鼠模型(图1A)。通过DNA测序证实外显子50的缺失(图1B)。外显子50的缺失使肌养蛋白基因位于框外，导致骨骼肌和心脏中肌养蛋白的缺乏(图1C-E)。缺少外显子50的小鼠在2个月大时显示明显的肌营养不良性肌肉变化(图1E)。Δ外显子50小鼠的血清分析显示肌酸激酶(CK)水平显著增加，指示肌肉损伤(图1F)。总之，肌养蛋白表达、肌肉组织学和血清CK水平证实了ΔEx50小鼠模型的肌营养不良表型。
使用单一切割策略跳读外显子51来恢复肌养蛋白表达。化脓性链球菌Cas9需要NAG/NGG作为PAM序列以产生双链DNA断裂。有趣的是，外显子的通用剪接接纳体和供体位点含有NAG或NGG(图3B)。因此，为了在ΔEx50小鼠模型中校正阅读框和肌养蛋白表达，本发明人产生了靶向外显子51的剪接接纳体和供体位点的sgRNA以使其缺失，从而重建框内肌养蛋白。为了测试sgRNA指导是否能够高效地切割，本发明人首先在小鼠和人细胞系中评估了其有效性(图5)。为了确定校正DMD阅读框的最高效方法，发明人比较了两种不同的策略：(1)双重指导策略，其中将靶向剪接接纳体位点的第一sgRNA(sgRNA-SA)的一个拷贝和靶向供体接纳体位点的第二sgRNA(sgRNA-SD)的一个拷贝克隆到rAAV9-sgRNA载体中；(2)三重策略，其中发明人将相同sgRNA(sgRNA-SA)的3个拷贝克隆到rAAV9-sgRNA载体中(图3C)。sgRNA-SA的每个拷贝的表达由不同的RNA启动子(U6、H1和7SK)驱动。本发明人使用AAV-Cas9载体(CK8-Cas9-shortPolyA)产生了AAV-Cas9，该载体使用CK8启动子在骨骼肌和心脏组织中特异性驱动人源化SpCas9的表达。在对P12小鼠用AAV进行肌内(IM)注射后，分析肌组织。来自用AAV-Tri-SA和AAV-SA+SD注射的ΔEx50小鼠的RNA的RT-PCR显示外显子51的缺失(ΔEx50-51)，允许从外显子49剪接至52(图2A，下方带)。ΔEx50-51带的RT-PCR产物的测序证实外显子49剪接至外显子52(图2B)。出乎意料的是，RT-PCR分析显示使用三重形式的sgRNA-SA(AAV-Tri-SA)的单一切割策略与使用两种sgRNA——sgRNA-SA和sgRNA-SD(AAV-SA+SD)一样高效。
为了进一步评估AAV-Tri-SA编辑策略的效率，发明人进行了经注射肌肉的组织学分析，以评估整个肌肉切片中表达肌养蛋白的纤维数量。有趣的是，与来自用AAV-SA+SD注射的ΔEx50小鼠的肌肉(平均值为31±0.1％)相比，来自用AAV-Tri-SA注射的ΔEx50小鼠的肌肉冷冻切片的肌养蛋白免疫染色显示显著更高数量的肌养蛋白阳性纤维(平均值为43±0.9％)(图3D-E，图6)。Western印迹分析证实了骨骼肌中肌养蛋白表达的恢复。(图3F-G)。在AAV递送后3周，肌肉的苏木精和伊红(H&E)染色显示TA肌肉中的肌营养不良的组织病理学标志(例如坏死肌纤维)减少(图4A)。肌纤维区域分布的定量分析显示，与ΔEx50肌肉相比，AAV-Tri-SA和AAV-SA-SD处理的肌肉的纤维尺寸明显增加(图4B)。然而，与AAV-SA+SD处理的肌肉相比，AAV-Tri-SA处理的肌肉显示出小纤维(＜500μm)的频率降低更多。总之，这些结果证明，使用AAV-Tri-SA单一切割靶向外显子51的剪接接纳体位点在恢复DMD中的肌养蛋白表达方面是高效的。这种方法对许多可通过外显子跳读校正的疾病是有用的。
单一DNA切割基因组编辑策略的调整。由sgRNA指导的化脓性链球菌Cas9结合与PAM相邻的靶基因组基因座，并在PAM序列之前3个核苷酸处产生双链DNA断裂(DSB)。为了进一步评估靶向剪接接纳体位点的方法的效率，本发明人设计了第二sgRNA三重指导构建体(sgRNA-ex51-SA2)，其靶向与外显子51剪接接纳体位点相邻的区域。该gRNA使用进一步进入外显子3个核苷酸的PAM序列，以产生接近外显子51的剪接接纳体位点的DSB(图7A-图7B)。在剪接接纳体区域附近和外显子序列内切割导致重构框事件和外显子跳读事件。此外，在物种间比内含子序列显示更高保守性的外显子序列中设计sgRNA促进sgRNA向其他物种的翻译。
使用错配特异性T7核酸内切酶I(T7E1)测定法在10T1/2小鼠成纤维细胞中评估与sgRNA-ex51-SA2偶联的Cas9的DNA切割活性(图8A)。为了研究由与sgRNA-51-SA2偶联的Cas9产生的突变类型，进行了基因组深度测序分析。测序分析显示9.3％的突变包含位于PAM序列3’的3个核苷酸处的单个腺苷(A)插入。此外，7.3％的突变包含覆盖外显子51的剪接接纳体位点和高度预测的外显子剪接增强子位点的缺失(图8B)。sgRNA-ex51-SA2对应于Dmd基因的高度保守区域(图8C-D)，并且发明人测试了Cas9和人sgRNA-51切割293T细胞中的人Dmd基因座的能力。T7E1测定显示在预测位点处的明显切割(图8E)。类似地，序列分析显示与人sgRNA-ex51-SA2偶联的Cas9产生在切割位点周围的相同的腺苷(A)插入和不同范围的缺失(图8F)。
为了将Cas9和sgRNA-ex51-SA2体内递送至骨骼肌和心脏组织，使用腺相关病毒9(AAV9)，其显示对这些组织的优先向性。为了进一步增强肌肉特异性表达，使用对肌肉和心脏中的表达具有高度特异性的AAV9-Cas9载体(CK8e-Cas9-shortPolyA)，其含有肌肉特异性CK调节盒，称为CK8e启动子(图9A)。该436bp的肌肉特异性盒和4101bp的Cas9cDNA一起在AAV9的包装限度内。每种sgRNA的表达由三种RNA聚合酶III启动子(U6、H1和7SK)之一驱动(图9B)。
