CN111172191B - 一种高效基因敲除载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供一种基于CRISPR/Cas9系统的高效基因敲除载体，其包括至少两种串联的、靶向不同基因或基因不同位点的根据sgRNA靶位点设计的DNA片段；可以高效、便捷的实现双基因或多基因的同时敲除，同时减少对转染细胞的损伤。还提供同时敲除猪肝富集基因1的方法、以及同时敲除pLeg1a和pLeg1b双等位基因的猪成纤维细胞。

Description

一种高效基因敲除载体及其应用
技术领域
本发明涉及基因编辑领域，具体而言，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的同时敲除多个基因的方法以及制备敲除猪肝富集基因1的猪成纤维细胞的方法。
背景技术
基于CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)/Cas9系统介导的基因组编辑技术，是继锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effectornuclease,TALEN)后的第三代基因组编辑技术，是基于细菌的获得性免疫系统改造而成。CRISPR/Cas9是基于细菌或古细菌规律成簇的间隔短回文重复CRISPR(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)介导的获得性免疫系统衍生而来的基因编辑技术。该技术通过RNA碱基互补配对识别DNA，指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA，诱发同源重组(HDR，homologous directed repair)或非同源末端连接(NHEJ，non-homologous end-joining)，进而实现目的DNA编辑。该系统的作用是通过单向导RNA(sgRNA,single guiding RNA)识别基因组中的靶序列，然后Cas9核酸酶行使DNA酶切活性，在设计的位点切割DNA的双链。
肝富集基因1(Leg1)在脊椎动物中进化保守，并编码新型糖基化分泌蛋白LEG1。在斑马鱼中发现了Leg1，包括zLeg1a和zLeg1b的两个拷贝，它们具有很高的同源性。在斑马鱼中，Leg1的编码蛋白LEG1作为分泌信号分子/调节剂，对肝脏正常发育有重要作用。然而，其在哺乳动物中的功能仍不清楚，在家猪中的功能，甚至拷贝数仍不清楚。
小型猪由于与人类的相似性而成为最重要的实验动物之一。它们体积小巧，易于操作和操作。它们与人的生理和解剖学相似性很高，因此广泛用于疾病模型研究以及异种移植。
因此，建立一种可以高效、准确、有效地敲除猪肝富集基因1的方法，获取敲除肝富集基因1的猪成纤维细胞和猪对于研究该基因在哺乳动物中的功能，以及猪的育种都具有重要的意义。
发明内容
首先，发明人利用已知的斑马鱼和人的Leg1基因，在猪的染色体1中鉴定出两个推定的猪Leg1同源物。其中人Leg1直系同源物的猪基因被命名为pLeg1a，而旁系同源物被命名为pLeg1b。两条猪Leg1的串联方式类似于斑马鱼Leg1基因，怀疑他们具有功能冗余性。
为了解决上述问题，首先发明人基于猪的肝富集基因1具有2个拷贝，且这两个基因以串联方式存在的发现，设计敲除猪肝富集基因的方法，而在此之前现有技术不知道猪的肝富集基因1具有2个或多个拷贝。因此，为避免pLeg1b在功能上与pLeg1a敲除互补，发明人提出同时敲除pLeg1a和pLeg1b基因拷贝的策略。
传统的利用CRISPR/Cas9系统敲除两个或多个基因的方法通常是针对不同的基因或者位点分别构建敲除载体，现有技术虽然有双基因敲除载体系统，但实际上这种系统仍然是通过构建两种独立的针对不同基因的基因敲除载体来实现的。这种方法不仅繁琐而且增大成本，而且导致后续细胞转染过程中由于需要将多个基因敲除载体都转染入同一种细胞，对细胞造成较大的毒性，不利于后续细胞系的正常生长发育和体细胞核移植。
为解决上述问题，首先本发明提出同时敲除猪肝富集基因1的两个拷贝的策略，猪肝富集基因1的两个拷贝分别为猪肝富集基因1a和猪肝富集基因1b。
其次，本发明通过提供一种高效的基因敲除载体，实现同时对两个或多个基因或基因位点的敲除。
本发明提供如下技术方案：
一种基因敲除载体，包括基因编辑载体骨架，其特征在于包括至少两种串联的、靶向不同基因或基因不同位点的DNA片段，所述DNA片段是根据sgRNA靶位点设计的DNA片段，所述基因敲除载体对所述串联的、靶向不同的两种基因或不同位点的两种基因进行双等位基因敲除。
例如，本发明的基因敲除载体在基因编辑载体骨架内，包括2种、3种、4种或5种串联的、靶向不同基因或基因不同位点的DNA片段，所述DNA片段是根据sgRNA靶位点设计的DNA片段。
所述基因敲除载体的基因编辑载体骨架为CRISPR/Cas9；优选地，所述CRISPR/Cas9选自pX330、pX260、pX334、pX335更优选地，所述CRISPR/Cas9为pX330。
或者提供一种基因敲除载体，其特征在于其包括两种串联的DNA片段，第一种DNA片段是猪肝富集基因1a(pLeg1a)的sgRNA的DNA片段，第二种DNA片段是猪肝富集基因1b(pLeg1b)的sgRNA的DNA片段，所述第二种DNA片段插入到所述第一种DNA片段所构成的载体骨架XbaI位点。
进一步的，所述的基因敲除载体中pLeg1a基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:1所示：CUGGCAUUACCUUGAGAGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC；所述pLeg1b基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:2所示：CAUGGCUGGCAAUAUACUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC。
或者进一步的，基因敲除载体中，所述第一种DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：CTGGCATTACCTTGAGAGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC；第二种DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示：CATGGCTGGCAATATACTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC。
