CN116121240A - 一种绵羊DQA基因1号外显子的扩增引物对、sgRNA及应用 - Google Patents

一种绵羊DQA基因1号外显子的扩增引物对、sgRNA及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种绵羊DQA基因1号外显子的扩增引物对、sgRNA及应用。本发明提供了一种扩增绵羊DQA基因1号外显子的引物对，通过扩增引物及PCR扩增获得该区段序列，经测序无误后，根据该序列设计两条sgRNA。在本发明实施例中，利用上述设计的两条sgRNA，基于CRISPR/Cas9体系，对1号外显子区域进行基因编辑，筛选获得40个单克隆细胞株，测序后，发生基因编辑阳性克隆为26个，阳性率为65％，在基因组两套染色体上(等位基因)均发生编辑的克隆的个数为6，双等位基因均发生编辑的概率为15％。

Description

一种绵羊DQA基因1号外显子的扩增引物对、sgRNA及应用
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种绵羊DQA基因1号外显子的扩增引物对、sgRNA及应用。
背景技术
利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，需要首先根据基因组序列设计sg(single-guide，单链引导)序列，目标基因中一般可设计多个sgRNA，但序列的位置碱基顺序会对其编辑靶基因的效率有影响，使用高编辑效率的sgRNA更容易获得目标基因编辑的细胞或受精卵，可为获得基因编辑细胞或动物个体减少实验时间及成本。CRISPR/Cas9技术为目前最常用的基因编辑技术，此前所用的同源重组、ZFN(锌指核酸酶)、TANLEN(转录激活样效应核酸酶)等技术实现也可以目的基因的大片段精确敲除，但细胞内自然发生同源重组的效率极低(10-6)。ZFN、TALEN技术的设计繁琐，成本更高且效率较低，而CRISPR/Cas9技术的基因编辑效率较高，并可以介导同源重组，相比于ZFN和TALEN，Cas9系统更具优势。
DQA(SLA class II histocompatibility antigen,DQ haplotype D alphachain)基因即SLAII类组织相容性抗原，DQ单倍型Dα链。DQA主要存在于淋巴，皮肤和脾脏等组织中，参与机体细胞免疫和体液免疫，尤其是在启动辅助T细胞对重要病原体的反应方面具有重要作用。对DQA基因功能的研究目前尚不够明确，通过基因编辑技术有助于对DQA功能进行验证，但是目前并没有针对绵羊DQA基因进行编辑的报道，没有针对DQA基因使用CRISPR/Cas9系统实现编辑的实例。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绵羊DQA基因1号外显子的扩增引物对、sgRNA及应用，通过引导CRISPR/Cas9发生基因编辑后可造成大片段缺失并导致移码突变，基因编辑效率高，有助于DQA基因功能的研究。
本发明提供了一种扩增绵羊DQA基因1号外显子的引物对，所述引物对包括DQAF1和DQAR1，所述DQAF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DQAR1的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了一种扩增绵羊DQA基因1号外显子的方法，包括以绵羊基因组DNA为模板，利用上述引物对配制PCR体系，进行PCR扩增，得绵羊DQA基因1号外显子。
优选的，所述PCR扩增的程序，包括95℃预变性5min；95℃变形30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；72℃再延伸5min。
本发明还提供了一组靶绵向羊DQA基因1号外显子的sgRNA，包括两对单链寡核苷酸序列：DQAsg1-F、DQAsg1-R、DQAsg2-F和DQAsg2-R；
所述DQAsg1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述DQAsg1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述DQAsg2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述DQAsg2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一组包含上述sgRNA的重组载体。
优选的，所述重组载体均以pX330载体为基础载体。
本发明还提供了上述sgRNA或上述重组载体在对绵羊基因组中DQA基因1号外显子区进行基因编辑中的应用。
优选的，所述基因编辑的方法包括CRISPR/Cas9。
优选的，所述基因编辑的方法，包括：(1)分别对DQAsg1-F和DQAsg1-R、DQAsg2-F和DQAsg2-R进行退火，得到DQAsg1和DQAsg2，酶切后连接pX330载体，构建得到重组载体pX330DQAsg1和pX330DQAsg2；
(2)将所述重组载体pX330DQAsg1和pX330DQAsg2与g418抗性载体pl452共转染羊体细胞，经培养和g418抗性筛选后，得基因编辑细胞。
优选的，在步骤(2)得所述基因编辑细胞后，还包括提取所述基因编辑细胞的基因组DNA进行PCR扩增和/或测序验证。
有益效果：本发明提供了一种扩增绵羊DQA基因1号外显子的引物对，通过扩增引物及PCR扩增获得该区段序列，经测序无误后，根据该序列设计两条sgRNA。在本发明实施例中，利用上述设计的两条sgRNA，基于CRISPR/Cas9体系，对1号外显子区域进行基因编辑，筛选获得40个单克隆细胞株，测序后，发生基因编辑阳性克隆为26个，阳性率为65％，在基因组两套染色体上(等位基因)均发生编辑的克隆的个数为6，双等位基因均发生编辑的概率为15％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为序列设计和实验实施过程；
