CN111662932B

CN111662932B - 一种提高CRISPR-Cas9基因编辑中同源重组修复效率的方法

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Publication number: CN111662932B
Application number: CN202010652378.5A
Authority: CN
Inventors: 俞家华; 丁伯洋; 刘芬菊; 张昊文
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2020-07-08
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2040-07-08
Also published as: CN111662932A

Abstract

本发明公开了一种提高CRISPR‑Cas9基因编辑中同源重组修复效率的方法，本发明的方法是在单链DNA模板的5′端修饰C6氨基，将5′端修饰C6氨基的单链DNA模板与CRISPR‑Cas9系统共转染细胞来提高基因编辑中同源重组修复效率。本发明采用5′端C6氨基修饰的单链DNA与CRISPR‑Cas9系统共转染细胞，能显著提高同源重组修复的效率，从而提高基因编辑的成功率。

Description

一种提高CRISPR-Cas9基因编辑中同源重组修复效率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高CRISPR-Cas9基因编辑中同源重组修复效率的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR/CRISPR-associated protein 9，CRISPR-Cas9)是目前最常用的基因编辑工具。CRISPR-Cas9系统在向导RNA(single guideRNA，sgRNA)的引导下在基因组特定位点进行剪切形成DNA双链断裂(double-strandbreak，DSB)，当存在与DSB两端有同源性的DNA模板的情况下，可发生同源重组(Homologousrecombination，HR)修复。通过设计同源性DNA模板中的序列，可以在DSB附近区域诱导点突变、插入片段、插入基因，从而达到基因编辑的目的。其中另外一种修复方式为非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)，不需要模板存在，修复之后会导致基因突变。

在基因编辑中常用的DNA模板种类有单链DNA、双链DNA、质粒等，其中单链DNA的合成最为方便。现有的通过不同的DNA模板来提高CRISPR-Cas9基因编辑中同源重组修复效率的技术方法主要有:

(1)增加模板同源性序列的长度，模板两端的同源性序列在1000bp以上时，可以比100bp的模板提升同源重组效率2-4倍。但缺点是合成长序列的模板难度高、效率低、成本高；

(2)硫代(phosphorothioate)修饰的模板可以提高模板的稳定性，提高同源重组效率。但缺点是硫代的模板转染细胞后存在毒性反应；

(3)将核定位序列连接到模板，可以促进模板向细胞核的转移，从而提高同源重组效率。但缺点是核定位序列为氨基酸序列，修饰过程难度高、损失大、成本高。

发明内容

为解决上述问题。本发明采用5′端C6氨基修饰的单链DNA与CRISPR-Cas9系统共转染细胞，能显著提高同源重组修复的效率，从而提高基因编辑的成功率。

本发明的第一个目的是提供一种提高CRISPR-Cas9基因编辑中同源重组修复效率的方法，所述方法是在单链DNA模板的5′端修饰C6氨基，将5′端修饰C6氨基的单链DNA模板与CRISPR-Cas9系统共转染细胞来提高基因编辑中同源重组修复效率。

进一步地，所述的基因编辑是利用基因编辑工具对染色体基因进行敲除、插入、突变及任意组合。

进一步地，所述的细胞为细菌、真菌、动植物细胞中的一种。

进一步地，所述的方法具体包括如下步骤：

S1、根据待编辑的目的基因的序列设计sgRNA序列；

S2、根据基因编辑的目的，设计同源性单链DNA模板；

S3、合成5′端C6氨基修饰的单链DNA模板；

S4、将CRISPR-Cas9系统和5′端C6氨基修饰的单链DNA模板转入细胞中，获取突变细胞。

进一步地，所述的单链DNA模板的DSB两端各有50～60bp的DNA序列。

进一步地，在S2步骤中，同源性单链DNA模板中存在插入片段和/或突变序列。

进一步地，将CRISPR-Cas9系统和单链DNA模板转入细胞的方法为脂质体转染法、电穿孔转染法或显微注射法。

本发明的第二个目的是提供一种用于基因编辑的试剂盒，包括CRISPR-Cas9系统以及5′端修饰C6氨基的单链DNA模板。

本发明的第三个目的是提供所述的方法在构建肝素结合表皮生长因子样生长因子点突变中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述的方法在在HEK293T细胞的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶第二外显子插入序列中的应用。

