CN114574493A - 一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、扩增用引物和应用 - Google Patents
一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、扩增用引物和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114574493A CN114574493A CN202210349607.5A CN202210349607A CN114574493A CN 114574493 A CN114574493 A CN 114574493A CN 202210349607 A CN202210349607 A CN 202210349607A CN 114574493 A CN114574493 A CN 114574493A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sosg1
- sosg2
- seq
- vector
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001494479 Pecora Species 0.000 title claims abstract description 49
- 101150107526 Socs2 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title abstract description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title abstract description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 57
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 38
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 claims description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 101000687808 Homo sapiens Suppressor of cytokine signaling 2 Proteins 0.000 abstract 1
- 102100024784 Suppressor of cytokine signaling 2 Human genes 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高效编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、扩增用引物和应用。利用本发明的sgRNA组合制备Cas9载体，可针对SOCS2基因进行编辑，实施例结果表明不同单克隆细胞基因组中造成不同程度编辑，包括大片段(52或53bp敲除)、点突变(G突变为C)、小片段敲除(9或11bp敲除)，对SOCS2蛋白结构造成极大影响，在目标区域的总体编辑效率达到82.9％，双等位基因上均发生编辑效率为51.2％。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高效编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、扩增用引物和应用。
背景技术
Sg(single-guide，单链引导)序列为利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时设计的靶向目标基因的序列，sg序列位置的设计对其编辑靶基因的效率有影响，使用高编辑效率的sg序列更容易获得基因编辑的细胞或受精卵，可为获得基因编辑细胞或动物个体减少实验时间及成本。在CRISPR/Cas9技术出现之前，通常利用同源重组、ZFN(锌指核酸酶)、TANLEN(转录激活样效应核酸酶)等技术实现目的基因的大片段精确敲除。但细胞内自然发生同源重组的效率极低(10-6)，CRISPR/Cas9技术的出现大大提高了基因编辑的发生效率，并可以高效的介导同源重组，相比于ZFN和TALEN，Cas9编辑的效率更高。
SOCS2(Suppressors of cytokine signaling 2)基因即细胞信号转导抑制因子2，与动物生长发育调控相关，在绵羊中，SOCS2基因是与生长速度与体型大小相关的重要候选基因，对该基因进行编辑有助于获得生长更快，体型更大的绵羊新品系。目前，未见有高效的编辑SOCS2基因的sg序列的报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、扩增用引物和应用，高效编辑绵羊SOCS2基因，验证SOCS2基因敲除对绵羊生长发育的影响，为培育生长性能的绵羊品种提供依据。
本发明提供了一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合，包括Sosg1和Sosg2；
所述Sosg1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Sosg2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了一种用于扩增上述技术方案所述sgRNA组合的引物，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物Sosg1-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物Sosg1-R；核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物Sosg2-F和核苷酸序列如SEQID NO.6所示的反向引物Sosg2-R。
本发明还提供了一种包含上述技术方案所述sgRNA组合的重组载体，所述重组载体的出发载体包括pX330载体。
优选的，所述重组载体的基础载体包括pX330载体。
本发明还提供了上述技术方案所述sgRNA组合、上述技术方案所述引物或上述技术方案所述重组载体在敲除绵羊SOCS2基因或在改善绵羊生长性能中的应用。