图2为引物扩增和测序结果；图中A.引物扩增结果，外显子1扩增获得215bp；B.测序获得的DQA外显子1序列；C.DQA外显子1设计的sgRNA及位置示意图；
图3为获得的单克隆细胞DQA基因部分测序结果。
具体实施方式
本发明提供了一种扩增绵羊DQA基因1号外显子的引物对，所述引物对包括DQAF1和DQAR1，所述DQAF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DQAR1的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明实施例中，优选根据NCBI公布的绵羊(版本号ARS-UI_Ramb_v2.0)的DQA基因(NC_056073)提供的参考序列设计针对1号外显子的PCR引物，基于所述PCR引物扩增得到的片段长度为215bp。
本发明所述引物对的序列，上游引物DQAF1：5’-gcttctcagctcagccctcatc-3’
下游引物DQAR1：5’-ttttccctctgattccctgttccc-3’。
本发明还提供了一种扩增绵羊DQA基因1号外显子的方法，包括以绵羊基因组DNA为模板，利用上述引物对配制PCR体系，进行PCR扩增，得绵羊DQA基因1号外显子。
本发明所述PCR体系以20μL计，优选包括：DQAF1/DQAR1各1μL、DNA模板1μL、2×mix12.5μL和余量的水。本发明所述PCR扩增的程序，优选包括95℃预变性5min；95℃变形30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；72℃再延伸5min。在本发明实施例中，优选以湖羊基因组为模板，利用上述引物对进行PCR扩增，扩增产物测序后，将测序结果与参考序列比对，确认湖羊的DQA序列。
本发明还提供了一组靶向绵羊DQA基因1号外显子的sgRNA，包括两对单链寡核苷酸序列：DQAsg1-F、DQAsg1-R、DQAsg2-F和DQAsg2-R；
所述DQAsg1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述DQAsg1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述DQAsg2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述DQAsg2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明优选基于上述扩增得到的湖羊的DQA序列设计sgRNA，并合成单链寡核苷酸序列(上游及下游添加BbsⅠ酶切位点)。序列如下(5’-3’)：(下划线为酶切位点序列)
上游DQAsg1-F：CACCGTGAACAGAGCTCTGATTCTG
下游DQAsg1-R：AAACCAGAATCAGAGCTCTGTTCAC
上游DQAsg2-F：CACCGACCTCCACTGGGGCTCATCA
下游DQAsg2-R：AAACTGATGAGCCCCAGTGGAGGTC。
本发明优选对上述单链寡核苷酸序列进行退火，合成sgRNA，所述退火的程序，优选包括95℃、5min，37℃、10min，4℃保存。本发明在进行所述退火时，上游DQAsg1-F和下游DQAsg1-R混合配制体系，上游DQAsg2-F和下游DQAsg2-R混合配制体系。
本发明还提供了一组包含上述sgRNA的重组载体。
本发明所述重组载体优选均以pX330载体为基础载体，且在构建所述重组载体时，优选包括对Cas9表达载体pX330使用BbsⅠ进行酶切，回收酶切片段后，在T4 DNA连接酶作用下，分别与退火后形成的双链sgRNA进行连接，获得重组载体pX330DQAsg1、pX330DQAsg2。
本发明还提供了上述sgRNA或上述重组载体在对绵羊基因组中DQA基因1号外显子区进行基因编辑中的应用。
本发明所述基因编辑的方法，优选包括CRISPR/Cas9。本发明利用CRISPR/Cas9的方法进行基因编辑时，优选包括：(1)分别对DQAsg1-F和DQAsg1-R、DQAsg2-F和DQAsg2-R进行退火，得到DQAsg1和DQAsg2，酶切后连接pX330载体，构建得到重组载体pX330DQAsg1和pX330DQAsg2；
(2)将所述重组载体pX330DQAsg1和pX330DQAsg2与g418抗性载体pl452共转染羊体细胞，经培养和g418抗性筛选后，得基因编辑细胞。
本发明对所述转染的方法并没有特殊限定，实施例中优选通过脂质体转染法转染湖羊胎儿成纤维细胞。
本发明在步骤(2)得所述基因编辑细胞后，优选还包括提取所述基因编辑细胞的基因组DNA进行PCR扩增和/或测序验证。本发明优选在形成细胞克隆时，提取DNA进行PCR扩增，更优选以DQAF1和DQAR1引物进行PCR扩增，扩增产物进行测序，测序结果与DQA的1号外显子进行比对，检测序列是否发生编辑。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种绵羊DQA基因1号外显子的扩增引物对、sgRNA及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
根据图1所示流程进行以下实验：
1、根据NCBI公布的绵羊(版本号ARS-UI_Ramb_v2.0)的DQA基因(NC_056073)提供的参考序列设计针对1号外显子的PCR引物(DQAF1和DQAR1)，以湖羊基因组为模板，利用设计的引物进PCR扩增，扩增产物测序后，将测序结果与参考序列比对(图2)，确认湖羊的DQA序列。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变形30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。
扩增体系为(使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的扩增酶Phanta Max mix，货号P525-03)：DQAF1/DQAR1各1μL、DNA模板1μL、2×mix 12.5μL和水补齐至25μL。
