CN105907758B - CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种CRISPR‑Cas9引导序列引物、转基因表达载体及其构建方法。该CRISPR‑Cas9引导序列sgRNA包括针对SIDT1基因的靶点位于E1外显子上的Target site‑1和针对SIDT1基因的靶点位于E2外显子上的Target site‑2；其中，Target site‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，Target site‑2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。该CRISPR‑Cas9转基因表达载体，所述表达载体包括在重组穿梭cas9工具质粒的BsmB I和Bbs I酶切位点连接有cas9引导序列Target site‑1和Target site‑2。本发明所述的重组穿梭cas9工具质粒能够快速的装配上针对基因组两个靶位点的引导序列进而包装成针对两个靶位点重组腺病毒载体，并且可单独完成对大片段基因组的编辑，不依赖于协同作用；且构建过程简单快捷，发挥基因组大片段编辑作用的效率高。

Description

CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建 方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种CRISPR-Cas9引导序列引物、转基因表达载体(尤其是一种基于复制缺陷型腺病毒的双启动子CRISPR-Cas9转基因载体)及其构建方法。
背景技术
基因组编辑可以通过DNA片段删除、染色体倒位、DNA片段插入等方式来实现，是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病治疗、病毒整合相关疾病的治疗以及动物模型的制作，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到限制。随着人工核酸内切酶(engineeredendonuclease，EEN)出现，将这一现状彻底改变。
第一代人工核酸内切酶是锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)。锌指蛋白是一类能够结合DNA的蛋白质，人类细胞的转录因子中大约有一半含有锌指结构，ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶FokⅠ融合形成的核酸内切酶[Kim Y G,Cha J,Chandrasegaran S.Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to FokⅠcleavage domain.Proc Natl Acad SciUSA,1996,93(3):1156-1160]，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。到目前为止，ZFN已经成功应用于黑长尾猴、大鼠、小鼠、中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海胆、家蚕、拟南芥、烟草、玉米、猪、牛、人类iPS细胞[Urnov F D,Rebar E J,Holmes M C,et al.Genome editing with engineered zincfinger nucleases.Nat Rev Genet,2010,11(9):636-646]。更令人振奋的是已经有用于治疗HIV的ZFN(破坏人CCR基因表达)药物进入二期临床试验[Perez E E,Wang J,Miller JC,et al.Establishment of HIV-1resistance in CD4+T cells by genome editingusing zinc-finger nucleases.Nat Biotechnol,2008,26(7):808-816]。但是，ZFN制备复杂，成本昂贵，而且其技术专利被少数几家商业公司控制，因此其应用受到限制。
很快，第二代人工核酸酶———类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nuclease，TALEN)的出现在很大程度上替代了ZFN。2009年，科学家将一种水稻的致病菌(Xanthamonas)编码的类转录激活因子效应物(transcriptionactivator-likeeffector，TALE)与DNA的碱基对应关系解密[Moscou M J,Bogdanove AJ.A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science,2009,326(5959):1501]。2010年，首次报道TALEN蛋白在酵母中应用成功[Li T,Huang S,Zhao X,etal.Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted geneknockout and gene replacement in eukaryotes.Nucleic acids Res,2011,39(14):6315-6325]，之后，在植物、人类细胞、小鼠、斑马鱼、猪、牛中得到迅速的应用[Joung J K,Sander J D.TALENs:a widely applicable technology for targeted genomeediting.Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(1):49-55]。TALEN相对于ZFN其构建较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐。
但是ZFN和TALEN对靶点的识别主要依赖于DNA结合蛋白对核酸的识别.ZFN中一个锌指蛋白(结构单元)识别三个碱基序列，而TALEN的一个RVD识别一个碱基，为了保证特异性，通常靶点长度在18-20bp.因此，在构建ZFN或是TALEN时需要根据靶点的序列来将锌指蛋白单元或是RVD排列组合起来，需拼接的片段多、操作繁琐、制备周期长、需要耗费大量的劳动和费用。并且耗费大量的劳动和费用完成的载体仅仅能针对一个识别位点进行基因编辑，如果要实现大片段的基因编辑，就必需要同时构建针对两个位点的载体，后续还需要将这些载体共同转入目的样本且依赖于协同作用才能完成特定位点的基因编辑，难度大、费用高、效率低、周期长。
