CN105671080B - CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法 - Google Patents

CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及CRISPR‑Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其是根据羊的MSTN基因序列，构建基于CRISPR‑Cas9系统的gRNA表达载体，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将优化的CRISPR‑Cas9载体、上述构建的gRNA表达载体和线性化的供体质粒共同转入羊的成纤维细胞中，获得羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞。本发明构建的CRISPR‑Cas9介导的打靶载体为羊MSTN基因的敲除和外源基因的定点整合提供了一种简便快速安全的途径，大大提高了转基因细胞系的筛选效率。该方法实现了不添加任何筛选标记即可筛选定点整合外源基因细胞系，大大提高了转基因动物的安全性，对羊的遗传育种具有重要价值。

Description

CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基 因的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学及动物遗传育种领域，具体地说，涉及CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法。
背景技术
CRISPR-Cas9基因编辑系统是由规律成簇间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)组成，是继锌指核酸酶(znic finger nuclease，ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectornucleases，TALENs)技术之后迅速发展起来的基因组编辑技术，在细胞基因敲除中已被广泛应用。CRISPR-Cas9通过小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)识别靶序列并引导Cas9蛋白对靶位点进行切割，使DNA发生双链断裂(DNA double-strand break，DSB)，断裂的DNA为防止被降解会自动启动内源性修复机制，而内源修复机制通常有两种，在非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)修复机制下修复时并不是非常精确，在断裂缺口处往往随机的插入或删除碱基，若突变位点位于蛋白编码区(codingsequence，CDS)，将转录错误mRNA，而导致翻译失败或蛋白失活从而实现基因敲除；而在同源重组(Homologousrecombination，HR)修复机制以及修复模板存在的条件下，也可以实现定点的单个碱基或者长片段的插入、删除或者突变，形成基因的敲入与敲除。
肌细胞生长抑制素(MSTN，Myostatin)是一类重要的肌细胞生长负调控因子，它通过抑制MRFs家族成员转录活性负向控制肌细胞的生长发育，MSTN功能缺失后会刺激肌细胞数量增加而出现“双肌现象”。因此人们通常采用突变、缺失、敲除等基因打靶技术对家畜MSTN基因进行修饰，然后借助胚胎工程手段获得产肉性能高的转基因家畜。
Fat-1基因来源于秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)四号染色体上，该基因编码ω-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)脱氢酶，可以将PUFAs从ω-6转化为ω-3形式，ω-3对维持机体的正常发育和生长至关重要，但人体内缺乏从ω-6转化为ω-3形式的脱氢酶基因，所以每天必须摄入一定的ω-3。人们通过转基因的方法在山羊细胞表达hfat-1基因，培育富含不饱和脂肪酸的高品质保健羊肉，使肉品质得到改善，从而提高人们ω-3PUFAs日常摄入量。
利用CRISPR-Cas9系统敲除羊MSTN基因，同时在gRNA识别位点定点整合hfat-1基因的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其是根据羊的MSTN基因序列(Gene ID 100860887)，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将优化的CRISPR-Cas9载体、上述构建的gRNA表达载体和线性化的供体质粒共同转入羊的成纤维细胞中，获得羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞。