本发明还提供了一种编辑绵羊SOCS2基因的方法，包括以下步骤：
将Sosg1-F和Sosg1-R退火得Sosg1；将Sosg2-F和Sosg2-R退火得Sosg2；所述Sosg1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Sosg1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Sosg2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Sosg2-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；
将Sosg1和Sosg2分别插入pX330载体中，得到重组载体pX330-Sosg1和pX330-Sosg2；
将所述重组载体pX330-Sosg1、pX330-Sosg2及抗性载体共转绵羊细胞，培养得单克隆细胞。
优选的，所述插入位点包括BbsI。
优选的，所pX330-Sosg1、pX330-Sosg2和抗性载体的质量比为1：1：1；
所述抗性载体包括G418抗性载体pl452。
优选的，得单克隆细胞后，还包括利用SOCS2F1和SOCS2F2验证基因敲除效果，所述SOCS2F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SOCS2F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选的，所述绵羊细胞包括绵羊胎儿成纤维细胞。
本发明提供了编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合，包括Sosg1和Sosg2。本发明Sosg1和Sosg2共同作用于绵羊基因组并发生基因编辑后可造成大片段缺失并导致移码突变，对SOCS2蛋白结构产生极大影响。实施例结果表明，在利用所述sgRNA组合编辑获得的170株绵羊单克隆细胞中，基因编辑阳性克隆为141个，阳性率为82.9％，在基因组两套染色体上(等位基因)均发生编辑的克隆的个数为87，等位基因均发生编辑的概率为51.2％，本发明sgRNA组合能够实现高效编辑绵羊SOCS2基因，为培育生长性能的绵羊品种提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1流程图；
图2为测序获得的湖羊SOCS2基因2号外显子的真实序列；
图3为部分单克隆细胞基因组测序结果。
具体实施方式
本发明提供了一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合，包括Sosg1和Sosg2；所述Sosg1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Sosg2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明Sosg1和Sosg2的核苷酸序列，从5’-3’依次如下：
Sosg1：5’-TCCTCCGGGAATGGCGCGGA-3’；
Sosg2：5’-GGCGGAGGAGCCGTCCCCA-3’。
本发明根据NCBI公布的绵羊(版本号ARS-UI_Ramb_v2.0)SOCS2基因(NC056056.1)的参考序列设计针对绵羊SOCS2基因的2号外显子(第一个CDS区域)的Sosg1和Sosg2，二者共同作用于绵羊基因组并发生基因编辑后可造成不同程度编辑，包括大片段(52或53bp敲除)、点突变(G突变为C)和小片段敲除(9或11bp敲除)，对SOCS2蛋白结构造成极大影响。本发明对上述Sosg1和Sosg2的来源没有严格要求，可采用人工合成或者退火的方式获得。
本发明还提供了一种用于扩增上述技术方案所述sgRNA组合的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物Sosg1-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物Sosg1-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物Sosg2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物Sosg2-R。
本发明各引物的核苷酸序列序列，从5’-3’依次如下：
Sosg1-F：5’-CACCGTCCTCCGGGAATGGCGCGGA-3’；
Sosg1-R：5’-AAACTCCGCGCCATTCCCGGAGGAC-3’；
Sosg2-F：5’-CACCGGGCGGAGGAGCCGTCCCCAG-3’；
Sosg2-R：5’-AAACCTGGGGACGGCTCCTCCGCCC-3。
本发明针对Sosg1设计正向引物Sosg1-F和反向引物Sosg1-R，针对Sosg2设计正向引物Sosg2-F和反向引物Sosg2-R，利用Sosg1-F和Sosg1-R退火即可得到带有BbsI酶切位点的Sosg1；利用Sosg2-F和Sosg2-R退火即可得到带有BbsI酶切位点的Sosg2。以利用Sosg1-F和Sosg1-R退火得到带有BbsI酶切位点的Sosg1为例，本发明所述退火的程序优选为95℃预变性5min，37℃退火10min，4℃保存；所述退火的体系优选以10μL计，包括2.5μL 100μMSosg1-F、2.5μL 100μM Sosg1-R、1μL 10×PCRbuffer和余量的水。本发明利用Sosg2-F和Sosg2-R退火得到带有BbsI酶切位点的Sosg2的程序和体系优选与利用Sosg1-F和Sosg1-R退火得到带有BbsI酶切位点的Sosg1的程序和体系相同，在此不作赘述。
本发明还提供了一种包含上述技术方案所述sgRNA组合的重组载体。
在本发明中，所述重组载体的基础载体优选包括pX330载体。本发明基础载体pX330上存在BbsI酶切位点，在具体操作过程中，采用酶切、酶连的方式即可将所述带有BbsI酶切位点的Sosg1和Sosg2分别插入到pX330载体。本发明所述酶切的体系优选以100μL计，包括10μgpX330载体、10μLNEB Cutsmart、3.0μLBbsⅠ和余量的水。本发明所述酶切的温度优选为37℃，酶切的时间优选为4～5h。