来源于细菌的CRISPR-Cas9系统在真核细胞内也能很好的工作，这显示出了其巨大的应用潜力。例如在基础研究领域，CRISPR-Cas9系统可以快捷的用来构建基因定点突变、删除或者敲入的细胞系或者动物模型，从而有利于各物种基因的生物学功能研究。CRISPR-Cas9系统在商业领域的应用潜力也同样巨大。例如在生物治疗领域，结合诱导多能干细胞(iPS)技术，人们可以将通过基因编辑修复的iPS细胞重新发育为正常组织和器官来供病人使用。在畜牧业育种工作中，对一些影响性状基因进行编辑能够大大加快良种的育种速度。甚至可以利用病毒载体递送系统，用于艾滋病和宫颈癌等疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
本发明的第一目的在于提供一种CRISPR-Cas9引导序列sgRNA，所述sgRNA包括针对SIDT1基因(SID1transmembrane family member 1，Gene ID:54847，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54847)的靶点位于E1外显子上的Target site-1和针对SIDT1基因的靶点位于E2外显子上的Target site-2；其中，Target site-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，Target site-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明的第二目的在于提供一种针对上述CRISPR-Cas9引导序列sgRNA的引物，包括：
针对SIDT1基因的靶点位于E1外显子上的Target site-1(SEQ ID NO.8)的引物对：
Target site-1-F：SEQ ID NO.18；
Target site-1-R：SEQ ID NO.19；
以及针对SIDT1基因的靶点位于E2外显子上的Target site-2(SEQ ID NO.9)的引物对：
Target site-2-F：SEQ ID NO.20；
Target site-2-R：SEQ ID NO.21。
本发明的第三目的在于提供一种CRISPR-Cas9转基因表达载体，所述表达载体包括在重组穿梭cas9工具质粒的BsmB I和Bbs I酶切位点连接有cas9引导序列Target site-1(SEQ ID NO.8)和Target site-2(SEQ ID NO.9)。
进一步的，所述重组穿梭cas9工具质粒包括N端带有3flag标签、核定位信号NLS1、C端带有核定位信号NLS2的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)cas9基因编码序列，如SEQ ID NO.5所示的CMV启动子、如SEQ ID NO.6所示的人hU6启动子和如SEQ ID NO.7所示的人H1启动子；
其中，3flag标签的序列如SEQ ID NO.2所示；核定位信号NLS1的序列如SEQ IDNO.3所示；核定位信号NLS2的序列如SEQ ID NO.4所示；肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)cas9基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；CMV启动子、3flag标签、核定位信号NLS1、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)cas9基因编码序列以及核定位信号NLS2依次串联。
进一步的，所述质粒为腺病毒载体或慢病毒载体等。
进一步的，所述CRISPR-Cas9转基因表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
本发明的第四目的在于提供一种上述表达载体的构建方法，包括以下步骤：
a.将N端带有3flag标签(SEQ ID NO.2)、核定位信号NLS1(SEQ ID NO.3)、C端带有核定位信号NLS2(SEQ ID NO.4)的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)cas9基因编码序列(SEQ ID NO.1)，CMV启动子(SEQ ID NO.5)、人hU6启动子(SEQ ID NO.6)、人H1启动子(SEQ ID NO.7)，经过酶切、连接、重组反应克隆至腺病毒穿梭质粒psb50中，得到重组穿梭cas9工具质粒(命名为pAd-cas9-double basic)；
b.根据cas9引导序列的设计规则，设计针对SIDT1基因的靶点位于E1外显子上的Target site-1(SEQ ID NO.8)和位于E2外显子上的Target site-2(SEQ ID NO.9)；
c.将Target site-1(SEQ ID NO.8)的引物对(SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19)和Target site-2(SEQ ID NO.9)的引物对(SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21)通过酶切、连接反应克隆至pAd-cas9-double basic载体中，得到重组穿梭质粒(命名为pAVT12512)；
d.将得到的重组穿梭质粒pAVT12512与骨架质粒pBHG共同转染HEK293细胞，在HEK293细胞中进行特异位点重组，并且包装成重组腺病毒，收集细胞，得到细胞包装的重组腺病毒；
e.将得到的细胞包装的重组腺病毒采用氯化铯梯度离心法进行纯化，得到重组腺病毒载体(命名为AVT12512)。
进一步的，所述步骤(a)中的酶切采用Mlu I和Xba I限制性内切酶进行双酶切。
进一步的，所述步骤(c)中的酶切采用BsmB I和Bbs I限制性内切酶进行双酶切。
进一步的，所述步骤(c)中的连接采用T4DNA连接酶。
重组腺病毒载体系统(步骤d)由世翱(上海)生物医药科技有限公司提供，其制备方法参照以下文献所记载方法进行：Ng,P.,Parks,R.J.,Cummings,D.T.,Evelegh,C.M.,Sankar,U.,&Graham,F.L.(1999).A high efficiency Cre/loxP based system forconstruction of adenoviral vectors.Hum.Gene Ther.10,2667-2672.