通过单一DNA切割校正ΔEx50小鼠中的肌养蛋白阅读框。通过肌内(IM)注射将sgRNA-ex51-SA2以三拷贝(AAV-Tri-SA2)与Cas9(AAV-Cas9)一起递送至小鼠。注射后，分析肌组织。通过使用外显子48和53中的序列的引物的RT-PCR和用于靶基因组区域的T7E1测定来估计体外靶向效率。为了研究是否实现了有效的靶切割，本发明人扩增了跨越靶位点的771bp区域并使用T7EI测定对其进行分析(图10A)。在靶位点分析具有相应sgRNA的SpCas9的活性。T7EI测定揭示了在递送AAV-Cas9和AAV9-sgRNA-51-SA2后Dmd基因座的诱变(图10A)。为了研究在用表达Cas9和sgRNA的AAV9注射的ΔEx50小鼠中产生的突变类型，通过扩增子深度测序分析跨越靶位点的基因组PCR扩增产物。靶区域的深度测序表明总读数的27.9％包含靶基因组位点的变化(图10B)。平均而言，15％的经鉴定突变包含在体外小鼠10T1/2和人293细胞中观察到的相同A插入。使用该方法鉴定的缺失涵盖了外显子51的高度预测的外显子剪接增强子位点(图10B)。
来自用AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA-51肌内注射的ΔEx50小鼠的肌肉的RNA的RT-PCR产物显示外显子51的缺失(ΔEx50-51)，允许从外显子49剪接至52(图11A，下方带)。通过对ΔEx50-51带的RT-PCR产物进行测序，证实外显子49剪接至外显子52。为了进一步定义由我们的基因编辑策略引入的突变，将来自4个样品的RT-PCR扩增产物无需凝胶纯化直接进行基于拓扑异构酶的胸腺嘧啶至腺苷(TOPO-TA)克隆，随后测序。出人意料的是，来自每个样品的40个克隆的序列分析显示，除了在15％的测序克隆中鉴定的外显子51-跳读的cDNA产物(ΔEx50-51)之外，注射AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA-51的ΔEx50小鼠显示出高频率的重构框事件。在测序的克隆中，63％包含外显子51的序列中的单核苷酸插入(图11B-C)。看到的最主要的插入突变是A插入。
在凝胶上，A插入在大小上与未编辑的cDNA产物难以区分，因此进行深度测序分析以确定与这种插入其他小插入相比的丰度。含有未编辑的cDNA产物和重构框cDNA产物的上方带的深度测序表明，69.22％的总读数包含具有A插入的重构框cDNA产物，17.71％包含未编辑的cDNA产物，其余包含小的缺失和插入(图11D)。未注射的ΔEx50小鼠的深度测序分析证实A插入是Cas9产生的编辑的结果。这些扩增子深度测序结果证实了来自TOPO-TA克隆和测序的结果。总之，RT-PCR分析显示，除了由高度保守的外显子剪接增强子区域中的缺失导致的外显子51跳读事件外，注射AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA-51-SA2的ΔEx50小鼠显示出高频率重构框事件，其中cDNA产物包含外显子51序列中的A插入。
在Cas9和sgRNA-51-SA2的肌内AAV9递送后肌养蛋白表达的恢复。显著地，来自注射AAV-Tri-SA2的ΔEx50小鼠的肌肉冷冻切片的肌养蛋白免疫染色显示出显著更高数量的肌养蛋白阳性纤维，平均99％恢复为正常纤维(图12A，图13)。Western印迹分析证实了骨骼肌中肌养蛋白表达的恢复(图12C，图12D)。在AAV递送后3周，肌肉的苏木精和伊红(H&E)染色显示TA肌肉中的肌营养不良的组织病理学标志(例如坏死肌纤维)校正(图12B和图14)。该方法采用独特的sgRNA设计，表现出了DMD校正效率的重大进步，其可直接应用于具有最常见的肌养蛋白突变的患者。
肌内注射AAV9-Cas9与表达单拷贝或三拷贝sgRNA的不同AAV9的组合后拯救肌养蛋白表达。为了评估体内sgRNA-ex51-SA2的三重启动子表达的益处，研究了不同的构建体，其中sgRNA表达分别由单个RNA聚合酶III启动子(U6或H1或7SK)和三个RNA聚合酶III启动子(U6、H1和7SK)驱动(图15A)。本发明人以单独由U6启动子(AAV9-U6-sgRNA-51-SA2)、H1启动子(AAV9-H1-sgRNA-51-SA2)、7SK启动子(AAV9-7SK-sgRNA-51-SA2)驱动的单一拷贝以及以三拷贝(AAV9-Triple-sgRNA-51-SA2)递送sgRNA-ex51-SA2。在对P12小鼠用AAV9进行肌内(IM)注射后，分析肌组织。出乎意料的是，来自用AAV9-Triple-sgRNA-51-SA2注射的ΔEx50小鼠的肌肉冷冻切片的肌养蛋白免疫染色显示了显著更高数量的肌养蛋白阳性纤维，其中平均95％恢复为正常纤维，相比之下用AAV9-U6-sgRNA-51-SA2、AAV-H1-sgRNA-51-SA2和AAV-7SK-sgRNA-51-SA2注射的ΔEx50小鼠分别为平均70％、40％和50％恢复为正常纤维(图15B)。
在全身递送AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA-51-SA2后拯救肌肉结构和功能。将AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA-51-SA2全身递送至P4ΔEx50小鼠在注射后4周和第8时在基因编辑的ΔEx50小鼠的心脏、三头肌、胫骨前肌(TA)和膈肌中产生广泛的肌养蛋白表达(图16A和图17A)。Western印迹分析证实了骨酪肌和心肌中肌养蛋白表达的恢复(图16B和图17B)。与ΔEx50对照小鼠相比，握力测试也显示在腹膜内AAV9注射后4周ΔEx50小鼠的肌肉力量显著增加(野生型对照92.6±1.63；ΔEx50对照50.5±1.85；ΔEx50-AAV9-sgRNA-5179.7±2.63)(图18A)。一致地，与ΔEx50对照小鼠相比，AAV9-sgRNA-51-SA2基因编辑的ΔEx50小鼠也显示血清CK浓度显著降低(图18B)。