本发明优选将pX330载体的酶切产物进行纯化回收，得用BbsI酶切后的pX330线性质粒。本发明对所述纯化回收的方式没有严格要求，采用常规方式即可，例如使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收。本发明在具体实施过程中使用的琼脂糖凝胶回收试剂盒购买自湖南艾科瑞生物工程有限公司，货号：AG21004。
本发明所述酶连优选包括利用T4 DNA连接酶将用BbsI酶切后的pX330线性质粒与退火后得到的带有BbsI酶切位点的Sosg1和Sosg2分别连接，得重组载体pX330-Sosg1和pX330-Sosg2。以带有BbsI酶切位点的Sosg1与用BbsI酶切后的pX330线性质粒的酶连过程为例，本发明所述酶连的体系优选以10μL计，包括100ng BbsI酶切后的pX330线性质粒、6.5μL带有BbsI酶切位点的Sosg1、0.5μl T4 DNA连接酶和余量的水。本发明所述酶连的温度为16℃，酶连的时间为3～6h。本发明带有BbsI酶切位点的Sosg2与用BbsI酶切后的pX330线性质粒的酶连过程优选与带有BbsI酶切位点的Sosg1与用BbsI酶切后的pX330线性质粒的酶连过程相同，在此不作赘述。
本发明还提供了一种包含上述技术方案所述sgRNA组合、所述引物或所述重组载体在敲除绵羊SOCS2基因或在培育高生长性能绵羊中的应用。
本发明使用Sosg1和Sosg2可以在绵羊基因组中进行高效基因编辑，有利于进一步制备SOCS2基因编辑绵羊个体。
本发明还提供了一种敲除绵羊SOCS2基因的方法，包括以下步骤：
将所述Sosg1-F和Sosg1-R退火得带有BbsI酶切位点的Sosg1；将Sosg2-F和Sosg2-R退火得带有BbsI酶切位点的Sosg2；所述Sosg1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Sosg1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Sosg2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Sosg2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
将带有BbsI酶切位点的Sosg1和带有BbsI酶切位点的Sosg2分别插入pX330载体中，得到重组载体pX330-Sosg1和pX330-Sosg2；
将pX330-Sosg1、pX330-Sosg2及抗性载体共转绵羊细胞，培养得单克隆细胞。
本发明将所述Sosg1-F和Sosg1-R退火得带有BbsI酶切位点的Sosg1，将Sosg2-F和Sosg2-R退火得带有BbsI酶切位点的Sosg2的程序和体系优选与前文记载的内容相同，在此不作赘述。
本发明分别将带有BbsI酶切位点的Sosg1和带有BbsI酶切位点的Sosg2插入到pX330载体中，得到重组载体pX330-Sosg1和pX330-Sosg2。本发明所述插入的位点优选包括BbsI。本发明所述插入的方式优选包括酶切和酶连。本发明所述酶切和酶连的体系和条件已在前文记载，在此不作赘述。
本发明优选将重组载体pX330-Sosg1和pX330-Sosg2分别转化大肠杆菌感受态细胞，对获得的菌体克隆进行测序，测序若结果包含设计的sgRNA，表明连接正确。将包含正确载体的菌落大量培养并利用去内毒素质粒提取试剂盒(天根生化科技有限公司：DP118-02)提取质粒，分别得到阳性pX330-Sosg1和pX330-Sosg2。
本发明将测序结果为阳性的pX330-Sosg1和pX330-Sosg2以及抗性载体共转绵羊细胞，培养得单克隆细胞。本发明所述抗性载体优选包括G418抗性载体pl452。本发明对所述绵羊细胞的种类并没有特殊限定，在具体实施中以绵羊胎儿成纤维细胞为例进行说明，但不能仅将其理解为本发明的全部保护范围。
本发明在所述共转过程中，所述pX330-Sosg1、pX330-Sosg2和抗性载体的质量比优选为1：1：1。本发明所述共转的方式优选包括脂质体转染法。本发明所述脂质体转染法的体系优选包括体系1和体系2；所述体系1优选包括125μlDMEM/F12和7.5μL脂质体；所述体系2优选包括3μg G418抗性载体pl452、3μgpX330-Sosg1、3μgpX330-Sosg2、10μLP3000reagent和125μLDMEM/F12。本发明优选将所述体系1和所述体系2混合，室温下孵育20min，然后将其加入含有绵羊细胞的六孔板孔中，补充培养基(85％DMEM/F12+15％胎牛血清)至2mL，实现所述共转。
共转48h后，本发明优选将细胞消化并分配至20个10cm培养皿中，加入350μg/mlG418进行筛选，培养得单克隆细胞。本发明对培养单克隆细胞的方式没有严格要求，常规操作即可。本发明所述培养的时间优选为10～12d。
本发明优选提取所述单克隆细胞的基因组，利用SOCS2F1和SOCS2F2验证基因敲除效果，所述SOCS2F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SOCS2F2的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
本发明各引物的核苷酸序列序列，从5’-3’依次如下：
SOCS2F1：5’-CTCTCTGTCCTTTCTCTGGAACG-3’；
SOCS2F2：5’-GATTTCCAAGGAACCCTCCTCG-3’。
本发明所述验证的方式优选包括PCR扩增。本发明所述PCR扩增的程序优选为第一阶段：95℃预变性5min；第二阶段95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；第三阶段72℃终延伸5min，4℃保存。本发明优选对PCR扩增产物进行测序，测序结果与SOCS2基因2号外显子进行比对，检测序列是否发生编辑。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.根据NCBI公布的绵羊(版本号ARS-UI_Ramb_v2.0)SOCS2基因(NC056056.1)的参考序列设计针对2号外显子的PCR引物SOCS2F1和SOCS2R1，以湖羊基因组为模板，利用设计的引物进PCR扩增，扩增产物测序后，将测序结果与参考序列比对，结果如图2所示，其中绿色部分为湖羊SOCS2基因2号外显子的真实序列。根据图2可以看出，湖羊的SOCS2基因真实序列与参考序列一致。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，34×[95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s]，72℃终延伸5min，4℃保存。