本发明将肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)cas9编码序列、核定位信号NLS1,、核定位信号NLS2、3flag标签、CMV启动子、人hU6启动子、人H1启动子、Target site-1、Target site-2构建进入重组腺病毒载体，由CMV启动cas9基因表达。3flag标签位于cas9编码序列的N端，用于WB检测cas9表达。核定位信号NLS1位于3flag标签和cas9编码序列之间，核定位信号NLS2位于cas9编码序列C端，将表达的cas9蛋白质运送至细胞核内。人hU6启动子启动Target site-1表达，引导cas9蛋白至位点1进行切割。人H1启动子启动Targetsite-2表达，引导cas9蛋白至位点2进行切割。SIDT1的E1和E2外显子之间的间隔为33kb，被切除后E1和E2残余的部分外显子经细胞的自我修复后连接在一起，实现了大片段的DNA删除。
本公司采用AdV包装系统是无辅助病毒包装系统，通过Cre/loxP系统，在HEK293细胞中，将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染HEK293细胞，产生重组腺病毒。重组后的腺病毒载体缺失了E1基因，在正常细胞内无法复制，缺失了E3基因降低了免疫原性，且重组腺病毒载体不整合到靶细胞基因组，无插入突变，无致癌性，对人无致病、致畸、致癌的潜在危害。
本发明涉及含肽的医药配置品，具体涉及含肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)cas9基因序列、核定位信号NLS1,、核定位信号NLS2、3flag标签序列、人hU6启动子、人H1启动子、cas9基因的引导序列sgRNA的重组腺病毒载体构建方法，该方法得到的重组载体可以实现细胞内的基因大片段编辑。
本发明提供的CRISPR/Cas9系统全称是clustered regularly interspacedshort palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效[Mussolino C,Cathomen T.RNA guides genome engineering.Nat Biotechnol,2013,31(3):208-209]。
针对ZFN和TALEN操作繁琐、制备周期长的缺点，该系统是一个由核酸和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，它对靶点的识别依赖于核酸对核酸的识别，通过碱基的互补配对完成。改变一个识别位点只需要在原有载体的基础上替换20～30bp的核苷酸，相当于合成一对引物，构建过程相对于ZFN和TALEN非常简单、快捷，适合规模化、高通量的组装。
针对大片段基因编辑依赖于双载体协同作用且效率低下的缺点，该系统将两个真核生物三型启动子构建在同一个载体上，分别同时表达两个位点的引导序列，可高效实现对基因组大片段的有效编辑。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所述的重组腺病毒载体系统，只需要更换Target site-1和Target site-2的序列，即可完成对基因组任意位点的大片段编辑重组腺病毒载体的构建，而传统的ZFN(Bibikova,M.,Golic,M.,Golic,K.G.&Carroll,D.Targeted chromosomal cleavage andmutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.Genetics 161,1169–1175(2002).)和TALEN(Claudio M,Robert M,Fabienne L,Nadine D,Thomas L and Toni C.Anovel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity incombination with low toxicity.)则需要将针对靶位点的诸多模块通过复杂的构建过程拼接起来，且针对两个靶位点则需要构建四个重组穿梭质粒，如果需要实现基因组的大片段编辑，则需要四个重组载体的协调作用，这给实际应用带来极大的不便。
而本发明所述的重组穿梭cas9工具质粒pAd-cas9-double basic能够快速的装配上针对基因组两个靶位点的引导序列进而包装成针对两个靶位点重组腺病毒载体，并且可单独完成对大片段基因组的编辑，不依赖于协同作用。可见，本发明所述的重组腺病毒载体的优势是构建过程简单快捷，发挥基因组大片段编辑作用的效率高。
附图说明
图1是本发明CRISPR-Cas9转基因表达载体的构建流程图；其中，(A)是重组穿梭cas9工具质粒的结构示意图，(B)是重组穿梭质粒的结构示意图，(C)是骨架质粒的结构示意图。
图2是重组穿梭cas9工具质粒pAd-cas9-double basic的酶切预测及酶切琼脂糖凝胶电泳图；其中，图2A是重组穿梭cas9工具质粒pAd-cas9-double basic的酶切预测图，其中lane1是1kb DNA ladder Marker：条带从上倒下依次为：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、3.5Kb、3Kb、2.5kb、2Kb、1.5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp，lane2是pAd-cas9-double basic的Bgl II酶切预测：条带从上倒下依次为：8283bp、937bp；图2B是重组穿梭cas9工具质粒pAd-cas9-double basic的酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中lane1是pAd-cas9-double basic的Bgl II酶切电泳结果，lane2是1kb DNA ladder Marker的电泳结果。
图3是重组穿梭质粒pAVT12512两个位点的测序结果，其中，图3A是Target site-1；图3B是Target site-2。
图4是腺病毒AVT12512滴度的检测图片。
图5是mRNA相对表达量的柱状图，RT-QPCR结果表明cas9在HEK293T细胞内高效转录。
图6为cas9蛋白表达量的WB检测图，结果表明cas9在HEK293T细胞内高效表达；其中，图6A中的lane1为HEK293T空细胞，lane2为对照病毒MOCK，lane3为AVT12512；图6B是GAPDH内参条带。