迪谢内肌营养不良的狗模型中肌养蛋白表达的校正。为了进一步评估这种新方法的效率和治疗潜力，本发明人研究了对DMD狗模型(ΔE50-MD狗)中引起疾病的突变的校正，所述模型在外显子50的5’供体剪接位点中具有错义突变，导致外显子50缺失((Walmsley等，2010)。ΔE50-MD狗是研究基因编辑作为永久校正人中最常见的DMD突变的方法的理想犬类模型。
发明人使用靶向剪接接纳体区域的相同基因组基因座的sgRNA(sgRNA-ex51-SA2)。sgRNA-ex51-SA2序列是高度保守的。小鼠sgRNA-ex51-SA2和狗sgRNA-ex51-SA2(sgRNA-D-ex51-SA2)的靶序列仅相差一个单核苷酸(表4)。发明人以三拷贝(AAV-D-Tri-SA2)递送sgRNA-D-ex51-SA2。在用AAV肌内(IM)注射1月龄的狗后，分析肌组织。显著地，来自用AAV-Tri-SA2注射的ΔEx50小鼠的肌肉冷冻切片的肌养蛋白免疫染色显示显著更高数量的肌养蛋白阳性纤维(图19)。Western印迹分析证实了骨骼肌中肌养蛋白表达的恢复(图20)。在AAV递送后6周，肌肉的苏木精和伊红(H&E)染色显示颅骨胫骨肌中的肌营养不良的组织病理学标志(例如坏死肌纤维)减少(图21)。该方法采用独特的sgRNA设计，表现出了DMD校正效率的重大进步，可直接应用于具有最常见的肌养蛋白突变的患者。
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根据本公开内容，无需过度实验即可制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管已经根据优选实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开内容的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行变化。更具体地，明显的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时可以获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的是的所有这些类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本公开内容的精神、范围和概念内。
VII.参考文献
以下参考文献在其为本文给出的内容提供示例性程序或其他细节补充的程度上，特别地通过引用并入本文。
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Claims (186)

1.核酸，其包含：
编码第一DMD指导RNA的序列，所述第一DMD指导RNA靶向第一基因组靶序列，
编码第二DMD指导RNA的序列，所述第二DMD指导RNA靶向第二基因组靶序列，
编码第一启动子的序列，其中所述第一启动子驱动所述编码第一DMD指导RNA的序列的表达，和
编码第二启动子的序列，其中所述第二启动子驱动所述编码第二DMD指导RNA的序列的表达，
其中所述第一基因组靶序列和第二基因组靶序列各自包含肌养蛋白剪接接纳体位点。
2.权利要求1所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列与所述编码第二启动子的序列相同。
3.权利要求1所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列与所述编码第二启动子的序列不相同。
4.权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中所述第一基因组靶序列与所述第二基因组靶序列相同。
5.权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中所述第一基因组靶序列与所述第二基因组靶序列不相同。
6.权利要求1至5中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含：
编码第三DMD指导RNA的序列，所述第三DMD指导RNA靶向第三基因组靶序列，和
编码第三启动子的序列，其中所述第三启动子驱动所述编码第三DMD指导RNA的序列的表达，
其中所述第三基因组靶序列包含肌养蛋白剪接接纳体位点。
7.权利要求6所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列和编码第三启动子的序列中的至少两个相同。
8.权利要求6所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列和编码第三启动子的序列中的至少两个不相同。
9.权利要求6至8中任一项所述的核酸，其中所述第一基因组靶序列、第二基因组靶序列和第三基因组靶序列中的至少两个相同。
10.权利要求6至8中任一项所述的核酸，其中所述第一基因组靶序列、第二基因组靶序列和第三基因组靶序列中的至少两个不相同。
11.权利要求6至10中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含：
编码第四DMD指导RNA的序列，所述第四DMD指导RNA靶向第四基因组靶序列，和
编码第四启动子的序列，其中所述第四启动子驱动编码第四DMD指导RNA的序列的表达，
其中所述第四基因组靶序列包含肌养蛋白剪接接纳体位点。
12.权利要求11所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列和编码第四启动子的序列中的至少两个相同。
13.权利要求11所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列和编码第四启动子的序列中的至少两个不相同。