另一方面，本发明提供一种制备敲除猪肝富集基因1(pLeg1)的猪成纤维细胞的方法，通过同时敲除猪肝富集基因1a(pLeg1a)和猪肝富集基因1b(pLeg1b)实现；具体的所述方法包括：(1)构建3-5任一项所述基因敲除载体；(2)将步骤(1)构建的基因敲除载体系统转入猪成纤维细胞中，通过筛选和鉴定获得同时双等位基因敲除pLeg1a和pLeg1b的单克隆细胞。
进一步的，所述猪成纤维细胞为猪胎儿成纤维细胞，优选地，猪为中国实验用小型猪。
进一步的，本发明涉及根据上述方法制备而成的pLeg1a和pLeg1b基因同时敲除的猪成纤维细胞，即pLeg1a-/-；pLeg1b-/-双等位基因敲除的猪成纤维细胞。
进一步的，基因敲除载体转染入猪成纤维细胞时，使用的转染参数为DO-113。
进一步的，例如同时转染两个基因时，转染用基因敲除载体的量仅为常规单基因分别转染方法所用载体量的一半或更少，如3μg/两个基因/106个成纤维细胞。
另一方面，本发明也涉及所提供的基因敲除载体在制备基因敲除动物模型，尤其是猪，小型猪动物模型中的应用。
另一方面，本发明方法获得的是不带有外源标记基因的猪成纤维细胞。
本发明的方法以及提供的基因敲除载体可以高效、便捷的实现双基因或多基因的同时敲除，同时减少对转染细胞的损伤。
附图说明
图1：使用不同核转染仪参数的转染效率。
图2：具有pLeg1a-/-和pLeg1b-/-双等位基因敲除的四个克隆点的基因型。
图3：外源Cas9 DNA基因整合检测结果；
(图中M：DNA分子标记；nc：阴性对照水；WT：野生型；11、15、19、24分别指示：四个pLeg1a-/-和pLeg1b-/-双等位基因敲除的克隆点；p：质粒pX330阳性对照)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：基因敲除载体的构建
U6启动子驱动的gRNA克隆载体pX330购自Addgene(PlasmidNo.42230；Watertown，MA，USA)。使用在线gRNA设计工具(http://crispr.mit.edu)设计了靶向猪pLeg1a(XM_003121211.1/XP_003121259.1)和pLeg1b(XM_021074892.1/XP_020930551.1)外显子1的gRNA。
首先利用pX330中的BpiI限制性位点分别构建了pX330-pLeg1a和pX330-pLeg1b的gRNA重组载体。用于gRNA-pLeg1a的引物为正向(SEQ ID NO:5)：5'-CACCGCATGGCTGGCAATATACTAC-3'，反向(SEQ ID NO:6)：5'-AAACGTAGTATATTGCCAGCCATGC-3'；而针对gRNA-pLeg1b的引物为正向(SEQ ID NO:7)：5'-CACCGCTGGCATTACCTTGAGAGAC-3'，反向(SEQ ID NO:8)：5'-AAACGTCTCTCAAGGTAATGCCAGC-3'。
然后使用引物P1(SEQ ID NO:9)：5'-TCTGTACCTCTAGAgagggcctatttcccatgat-3'；和引物P2(SEQ ID NO:10)：5'-ATCGTCGTCTAGAacttgctatttctagctctaaaac-3'从pX330-1b载体上扩增一个包含U6-gRNA-pLeg1b的380个碱基对的片段，然后插入到pX330-pLeg1a载体的XbaI位点，产生包含U6-gRNA-pLeg1a和U6-gRNA-pLeg1b的重组载体pX330-pLeg1a-pLeg1b，它们可以同时靶向pLeg1a和pLeg1b基因，两端靶向敲除DNA片段串联连接。
实施例2：猪胎儿成纤维细胞的培养，转染和筛选
猪胎儿成纤维细胞(PFFs)是从32天大的雄性中国实验用小型猪胚胎中分离出来的。这些原代细胞在含10％胎牛血清(FBS；Gibco)的高葡萄糖Dulbecco's Medium Eagle培养基(Gibco,Gaithersburg,MD,USA)中培养。
所有动物实验均根据中国动物保护和协议委员会制定的指南进行，并得到浙江大学实验动物福利委员会(中国浙江省)的批准。使用Lonza Nucleofector进行pX330-pLeg1a-pLeg1b对PFF的转染。转染前一天，将PFF解冻并培养。然后使用3μg pMax(Lonza，Walkersville，MD，USA)在不同的参数(CA-137，CL-133和DO-113)下进行转染，转染约1×106PFF细胞。利用转染后72小时的荧光强度(发光细胞与总细胞的比率)评估转染效果，结果显示DO-113最佳，其次是CA-137，如附图1所示。
使用最佳转染参数DO-113，用3μg pX330-pLeg1a-pLeg1b双基因敲除载体转染1×106PFFs。转染后48小时，使用单克隆有限稀释形成策略进行选择，方法为将细胞在10cm培养皿中以5000个细胞/皿传代培养，然后在含20％FBS和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(Gibco)的DMEM中培养约10天。然后选择单个细胞克隆点并在24孔板中培养。当细胞达到汇合时，50％冷冻保存，另外50％进行基因组提取以鉴定突变。
实施例3：检测基因修饰和外源基因整合
使用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)从每个细胞克隆中提取基因组DNA，然后使用高保真Phusion聚合酶(Thermo FisherScientific)进行PCR检测，使用的pLeg1a特异性引物为：5'-CCCCCGCTGTGTGGAATAAGAG-3'(SEQ ID NO:11)和5'-GCCCCACTGCAGTTTTTAGTAGC-3'(SEQ ID NO:12)，使用的pLeg1b特异性引物为:5'-ACAAGGGAAGTGCCCTATTACC-3'(SEQ ID NO:13)和5'-TGATGTACAGGCAATCCCCA-3'(SEQ ID NO:14)。
PCR产物经过凝胶纯化，然后进行Sanger测序(BGI Genomics，中国深圳)。
