CN113528633A - 一种快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，包括如下步骤：S1、基于靶标区间设计载体通用引物，扩增，构建文库，送高通量测序，得到测序数据；S2、对步骤S1中得到的测序数据进行质控；S3、对步骤S2中得到的质控后的数据进行两端reads的拼接，获得长序列数据；S4、根据靶标区间前后的载体序列是已知、并且相同的特点，对步骤S3中获得的长序列数据进行分析，然后将靶标区间序列提取出来，进行统计分析，从而可以获得靶标的构建情况；该方法快速精准、成本低廉，可以多样品混合测序，鉴定成千上万个基因编辑载体，只需要1G的数据量即可以满足分析需求，因此，在植物、动物或微生物载体构建中的应用领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法及应用。
背景技术
基因组编辑技术是对基因组进行改造及研究基因功能的一种有效方法，但在基因组编辑技术未被发现之前，人们只能通过同源重组的方式对基因组进行定向修饰，但是这种方式过度依赖自然重组，效率极低，不能够满足人类日益发展的科研需求。在此情况下，基因编辑技术应运而生。在近几年中，人工核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)技术的兴起使得基因编辑技术变得简单可行，现常用的EEN技术主要为锌指核酸酶(zincfinger nuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)和相关基因(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR/Cas9)。目前，ZFN和TALEN技术已经成功地运用于动植物的基因修饰研究，CRISPR/Cas9是最近出现的新基因修饰技术，因其具有靶位点设计简单、基因打靶效率高等优点，具有十分广阔的应用情景。
目前，基因组编辑技术被广泛应用于研究生物学研究的各个领域，其中CRISPR/Cas9系统因为其操作简单、打靶效率高和低成本的特点，成为当下最热门的基因组编辑系统。整个CRISPR/Cas9系统包含3个部分：Cas9蛋白、sgRNA骨架和sgRNA，其中人为的只需要设计不同的sgRNA靶标序列即可以精准的打靶不同的功能基因，研究基因的功能。因此，可以针对不同功能基因，大批量设计不同的sgRNA，构建不同的CRISPR/Cas9基因编辑载体，则可以进行全基因组的精准打靶敲除，可以在全基因组范围内进行基因的功能研究。近年来，在动植物中已经构建了许多突变体库，如在水稻中，有研究团队设计了88541条sgRNA靶向了34234个水稻功能基因，制备了水稻的功能基因突变体库，对于水稻的分子育种和功能研究有着重大意义。但是，大量的构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，需要进行测序分析，采用一代测序技术，价格成本高昂，难以大规模的使用。
因此，有必要开发一种完整的实验方法和分析流程，可以低成本高效快速的鉴定大批量CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法及应用。解决现有的大量的构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，需要进行测序分析，采用一代测序技术，价格成本高昂，难以大规模的使用等问题。
本发明的一个目的在于提供一种快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法。
一种快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，包括如下步骤：
S1、基于靶标区间设计载体通用引物，扩增，构建文库，送高通量测序，得到测序数据；
S2、对步骤S1中得到的测序数据进行质控；
S3、对步骤S2中得到的质控后的数据进行两端reads的拼接，获得长序列数据；
S4、根据靶标区间前后的载体序列是已知、并且相同的特点，对步骤S3中获得的长序列数据进行分析，然后将靶标区间序列提取出来，进行统计分析，从而可以获得靶标的构建情况。
进一步地，步骤S4中，将靶标区间序列提取出来的方法如下：
S41、靶标前后端序列识别：选取靶标前后端的序列长度在18～30bp之间，采用完全匹配形式定位到靶标前后的序列位置上；
S42、标记的添加：分别在步骤S41中识别到的靶标前后端序列上添加一段标记字符，使靶标带上独特的标记；
S43、提取靶标序列：根据步骤S42中的标记字符，提取出靶标序列，并完成统计计数。
更进一步地，步骤S43中，统计计数的方法如下：对靶标序列进行序列的计数，然后将相同的靶标序列去除重复并统计，最后获得靶标的构建情况。
进一步地，步骤S1中，所述高通量测序选择PE150测序方法，扩增片段大小在180～280bp以内，靶标序列处在中间位置，而且左右两端测序数据覆盖靶标区间重叠区间大于5bp，所述PE150测序方法基于Illumina测序平台。