本发明中述及的羊包括但不限于阿尔巴斯绒山羊。
本发明中述及的外源基因包括脂肪酸去饱和酶fat-1基因，或fat-1基因经过人源化修饰后的基因hfat-1等。
前述的方法，gRNA作用位点位于羊MSTN基因的1号外显子上。gRNA作用位点的DNA序列为5′-CGATGACTACCACGTTACGA-3′或5′-CGTTACGACGGAAACGGTCA-3′。优选地，gRNA作用位点的DNA序列为5′-CGTTACGACGGAAACGGTCA-3′。
前述的方法，所述供体质粒中含有如下顺次连接的表达元件：根据gRNA作用位点设计的羊MSTN基因5’同源臂—CAG启动子—脂肪酸去饱和酶fat-1基因或fat-1基因经过人源化修饰后的基因—ployA—根据gRNA作用位点设计的羊MSTN基因3’同源臂。其中，根据gRNA作用位点设计的羊MSTN基因5’同源臂和3’同源臂大小约1.0kb。
前述的方法，所述优化的CRISPR-Cas9载体(即hCas9质粒)的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示(hCas9质粒图谱见图1)；所述gRNA表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述供体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供根据上述方法获得的羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞。
本发明进一步提供上述方法在生产羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的克隆羊中的应用。该应用是指将所述羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞为核移植供体细胞，离体的羊卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得羊克隆胚胎，然后将克隆胚胎通过非手术法移入羊子宫内进行妊娠，获得转基因羊。
本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
1)CRISPR-Cas9载体的优化；2)根据羊的MSTN基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体；3)根据gRNA作用位点构建含有外源基因fat-1(hfat-1)的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒；4)将上述优化的CRISPR-Cas9载体、gRNA表达载体和线性化的供体质粒共同转染到阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞中，通过口吸管法和流式细胞仪筛选单克隆细胞系；5)通过PCR技术鉴定筛选单克隆细胞系，获得敲除MSTN基因同时在MSTN基因组断裂位置定点整合fat-1(hfat-1)基因的单克隆细胞系。
其中，步骤4)中利用口吸管法挑取单克隆细胞系是指用玻璃管拉制成保证可以使单个细胞通过的合适直径口吸管，在显微镜下无菌操作，将单细胞分别接种于预先平衡后含有细胞培养液的96孔细胞培养板中，进行细胞培养。待细胞生长呈簇后，分别用0.25％胰酶消化，将细胞集落转移至24孔细胞培养板中继续扩大培养。待细胞继续生长需要再次传代时，将细胞编号后一半细胞冻存，一半细胞用于基因组DNA的提取。
步骤4)中利用流式细胞仪筛选单克隆细胞系是指当细胞转染24h后，用胰蛋白酶消化细胞并将细胞重悬于PBS中，使用流式细胞仪将细胞筛选成单个细胞接种于96孔板。72h后换培养液一次；第7天对形成单细胞克隆群的孔进行换液操作；在第10天时，在显微镜下观察，将汇合度较高的细胞克隆传代至24孔板中继续扩大培养。
步骤5)中鉴定敲除MSTN基因同时定点整合fat-1基因的单克隆细胞系主要采用设计跨上游同源臂的PCR引物的方法，通过PCR技术扩增出包含基因组部分序列、上游同源臂全部序列、CAG启动子部分序列的产物，目的是确定外源基因整合到MSTN基因组断裂处。
本发明共成功获得156株单克隆细胞，鉴定MSTN基因敲除细胞系55株，其中通过同源重组修复的单克隆细胞系有40株，通过非同源重组修复的细胞有15株，即发生同源重组同时又发生非同源重组修复的单克隆细胞有4株。
本发明具有以下优点：
(一)CRISPR-Cas9基因编辑技术与常规的同源重组技术、TALEN技术和ZFNs技术相比，基因敲除效率显著提高。
(二)与传统的同源重组技术TALEN技术和ZFNs技术相比，由CRISPR-Cas9介导的同源重组使外源基因的整合效率显著提高。
