CN108192990A - 与西瓜果皮底色相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

与西瓜果皮底色相关的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记及其应用。SNP位点位于西瓜基因组第4号染色体第48456位核苷酸。SNP分子标记能够用于鉴定西瓜果皮底色，具有较高的准确率。利用该SNP分子标记对1个杂交F2群体进行西瓜果皮底色鉴定，结果表明，该SNP分子标记对杂交群体后代的西瓜果皮底色鉴定准确率为100%。利用该SNP分子标记对20份西瓜种质资源进行果皮底色鉴定，结果表明，该SNP分子标记对黄色果皮底色的西瓜和绿色果皮底色的西瓜鉴定的准确率均为100%。这说明，利用本发明开发的SNP分子标记能够快速准确地鉴定出西瓜果皮底色，可以在生产中大规模应用。

Description

与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
在植物传统育种过程中，人们通常只能依靠表现型进行田间选择和后续的培育，不单依赖育种家的经验，而且经常受到基因型和环境互作的影响。由于很难获知后代的基因型，这种选择往往耗时较长且可能与基因型有偏差，仅适用于对简单的质量性状进行选择。但对数量性状而言，因表现型与基因型之间缺乏明确的对应关系，极易造成选择的不准确性和效率低下。分子标记辅助选择是将分子标记应用于作物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段，主要包括对目标性状的前景选择和对遗传材料的背景选择。可以快速检测到目标基因或者与目标性状基因紧密连锁的位点，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。可以显著加快选择速度，缩短育种时间。
西瓜是重要的园艺作物，我国是世界第一西瓜生产大国，然而现阶段我国西瓜育种仍以传统育种为主，分子标记辅助选择应用较少，育种效率较低，很难获得突破性新品种。西瓜果皮性状是一种重要的商品性状，也是育种家重点改良的对象，早在上世纪三十、四十年代研究人员针对果皮性状预测了多种遗传模型，Barham(1956)等认为金黄色果皮受单个隐性基因go控制，Yang(2015)等认为果皮性状受3个独立的基因位点控制，即S控制条纹，D控制颜色深浅，Dgo控制果皮背景色(底色)，但未见有与西瓜果皮底色性状紧密连锁的分子标记开发的研究报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记及其应用。
本发明的目的之一在于提供与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5'端起第266位碱基为SNP位点，所述SNP位点位于西瓜基因组的第4号染色体第48456位核苷酸。
进一步地，所述SNP位点的碱基为C的西瓜的果皮底色为黄色，SNP位点的碱基为T的西瓜的果皮底色为绿色。
本发明的又一目的是提供与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记在西瓜分子标记辅助选择育种中的应用。
进一步地，所述SNP分子标记用于鉴定西瓜的黄色果皮底色和绿色果皮底色。
本发明的又一目的是提供用于检测与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的引物对，所述引物对的上游引物是根据西瓜基因组的第4号染色体第48456位核苷酸上游的序列进行设计，下游引物是根据西瓜基因组第4号染色体第48456位核苷酸下游的序列进行设计。
进一步地，所述引物对由两条单链DNA组成，上游引物为5'-TGCATGATGAGCCTTCTTTGAA-3'，如SEQ ID NO.2所示；下游引物为5'-TAGACGGGGCTCACAAGTCA-3'，如SEQ ID NO.3所示。
本发明的再一目的是提供用于检测与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的引物对在西瓜分子标记辅助选择育种中的应用。
本发明的再一目的是提供用于鉴定西瓜果皮底色的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求5或6所述的引物对。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明利用重测序集团分离分析(BSA)获得了控制西瓜果皮底色(黄色/绿色)性状确切的基因区间，通过F2分离群体实现了目标基因的精细定位，开发出与目标性状紧密连锁的SNP分子标记，可用于西瓜分子标记辅助选择育种，提高对西瓜果皮底色性状选择的精确性，加速育种进程。
2、本发明根据西瓜基因组第4号染色体第48456位单核苷酸多态性差异，能够鉴定西瓜果皮底色(黄色/绿色)，对鉴定西瓜果皮底色具有较高的准确性。
3、利用本发明的SNP分子标记对1个杂交F2群体共618个待测西瓜植株进行表型验证，结果表明，该SNP分子标记鉴定西瓜果皮底色的准确率达到了100％。又利用本发明的SNP分子标记对20份不同果皮底色的西瓜种质资源进行验证，结果表明，该SNP分子标记对黄色和绿色果皮西瓜鉴定的准确性都达到了100％，这说明，利用本发明的SNP分子标记进行西瓜果皮底色的鉴定具有简单快速，准确率高的优点，可以在生产中大规模应用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1与西瓜果皮底色性状紧密连锁的SNP位点的获得
1.1、杂交群体的BSA(混池重测序)
利用一个黄色果皮西瓜(94E1)作母本，一个绿色果皮西瓜(青峰)作父本进行杂交，配制出一个包含黄色果皮底色西瓜和绿色果皮底色西瓜的F2分离群体，从F2代分离群体中挑选出黄色果皮底色和绿色果皮底色的西瓜各30株，分别提取叶片基因组DNA，将30株黄色果皮底色的西瓜的基因组DNA混合在一起，30株绿色果皮底色的西瓜的基因组DNA混合在一起。利用Illumina HiSeq 2000测序仪对其进行测序，得到33.75G数据，与西瓜参考基因组97103(http://cucurbitgenomics.org/organism/1)进行比对。鉴定出247012个SNP位点，利用这些SNPs进行生物信息学分析计算SNP-index值，得到了和西瓜果皮底色性状相关基因的候选区间位于西瓜基因组第4号染色体的第1位核苷酸和第7000000位核苷酸之间。