进一步地，步骤S1中，所述构建文库采用的是多重PCR建库模式，在载体通用引物上添加一个15～18bp的搭桥序列，所述载体通用引物中的正向引物5’端的搭桥序列如SEQID NO.1所示，所述载体通用引物中的反向引物5’端的搭桥序列如SEQ ID NO.2所示，然后进行第一轮PCR扩增反应，扩增出特异性片段；接着分别使用barcode引物和测序接头引物进行第二轮PCR扩增反应，从而构建出文库。
更进一步地，所述barcode引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述barcode引物用于样品的拆分，N代表任意碱基，一般设计大小为6～8bp；所述测序接头引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
更进一步地，所述barcode引物序列可以为一个或多个。
本发明中，当只鉴定一个基因编辑载体文库，只需要设计一种barcode序列；当需要鉴定多个基因编辑载体文库，或使用农杆菌混转多个基因编辑载体进入植物，鉴定每棵转基因植株所含sgRNA的时候，则可以设计多个不同的barcode序列，方便后续拆分以区别不同的编辑载体文库和转基因植株。
进一步地，步骤S2中，所述质控的方法具体如下：去除质量值小于30的reads，去除含有“N”碱基数量大于10％的reads，剔除只含有测序接头的reads。
进一步地，步骤S3中，质控后的数据进行两端reads的拼接方法如下：根据左右两端测序数据覆盖靶标区间重叠区间大于5bp，对2条reads的重叠区间进行序列的拼接，从而获得长序列数据。
本发明的另一个目的在于提供一种快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法的应用。
上述所述的快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法在植物、动物或微生物载体构建中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)快速精准：1G的二代测序数据，分析过程1分钟就可以给出分析报告，无需人工统计；
2)成本低廉：可以多样品混合测序，鉴定成千上万个基因编辑载体，只需要1G的数据量即可以满足分析需求，因此，本发明快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法在植物、动物或微生物载体构建中的应用领域具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法流程图；
图2为本发明中将靶标区间序列提取出来的方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所使用的其他试剂和设备，如无特殊说明，均可市售获得。
实施例1
以下实施例选取了100个构建完成的CRISPR/Cas9基因编辑载体，进行等比例混合后，形成基因编辑载体文库，具体操作过程如下：
1.1引物设计
依据载体序列，设计扩增的载体通用引物序列，分别如下所示：
ZT-F：5’-ggagtgagtaccgtgagcTGGACGACAACAAAGACTAG-3’；
ZT-R：5’-ggaatgcatgctgcatgcTGCCACTTTTTCAAGTTGAT-3’；
上述载体通用引物序列中的小写字母为搭桥序列(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，大写字母为载体通用扩增引物(需要说明的是，可以依据不同的基因编辑载体设计不同的载体通用引物序列)，本实施例按照PE150的测序方法，设计的正向引物和反向引物距离靶标位置距离为80bp。
1.2构建测序文库
基于多重PCR扩增技术，完成测序文库的制备，第一轮PCR使用ZT-F和ZT-R引物，扩增出含有sgRNA靶标序列的载体片段，模板使用均匀混合的基因编辑载体文库，PCR体系如下表1.1所示：
表1.1 PCR扩增体系
以第一轮的PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，扩增体系和扩增程序如下表1.2所示：
表1.2 PCR扩增体系
其中，反应体系中的引物如下表1.3所示：
表1.3反应体系中的引物
PCR扩增完成后，电泳检测，送高通量测序，测序数据量为1G。
1.3测序数据的处理
获得测序数据后，进行数据的质控，使用高通量测序质控软件Fastp，对数据进行质控处理，质控要求：碱基质量值为30及以上，否则去除reads；去除包含有超过10％的“N”碱基的reads以及剔除只含有测序接头的reads；接下来进行序列拼接，使用FLASH软件对两端测序数据进行拼接，形成长序列数据。
1.4载体构建情况的分析
基于步骤1.3中获得的长序列数据，以及本实施例使用靶标前后的载体序列是已知、并且相同的特点，撰写了PERL脚本，首先对靶标前后端序列识别：选取靶标前后端的序列长度在18～30bp之间，采用完全匹配形式定位到靶标前后的序列位置上；然后进行标记的添加：分别在上述识别到的靶标前后端序列上添加一段标记字符，使靶标带上独特的标记；最后提取靶标序列：根据上述的标记字符，提取出靶标序列，并完成统计计数；获得如表1.4所示的结果(部分展示)，表中包含reads数和sgRNA序列，其中，reads数为测序获得的sgRNA的测序量，从表中可以清楚知道哪些sgRNA载体构建成功和具体每个sgRNA编辑载体的测序数量。