本发明的有益效果：

本发明采用5′端C6氨基修饰的单链DNA与CRISPR-Cas9系统共转染细胞，能显著提高同源重组修复的效率，从而提高基因编辑的成功率。

附图说明

图1为5′端C6氨基修饰分子结构；

图2为PCR扩增产物测序结果对比图；

图3为未修饰模板与5′端C6氨基修饰的单链DNA模板明显提高了片段的插入效率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实例中CRISPR-Cas9构建试剂盒购自唯尚立德生物技术有限公司，引物和修饰的单链DNA模板由生工生物工程(上海)股份有限合成，用蒸馏水配置成10μmol/L，转染试剂Lipofectamine 3000购自invitrogen上海公司，基因组DNA提取试剂盒与PCR用DNA聚合酶购自Takara公司，荧光定量PCR用SYBR Green购自天根生化科技(北京)公司。

实施例1：构建肝素结合表皮生长因子样生长因子点突变的HeLa细胞

(1)构建针对HBEGF基因的Cas9/gRNA质粒。按照gRNA设计原则设计HBEGF靶点引物，正向引物(SEQ ID NO.1)：AAACACCGTTCTCTCGG CACTGGTGAC，反向引物(SEQ ID NO.2)：CTCTAAAACCTGACCAGTGC CGAGAGAA，将引物退火形成二聚体，按照CRISPR-Cas9构建试剂盒的方法，将gRNA序列引物二聚体插入Cas9/gRNA质粒，转化感受态大肠杆菌，涂于氨苄抗性的平板，挑选3～5个单克隆摇菌，提取质粒进行测序并与设计的识别序列比对，获得测序正确的Cas9/gRNA质粒。

(2)合成5′端C6氨基修饰的单链DNA模板。获取Cas9/gRNA质粒打靶位置上下游各50bp的DNA序列(SEQ ID NO.3)：TGTCTGATGCGGCCTG GCCTCTCGCCCGCAGTTCTCTCGGCACTGGTGACTGGCGAGAGCCTGGAG CGGCTTCGGAGAGGGCTAGCTGCTGGAACCAGCA，将下划线部分的序列变为ACCGCC，这样使HBEGF的第23个氨基酸由甘氨酸变为丙氨酸。将序列提交给生工生物工程(上海)股份有限合成5′端C6氨基修饰的单链DNA模板。

(3)Cas9/gRNA质粒与模板共转染HeLa细胞。将HeLa细胞接种在6cm培养皿中，当细胞密度达到70％时，采用Lipofectamine 3000将5μg Cas9/gRNA质粒与10pmol单链DNA模板转染HeLa细胞。

(4)生成稳定突变细胞克隆。采用有限稀释法培养转染后的HeLa细胞，培养形成克隆后收集细胞。

(5)细胞突变位点的鉴定。挑选10个细胞克隆，采用基因组DNA提取试剂盒提取细胞的基因组，采用正向引物(SEQ ID NO.4)TGGGCGGGTGTC TGATG和负向引物(SEQ ID NO.5)CAGCTGGTCCGTGGATACAGT进行PCR扩增，PCR产物送测序公司测序，测序结果比对结果如图2所示，位点突变成功，与未修饰的单链DNA模板相比，采用5′端C6氨基修饰的单链DNA模板可使获得突变细胞的成功率显著提高。

实施例2：在HEK293T细胞的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶第二外显子插入序列

(1)构建针对HPRT基因的Cas9/gRNA质粒。按照gRNA设计原则设计HPRT靶点引物，正向引物(SEQ ID NO.6)：AAACACCGAAAGGGTGTTTA TTCCTCA，反向引物(SEQ ID NO.7)：CTCTAAAACTGAGGAATAAACAC CCTTT，将引物退火形成二聚体，按照CRISPR-Cas9构建试剂盒的方法，将g RNA序列引物二聚体插入Cas9/gRNA质粒，转化感受态大肠杆菌，涂于氨苄抗性的平板，挑选3～5个单克隆摇菌，提取质粒进行测序并与设计的识别序列比对，获得测序正确的Cas9/gRNA质粒。