2.根据测序结果的湖羊SOCS2基因真实序列，设计正向引物Sosg1-F、反向引物Sosg1-R、正向引物Sosg2-F和反向引物Sosg2-R，退火合成带有BbsI酶切位点的sgRNA组合(带有BbsI酶切位点的Sosg1和带有BbsI酶切位点的Sosg2)，退火的体系和条件如下表1～2。
表1合成Sosg1的退火体系和条件
表2合成Sosg2的退火体系和条件
3.在步骤2退火的同时对Cas9表达载体pX330使用BbsⅠ(NEB：R3539L)进行酶切，酶切体系和条件如下表3。
表3酶切体系和条件
将以上体系与37℃酶切4-5h，将酶切产物通过琼脂糖凝胶回收试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司：AG21004)进行纯化回收。
4.将酶切后的pX330载体与退火后的双链sgRNA序列通过T4 DNA连接酶(NEB：N103-C2)进行连接，连接体系和条件如下表4～5。
表4酶切后的pX330载体与Sosg1连接体系和条件
表5酶切后的pX330载体与Sosg2连接体系和条件
连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，获得的菌体克隆进行测序，测序若结果包含设计的sgRNA，表明连接正确。将包含正确载体的菌落大量培养并利用去内毒素质粒提取试剂盒(天根生化科技有限公司：DP118-02)提取质粒。
5、将带有sg序列的pX330-Sosg1、pX330-Sosg2及g418(遗传霉素)抗性载体pl452通过脂质体转染法(Invitrogen:LIPOFECTAMINE 3000L3000015)共转湖羊胎儿成纤维细胞，每个六孔板孔转染质粒的总量为9μg，转染体系如下表6。
表6转染体系
将体系1和体系2混合后室温下孵育20min，然后将其加入含有湖羊胎儿成纤维细胞的六孔板孔中进行转染，补充培养基(85％DMEM/F12(Hyclone：SH30023.01)，15％胎牛血清(gibco：10091148))至2mL。转染后48h，将细胞消化并分配至20个10cm培养皿中，并加入350μg/ml g418进行筛选培养。
6、细胞培养第10～12天，培养皿中形成细胞克隆，挑取单克隆细胞于48孔板中培养，细胞长满后收集细胞并提取基因组。
7、将单克隆基因组以SOCS2F1及SOCS2R1引物进行PCR扩增，扩增产物进行测序，测序结果与SOCS2基因2号外显子进行比对，检测序列是否发生编辑。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，34×[95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s]，72℃终延伸5min，4℃保存。部分单克隆细胞基因组测序结果如图3所示。根据图3可以看出，不同单克隆细胞基因组中造成不同程度编辑，包括大片段(52或53bp敲除)、点突变(G突变为C)、小片段敲除(9或11bp敲除)，对SOCS2蛋白结构造成极大影响。本发明通过实验筛选得到170个单克隆，其中任意一套染色体中SOCS2等位基因发生编辑的个数为141，即在目标区域的总体编辑效率达到82.9％；两套染色体中SOCS2等位基因上均发生编辑的单克隆个数为87，即在目标区域的上均发生编辑效率为51.2％。
利用本发明的sgRNA组合制备Cas9载体，可针对SOCS2基因进行高效编辑，以此为基础可制备SOCS2基因编辑绵羊，验证该基因敲除对绵羊生长发育的影响，并在未来培育具有更好生长性能的绵羊品种。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、扩增用引物和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctccggga atggcgcgga 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcggaggag ccgtcccca 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgtcctc cgggaatggc gcgga 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaactccgcg ccattcccgg aggac 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgggcgg aggagccgtc cccag 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacctgggg acggctcctc cgccc 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctctctgtcc tttctctgga acg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatttccaag gaaccctcct cg 22
Claims (10)
1.一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合，其特征在于，包括Sosg1和Sosg2；
所述Sosg1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Sosg2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于扩增权利要求1所述sgRNA组合的引物，其特征在于，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物Sosg1-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物Sosg1-R；核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物Sosg2-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物Sosg2-R。