图7是包含SIDT1的部分基因组；其中，图7A显示的E1和E2之间相距33kb；图7B为Target site-1(深色标记)位于E1外显子正义链上；图7C为Target site-2(深色标记)位于E2外显子反义链上。
图8是SIDT1基因的外显子E1和外显子E2之间发生基因组大片段删除后的预测结果；其中，图8A为删除后的示意图，图8B为E1和E2剩余的序列拼接在一起的序列图。
图9是基因鉴定结果；其中，M为DL2000marker，从上到下条带依次为2kb、1Kb、750bp、500bp、250bp、100bp，lane1-lane5为挑取的单克隆编号，lane6是野生型HEK293T作为对照；
图9A使用SIDT1-T1-genotyping-F(SEQ ID NO.26)/SIDT1-T1-genotyping-R(SEQID NO.27)进行PCR检测外显子E1的敲除情况，野生型条带为517bp，敲除型条带为0bp；
图9B使用SIDT1-T2-genotyping-F(SEQ ID NO.28)/SIDT1-T2-genotyping-R(SEQID NO.29)进行PCR检测外显子E2的敲除情况，野生型条带为688bp，敲除型条带为0bp；
图9C使用SIDT1-T1-genotyping-F(SEQ ID NO.26)/SIDT1-T2-genotyping-R(SEQID NO.29)进行PCR检测E1和E2的敲除情况，野生型条带为34kb，敲除型条带为626bp。
图10是SIDT1基因组大片段删除纯化克隆的测序结果比对情况，正向引物和反向引物的测序结果与预测结果相比，实现了基因组33kb的大片段删除。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 构建重组腺病毒载体
一、材料
1、重组腺病毒骨架质粒pBHG、腺病毒穿梭质粒psb50、HEK293细胞、同源重组酶由世翱(上海)生物医药科技有限公司提供；
2、引物：根据引物设计原则设计扩增DNA片段和靶位点所需的引物，该引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，具体为：
Cas9-F：5’-GTCAGATCCGCTAGCGCCACCATGGACTATAAGGACCACGACG-3’(SEQ IDNO.10)
Cas9-R：5’-TTGCTCGAAGTCGACTCATTTCTTTTTCTTAGCTTGACC-3’(SEQ ID NO.11)
CMV-F：5’-GCTTGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAAC-3’(SEQ ID NO.12)
CMV-R：5’-CATGGTGGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCACTAAACCA-3’(SEQ ID NO.13)
hU6-F：5’-AGCTCTAGACTCGAGAAGGTCGGGCAGGAAGAGG-3’(SEQ ID NO.14)
hU6-R：5’-TTCAGCTCCCTATAACTATTAATAACTAATGCATGGCGGT-3’(SEQ ID NO.15)
hH1-F：5’-ATTAGTTATTAATAGTTATAGGGAGCTGAAGGGAAGG-3’(SEQ ID NO.16)
hH1-R：5’-TATCCACGCGGCCGCCTAATGGATCCAAGCTTCAAAA-3’(SEQ ID NO.17)
Target site-1-F：5’-ACACCGGCACCCGGCGAAATCCCCCG-3’(SEQ ID NO.18)
Target site-1-R：5’-AAAACGGGGGATTTCGCCGGGTGCCG-3’(SEQ ID NO.19)
Target site-2-F：5’-TTTCCCGGCGAACCACAACAAGGACCGT-3’(SEQ ID NO.20)
Target site-2-R：5’-TAAAACGGTCCTTGTTGTGGTTCGCCGG-3’(SEQ ID NO.21)
Cas9-QPCR-F：5’-GACGATAAGATGGCCCCAA-3’(SEQ ID NO.22)
Cas9-QPCR-R：5’-TGCTCGGCACCTTGTACTCGT-3’(SEQ ID NO.23)
Actin-QPCR-F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’(SEQ ID NO.24)
Actin-QPCR-R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(SEQ ID NO.25)
SIDT1-T1-genotyping-F：5’-GCGGCAGCATCAGTATTTGAT-3’(SEQ ID NO.26)
SIDT1-T1-genotyping-R：5’-TCCCCGAAGTCTCCCAAGGT-3’(SEQ ID NO.27)
SIDT1-T2-genotyping-F：5’-GGCAGGTTGGATTTAGGCATCA-3’(SEQ ID NO.28)
SIDT1-T2-genotyping-R：5’-GTTGACCCAGTACCCCAAAGCTA-3’(SEQ ID NO.29)
3、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示的DNA序列由上海捷瑞生物工程有限公司，并克隆至pUC57载体中保存；
4、工具酶Mlu I、Xba I、BsmB I、Bbs I、T4DNA连接酶均购自NEB公司；
5、高保真酶PrimeSTAR购自Takara公司
6、3flag抗体购自abcam公司
7、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自MN公司；
8、感受态细胞TOP10购自tiangen公司；
9、NP40、CsCl、Tris、HCl、MgCl2、EDTA Na2、蔗糖、透析袋均购自上海生工；
10、FBS、DMEM购自invitrogen公司；
11、anti-Hexon抗体购自santa cruz公司；
12、辣根过氧化物酶标记的二抗、DAB工作液均购自北京中杉金桥；
13、ECL+plusTM Western blotting system购自Amersham公司。
二、重组腺病毒载体AVT12512的构建方法。