14.权利要求11至13中任一项所述的核酸，其中所述第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列和第四基因组靶序列中的至少两个相同。
15.权利要求11至13中任一项所述的核酸，其中所述第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列和第四基因组靶序列中的至少两个不相同。
16.权利要求11至15中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含：
编码第五DMD指导RNA的序列，所述第五DMD指导RNA靶向第五基因组靶序列，和
编码第五启动子的序列，其中所述第五启动子驱动所述编码第五DMD指导RNA的序列的表达，
其中所述第五基因组靶序列包含肌养蛋白剪接接纳体位点。
17.权利要求16所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少两个相同。
18.权利要求16所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少两个不相同。
19.权利要求16至18中任一项所述的核酸，其中所述第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列、第四基因组靶序列和第五基因组靶序列中的至少两个相同。
20.权利要求16至18中任一项所述的核酸，其中所述第一基因组靶序列、第二基因组靶序列、第三基因组靶序列、第四基因组靶序列和第五基因组靶序列中的至少两个不相同。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含：
至少一个编码另外的DMD指导RNA的序列，所述另外的DMD指导RNA靶向基因组靶序列，和
至少一个另外的启动子，其中所述另外的启动子驱动所述编码另外的DMD指导RNA的序列的表达，
其中所述另外的基因组靶序列包含肌养蛋白剪接接纳体位点。
22.权利要求1至21中任一项所述的核酸，其中所述肌养蛋白剪接接纳体位点是外显子51的5’剪接接纳体位点。
23.权利要求1至23中任一项所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列或编码第二启动子的序列包含编码组成型启动子的序列。
24.权利要求1至23中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子或第二启动子包含组成型启动子。
25.权利要求20所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含编码组成型启动子的序列。
26.权利要求20所述的核酸，其中所述第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子和第五启动子中的至少一个包含组成型启动子。
27.权利要求1至23中任一项所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列或编码第二启动子的序列包含编码诱导型启动子的序列。
28.权利要求20所述的核酸，其中所述第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子和第五启动子中的至少一个包含诱导型启动子。
29.权利要求1至23中任一项所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列或编码第二启动子的序列包含编码细胞类型特异性启动子的序列。
30.权利要求20所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含细胞类特异性启动子。
31.权利要求29或30所述的核酸，其中所述编码细胞类型特异性启动子的序列包含编码肌肉特异性启动子的序列。
32.权利要求1至22中任一项所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列或编码第二启动子的序列包含编码U6启动子、H1启动子或7SK启动子的序列。
33.权利要求20所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含编码U6启动子的序列、编码H1启动子的序列或编码7SK启动子的序列。
34.权利要求20所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含编码U6启动子的序列。
35.权利要求20所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含编码H1启动子的序列。
36.权利要求20所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列、编码第三启动子的序列、编码第四启动子的序列和编码第五启动子的序列中的至少一个包含编码7SK启动子的序列。
37.权利要求6所述的核酸，
其中所述编码第一DMD指导RNA的序列、编码第二DMD指导RNA的序列和编码第三DMD指导RNA的序列相同，
其中所述编码第一启动子的序列、编码第二启动子的序列和编码第三启动子的序列不相同，并且
其中所述5’剪接接纳体位点包含外显子51的5’剪接接纳体位点。
38.权利要求37所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列包含编码U6启动子的序列，所述编码第二启动子的序列包含编码H1启动子的序列，并且所述编码第三启动子的序列包含编码7SK启动子的序列。
39.权利要求1至38中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含DNA序列。
40.权利要求1至38中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含RNA序列。