1.2、获得SNP位点
利用混池重测序获得的位于西瓜基因组第4号染色体的第1～7000000位核苷酸之间的SNP，设计CAPS标记，对F2群体单株进行基因型分析，结合单株表现型数据(果皮底色为黄色或绿色)，筛选重组单株，测算标记的重组率，再利用第1～7000000位核苷酸之间的SNP和CAPS继续对重组单株鉴定基因型，获得新的重组单株，由两端逐步向内侧压缩候选区间，最终将目标基因精细定位于1～59800位核苷酸之间。该区间内第48456位SNP检测的基因型与表现型完全吻合，未发生交换事件，确定该SNP位点与果皮底色性状紧密连锁，该SNP位点对应的分子标记(SNP02)即为与西瓜果皮底色性状紧密连锁的SNP分子标记。定位过程中所用标记及其引物信息见表1。
表1定位过程中所用标记及其引物信息
注：表中F代表正向引物，R代表反向引物。
实施例2利用SNP分子标记鉴定西瓜果皮底色
2.1、DNA提取
采用常规CTAB法提取西瓜叶片的基因组DNA，去除RNA，基因组DNA样品体积为50μL，用紫外分光光度计测定基因组DNA样品在260nm、280nm处的OD值，计算DNA含量以及OD260/280的比值，选择OD260/280值在1.8～2.0之间基因组DNA样品，浓度稀释至100ng/μL。
2.2、引物
引物为实施例1中得到的与西瓜果皮底色性状紧密连锁的SNP分子标记(SNP02)的引物对，该引物对是根据西瓜基因组第4号染色体第48456位核苷酸上下游的序列设计，引物序列见表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，稀释至10μM后备用。
表2引物序列
引物名称 序列(5'-3') 序列表编号
上游引物 TGCATGATGAGCCTTCTTTGAA SEQ ID NO.2
下游引物 TAGACGGGGCTCACAAGTCA SEQ ID NO.3
2.3、PCR反应体系
PCR反应体系如表3。
表3PCR反应体系
试剂 加入体积(μL)
基因组DNA 2
2×PCR Mix 12.5
上游引物 1.25
下游引物 1.25
灭菌蒸馏水 8
总体积 25
PCR扩增程序为：95℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃50s，共35个循环；72℃10min；4℃保存。
2.4、连接转化
配制1％的琼脂糖凝胶，对PCR扩增产物进行电泳检测，将400bp处明亮单一的电泳条带进行胶回收。回收得到的PCR产物连接到pTOPO载体上，连接体系如表4。
表4切胶回收产物连接体系
试剂 加入体积(μL)
PCR回收产物 4
10×Enhancer 0.5
ptopO载体 0.5
总体积 5
样品混匀后，室温放置5min后进行连接反应。
将连接产物转化至TOP 10感受态细胞，涂布在附加100mg·L-1Amp的培养基上，然后37℃过夜培养，将长出的菌落放在LB液体培养基中进行培养，经过菌液测序得到PCR扩增的完整序列。经过和西瓜全基因组序列比对，黄色果皮底色西瓜在4号染色体的第48456位碱基均为C，绿色果皮底色西瓜在4号染色体的第48456位碱基均为T，该SNP分子标记(SNP02)可以作为鉴定黄色果皮底色和绿色果皮底色西瓜的标记。
实施例3利用SNP分子标记对杂交群体进行果皮底色鉴定
3.1、实验材料的选择
以杂交组合94E1(黄)×青峰(绿)的F2群体的618个单株为实验材料，其中94E1(黄)为母本，青峰(绿)为父本，表型检测结果显示，F2代群体中，果皮底色为黄色的有458个单株，果皮底色为绿色的有160个单株。
3.2、利用SNP分子标记对F2群体进行鉴定
以实施例1得到的西瓜4号染色体上与果皮底色相关的SNP分子标记(SNP02)对618个F2单株进行鉴定，具体鉴定方法参照实施例2中的方法。鉴定结果表明，由该SNP分子标记鉴定的结果和F2群体的表型相一致，准确性达到100％。
实施例4利用SNP分子标记对20份西瓜种质资源进行鉴定
4.1、实验材料的选择
以国家西瓜甜瓜中期库挑选的20份西瓜种质资源为实验材料，其中黄色果皮底色西瓜10份，绿色果皮底色西瓜10份，具体品种以及表型见表5。
表5 20份西瓜种质资源的名称以及表型
品种 果皮底色 品种 果皮底色 品种 果皮底色 品种 果皮底色
短127 绿 短117 绿 久比例 绿 美丽 绿
石红2号选 绿 XBF 绿 G5F 绿 中育10号选 绿
桂引6号选 绿 米奇利 绿 小金甜 黄 宝冠选 黄
黄皮小西瓜 黄 ZGS-1 黄 ZGS-2 黄 ZGS-3 黄
ZGS-4 黄 ZGS-5 黄 ZGS-6 黄 ZGS-7 黄
4.2、利用SNP分子标记对20份西瓜种质资源进行鉴定
以实施例1得到的西瓜4号染色体上与果皮底色相关的SNP分子标记(SNP02)对20份西瓜种质资源进行鉴定，具体鉴定方法参照实施例2中的方法。鉴定结果表明，该分子标记对黄色果皮底色和绿色果皮底色西瓜鉴定的准确率均为100％。
综上所述，本发明的SNP分子标记能够对西瓜果皮底色进行精确鉴定，不仅快速有效，而且在苗期就可以进行鉴定，大大缩短了育种的周期，可以在生产中大规模应用。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记及其应用
<130> 无
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 394
<212> DNA
<213> 西瓜（Citrullus lanatus）
<220>
<221> variation
<222> (301)..(301)
<223> n=c或t
<400> 1
tgcatgatga gccttctttg aatagtaaaa ctaatggcat gtttgatttt aaattagaaa 60
atcctatgaa gaatgtttct agttgcaata atgtccctag ttcttcttgc atacctccaa 120