参见图1，本发明所述重组腺病毒载体的构建方法如下：
1、将3flag-NLS1-cas9-NLS2、CMV、hU6、hH1片段克隆至腺病毒穿梭质粒，得到重组穿梭cas9工具质粒pAd-cas9-double basic。
(1)将腺病毒穿梭质粒psb50使用Mlu I和Xba I限制性内切酶进行双酶切，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认3401bp的片段V1，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。
(2)用引物Cas9-F和Cas9-R以合成的SEQ ID NO.1为模板，使用表1中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃4min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认4346bp的片段a，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。
试剂 体积(μl)
H2O 32.5
5×Buffer(with Mg2+) 10
dNTP(各2.5mM) 4
Primer1(+)(10uM) 1
Primer2(－)(10uM) 1
Template 1
PrimeSTAR 0.5
表1
(3)用引物CMV-F和CMV-R以合成的SEQ ID NO.5为模板，使用表1中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃1min)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认655bp的片段b，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。
(4)用引物hU6-F和hU6-R以合成的SEQ ID NO.6为模板，使用表1中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认294bp的片段c，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。
(5)用引物hH1-F和hH1-R以合成的SEQ ID NO.7为模板，使用表1中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认404bp的片段d，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。
(6)将DNA片段V1、a、b、c、d以5ul总体积且摩尔比1:1:1:1:1的比例加入Eppendorf管内，加入同源重组酶反应液15ul，混匀后在42℃孵育30分钟，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50ul TOP10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μlLB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100ul的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。
(7)挑取克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆即为重组穿梭cas9工具质粒pAd-cas9-double basic，对正确的克隆进行酶切鉴定(见图2)。
2、构建包含SIDT1基因的靶点位于E1外显子上Target site-1(SEQ ID NO.8)和位于E2外显子上的Target site-2(SEQ ID NO.9)的重组穿梭质粒pAVT12512。
(1)将重组穿梭cas9工具质粒pAd-cas9-double basic使用BsmB I和Bbs I限制性内切酶进行双酶切，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认8540bp的片段V2和508bp的片段e，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。
(2)用引物Target site-1-F和Target site-1-R分别用双蒸水配制成浓度20μM，各取30μl混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5分钟，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段f。
(3)用引物Target site-2-F和Target site-2-R分别用双蒸水配制成浓度20μM，各取30μl混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5分钟，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段g。
(4)将DNA片段V2、e、f、g，以17ul总体积且摩尔比1:3:3:3的比例加入Eppendorf管内，加入10×T4DNA ligase Buffer 2ul和1ul T4DNA ligase，混匀后在16℃孵育16小时，将反应液加入50ul TOP10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100ul的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。
(5)挑取克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆即为重组穿梭质粒pAVT12512，对正确的克隆进行测序鉴定(见图3)。
靶点的筛选是通过美国麻省理工学院Broad研究所的张锋实验室开发(http:// crispr.mit.edu/)在线工具进行设计。然后针对设计出的靶点对于脱靶效应进行评估，该软件仅包含人、小鼠和大鼠等15个物种基因组供脱靶效应评估，其考察脱靶位点碱基错配数，允许≤4个碱基错配；PAM类型除了“NGG”外，还有“NAG”，并进一步考察脱靶位点是否位于其他基因外显子等。软件将依据特定公式对每个脱靶位点评分，再采用脱靶位点结合反向似然法(Inverse likelihood of off target binding)，计算每条sgRNA的总得分。最后，按照分数高低对sgRNA进行排序，并用红、绿和黄3种颜色标示sgRNA特异性高低。其中绿色表示特异性高，总得分大于50的sgRNA；黄色表示特异性为中等水平的sgRNA；而红色表示该sgRNA可能存在较高脱靶风险，应避免使用。