2、将合成的sgRNA的寡核苷酸序列(SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.6)退火，退火程序为95℃、5min，37℃、10min，4℃保存；退火的同时，对Cas9表达载体pX330使用BbsⅠ进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收(湖南艾科瑞生物工程有限公司，货号：AG21004)。
退火体系(10μL)：DQAsg-F 2.5μL、DQAsg-R2.5μL、10×PCR buffer 1.0μL和余量的ddH2O。
3、将酶切后的pX330载体与退火后的双链sg序列通过T4 DNA连接酶进行连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，获得的菌体克隆进行测序，测序结果若包含设计的sg序列，表明连接正确。将包含正确载体的菌落大量培养并提取质粒(天根生化科技有限公司：DP118-02)，获得重组载体pX330DQAsg1、pX330DQAsg2。
4、细胞转染：使用pX330DQAsg1、pX330DQAsg2和g418(遗传霉素)抗性载体pl452，通过脂质体转染法(Invitrogen:LIPOFECTAMINE 3000 L3000015)共转湖羊胎儿成纤维细胞，每个六孔板孔转染质粒的总量为9μg。
转染体系1：脂质体7.5μL和DMEM/F12 125μL；
转染体系2：pl452载体3μg、pX330DQAsg1 3μg、pX330DQAsg2 3μg、P3000 reagent10μL和DMEM/F12 125μL。
5、将体系1和体系2混合后室温下孵育20min，然后将其加入含有湖羊胎儿成纤维细胞的六孔板孔中进行转染，补充培养基(85％DMEM/F12(Hyclone：SH30023.01)，15％胎牛血清(gibco：10091148))至2mL。转染后48h，将细胞消化并分配至20个10cm培养皿中，并加入350μg/ml g418进行筛选培养。
6、细胞培养第10～12天，培养皿中形成细胞克隆，挑取单克隆细胞于48孔板中培养，细胞长满后收集细胞并提取基因组(基因组提取试剂盒：(天根生化科技(北京)有限公司)，DP304-03)。
4、将针对DQA外显子1编辑的单克隆基因组分别以DQAF1和DQAR1引物进行PCR扩增，扩增产物进行测序(图3)，测序结果与DQA的1号外显子进行比对，检测序列是否发生编辑。PCR扩增程序和体系与第一步相同。
经过以上步骤，载体转染后，对于1号外显子编辑，筛选获得40个单克隆细胞株，测序后，发生基因编辑阳性克隆为26个，阳性率为65％，在基因组两套染色体上(等位基因)均发生编辑的克隆的个数为6，双等位基因均发生编辑的概率为15％。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种扩增绵羊DQA基因1号外显子的引物对，其特征在于，所述引物对包括DQAF1和DQAR1，所述DQAF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DQAR1的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.一种扩增绵羊DQA基因1号外显子的方法，其特征在于，包括以绵羊基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物对配制PCR体系，进行PCR扩增，得绵羊DQA基因1号外显子。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序，包括95℃预变性5min；95℃变形30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；72℃再延伸5min。
4.一组靶向绵羊DQA基因1号外显子的sgRNA，其特征在于，包括两对单链寡核苷酸序列：DQAsg1-F、DQAsg1-R、DQAsg2-F和DQAsg2-R；
所述DQAsg1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述DQAsg1-R的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，所述DQAsg2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述DQAsg2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.一组包含权利要求4所述sgRNA的重组载体。
6.根据权利要求5所述重组载体，其特征在于，所述重组载体均以pX330载体为基础载体。
7.权利要求4所述sgRNA或权利要求5或6所述重组载体在对绵羊基因组中DQA基因1号外显子区进行基因编辑中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述基因编辑的方法包括CRISPR/Cas9。
9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，所述基因编辑的方法，包括：(1)分别对DQAsg1-F和DQAsg1-R、DQAsg2-F和DQAsg2-R进行退火，得到DQAsg1和DQAsg2，酶切后连接pX330载体，构建得到重组载体pX330DQAsg1和pX330DQAsg2；
(2)将所述重组载体pX330DQAsg1和pX330DQAsg2与g418抗性载体pl452共转染绵羊体细胞，经培养和g418抗性筛选后，得基因编辑细胞。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，在步骤(2)得所述基因编辑细胞后，还包括提取所述基因编辑细胞的基因组DNA进行PCR扩增和/或测序验证。
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