CN108359712B - 一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法 - Google Patents
一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法 Download PDFInfo
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- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
Abstract
本发明公开了一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法，该方法基于SgRNA靶向DNA序列框架，设计多条SgRNA靶向引物；然后以SgRNA载体为模板，通过PCR的方法获得hU6启动子序列+靶向SgRNA序列的DNA片段；接着将其转染到稳定表达Cas9细胞中，48小时后提取基因组；再通过PCR扩增获得含SgRNA靶点的基因组DNA片段，经双向测序分析，从而筛选SgRNA靶向DNA序列切割活性位点。本发明的筛选方法极大地缩短了筛选基因靶点时间，并降低了Crispr‑Cas9系统的操作难度，具有操作性强、重复性好、成功率高、使用简单方便、可流程化操作等优点，适合试剂盒的研发。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法。
背景技术
近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术已成为功能基因组学研究的有力工具。可以实现对动物和细胞模型进行基因的精准编辑，以更好地研究基因功能。该系统相比于传统的基因编辑系统，其操作容易和敲除效率高，已日趋广泛和成熟地被应用于基因编辑的研究中。
CRISPR-Cas9系统是新生代基因编辑技术，其本质是细菌中一种对付诸如病毒等外来DNA的防御系统。此系统的工作原理是成簇的、规律间隔的短回文重复序列的crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。通过人工设计这两种RNA，形成具有引导作用的sgRNA(short guide RNA)，可实现Cas9对DNA的定点切割，从而达到精确编辑DNA和核苷酸序列的目的。因此，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术可以筛选高效可靠的基因编辑靶点。
CRISPR-Cas9系统应用前，先将细胞系稳定过表达Cas9蛋白，然后转入具有指引切割作用sgRNA，sgRNA靶向切割的活性位点，需要进行筛选，在很多情况下，存在脱靶效应，导致试验失败，成为应用此系统最重要和耗时的一步。
现有的SgRNA靶向DNA序列的筛选方法从头合成sgRNA序列或者构建稳转载体，再进行转基因的操作，时间周期长，操作繁琐，检测位点数量有限。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法，可应用于Crispr-Cas9基因编辑技术靶点筛选。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法，包括以下步骤：
(1).分别以pLVX-hU6-SgRNA载体为模板，SEQ ID No:1～2，以及SEQ IDNo:3～4为引物，进行PCR扩增，得到模板DNA-1和模板DNA-2；
(2).以GAAAGGACGAAACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC作为SgRNA靶向DNA序列框架，设计n条SgRNA靶向引物；以模板DNA-1和模板DNA-2作为模板，以SEQ ID No:1和SEQ ID No:4为引物，分别与所述n条SgRNA靶向引物进行PCR扩增，得到n个SgRNA片段；
(3).将步骤(2)获得的n个SgRNA片段混合，细胞转染稳定表达Cas9猪滋养层细胞，提取基因组作为模板，分别以引物SEQ ID No:14～15、SEQ ID No:16～17以及SEQ ID No:18～19进行PCR扩增，获得三条含n个SgRNA靶点的DNA片段；
(4).分别以引物SEQ ID No:14～15、SEQ ID No:16～17以及SEQ ID No:18～19作为测序引物，对步骤(3)的3条DNA片段进行双向测序分析，再通过使用软件SeqMan进行分析，根据结果是否出现套峰来判断靶点的可靠性，从而筛选SgRNA靶向DNA序列。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述细胞转染的步骤为：
a.将稳定表达Cas9猪滋养层细胞以1×105密度接种到6培养板上，待细胞达到70～85％的融合；
b.取200μL Opti-MEM培养基稀释4μL
3000，静置5min；再取200μLOpti-MEM培养基稀释2μg的n个量比1:1的SgRNA片段，静置5min；然后将两个溶液混合静置10min；
c.随后将上述溶液添加到去除培养液的步骤a的细胞中，轻轻混匀，放入培养箱中，次日全量换液，培养48h。
在其中一些实施例中，步骤(1)～(3)中所述PCR扩增的反应程序为：预变性95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，循环35个；最后总延伸72℃7min。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述PCR扩增的反应体系为：2×PrimeStarBuffer/Premix 25μL；上游引物F1.5μL；下游引物R1.5μL；模板2μL和ddH2O 20μL。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：2×PrimeStarBuffer/Premix 25μL；SEQ ID No:1引物1.5μL，SgRNA靶向引物0.5μL，SEQ IDNo:4引物1.5μL，模板DNA-12μL，模板DNA-22μL和ddH2O 17.5μL。