41.权利要求1至40中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含一个或更多个编码反向末端重复(ITR)的序列。
42.权利要求1至40中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列。
43.权利要求42所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含分离或衍生自腺相关病毒(AAV)的序列。
44.权利要求43所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含分离或衍生自血清型2的腺相关病毒(AAV)(AAV2)的序列。
45.权利要求43所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列包含分离或衍生自AAV2的序列。
46.权利要求43所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含分离或衍生自血清型4的腺相关病毒(AAV)(AAV4)的序列。
47.权利要求46所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列包含分离或衍生自AAV4的序列。
48.权利要求43至47中任一项所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含145个核苷酸或由145个核苷酸组成。
49.权利要求43至47中任一项所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含115个核苷酸或由115个核苷酸组成。
50.权利要求43至47中任一项所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或所述编码3’ITR的序列包含141个核苷酸或由141个核苷酸组成。
51.权利要求1至50中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含聚腺苷(polyA)序列。
52.权利要求51所述的核酸，其中所述polyA序列是微型polyA序列。
53.权利要求6至52中任一项所述的核酸，其中所述编码第一DMD指导RNA的序列、编码第二DMD指导RNA的序列或编码第三DMD指导RNA的序列包含SEQ ID No.60-382、706-708和712-719中任一个的序列。
54.权利要求6至52中任一项所述的核酸，其中所述编码第一DMD指导RNA的序列、编码第二DMD指导RNA的序列或编码第三DMD指导RNA的序列包含SEQ ID NO：714的序列。
55.权利要求6至52中任一项所述的核酸，其中所述编码第一DMD指导RNA的序列、编码第二DMD指导RNA的序列和编码第三DMD指导RNA的序列包含SEQ ID NO：714的序列。
56.细胞，其包含权利要求1至55中任一项所述的核酸。
57.组合物，其包含权利要求1至55中任一项所述的核酸。
58.细胞，其包含权利要求56所述的组合物。
59.组合物，其包含权利要求58所述的细胞。
60.载体，其包含权利要求1至55中任一项所述的核酸。
61.权利要求60所述的载体，其中所述载体还包含编码转座元件的反向末端重复(ITR)的序列。
62.权利要求61所述的载体，其中所述转座元件是转座子。
63.权利要求62所述的载体，其中所述转座子是Tn7转座子。
64.权利要求63所述的载体，其中所述载体还包含编码T7转座子的5’ITR的序列和编码T7转座子的3’ITR的序列。
65.权利要求60至64中任一项所述的载体，其中所述载体是非病毒载体。
66.权利要求65所述的载体，其中所述非病毒载体是质粒。
67.权利要求60至64中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
68.权利要求67所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
69.权利要求69所述的载体，其中所述AAV载体是复制缺陷型或条件性复制缺陷型的。
70.权利要求68或69所述的载体，其中所述AAV载体是重组AAV载体。
71.权利要求68至70中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自以下血清型的AAV载体的序列：血清型1(AAV1)、2(AAV2)、3(AAV3)、4(AAV4)、5(AAV5)、6(AAV6)、7(AAV7)、8(AAV8)、9(AAV9)、10(AAV10)、11(AAV11)或其任何组合。
72.权利要求68至71中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自血清型9的AAV载体(AAV9)的序列。
73.权利要求68至72中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自血清型2的AAV载体(AAV2)的序列。
74.权利要求68至73中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自AAV2的序列和分离或衍生自AAV9的序列。
75.权利要求68至72中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自血清型4的AAV载体(AAV4)的序列。
76.权利要求68至72或75中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自AAV4的序列和分离或衍生自AAV9的序列。
77.权利要求60至76中任一项所述的载体，其中所述载体被优化成在哺乳动物细胞中表达。