表1.4载体构建情况的分析结果表(部分展示)
实施例2
将100个已经构建成功的CRISPR/Cas9基因编辑载体文库，混转进入农杆菌，培养2～3天后，再将农杆菌刮取，重悬所有农杆菌，对水稻愈伤组织进行侵染。经过组培后，获得大量再生的阳性组培苗，按照PCR96孔板的排布进行编号：A1-H12。
2.1引物设计
依据载体序列，与实施例1中的引物设计方法一样。
2.2基因组提取
将再生的阳性组培苗，取叶片1～2cm的叶片大小，放入96深孔板中，每孔加入50μL0.2M的KOH溶液和1～2粒研磨珠，在室温下，将2mL的离心管分别转移到全自动磨样机的适配器中，运行30～60秒，待缓冲液变绿即可；然后使用排枪分别吸取1μL的上清液于96孔PCR板中，作为PCR的模板。
2.3构建测序文库
基于多重PCR扩增技术，完成测序文库的制备，第一轮PCR使用ZT-F和ZT-R引物，扩增出含有sgRNA靶标序列的载体片段，PCR体系如下表2.1所示：
表2.1 PCR扩增体系
以第一轮的PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，扩增体系和扩增程序如下表2.2所示：
表2.2 PCR扩增体系
其中，反应体系中的引物如实施例1中表1.3所示：
PCR扩增完成后，电泳检测，送高通量测序，测序数据量在1G，另外可以添加不同的barcode序列进行样品区分，barcode序列可以自行任意设计，一般大小为6～8bp。
2.4测序数据的处理
获得测序数据后，进行数据的质控，使用高通量测序质控软件Fastp，对数据进行质控处理，质控要求：碱基质量值为30及以上，否则去除reads；去除包含有超过10％的“N”碱基的reads以及剔除只含有测序接头的reads；根据barcode序列拆分不同样品的测序数据，然后再进行序列拼接，使用FLASH软件对两端测序数据进行拼接，形成长序列数据。
2.5载体构建情况的分析
基于步骤2.3中获得的长序列数据，以及本实施例使用靶标前后的载体序列是已知、并且相同的特点，撰写了PERL脚本，首先对靶标前后端序列识别：选取靶标前后端的序列长度在18～30bp之间，采用完全匹配形式定位到靶标前后的序列位置上；然后进行标记的添加：分别在上述识别到的靶标前后端序列上添加一段标记字符，使靶标带上独特的标记；最后提取靶标序列：根据上述的标记字符，提取出靶标序列，并完成统计计数；获得如表2.3所示的结果(部分展示)，表中包含孔号、sgRNA个数、reads数和sgRNA序列；因为是混转，可能有阳性苗中会插入多个sgRNA的情况，从表中的结果可以清楚知道，每个阳性苗含有那些sgRNA，能够为构建突变体库的检测工作，带来极大的便利。
表2.3载体构建情况的分析结果表(部分展示)
| 孔号 | sgRNA个数 | reads数 | sgRNA序列 |
| A01 | 1 | 560 | TGATCTGCAGCTTGAGCTCG |
| A02 | 1 | 845 | GAACTCCAGCTCGTCGTCGT |
| A03 | 1 | 81336 | AGCTCGAGTTGATGACGAGC |
| A05 | 1 | 86900 | GCGAGTGGGCAACGAGCGGT |
| A06 | 1 | 1046 | GTTTGGGATGGTGGAGGACG |
| A06 | 2 | 66296 | GCGCGACGAAAGATCCCGAT |
| A06 | 3 | 772 | CGATCGCACGTCCCAACCCT |
| A07 | 1 | 82382 | CGATCGCACGTCCCAACCCT |
| A08 | 1 | 68484 | GAACTCCAGCTCGTCGTCGT |
| A10 | 1 | 63759 | TTCAACCTCCTCCTCCAACG |
| A10 | 2 | 73416 | TGTATCACCAACATCAGGGT |
| A11 | 1 | 46887 | ATCCACCCGGGAATCTCCCG |
| A12 | 1 | 68421 | CGCCTGGGCTGATCCACCAC |
| B01 | 1 | 73861 | CGCCTGGGCTGATCCACCAC |
| B02 | 1 | 53342 | GCGCGACGAAAGATCCCGAT |
| B04 | 1 | 1385 | GTTTGGGATGGTGGAGGACG |
| B05 | 1 | 68901 | GGAGGACGCGTCCCTGCTCC |
| B06 | 1 | 56470 | GGATGGTGCTGTTCGAGGGC |
| B07 | 1 | 79815 | CGCCGCCGGTAGTCATCGAC |
| B08 | 1 | 59932 | GGATGGTGCTGTTCGAGGGC |
以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北伯远合成生物科技有限公司
<120> 一种快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagtgagta ccgtgagc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaatgcatg ctgcatgc 18