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述PCR扩增的反应体系为：2×PrimeStarBuffer/Premix 25μL；上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，基因组模板2μL和ddH2O20μL。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述SgRNA靶向引物针对三个以上基因。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述SgRNA靶向引物针对Aqp3、Aqp11、以及Slc7a2三个基因。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的SgRNA特异性DNA靶向序列的筛选方法通过利用设计特定引物和重叠PCR的方法可以快速扩增出含有特定基因靶点的SgRNA序列，不需要进行分子克隆构建SgRNA载体，再通过常规的DNA转基因技术将SgRNAs转入稳定表达Cas9的细胞系中，经过48h后检测分析SgRNA的活性，判断具有切割活性的靶点，就可以做出基因靶点可靠性评价，一般最快3～4天就可以完成对设计的3个基因的3个基因编辑靶点筛选工作，极大的缩短了筛选基因靶点的时间，操作性强、重复性高、成功率高、降低了Crispr-Cas9系统的操作难度、操作简单，并且同时可以进行多基因多个靶点的筛选，大大提高靶点筛选的效率，同时也极大的节约了试验费用，更容易操作和推广，适合试剂盒的研发。
附图说明
图1为本发明的一种快速高效SgRNA靶向DNA序列的筛选方法的技术路线图；
图2为本发明实施例1中获得的通用模板DNA-1和模板DNA-2的电泳图；
图3为本发明实施例1中获得的SgRNAs片段的电泳图；其中，泳道1-3为Aqp3三个靶点SgRNA片段、泳道4-6为Aqp11三个靶点SgRNA片段、泳道7-9为Slc7a2三个靶点SgRNA片段；
图4为本发明实施例1中SgRNA片段细胞转染稳定表达Cas9猪滋养层细胞的步骤图，其中A和B为稳定高水平表达Cas9猪滋养层细胞系的白光图及电泳检测图；C为靶点检测引物设计模式图；D为扩增含三个靶点的DNA片段的电泳图；
图5为本发明实施例1中靶点测序分析，其中，A为Aqp3三个SgRNA靶点分析结果；B为Aqp11三个SgRNA靶点分析结果；C为Slc7a2三个SgRNA靶点分析结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。
实施例1一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法
请参阅图1，为本发明的一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法的技术路线图，包括以下步骤：
1、通过PCR方法获取通用模板DNA-1和2
以pLVX-hU6-SgRNA载体(购自Addgene)为模板，以试验检测设计的通用引物1F和1R、以及通用引物2F和2R进行通用PCR扩增。
扩增引物为：
1F：CTTTGGCGCCGGCTCGAGTGTACA(SEQ ID No:1)；
1R：CGGTGTTTCGTCCTTTCC(SEQ ID No:2)；
2F：GTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(SEQ ID No:3)；
2R：CACCGGTTAGCGCTAGCTAATGCC(SEQ ID No:4)
通用PCR程序为：预变性95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，循环35个；最后总延伸72℃7min；4℃∞保存。
通用PCR体系(50μL)为：2×PrimeStar Buffer/Premix 25μL；上游引物F1.5μL；下游引物R1.5μL；模板2μL和ddH2O 20μL。
扩增获得通用模板DNA-1和DNA-2片段，片段长度分别为337bp和134bp(结果如图2所示)，胶回收后保存备用。
2、SgRNA靶向引物的设计和PCR程序的优化
首先设计SgRNA靶向引物，设计框架为：GAAAGGACGAAACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC，将预测靶点序列20bp套入以上设计框架的N序列中即可，可以同时合成多个SgRNA靶向引物，进行筛选，批量设计的SgRNA靶向引物如表1所示，共设计9条SgRNA引物，针对三个基因各三个位点。
表1批量设计SgRNA靶向引物表
采用以下PCR体系(50μL)：2×PrimeStarBuffer/Premix 25μL；通用引物1F(SEQID No:1)1.5μL，SgRNA靶向引物0.5μL，通用引物2R(SEQ ID No:4)1.5μL，模板DNA-12μL，模板DNA-22μL和ddH2O 17.5μL；
采用通用PCR程序为：预变性95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，循环35个；最后总延伸72℃7min；4℃∞保存。
扩增SgRNA片段长度为491bp，电泳结果如图3所示，说明Aqp3三个靶点、Aqp11三个靶点、Slc7a27三个靶点均扩增出SgRNA片段。胶回收后准备转入细胞。
3、SgRNA片段细胞转染稳定表达Cas9猪滋养层细胞
稳定高水平表达Cas9猪滋养层细胞系(如图4A和4B)可以较容易地转入外源DNA片段，成为猪基因组编辑应用的一个理想的细胞工具(申请号为201610087909.4，专利名称为：一种条件性诱导Cas9表达的猪滋养层细胞系的建立方法)。将稳定高水平表达Cas9猪滋养层细胞以1×105密度接种到6培养板上。待细胞达到70～85％的融合；分别使用200μLOpti-MEM培养基(Gibco)稀释4μL
3000(静置5min)；然后再取200μLOpti-MEM培养基稀释2μg的9个SgRNAs混合片段(量比1:1，静置5min)；然后将两个溶液混合静置10min。随后将溶液添加到去除培养液的细胞中，轻轻混匀，放入培养箱中，次日全量换液，48h后提取基因组，通过根据模式图(如图4C)设计的引物Slc7a2，Aqp11和Aqp3(如表2所示)分别进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系均为：2×PrimeStar Buffer/Premix 25μL；引物1F1.5μL，引物2R 1.5μL；基因组DNA模板2μL，和ddH2O 20μL。