3.一种包含权利要求1所述sgRNA组合的重组载体，其特征在于，所述重组载体的出发载体包括pX330载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的基础载体包括pX330载体。
5.权利要求1所述sgRNA组合、权利要求2所述引物或权利要求3或4所述重组载体在敲除绵羊SOCS2基因或在改善绵羊生长性能中的应用。
6.一种编辑绵羊SOCS2基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将Sosg1-F和Sosg1-R退火得Sosg1；将Sosg2-F和Sosg2-R退火得Sosg2；所述Sosg1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Sosg1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Sosg2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Sosg2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
将Sosg1和Sosg2分别插入pX330载体中，得到重组载体pX330-Sosg1和pX330-Sosg2；
将所述重组载体pX330-Sosg1、pX330-Sosg2及抗性载体共转绵羊细胞，培养得单克隆细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述插入位点包括BbsI。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所pX330-Sosg1、pX330-Sosg2和抗性载体的质量比为1：1：1；
所述抗性载体包括G418抗性载体pl452。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，得单克隆细胞后，还包括利用SOCS2F1和SOCS2F2验证基因敲除效果，所述SOCS2F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SOCS2F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述绵羊细胞包括绵羊胎儿成纤维细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210349607.5A CN114574493A (zh) | 2022-04-02 | 2022-04-02 | 一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、扩增用引物和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210349607.5A CN114574493A (zh) | 2022-04-02 | 2022-04-02 | 一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、扩增用引物和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114574493A true CN114574493A (zh) | 2022-06-03 |
Family
ID=81784520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210349607.5A Pending CN114574493A (zh) | 2022-04-02 | 2022-04-02 | 一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、扩增用引物和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114574493A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116064506A (zh) * | 2022-09-30 | 2023-05-05 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种绵羊DQB基因的1号外显子的扩增引物对、sg序列和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105101787A (zh) * | 2012-06-21 | 2015-11-25 | 重组股份有限公司 | 遗传修饰的动物及其制备方法 |
| WO2016170348A2 (en) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | Mina Therapeutics Limited | Sarna compositions and methods of use |
| CN106460050A (zh) * | 2014-04-28 | 2017-02-22 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 使用靶向核酸内切酶进行哺乳动物基因组的表观遗传修饰 |
| WO2020014261A1 (en) * | 2018-07-09 | 2020-01-16 | The Broad Institute, Inc. | Rna programmable epigenetic rna modifiers and uses thereof |
-
2022
- 2022-04-02 CN CN202210349607.5A patent/CN114574493A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105101787A (zh) * | 2012-06-21 | 2015-11-25 | 重组股份有限公司 | 遗传修饰的动物及其制备方法 |
| CN106460050A (zh) * | 2014-04-28 | 2017-02-22 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 使用靶向核酸内切酶进行哺乳动物基因组的表观遗传修饰 |