(三)由CRISPR-Cas9介导的同源重组的同源臂(约1.0kb)与传统同源重组使用的同源臂(约3.0-4.0kb)相比长度大大减少，更加有利于后续检测工作的进行。
(四)通过CRISPR-Cas9系统的介导，实现了不加任何筛选标记即可筛选出MSTN基因敲除且定点整合外源基因的转基因细胞系，这是传统同源重组技术、TALEN技术和ZFNs技术无法实现的，很大程度提高了转基因动物的安全性。
(五)通过体细胞核移植技术制备MSTN基因敲除且定点整合外源基因hfat-1的转基因羊(例如转基因阿尔巴斯绒山羊)，为构建成熟的基因修饰动物研究和生产奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中hCas9质粒图谱。
图2为本发明实施例3中利用Surveyor突变检测试剂盒检测靶位点的电泳结果；其中，M:100bp marker；1:gRNA1(666bp)；2:酶切后的gRNA1；3:gRNA2(666bp)；4:酶切后的gRNA2；5:阳性对照。
图3为本发明实施例3中5’h-pCAGDNA3-hFat-1-3’h质粒酶切图；其中，M分别为100bp marker和1kb marker；1:NdeI单酶切；2:MluI和xholI双酶切；3:EcoRI单酶切；4:质粒。
图4为本发明实施例4中供体质粒hfat-1的构建流程示意图。
图5为本发明实施例6中MSTN基因敲除检测图；其中，M:DL1000bp；1-9为目的条带，大小为666bp。
图6为本发明实施例6中MSTN基因敲除单克隆细胞系p014产物测序双峰图。
图7为本发明实施例6中利用试剂盒扩增样品MSTN敲除并且定点整合hfat-1基因组DNA产物的电泳结果；其中，扩增产物大小为1525bp，M:分子量标准(250bp Ladder)。
图8为本发明实施例6中MSTN基因敲除同时hfat-1基因定点整合转基因细胞系的构建流程图。
图9为本发明实施例6中挑取的单克隆细胞鉴定结果汇总图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中测序工作由华大基因完成。
实施例1 CRISPR-Cas9载体的优化
对购自北京中原公司的CRISPR-Cas9表达载体进行优化，优化的CRISPR-Cas9载体(即hCas9质粒)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hCas9质粒图谱见图1。
实施例2 gRNA表达载体的构建
根据羊的MSTN基因序列(Gene ID 100860887)，针对MSTN的一号外显子序列设计gRNA序列，并构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体。gRNA表达载体包括4部分：U6启动子、靶序列、gRNA骨架和终止信号。
其中，gRNA作用位点的DNA序列如下：
5′-CGATGACTACCACGTTACGA-3′(gRNA1靶位点)
5′-CGTTACGACGGAAACGGTCA-3′(gRNA2靶位点)
利用生物学软件根据gRNA作用位点(gRNA1靶位点和gRNA2靶位点)分别设计gRNA序列，克隆至PMD-19T载体上，转化大肠杆菌Trans-110，涂板后挑取单菌落，进行菌液PCR，经电泳及测序鉴定，测序正确的单菌落接种于含Amp的LB培养基中，37℃、220rpm过夜揺菌，提取质粒分别命名为RNA1-MSTN和RNA2-MSTN，并将其作为gRNA PCR模板备用。
实施例3 CRISPR-Cas9系统的效率检测
用Premier5软件设计横跨不同靶位点位置的PCR引物，对转染hCas9质粒和RNA1-MSTN/RNA2-MSTN48h质粒后的羊成纤维细胞进行基因组提取，以基因组为模板进行PCR的扩增。引物如下：
MSTN-B-F：5′-CTATTTATGCTGCTTGTTGC-3′
MSTN-B-R：5′-CTATCTCCCAATCCTTCACC-3′
PCR反应总体系为50μL，预混Ex Taq 25μL，上、下游引物(100mmol·L-1)各2μL，基因组DNA 2μL，灭菌水19μL。PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃变性1min、50℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃10min，16℃30min。扩增片段大小为666bp，从羊基因组中扩增出含有gRNA1和gRNA2靶位点的片段，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并将目的片段进行胶回收并纯化，利用逐步降温退火的方法进行DNA杂交，杂交体系如下：DNA 30μL(120ng/μL)，10×La PCR BufferⅡ3μL，杂交条件见表1。