另外，筛选出的双基因敲除细胞克隆的基因组DNA还进行PCR检测以验证载体质粒的整合。使用的引物为：Cas9-F(SEQ ID NO:15)：5'-CATCGAGCAGATCAGCGAGT-3'和Cas9-R(SEQ ID NO:16)：5'-CGATCCGTGTCTCGTACAGG-3'。水和野生型基因组用作阴性对照，pX330载体作为阳性对照。
结果如下：
实施例2的方法共获得了39个细胞克隆点，通过鉴定双基因和单基因突变克隆点，显示其中有4个克隆点(#11、15、19和24)是pLeg1a-/-；pLeg1b-/-双等位基因敲除，带有移码突变，包括插入和缺失(如附图2所示)，至少有23个克隆点显示一个基因中有一个单等位基因突变体，有12个克隆点未显示突变。
表明：两个基因位点同时双等位基因敲除率约为10.3％(4/39)，至少一个等位基因突变体的敲除率为69.2％(27/39)。高于TALEN在PFFs中进行传统基因编辑的敲除率。
另外，载体质粒的整合PCR检测结果显示，所有四个pLeg1a-/-和pLeg1b-/-双敲除PFF细胞克隆点都没有CRISPR/Cas9质粒整合的迹象(编号11、15、19和25；如附图3所示)。
实施例4：脱靶分析
脱靶效应是CRISPR/Cas9基因编辑技术的主要缺点。因此，使用脱靶切割位点的在线预测工具(http://crispr.mit.edu)，选择了与我们的靶序列相似的七个脱靶序列(pLeg1a为四个，pLeg1b为三个)进行PCR分析。PCR产物的DNA测序表明，在所有测定的细胞克隆点中，这些预测的脱靶位点均未发生突变。表明本发明的基因敲除载体及其应用方法具有较好的效果。
表1：脱靶检测预测位置及测序引物
Figure GDA0002622877230000101
Figure GDA0002622877230000111
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种高效基因敲除载体及其应用
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 96
<212> RNA
<213> 家猪(Sus scrofa)
<400> 1
cuggcauuac cuugagagac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 2
<211> 96
<212> RNA
<213> 家猪(Sus scrofa)
<400> 2
cauggcuggc aauauacuac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 3
<211> 96
<212> DNA
<213> 家猪(Sus scrofa)
<400> 3
ctggcattac cttgagagac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96
<210> 4
<211> 96
<212> DNA
<213> 家猪(Sus scrofa)
<400> 4
catggctggc aatatactac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacgtctct caaggtaatg ccagc 25
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctgtacctc tagagagggc ctatttccca tgat 34
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atcgtcgtct agaacttgct atttctagct ctaaaac 37
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccccgctgt gtggaataag ag 22
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccccactgc agtttttagt agc 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acaagggaag tgccctatta cc 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgatgtacag gcaatcccca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catcgagcag atcagcgagt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgatccgtgt ctcgtacagg 20
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<212> DNA
<213> 家猪(Sus scrofa)
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catggctggc aatatactac agg 23
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccccgctgt ggaataagag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccccactgc agtttttagc 20
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 家猪(Sus scrofa)
<400> 20
aaaggctaga aatatactac gag 23
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tccgttcctg actacaggtt g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aacttcatgt ggtgggattg c 21
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 家猪(Sus scrofa)
<400> 23
cattaatggt aatatactac tgg 23
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgctttctgg ctgtatggag aa 22