PCR扩增的反应程序均为：预变性95℃3min；循环35个，采取95℃30s；60℃30s；72℃40s；最后总延伸72℃7min；4℃∞。
表2靶点检测引物表
PCR扩增得到含三个靶点的DNA片段，长度分别为675bp，489bp和433bp(如图4D)，其中包含三个基因三个靶点，接下来进行靶点活性测序分析。
4、扩增片段进行测序分析
将表2靶点检测引物作为测序引物，对上述扩增含有三个靶点的DNA片段进行双向测序分析(由测序公司完成，次日提供ABI文件)，然后通过使用软件SeqMan进行分析，根据结果是否出现套峰来判断靶点的可靠性；对Aqp3、Aqp11和Slc7a2等三个DNA片段进行分析。
结果显示：Aqp3的三个靶点出现脱靶，无切割活性(如图5A)；Aqp11三个靶点出现了高活性的切割位点，根据双向切割情况，确定为156～176bp的靶序列具有切割活性，另外两个位点只有单向切割，并且无起始，故无切割活性(如图5B)；Slc7a2三个靶点也存在切割活性靶点，但活性不高等问题，结果不明显，但可以确定具有切割活性的位点为214～234之间的位点，需要进一步深入验证。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省农业科学院农业生物基因研究中心
<120> 一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法
<130> 19
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ctttggcgcc ggctcgagtg taca 24
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cggtgtttcg tcctttcc 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gttttagagc tagaaatagc a 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
caccggttag cgctagctaa tgcc 24
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gaaaggacga aacaccggct gagcacgacc tgtgccagtt ttagagctag aaatagc 57
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gaaaggacga aacaccggga aaccaccatg agtgcccgtt ttagagctag aaatagc 57
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gaaaggacga aacaccggcc ggcaacaagg atacccagtt ttagagctag aaatagc 57
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gaaaggacga aacaccggga acctccagca atccgtggtt ttagagctag aaatagc 57
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gaaaggacga aacaccgccg ctgagatagg tggaatggtt ttagagctag aaatagc 57
<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
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<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gaaaggacga aacaccgagt gttgcaagag catggaggtt ttagagctag aaatagc 57
<210> 12
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<212> DNA
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gaaaggacga aacaccgact gaccaatctg tttgttagtt ttagagctag aaatagc 57
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<212> DNA
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gaaaggacga aacaccgtac ttcaaaatga attacacgtt ttagagctag aaatagc 57
<210> 14
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gcttctcatc ctcctgtctc c 21
<210> 15
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cgcctaaggt tctaagtatc aaattc 26
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gcccacgctt tcgtcttg 18
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<212> DNA
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atagaccaaa aaggtgatga gtgc 24