表1 DNA杂交条件
然后利用Surveyor突变检测试剂盒分别对gRNA1靶位点、gRNA2靶位点的效率进行检测，加样体系为：杂交DNA 20μl，0.15M MgCl2溶液3μl，SURVEYOR Enhancer S1μl，SURVEYOR NucleaseS 1μl，加样完毕后轻轻混匀，42℃酶切1h，加入1/10体积的终止溶液(Stop Solution)，用2％琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图2所示。确定gRNA2靶位点的酶切效率比gRNA1靶位点高，确定后续工作使用的靶位点为gRNA2，其对应的质粒RNA2-MSTN的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例4供体质粒hfat-1的构建
根据gRNA作用位点(gRNA2靶位点)构建含有外源基因hfat-1的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒。所述供体质粒中含有如下顺次连接的表达元件：根据gRNA2靶位点设计的羊MSTN基因5’同源臂—CAG启动子—人源化的脂肪酸去饱和酶hfat-1基因—ployA—根据gRNA2靶位点设计的羊MSTN基因3’同源臂。测序结果如SEQ ID NO:3所示，构建过程如下：
1、拟同源臂的获得
以阿尔巴斯绒山羊基因组为模板，与山羊MSTN基因序列进行比对，利用primer5软件在插入靶位点附近设计拟同源臂引物，通过PCR技术扩增大小为1768bp的拟5’上游同源臂和大小为2081bp的拟3’下游同源臂，1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增大小与预期的DNA片段大小一致，用thermo的胶回收试剂盒胶回收产物后连入PMD19-T，测序验证扩增的拟同源臂正确。扩增引物如下(5′-3′)：
N-5’h-F CCTTTATGACGGTGTTCC
N-5’h-R TGGCTGCTACTATCTCCC
N-3’h-F GAGAACAGCGAGCAGAAG
N-3’h-R GAACGCCTCCATGTCAAT
2、同源臂的获得
以拟上游同源臂为模板，设计含有Bglll和Mlul酶切位点的PCR引物，扩增大小为1019bp的5’上游同源臂，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带大小与预期结果一致，用Thermo胶回收试剂盒回收扩增出的上游同源臂，测序验证扩增的上游同源臂正确。用同样的方法扩增下游同源臂，下游同源臂含有Hindlll单酶切位点。然后将上、下游同源臂分别连入PMD-19T，测序鉴定所扩增的同源臂正确。所使用的引物如下(5′-3′)：
5’h-F CGCGGATCCtatgtgctaagaatttattca
5’h-R CGACGCGTccaaggagccgtcgctgctgt
3’h-F CCCAAGCTTttaccatgcccacggagtgtg
3’h-R CCCAAGCTTaagtgggtagcataaagccag
其中，大写字母为酶切位点。
3、供体质粒hfat-1的构建
将上游同源臂、下游同源臂通过相应的限制性内切酶连入含有CAG-hFat-1-Ploy的骨架载体，连接过程如下：
利用Thermo质粒小提试剂盒提取含有下游同源臂的质粒PMD-19T-Dh(即PMD-19-3’hT)和质粒pCAGDNA3-hFat-1(质粒pCAGDNA3-hFat-1见Han XJ,Liang H,Yun T,Zhao YH,Zhang ML,Zhao LH,Li RF and Li XL.Decreased expression of humanized Fat-1inporcine fetal fibroblasts following deletion of PGK-neomycin resistance.Genet.Mol.Res.2015Step,14(3):11594-11604，由内蒙古大学动物中心李雪玲老师惠赠)，用Hindlll同时酶切PMD-19T-Dh载体和pCAGDNA3-hFat-1骨架载体(注意酶切pCAGDNA3-hFat-1骨架载体时加入去磷酸化酶防止粘性末端自连)，用Thermo试剂盒胶回收PMD-19T-Dh载体上1000bp左右的小片段和pCAGDNA3-hFat-1骨架载体上8000bp左右的大片段，然后利用T4连接酶将下游同源臂连入骨架载体上获得pCAGDNA3-hFat-1-3’h重组质粒。连接体系为solutionI10μl，3’同源臂6μl，骨架载体4μl，反应条件为16℃过夜，连接后在大肠杆菌感受态细胞中进行转化，挑取单菌落摇菌，对pCAGDNA3-hFat-1-3’h重组质粒进行筛选和菌液PCR初步鉴定，然后进行测序，确定构建pCAGDNA3-hFat-1-3’h质粒成功。