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggctttcaca catgaatacc gc 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 家猪(Sus scrofa)
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cacagctagc aaaatactac tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcccatcag ctaaggcaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctgttgatt tcgcagagcc 20
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<212> DNA
<213> 家猪(Sus scrofa)
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gtttgctggc aatatactcc tag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcagatgtca aagtgactac ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctagctttgt ggtgggcaaa c 21
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<212> DNA
<213> 家猪(Sus scrofa)
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ctggcattac cttgagagac tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acaagggaag tgccctatta cc 22
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<212> DNA
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<213> 家猪(Sus scrofa)
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caaggcatta ccttgagaga atgatgg 27
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcacgctga atttacaaca gg 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccttgaggaa gggcaatagc 20
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<213> 家猪(Sus scrofa)
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catggcatta cctggacagc ctggtgg 27
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cggctactca ccaagcttcc 20
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aagcctcgag tcaggtccta 20
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<213> 家猪(Sus scrofa)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctctcaaggc agaccccaag 20

Claims (7)

1.一种基因敲除载体，包括采用CRISPR/Cas9编辑系统编辑的基因编辑载体骨架pX330，其特征在于，所述基因敲除载体包括处于不同位点的猪肝富集基因1a（pLeg1a）和猪肝富集基因1b（pLeg1b）的DNA片段，所述第一种DNA片段和第二种DNA片段均分别根据sgRNA靶位点设计后利用所述基因编辑载体骨架pX330中的BpiI限制性位点分别构建gRNA重组载体，得到的所述第一种DNA片段为采用U6启动子连接的猪肝富集基因1a（pLeg1a）的sgRNA的DNA片段U6-gRNA-pLeg1a，得到的所述第二种DNA片段为采用U6启动子连接的猪肝富集基因1b（pLeg1b）的sgRNA的DNA片段U6-gRNA-pLeg1b，所述第二种DNA片段U6-gRNA-pLeg1b被插入至所述第一种DNA片段U6-gRNA-pLeg1a的XbaI位点。
2.根据权利要求1所述的基因敲除载体，其特征在于，所述第一种DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；第二种DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.一种制备敲除猪肝富集基因1（pLeg1）的猪成纤维细胞的方法，其特征在于，通过同时敲除猪肝富集基因1a（pLeg1a）和猪肝富集基因1b（pLeg1b）实现；具体的所述方法包括：（1）构建权利要求1-2任一项所述基因敲除载体；（2）将步骤（1）构建的基因敲除载体系统通过电转染转入猪成纤维细胞中，通过筛选和鉴定获得pLeg1a和pLeg1b同时双等位基因敲除的单克隆细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因敲除载体的用量为单基因分别敲除方法载体用量的一半或更少。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中基因敲除载体转染入猪成纤维细胞时，使用的转染参数为DO-113。
6.根据权利要求3-5任一项所述方法制备而成的pLeg1a和pLeg1b双等位基因同时敲除的猪成纤维细胞。
7.根据权利要求1-2任一项所述的基因敲除载体在制备基因敲除动物模型中的应用，所选动物为猪。
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