78.权利要求60至77中任一项所述的载体，其中所述载体被优化成在人细胞中表达。
79.权利要求60至78中任一项所述的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO.914、SEQ IDNO.915、SEQ ID NO.916或SEQ ID NO.917的核酸序列。
80.组合物，其包含权利要求60至79中任一项所述的载体。
81.权利要求80所述的组合物，其还包含可药用载体。
82.细胞，其包含80或81所述的组合物。
83.权利要求82所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
84.权利要求82或83所述的细胞，其中所述细胞是肌细胞或卫星细胞。
85.权利要求82或83所述的细胞，其中所述细胞是诱导多能干(iPS)细胞。
86.组合物，其包含权利要求82至85中任一项所述的细胞。
87.核酸，其包含编码启动子的序列和编码Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列，
其中所述编码启动子的序列包含编码肌肉特异性启动子的序列。
88.权利要求87所述的核酸，其中所述编码肌肉特异性启动子的序列包含编码CK8启动子的序列。
89.权利要求87或88所述的核酸，其中所述编码肌肉特异性启动子的序列包含编码CK8e启动子的序列。
90.权利要求87至89中任一项所述的核酸，其中所述编码Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列分离或衍生自编码化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列。
91.Cas9蛋白或其核酸酶结构域分离或衍生自编码金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列。
92.权利要求87至91中任一项所述的核酸，其中所述编码Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列被密码子优化成在哺乳动物中表达。
93.权利要求87至91中任一项所述的核酸，其中所述编码Cas9蛋白或其核酸酶结构域的序列被密码子优化成在人中表达。
94.权利要求87至93中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含polyA序列。
95.权利要求94所述的核酸，其中所述polyA序列是微型polyA序列。
96.权利要求1至94中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含一个或更多个编码反向末端重复(ITR)的序列。
97.权利要求1至94中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列。
98.权利要求97所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含分离或衍生自腺相关病毒(AAV)的序列。
99.权利要求98所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含分离或衍生自血清型2的腺相关病毒(AAV)(AAV2)的序列。
100.权利要求99所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列包含分离或衍生自AAV2的序列。
101.权利要求98所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含分离或衍生自血清型4的腺相关病毒(AAV)(AAV4)的序列。
102.权利要求46所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列包含分离或衍生自AAV4的序列。
103.权利要求96至102中任一项所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含145个核苷酸或由145个核苷酸组成。
104.权利要求96至102中任一项所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含115个核苷酸或由115个核苷酸组成。
105.权利要求96至102中任一项所述的核酸，其中所述编码5’反向末端重复(ITR)的序列或编码3’ITR的序列包含141个核苷酸或由141个核苷酸组成。
106.权利要求1至55或87至105中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含核定位信号。
107.权利要求87至106中任一项所述的核酸，其中所述核酸被优化成在哺乳动物细胞中表达。
108.权利要求87至107中任一项所述的核酸，其中所述核酸被优化成在人细胞中表达。
109.组合物，其包含权利要求87至108中任一项所述的核酸。
110.细胞，其包含权利要求87至108中任一项所述的核酸。
111.细胞，其包含权利要求109所述的组合物。
112.组合物，其包含权利要求110或111所述的细胞。
113.载体，其包含权利要求87至108中任一项所述的核酸。
114.权利要求113所述的载体，其中所述载体还包含编码转座元件的反向末端重复(ITR)的序列。
115.权利要求114所述的载体，其中所述转座元件是转座子。
116.权利要求115所述的载体，其中所述转座子是Tn7转座子。
117.权利要求116所述的载体，其中所述载体还包含编码T7转座子的5’ITR的序列和编码T7转座子的3’ITR的序列。
118.权利要求1113至117中任一项所述的载体，其中所述载体是非病毒载体。