| WO2016170348A2 (en) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | Mina Therapeutics Limited | Sarna compositions and methods of use |
| WO2020014261A1 (en) * | 2018-07-09 | 2020-01-16 | The Broad Institute, Inc. | Rna programmable epigenetic rna modifiers and uses thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MAHDI等: "3 Embryo knockout efficiency improved when targeting ovine suppressor of cytokine signalling 2 with 2 small guide RNA", 《REPRODUCTION FERTILITY AND DEVELOPMENT》 * |
| ZHOU等: "Programmable Base Editing of the Sheep Genome Revealed No Genome-Wide Off-Target Mutations", 《FRONTIERS IN GENETICS》 * |
| 宋绍征等: "CRISPR /Cas9基因编辑技术在山羊和绵羊中的应用研究进展", 《生物技术通报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116064506A (zh) * | 2022-09-30 | 2023-05-05 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种绵羊DQB基因的1号外显子的扩增引物对、sg序列和应用 |
| CN116064506B (zh) * | 2022-09-30 | 2024-04-12 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种绵羊DQB基因的1号外显子的扩增引物对、sg序列和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107435051B (zh) | 一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法 | |
| CN105646719B (zh) | 一种高效定点转基因的工具及其应用 | |
| CN108546716A (zh) | 一种基因组编辑方法 | |
| CN105671080B (zh) | CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法 | |
| CN107418974A (zh) | 一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法 | |
| CN113278619B (zh) | 双sgRNA、基因敲除载体、基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系及其构建方法 | |
| CN111172191B (zh) | 一种高效基因敲除载体及其应用 | |
| CN109706148A (zh) | 一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、gRNA组合物以及电转方法 | |
| CN106520829B (zh) | 一种终止双等位基因转录的方法 | |
| CN114574493A (zh) | 一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、扩增用引物和应用 | |
| CN109402170B (zh) | 一种鱼类雄性不育模型的建立方法 | |
| CN113025613B (zh) | 一种adora2a基因敲除细胞及其构建方法和应用 | |
| CN109652457A (zh) | 一种基因敲除选育alpk2基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN111549070B (zh) | 对x染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法 | |
| CN111235153B (zh) | 靶向敲除人MC1R基因的sgRNA及其构建的细胞株 | |
| CN115029352A (zh) | 一种基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN104805100B (zh) | 水稻基因OsSμBP‑2在延缓植物叶片衰老中的应用 | |
| CN113249409A (zh) | 一种bmi1基因缺失斑马鱼 | |
| CN113151277A (zh) | 鸡DF-1细胞IHH基因敲除稳定细胞株的构建方法及其特异性sgRNA | |
| CN116121240A (zh) | 一种绵羊DQA基因1号外显子的扩增引物对、sgRNA及应用 | |
| CN116064506B (zh) | 一种绵羊DQB基因的1号外显子的扩增引物对、sg序列和应用 | |
| CN116024216A (zh) | 一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用 | |
| CN111057717B (zh) | 快速制备可直接使用的gRNA表达载体的方法及其应用 | |
| CN107201365A (zh) | 一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列及其应用 | |
| CN117467697A (zh) | 用于构建鸡igf2bp1基因突变的细胞株的方法及基因编辑系统和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220603 |