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnngga gtgagtaccg tgagc 55
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnngg aatgcatgct gcatgc 56
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<212> DNA
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg acacagtaca ctctttccct acacgac 57
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agataggtgt tggtgactgg agttcagacg tgtgctctt 59
Claims (10)
1.一种快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、基于靶标区间设计载体通用引物，扩增，构建文库，送高通量测序，得到测序数据；
S2、对步骤S1中得到的测序数据进行质控；
S3、对步骤S2中得到的质控后的数据进行两端reads的拼接，获得长序列数据；
S4、根据靶标区间前后的载体序列是已知、并且相同的特点，对步骤S3中获得的长序列数据进行分析，然后将靶标区间序列提取出来，进行统计分析，从而可以获得靶标的构建情况。
2.如权利要求1所述的快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，其特征在于，步骤S4中，将靶标区间序列提取出来的方法如下：
S41、靶标前后端序列识别：选取靶标前后端的序列长度在18～30bp之间，采用完全匹配形式定位到靶标前后的序列位置上；
S42、标记的添加：分别在步骤S41中识别到的靶标前后端序列上添加一段标记字符，使靶标带上独特的标记；
S43、提取靶标序列：根据步骤S42中的标记字符，提取出靶标序列，并完成统计计数。
3.如权利要求2所述的快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，其特征在于，步骤S43中，统计计数的方法如下：对靶标序列进行序列的计数，然后将相同的靶标序列去除重复并统计，最后获得靶标的构建情况。
4.如权利要求1所述的快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，其特征在于，步骤S1中，所述高通量测序选择PE150测序方法，扩增片段大小在180～280bp以内，靶标序列处在中间位置，而且左右两端测序数据覆盖靶标区间重叠区间大于5bp，所述PE150测序方法基于Illumina测序平台。
5.如权利要求1所述的快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，其特征在于，步骤S1中，所述构建文库采用的是多重PCR建库模式，在载体通用引物上添加一个15～18bp的搭桥序列，所述载体通用引物中的正向引物5’端的搭桥序列如SEQ ID NO.1所示，所述载体通用引物中的反向引物5’端的搭桥序列如SEQ ID NO.2所示，然后进行第一轮PCR扩增反应，扩增出特异性片段；接着分别使用barcode引物和测序接头引物进行第二轮PCR扩增反应，从而构建出文库。
6.如权利要求5所述的快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，其特征在于，所述barcode引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述barcode引物用于样品的拆分，N代表任意碱基，一般设计大小为6～8bp；所述测序接头引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
7.如权利要求5所述的快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，其特征在于，所述barcode引物序列可以为一个或多个。
8.如权利要求1所述的快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，其特征在于，步骤S2中，所述质控的方法具体如下：去除质量值小于30的reads，去除含有“N”碱基数量大于10％的reads，剔除只含有测序接头的reads。
9.如权利要求4所述的快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法，其特征在于，步骤S3中，质控后的数据进行两端reads的拼接方法如下：根据左右两端测序数据覆盖靶标区间重叠区间大于5bp，对2条reads的重叠区间进行序列的拼接，从而获得长序列数据。
10.权利要求1～9任一项所述的快速分析CRISPR/Cas9基因编辑载体构建情况的方法在植物、动物或微生物载体构建中的应用。
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