119.权利要求118所述的载体，其中所述非病毒载体是质粒。
120.权利要求113至117中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
121.权利要求120所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
122.权利要求121所述的载体，其中所述AAV载体是复制缺陷型或条件性复制缺陷型的。
123.权利要求121或122所述的载体，其中所述AAV载体是重组AAV载体。
124.权利要求121至123中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自以下血清型的AAV载体的序列：血清型1(AAV1)、2(AAV2)、3(AAV3)、4(AAV4)、5(AAV5)、6(AAV6)、7(AAV7)、8(AAV8)、9(AAV9)、10(AAV10)、11(AAV11)或其任何组合。
125.权利要求121至124中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自血清型9的AAV载体(AAV9)的序列。
126.权利要求121至125中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自血清型2的AAV载体(AAV2)的序列。
127.权利要求121至126中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自AAV2的序列和分离或衍生自AAV9的序列。
128.权利要求121至125中任一项所述的载体，其中所述AAV载体包含分离或衍生自血清型4的AAV载体(AAV4)的序列。
129.权利要求121至125或128中任一项所述的载体，其中AAV载体包含分离或衍生自AAV4的序列和分离或衍生自AAV9的序列。
130.权利要求121至129中任一项所述的载体，其中所述载体被优化成在哺乳动物细胞中表达。
131.权利要求121至130中任一项所述的载体，其中所述载体被优化成在人细胞中表达。
132.权利要求113至132中任一项所述的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO.899、SEQID NO.900、SEQ ID NO.901或SEQ ID NO.902的核酸序列。
133.组合物，其包含权利要求113至132中任一项所述的载体。
134.权利要求133所述的组合物，还包含可药用载体。
135.细胞，其包含权利要求133或134所述的组合物。
136.细胞，其包含权利要求113至132中任一项所述的载体。
137.权利要求135或136所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
138.权利要求135至137中任一项所述的细胞，其中所述细胞是肌细胞或卫星细胞。
139.权利要求135至137中任一项所述的细胞，其中所述细胞是iPS或iCM细胞。
140.组合物，其包含权利要求135至139中任一项所述的细胞。
141.组合物，其包含：
包含权利要求1至55中任一项所述的核酸序列的第一核酸序列，和
包含权利要求87至108中任一项所述的核酸序列的第二核酸序列。
142.组合物，其包含
包含权利要求1至55中任一项所述的核酸序列的第一载体，和
包含权利要求87至108中任一项所述的核酸序列的第二载体。
143.组合物，其包含
权利要求60至79中任一项所述的载体，和
权利要求113至132中任一项所述的载体。
144.权利要求141至143中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含可药用载体。
145.用于校正肌养蛋白缺陷的方法，所述方法包括使细胞与权利要求141至144中任一项所述的组合物在适合于所述第一DMD指导RNA、第二DMD指导RNA和Cas9蛋白或其核酸酶结构域表达的条件下接触，其中第一DMD指导RNA或所述第二DMD指导RNA中的至少一种与所述Cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合物以形成至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物，其中所述至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物破坏肌养蛋白剪接位点并诱导DMD外显子的选择性跳读。
146.用于校正肌养蛋白缺陷的方法，所述方法包括使细胞与权利要求141至144中任一项所述的组合物在适合于所述第一DMD指导RNA、第二DMD指导RNA和Cas9蛋白或其核酸酶结构域表达的条件下接触，其中第一DMD指导RNA或所述第二DMD指导RNA中的至少一种与所述Cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合物以形成至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物，其中所述至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物诱导肌养蛋白阅读框的重构。
147.权利要求146所述的方法，其中所述肌养蛋白阅读框的重构诱导插入。
148.权利要求147所述的方法，其中所述插入包含单个腺苷核苷酸或由单个腺苷核苷酸组成。