3、重组腺病毒载体AVT12512的包装。
(1)从液氮罐中取出冻存的HEK293细胞，迅速转移到37℃水浴中，1～2min后转移到超净台中，无菌操作将冻存管中的液体全部转移至10cm2dish中，补足含10％FBS的DMEM至8mL/10cm2dish，24h后显微镜观察细胞，细胞汇合的程度大于80％进行传代。
(2)选择细胞状态良好、无污染的HEK293细胞，使用细胞传代的方式，均匀铺与六孔板中，保证每孔细胞量相同，应该达到3.6×106个，隔天细胞长到90％以上开始转染。
(3)转染前一小时取出6孔板，去除原有细胞培养基，加入1.5ml的DMEM培养基，将细胞送回培养箱。
(4)将pAVT12512和pBHG按照摩尔比1:2加入到含有250μl的DMEM培养基的1.5mlEppendorf管中，轻轻混匀。
(5)将10μl PEI溶液加入到含有250μl的DMEM培养基的1.5ml Eppendorf管中，轻轻混匀，静止5min。
(6)将PEI-DMEM滴加到pAVT12512-pBHG-DMEM溶液中，边加边轻轻混匀后在室温孵育20分钟，使DNA和PEI充分结合形成稳定的转染复合体。取出细胞培养板，将上面得到的复合体加入到细胞培养器皿中，做好标记，放回培养箱。
(7)6h后吸去培养基，加入2mL新鲜生长培养基放入37℃培养箱培养，大概7-10天左右出现病毒空斑。收集细胞，-80℃与37℃反复冻融3次，12000rpm离心10min，弃细胞碎片，收集上清，得到重组腺病毒原液。
4、重组腺病毒载体AVT12512的扩增与纯化。
(1)将HEK293细胞铺于20-30个10cm dish，待细胞长至95％以上，最好是100％，每块板加入100ul重组腺病毒原液，感染细胞。2-3天后，HEK293细胞全部病变后，每块板中加入约500μl 10％Nonidet P 40(NP40)以裂解细胞。
(2)收集细胞裂解物，12000rpm离心10min，弃细胞碎片，收集上清。加入病毒沉淀液，加入的量为：每100ml上清加入50ml，冰上放置1-4h以沉淀病毒。
(3)12000rpm离心上述混合物10min，弃上清，将沉淀物悬浮在相应量的，密度为1.10g/ml的CsCl溶液中(溶剂为20mM Tris-HCl，pH 8.0)。
(4)4℃7000rpm离心5min，收集病毒悬浮液。
(5)在Beckman超速离心管中加入2.5ml的1.40g/ml CsCl溶液。再加入2.5ml1.30g/ml的CsCl溶液。
(6)最后加入病毒悬浮液5ml。23000rpm，4℃离心2.5h。
(7)收集密度在1.30-1.40g/ml之间的病毒条带。
(8)病毒放于透析袋中(透析袋使用前用EDTA Na2煮沸10min)。
(9)而后放在透析缓冲液(50g蔗糖，10ml pH为8.0的Tris-HCl液，2ml MgCl2溶液定容至1000ml)中，4℃透析过夜，中间更换透析液一次。收集得到重组腺病毒AVT12512病毒，于-80℃保存。
三、重组腺病毒载体AVT12512的滴度测定。
(1)选取状态良好的HEK293T细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成5×105个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入500μl细胞，37℃、5％CO2培养1小时。
(2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品【准备7个无菌的Ep管，在第一个Ep管中加入990μl的完全培养液，其余的6个管子中各加入900μl的完全培养液；待测病毒液的稀释：取10μl腺病毒原液加入990μl的Ep管中做1:100稀释(10-2)；然后以此为起点，再取100μl稀释液加入到900μl的Ep管中做1:10稀释(10-3)，直至稀释到10-8】，然后依次将10-5至10-8稀释的病毒液加入24孔板中，每孔加入100μl，每一稀释度占用一个孔。
(3)37℃、5％CO2感染48小时。
(4)轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇0.5ml，-20℃固定20min(枪头不要接触到细胞)。
(5)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min(切忌将细胞冲起)。
(6)加入0.2ml1％BSA的PBS37℃封闭1小时。
(7)加入0.2ml的1×anti-Hexon抗体溶液至每个孔中，37℃孵育1小时。
(8)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
(9)加入0.2ml的1×辣根过氧化物酶标记的二抗至每孔，37℃孵育1小时。
(10)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
(11)加入0.2ml新配置的1×DAB工作液至每孔，室温孵育5-10min(孵育时间不要超过10min)。
(12)弃DAB，使用PBS清洗2次，每孔加入1mlPBS。
(13)每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10×物镜下计算阳性细胞个数。
(14)计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度。
(15)计算显微镜下视野中阳性细胞的平均个数。选择一个梯度，此梯度视野中有5-50个阳性细胞，随机选择至少5个区域计数。
(16)计算24孔板中每孔视野的个数。
(17)按公式Viral Titer(IFU)＝平均每视野阳性细胞数*每孔视野数*稀释倍数/0.1ml，本次滴度为6*79*107/0.1＝4.74*1010(IFU/ml)。
(18)滴度结果如图4所示。
根据不同稀释倍数的视野下阳性细胞数，选取10-7为最佳稀释倍数，该稀释倍数下随机选取5个视野的阳性细胞平均数为6，代入如下公式中，可得病毒滴度结果。(参考文献：1.Bewig,B.,and W.E.Schmidt(2000)Accelerated titering ofadenoviruses.BioTechniques 28:870-873.)