将扩增好的上游同源臂连入pCAGDNA3-hFat-1-3’h骨架载体，首先用BglII和MluI对pCAGDNA3-hFat-1-3’h进行酶切，然后利用T4连接酶将含有BamHI(BamHI和BglII为同尾酶)和MluI酶切位点的上游同源臂连入pCAGDNA3-hFat-1-3’h骨架载体，构建好5’h-pCAGDNA3-hFat-1-3’h供体质粒，先用酶切初步确定连接正确，酶切结果如图3所示，然后进行测序，确定载体构建成功。供体质粒hfat-1的构建流程如图4所示。
实施例5单克隆细胞系的筛选
本实施例旨在筛选敲除MSTN基因且定点敲入hfat-1基因的单克隆细胞系。
首先将供体质粒hfat-1用BshTI和SgrDI双酶切使其线性化，将线性化的hfat-1载体、质粒hCas9、质粒RNA2-MSTN按比例转入羊胎儿成纤维细胞中，分别为质粒hCas9 4μg，线性化的hfat-1载体4μg，质粒RNA2-MSTN 2μg。然后利用电转法共同转入一代羊胎儿成纤维细胞，转染条件为225v/2.5ms。最后，将电转后的细胞接种于100mm培养皿中，培养48小时后用两种方法挑取单克隆细胞。方法一，将用胰酶消化起来的细胞利用流式细胞仪分选成单细胞，将单细胞接种于预先平衡后含有细胞培养液的96孔细胞培养板中。方法二，利用口吸管挑取单克隆细胞系，用玻璃管拉制成保证可以使单个细胞通过的合适直径口吸管，在显微镜下无菌操作，将单细胞分别接种于预先平衡后含有细胞培养液的96孔细胞培养板中，进行细胞培养。72h后换培养液一次；7天对形成单细胞克隆群的进行孔换液操作；在第10天时，在显微镜下观察，将汇合度较高的细胞克隆传代至24孔板的两个孔中培养，传代后24h内对细胞进行换液，当传代的细胞克隆汇合度达到90％以上时，用0.25％胰蛋白酶进行消化，将一孔的细胞加入1ml冻存液(0.1mL DMSO+0.9mL BI)冻存，另一孔细胞提取基因组。
实施例6单克隆细胞系的鉴定
1、总细胞的鉴定
将电转后的细胞接种于100mm培养皿中，一半用于单克隆细胞的挑取，另一半提取基因组，通过NCBI设计跨同源臂的引物鉴定是否存在敲除MSTN基因同时敲入hfat-1基因的细胞。反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，61.8℃退火30s，72℃延伸1min45s，32个循环；72℃10min，16℃30min，反应体系为：2×Gflex PCR Buffer(Mg2+,dNTP plus)12.5μl，上、下游引物各1μl，基因组DNA 1μl，Tks Gflex DNA聚合酶(1.25units/μl)0.5μl，用灭菌蒸馏水补充至25μl。使用GflexPCR酶进行聚合酶链式反应，扩增片段大小为1525bp，经鉴定，总的细胞中存在敲出MSTN基因同时敲入hfat-1基因的细胞，测序后，结果与预期一致。使用的引物如下(5′-3′)：
JC-KI-F TACCAGCACAGTAGTGAGAAGC
JC-KI-R GGGCTATGAACTAATGACCCCG
2、MSTN基因敲除细胞系的鉴定
将挑取的单克隆细胞系提取基因组后用MSTN-KO基因敲除引物进行检测，扩增大小为666bp，PCR扩增体系(50μl)为：预混Ex Taq25μL，上游引物MSTN-KO-F 2μL，下游引物MSTN-KO-R 2μl，基因组DNA 2μL，灭菌蒸馏水19μL。反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃10min，16℃30min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图5)，条带大小与预期结果相符合，然后将条带单一的片段纯化后测序，如果测序图谱中在CRISPR-Cas9作用位点附近出现双峰(图6)，则可以初步确定为碱基突变的阳性单克隆细胞系，然后与野生型对比确定为基因敲除细胞系。共成功获得156株单克隆细胞，MSTN基因敲除细胞系55株，其中通过同源重组修复的单克隆细胞系40株，通过非同源重组修复的细胞15株，既发生同源重组同时又发生非同源重组修复的单克隆细胞4株。使用的引物如下(5′-3′)：
MSTN-KO-F CTATTTATGCTGCTTGTTG
MSTN-KO-R CTATCTCCCAATCCTTCACC
3、hfat-1基因随机整合细胞系的鉴定