(2)合成5′端C6氨基修饰的单链DNA模板。获取Cas9/gRNA质粒打靶位置上下游各50bp的DNA序列并将插入序列放置在中央形成DNA模板序列(SEQ ID NO.8)：CTAATCATTATGCTGAGGATTTGGGTTTAATTGAGTTGT CATATGTTAATAACGGTATACTAATTATGGACAGGTAAGTAAGATCTTAAAA TGAGGTTTTTTAC，其中下划线部分为插入序列，将序列提交给生工生物工程(上海)股份有限合成5′端C6氨基修饰、C12氨基修饰的单链DNA模板与未修饰的模板。

(3)将Cas9/gRNA质粒与模板共转染HEK293T细胞。将细胞接种在6cm培养皿中，当细胞密度达到70％时，采用Lipofectamine 3000将5μg Cas9/gRNA质粒与10pmol单链DNA模板或未修饰模板转染HEK293T细胞。

(4)插入序列进入基因组的效率检测。转染2天后采用基因组DNA提取试剂盒提取细胞的基因组，采用正向引物(SEQ ID NO.9)AGGTTATGACCT TGATTTATTTTGCA与负向引物(SEQ ID NO.10)AACAGCTGCTGATGTTT GAAATTAA扩增打靶区域作为内参，采用正向引物(SEQID NO.11)GAGT TGTCATATGTTAATAACGGTAT与负向引物(SEQ ID NO.12)AACAGCTGCTGATGTTTGAAATTAA扩增插入片段序列作为目的片段，采用荧光定量PCR检测插入序列的相对含量，结果如图3所示，与未修饰模板和5′端C12氨基修饰的单链DNA模板相比5′端C6氨基修饰的模板明显提高了片段的插入效率。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种提高CRISPR-Cas9基因编辑中同源重组修复效率的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

aaacaccgtt ctctcggcac tggtgac 27

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

ctctaaaacc tgaccagtgc cgagagaa 28

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

tgtctgatgc ggcctggcct ctcgcccgca gttctctcgg cactggtgac tggcgagagc 60

ctggagcggc ttcggagagg gctagctgct ggaaccagca 100

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

tgggcgggtg tctgatg 17

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

cagctggtcc gtggatacag t 21

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

aaacaccgaa agggtgttta ttcctca 27

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

ctctaaaact gaggaataaa cacccttt 28

<210> 8

<211> 104

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

ctaatcatta tgctgaggat ttgggtttaa ttgagttgtc atatgttaat aacggtatac 60

taattatgga caggtaagta agatcttaaa atgaggtttt ttac 104

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

aggttatgac cttgatttat tttgca 26

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

aacagctgct gatgtttgaa attaa 25

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 11

gagttgtcat atgttaataa cggtat 26

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 12

aacagctgct gatgtttgaa attaa 25

Claims

1.一种提高CRISPR-Cas9基因编辑中同源重组修复效率的方法，其特征在于，所述方法是在单链DNA模板的5′端修饰C6氨基，将5′端修饰C6氨基的单链DNA模板与CRISPR-Cas9系统共转染细胞来提高基因编辑中同源重组修复效率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因编辑是利用基因编辑工具对染色体基因进行敲除、插入、突变及任意组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞为细菌、真菌、动植物细胞中的一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法具体包括如下步骤：

S1、根据待编辑的目的基因的序列设计sgRNA序列；

S2、根据基因编辑的目的，设计同源性单链DNA模板；

S3、合成5′端C6氨基修饰的单链DNA模板；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在S2步骤中，同源性单链DNA模板中存在插入片段和/或突变序列。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将CRISPR-Cas9系统和单链DNA模板转入细胞的方法为脂质体转染法、电穿孔转染法或显微注射法。

7.一种用于基因编辑的试剂盒，其特征在于，包括CRISPR-Cas9系统以及5′端修饰C6氨基的单链DNA模板。

8.权利要求1～6任一项所述的方法在构建肝素结合表皮生长因子样生长因子点突变中的应用。

9.权利要求1～6任一项所述的方法在在HEK293T细胞的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶第二外显子插入序列中的应用。