Figure BDA0000993001150000091
四、重组腺病毒载体AVT12512的鉴定。
1、采用本发明构建包装重组腺病毒载体AVT12512是否成功有以下两种鉴定方法：
(1)重组腺病毒载体AVT12512感染HEK293T细胞后，收集细胞采用RT-PCR进行cas9mRNA转录水平的检测，验证cas9基因的表达，如果cas9mRNA转录水平增高，则说明重组腺病毒载体构建成功。
(2)重组腺病毒载体AVT12512感染HEK293T细胞后，收集细胞采用western blot进行cas9蛋白表达水平的检测，验证cas9基因的表达，如果cas9蛋白表达水平增高，则进一步说明重组腺病毒载体构建成功。
(3)具体步骤：于6孔板中每孔铺2*105个HEK293T细胞,分别将MOI＝150的AVT12512和对照病毒MOCK感染细胞，48h后提取6孔板中细胞的总RNA和总蛋白分别进行荧光定量PCR实验和免疫印迹实验。
(4)Trizol法提取6孔板中细胞的总RNA，逆转录扩增cDNA,用QPCR引物(序列为SEQID NO.22---SEQ ID NO.25)进行荧光定量PCR实验，反应体系见表2，以内参Actin为对照组，验证其mRNA的转录情况。
试剂 体积(μl)
SYBR premix ex taq: 10μl
ROX Reverse Dye(50x) 0.4ul
上游引物(2.5μM)： 0.5μl
下游引物(2.5μM)： 0.5μl
cDNA 1.0μl
ddH2O 7.6μl
表2
(5)蛋白免疫印迹(Western Blot)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将从HEK293T中提取的总蛋白质按相对分子质量分离。采用湿转(4℃，400mA，120min)，将蛋白转移到PVDF膜上。用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h，封闭液1:3000稀释3flag抗体，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10min。封闭液1:2000稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2h，TBST洗膜3次，每次10min。采用Amersham公司ECL+plusTMWestern blotting system试剂盒进行显色。X光显影获得显示条带的胶片。
2、鉴定结果：
(1)酶切后可见8283bp、937bp条带(见图2)，测序结果也和目的靶点序列一致(见图3)，表明重组穿梭质粒pAVT12512已经构建成功。
(2)RT-QPCR检测显示，AVT12512感染HEK293T后的cas9的表达水平比对照病毒MOCK和空细胞有明显升高(见表3和图5)，初步证明该重组腺病毒表达系统正确。
Figure BDA0000993001150000092
表3
(3)蛋白免疫印迹(Western Blot)的结果表明，cas9蛋白在重组腺病毒系统中表达(见图6)，进一步验证了重组腺病毒AVT12512表达成功，即本发明所述的一种重组腺病毒载体AVT12512已经成功建立。
实施例2 重组腺病毒载体AVT12512的大片段基因编辑效果实验
一：作用对象
HEK293T细胞
二：实验方法
1、本发明所述的重组腺病毒载体AVT12512对HEK293T细胞的基因组大片段编辑作用。
(1)将HEK293T细胞株从液氮中取出，在10cm dish中复苏，将细胞状态调整到正常生长状态，提供细胞汇合度不超过80％的细胞。
(2)于感染前一天，利用胰蛋白酶消化HEK293T细胞，重悬细胞并计数，将细胞接种于6孔板中，5％CO2、37℃培养。感染前细胞调整至融合度40-50％；
(3)按照MOI＝80确定加入重组腺病毒载体AVT12512，感染时混合病毒用基本培养基(无血清)，同时加入6-8ug/ml的polybrene，病毒感染24h后细胞换液。
(4)将病毒感染48h左右的细胞消化离心并计数后调节细胞悬液密度为3×105个cell/ml，按梯度稀释法将细胞悬液接种于96孔板中，每孔加入100ul培养基，平均每孔约为0.5-1个cell(细胞加入96孔板过程中需反复轻柔混匀细胞悬液，以保证细胞均匀分布)，将铺好的96孔板置于37℃，5％CO2培养条件下培养。
(5)倒置显微镜下观察细胞，挑选出单个聚集的细胞克隆，排除两个以上及细胞群分散的细胞克隆，由于细胞生长不一致，每日观察细胞挑选出目的细胞克隆，并继续培养至细胞密度60％左右。
(6)待96孔板中细胞密度长至60％左右消化收集细胞并传入24孔板中培养；待24孔板单克隆细胞长至70-80％左右，消化细胞并传入6cm dish中继续扩大培养；待6cm dish中细胞密度达到70-80％左右消化细胞并传入10cm dish中继续扩大培养。
(7)将扩大培养后的单克隆提取基因组后进行PCR鉴定，阳性克隆送测序，同时冻存已筛选好的单克隆细胞。
三：实验结果
1、SIDT1的部分基因组如图7A所示，外显子E1和外显子E2相距33kb，Target site-1位于E1外显子正义链上，Target site-2位于E2外显子反义链上。
2、重组腺病毒载体AVT12512对SIDT1基因组的E1外显子和E2外显子进行大片段删除后的预测结果(图8A)，E1和E2剩余的序列拼接在一起(图8B)。
3、PCR鉴定重组腺病毒载体AVT12512对SIDT1基因组的大片段敲除情况。
(1)使用SIDT1-T1-genotyping-F(SEQ ID NO.26)/SIDT1-T1-genotyping-R(SEQID NO.27)进行PCR检测外显子E1的敲除情况，野生型条带为517bp，敲除型条带为0bp。(图9A)
(2)使用SIDT1-T2-genotyping-F(SEQ ID NO.28)/SIDT1-T2-genotyping-R(SEQID NO.29)
进行PCR检测外显子E2的敲除情况，野生型条带为688bp，敲除型条带为0bp。(图9B)
(3)使用SIDT1-T1-genotyping-F(SEQ ID NO.26)/SIDT1-T2-genotyping-R(SEQID NO.29)
进行PCR检测E1和E2的敲除情况，野生型条带为34kb，敲除型条带为626bp。(图9C)
两条染色体均敲除的纯合克隆鉴定结果应为(1)结果为0bp，(2)结果为0bp，(3)结果为626bp，根据图9A的结果，选取2号克隆送测序鉴定。
4、SIDT1基因组大片段删除纯化克隆的测序比对结果如图10所示，实现了基因组33kb的大片段删除。正向引物和反向引物的测序结果与预测结果相比，有5个碱基的缺失，这是由于基因组断裂后，细胞内会以非同源重组末端修复的方式来修复断裂部位，不同克隆的修复形成的末端会有部分碱基的差别。