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agttacctgg tttcacagtt atggac 26
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
acttggaggc aatgctggg 19
Claims (8)
1.一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1).分别以pLVX-hU6-SgRNA载体为模板，SEQ ID No:1～2以及SEQ ID No:3～4为引物，进行PCR扩增，得到模板DNA-1和模板DNA-2；
(2).以GAAAGGACGAAACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC作为SgRNA靶向DNA序列框架，设计n条SgRNA靶向引物；以模板DNA-1和模板DNA-2作为模板，以SEQ IDNo:1和SEQ ID No:4为引物，分别与所述n条SgRNA靶向引物进行PCR扩增，得到n个SgRNA片段；所述n为大于3的整数；
(3).将步骤(2)获得的n个SgRNA片段混合，细胞转染稳定表达Cas9猪滋养层细胞，提取基因组作为模板，分别以引物SEQ ID No:14～15、SEQ ID No:16～17以及SEQ ID No:18～19进行PCR扩增，获得三个含n个SgRNA靶点的DNA片段；
(4).分别以引物SEQ ID No:14～15、SEQ ID No:16～17以及SEQ ID No:18～19作为测序引物，对步骤(3)的3个DNA片段进行双向测序分析，再通过使用软件SeqMan进行分析，根据结果是否出现套峰来判断靶点的可靠性，从而筛选SgRNA靶向DNA序列。
2.根据权利要求1所述的快速高效SgRNA靶向DNA序列的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中所述细胞转染的步骤为：
a.将稳定表达Cas9猪滋养层细胞以1×105密度接种到6培养板上，待细胞达到70～85％的融合；
b.取200μL Opti-MEM培养基稀释4μL
3000，静置5min；再取200μLOpti-MEM培养基稀释2μg的n个量比1:1的SgRNA片段，静置5min；然后将两个溶液混合静置10min；
c.随后将上述溶液添加到去除培养液的步骤a的细胞中，轻轻混匀，放入培养箱中，次日全量换液，培养48h。
3.根据权利要求1任一项所述的快速高效SgRNA靶向DNA序列的筛选方法，其特征在于，步骤(1)～(3)中所述PCR扩增的反应程序为：预变性95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，循环35个；最后总延伸72℃7min。
4.根据权利要求1任一项所述的快速高效SgRNA靶向DNA序列的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增的反应体系为：2×PrimeStar Buffer/Premix 25μL；上游引物F1.5μL；下游引物R1.5μL；模板2μL和ddH2O 20μL；
所述模板DNA-1对应的上游引物F为SEQ ID No:1，下游引物R为SEQ ID No:2；
所述模板DNA-2对应的上游引物F为SEQ ID No:3，下游引物R为SEQ ID No:4。
5.根据权利要求1任一项所述的快速高效SgRNA靶向DNA序列的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：2×PrimeStar Buffer/Premix 25μL；SEQ ID No:1引物1.5μL，SgRNA靶向引物0.5μL，SEQ ID No:4引物1.5μL，模板DNA-12μL，模板DNA-22μL和ddH2O 17.5μL。
6.根据权利要求1任一项所述的快速高效SgRNA靶向DNA序列的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增的反应体系为：2×PrimeStar Buffer/Premix 25μL；上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，基因组模板2μL和ddH2O 20μL；
所述上游引物为SEQ ID No:14、SEQ ID No:16、SEQ ID No:18；
所述下游引物与上游引物相对应，分别为SEQ ID No:15、SEQ ID No:17、SEQ ID No:19。
7.根据权利要求1任一项所述的快速高效SgRNA靶向DNA序列的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述SgRNA靶向引物针对三个以上基因。
8.根据权利要求7所述的快速高效SgRNA靶向DNA序列的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述SgRNA靶向引物针对Aqp3、Aqp11以及Slc7a2三个基因。
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Application publication date: 20180803 Assignee: Zhanjiang shenghang Environmental Protection Technology Co.,Ltd. Assignor: AGRO-BIOLOGICAL GENE RESEARCH CENTER, GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2023980032246 Denomination of invention: A rapid and efficient method for screening SgRNA-targeted DNA sequences Granted publication date: 20200626 License type: Common License Record date: 20230216 |
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