149.用于诱导DMD外显子的选择性跳读的方法，所述方法包括使细胞与权利要求141至144中任一项所述的组合物在适合于所述第一DMD指导RNA、第二DMD指导RNA和Cas9蛋白或其核酸酶结构域表达的条件下接触，其中第一DMD指导RNA或所述第二DMD指导RNA中的至少一种与所述Cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合物以形成至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物，其中所述至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物破坏肌养蛋白剪接位点并诱导DMD外显子的选择性跳读。
150.用于在肌养蛋白阅读框中诱导重构事件的方法，所述方法包括使细胞与权利要求141至144中任一项所述的组合物在适合于所述第一DMD指导RNA、第DMD指导RNA和Cas9蛋白或其核酸酶结构域表达的条件下接触，其中第一DMD指导RNA或所述第DMD指导RNA中的至少一种与所述Cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合物以形成至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物，其中所述至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物破坏肌养蛋白剪接位点并诱导肌养蛋白阅读框的重构。
151.权利要求145至150中任一项所述的方法，其中所述至少一种DMD指导RNA-Cas9复合物破坏肌养蛋白剪接位点并诱导人DMD基因的外显子51的选择性跳读。
152.通过权利要求145至151中任一项所述的方法产生的细胞。
153.在有需要的对象中治疗肌营养不良的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求141至144中任一项所述的组合物。
154.权利要求153所述的方法，其中所述组合物局部施用。
155.权利要求153或154所述的方法，其中将所述组合物直接施用于肌组织。
156.权利要求153至155中任一项所述的方法，其中所述组合物通过肌内输注或注射施用。
157.权利要求155或156所述的方法，其中所述肌组织包括胫骨前肌组织、四头肌组织、比目鱼肌组织、膈肌组织或心脏组织。
158.权利要求153至157中任一项所述的方法，其中所述组合物通过心内注射施用。
159.权利要求153所述的方法，其中所述组合物全身施用。
160.权利要求159所述的方法，其中所述组合物通过静脉内输注或注射施用。
161.权利要求153至160中任一项所述的方法，其中，在施用所述组合物之后，所述对象表现出正常肌养蛋白阳性肌纤维和含有集中核的嵌合肌养蛋白阳性肌纤维或其组合。
162.权利要求153至161中任一项所述的方法，其中，在施用所述组合物之后，当与施用所述组合物之前正常肌养蛋白阳性肌纤维不存在或丰度水平相比，所述对象表现出正常肌养蛋白阳性肌纤维出现或丰度水平升高。
163.权利要求153至162中任一项所述的方法，其中，在施用所述组合物之后，当与施用所述组合物之前含有集中核的嵌合肌养蛋白阳性肌纤维不存在或丰度水平相比，所述对象表现出含有集中核的嵌合肌养蛋白阳性肌纤维出现或丰度水平升高。
164.权利要求153至163中任一项所述的方法，其中，在施用所述组合物之后，当与施用所述组合物之前的血清CK水平相比，所述对象表现出降低的血清CK水平。
165.权利要求153至164中任一项所述的方法，其中，在施用所述组合物之后，当与施用所述组合物之前的握力相比，所述对象表现出改善的握力。
166.权利要求153至165中任一项所述的方法，其中所述对象是新生儿、婴儿、儿童、年轻成人或成人。
167.权利要求153至166中任一项所述的方法，其中所述对象患有肌营养不良。
168.权利要求153至167中任一项所述的方法，其中所述对象是肌营养不良的遗传携带者。
169.权利要求153至168中任一项所述的方法，其中所述对象是男性。
170.权利要求153至168中任一项所述的方法，其中所述对象是女性。
171.权利要求153至170中任一项所述的方法，其中所述对象表现为无症状，并且其中遗传学诊断揭示DMD基因的一个或两个拷贝中的损害DMD基因产物功能的突变。
172.权利要求153至171中任一项所述的方法，其中所述对象呈现肌营养不良的早期体征或症状。
173.权利要求172所述的方法，其中所述肌营养不良的早期体征或症状包括肌肉量损失或近端肌无力。
174.权利要求173所述的方法，其中所述肌肉量损失或近端肌无力发生在一条或两条腿和/或骨盆中，接着是一个或更多个上身肌肉中。
175.权利要求174所述的方法，其中所述肌营养不良的早期体征或症状还包括假性肥大、低耐力、站立困难、行走困难、攀登楼梯困难或其组合。
176.权利要求153至175中任一项所述的方法，其中所述对象呈现肌营养不良的进行性体征或症状。
177.权利要求176的方法，其中所述肌营养不良的进行性体征或症状包括肌组织萎缩、肌组织被脂肪代替、或肌组织被纤维化组织代替。
178.权利要求153至177中任一项所述的方法，其中所述对象呈现肌营养不良的晚期体征或症状。
179.权利要求178的方法，其中所述肌营养不良的晚期体征或症状包括骨发育异常、脊柱弯曲、运动丧失和瘫痪。
180.权利要求153至179中任一项所述的方法，其中所述对象呈现肌营养不良的神经学体征或症状。
181.权利要求180的方法，其中所述肌营养不良的神经学体征或症状包括智力受损和瘫痪。
182.权利要求153至181中任一项所述的方法，其中所述组合物的施用在所述对象呈现肌营养不良的一种或更多种进行性、晚期或神经学体征或症状之前进行。
183.权利要求153至182中任一项所述的方法，其中所述对象小于10岁。
184.权利要求183所述的方法，其中所述对象小于5岁。
185.权利要求184所述的方法，其中所述对象小于2岁。
186.治疗有效量的权利要求141至144中任一项的组合物用于在有需要的对象中治疗肌营养不良的用途。
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