5、如图9所示，AVT12512感染后，随机筛选5个单克隆，其中2号克隆为双染色体基因敲除的纯合克隆，3号5号克隆为单染色体基因敲除的杂合克隆，1号4号为未敲除克隆。所以一个为纯合的大片段敲除阳性克隆，计算双敲成功率为20％。那么同理ZFN和TALEN一个载体在细胞内发挥作用的概率也为20％，那么要达到大片段删除的效果(不考虑递送效率等因素)，需要四个载体协同作用，即20％4＝0.16％，可见重组腺病毒双启动子CRISPR-Cas9载体的大片段删除效果要远远高于ZFN和TALEN。
6、本发明所述重组腺病毒载体AVT12512成功的在HEK293T细胞内实现了基因组大片段删除，此外还可以通过此种方法实现染色体倒位模型的建立，配合Donor片段实现DNA片段插入，因此本发明所述的载体在基因编辑领域拥有广阔的应用前景。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Figure IDA0000993001230000011
Figure IDA0000993001230000021
Figure IDA0000993001230000031
Figure IDA0000993001230000041
Figure IDA0000993001230000051
Figure IDA0000993001230000061
Figure IDA0000993001230000071
Figure IDA0000993001230000081
Figure IDA0000993001230000091
Figure IDA0000993001230000101
Figure IDA0000993001230000111
Figure IDA0000993001230000121

Claims (7)

1.一种CRISPR-Cas9转基因表达载体，所述表达载体包括在重组穿梭cas9腺病毒载体的BsmB I和Bbs I酶切位点连接有cas9引导序列Target site-1和Target site-2；Targetsite-1为针对SIDT1基因的靶点，位于E1外显子上，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；Target site-2位于E2外显子上，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，
所述重组穿梭cas9腺病毒载体包括N端带有3flag标签、核定位信号NLS1、C端带有核定位信号NLS2的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)cas9基因编码序列，如SEQ IDNO.5所示的CMV启动子、如SEQ ID NO.6所示的人hU6启动子和如SEQ ID NO.7所示的人H1启动子；
其中，3flag标签的序列如SEQ ID NO.2所示；核定位信号NLS1的序列如SEQ ID NO.3所示；核定位信号NLS2的序列如SEQ ID NO.4所示；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)cas9基因编码序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9转基因表达载体，其特征在于：
针对SIDT1基因的靶点位于E1外显子上的Target site-1的引物对：
Target site-1-F：如SEQ ID NO.18所示；
Target site-1-R：如SEQ ID NO.19所示；
以及针对SIDT1基因的靶点位于E2外显子上的Target site-2的引物对：
Target site-2-F：如SEQ ID NO.20所示；
Target site-2-R：如SEQ ID NO.21所示。
3.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9转基因表达载体，其特征在于：所述CRISPR-Cas9转基因表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
4.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9转基因表达载体的构建方法，包括以下步骤：
a.将N端带有如SEQ ID NO.2所示的3flag标签、如SEQ ID NO.3所示的核定位信号NLS1、C端带有如SEQ ID NO.4所示的核定位信号NLS2的如SEQ ID NO.1所示的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)cas9基因编码序列，如SEQ ID NO.5所示的CMV启动子、如SEQID NO.6所示的人hU6启动子、如SEQ ID NO.7所示的人H1启动子，经过酶切、连接、重组反应克隆至腺病毒穿梭质粒psb50中，得到重组穿梭cas9工具质粒；
b.根据cas9引导序列的设计规则，设计针对SIDT1基因的靶点位于E1外显子上的Target site-1和位于E2外显子上的Target site-2；
c.将Target site-1的引物对和Target site-2的引物对通过酶切、连接反应克隆至pAd-cas9-double basic载体中，得到重组穿梭质粒；
d.将得到的重组穿梭质粒与骨架质粒pBHG共同转染HEK293细胞，在HEK293细胞中进行特异位点重组，并且包装成重组腺病毒，收集细胞，得到细胞包装的重组腺病毒；
e.将得到的细胞包装的重组腺病毒采用氯化铯梯度离心法进行纯化，得到重组腺病毒载体。
5.根据权利要求4所述的一种CRISPR-Cas9转基因表达载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(a)中的酶切采用Mlu I和Xba I限制性内切酶进行双酶切。
6.根据权利要求4所述的一种CRISPR-Cas9转基因表达载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(c)中的酶切采用BsmB I和Bbs I限制性内切酶进行双酶切。
7.根据权利要求4所述的一种CRISPR-Cas9转基因表达载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(c)中的连接采用T4 DNA连接酶。
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