将挑取的单克隆细胞系提取基因组后，用SJ-KI引物进行鉴定，确定挑取的单克隆细胞中hfat-1基因随机整合的效率，扩增片段大小为837bp，反应条件：94℃预变性10min；94℃变性30s，温度梯度(57℃，58.5℃，60℃)退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃10min，16℃30min。反应体系(25μl)为：La Taq预混酶12.5μl，上、下游引物各1μl，模板DNA1μl，用灭菌水补充到25μl。用1％琼脂糖凝胶电泳检测，经电泳鉴定检测到156株单克隆细胞中有101个细胞为随机整合hfat-1基因的单克隆细胞系，从以上随机整合的单克隆细胞中随机取编号P001、P045、P161和P224的单克隆细胞的PCR产物进行测序，经过比对与预期结果相符。测序结果见SEQ ID NO:4，其中有4株单克隆细胞随机整合hfat-1基因的同时利用非同源重组修复敲除MSTN基因。使用的引物如下(5′-3′)：
SJ-KI-F TACCGAGGAGCCCAGGATAC
SJ-KI-R TGACCGTCCGTTATGTGGTG
4、MSTN基因敲除同时hfat-1基因定点整合细胞系的鉴定
将挑取的单克隆细胞系提取基因组后，利用使用TaKaRa公司的Tks Gflex DNA聚合酶进行跨同源臂的扩增，引物为JC-KI，反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，61.8℃退火30s，72℃延伸1min45s，32个循环；72℃10min，16℃30min。反应体系为：2×Gflex PCR Buffer(Mg2+,dNTP plus)12.5μl，上、下游引物各1μl，基因组DNA 1μl，TksGflex DNA聚合酶(1.25units/μl)0.5μl，用灭菌蒸馏水补充至25μl。扩增结束后，电泳检测条带大小为1525bp，与预期结果一致(图7)。经电泳检测，101株随机整合外源基因的单克隆细胞系中有40株定点整合的单克隆细胞，随机选取编号为P194、P195、P213、P163、P199、P164、P135、P011、P163、P109PCR产物进行测序，测序结果见SEQ ID NO:5，用NCBI BLAST比对序列正确。表明以上细胞为敲除MSTN基因并且定点整合外源hfat-1基因的转基因细胞系。
MSTN基因敲除同时hfat-1基因定点整合转基因细胞系的构建流程见图8。挑取的单克隆细胞鉴定结果汇总见图9。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (4)

1.CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其特征在于，其是根据羊的MSTN基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将优化的CRISPR-Cas9载体、上述构建的gRNA表达载体和线性化的供体质粒共同转入阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞中，获得羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞；
gRNA作用位点的DNA序列为5′-CGTTACGACGGAAACGGTCA-3′；
所述优化的CRISPR-Cas9载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述gRNA表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述供体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
用于鉴定羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞的引物如下：
JC-KI-F TACCAGCACAGTAGTGAGAAGC
JC-KI-R GGGCTATGAACTAATGACCCCG。
2.根据权利要求1所述方法获得的羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞。
3.权利要求1所述方法在生产羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的克隆羊中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以权利要求2所述羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞为核移植供体细胞，离体的羊卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得羊克隆胚胎，然后将克隆胚胎通过非手术法移入羊子宫内进行妊娠，获得转基因羊。
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