aatctataat gaattatgaa caaatcatgg agaagcatgt taaaaatgaa gtgttgagtc 180
cagtaaaatc taaacatgat gactctttaa tgctacttga ctacattagt aaagatgatg 240
tccaaattga taatggtttg ttgacnaact cactaaatgc taatgaatat gtttgtgagt 300
gtcaatgtgg ccgaaaacta aaagttgtag gtgatccaaa gcatgaaagg aagaaaccac 360
cttgggatct accatgactt gtgagccccg tcta 394
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcatgatga gccttctttg aa 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tagacggggc tcacaagtca 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agttcaatga ccaaaggtga act 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aatgtcacgt tgtcatgtcc a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgcaactaca ggtgtaaggc a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccaacaacca ttcacgcagg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
accttgggag cccttagaga 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aggtagaaca ctcaaactta gggt 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaacgtccca aggaaccaca 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tccaacttca aacccttcct ct 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgtacgtata ccaccacccg 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tggtcatcgt catcgctaag g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgacctattc tcgcttgccc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tccccttgca ttttccctcg 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aatagctctt cgttcatgta ctct 24
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agacatcacg tggaaattag aag 23
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
accctaccat gtctattaac catcc 25
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aggaaacaat tgtatagcta tggttt 26
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
agtgttcaaa ttaaccaagg gga 23
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
actcgcatgt cacctacacg 20
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tgactaccaa tcagacaaat cttga 25
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
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<400> 23
ggtggtcagt gggaattgca 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
acatcatctc tcccgctcca 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgttgcgttt agggttggtt 20
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
accgctaaaa actaaatgag tgtt 24
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
agcatgcaaa ataacgcccg 20
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
atcaattatg cctcaatagg tttctt 26
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tggagtattg cattgagtag ca 22
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ttccttgcag ccaactcact 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
caagggtgct cgagaaggtt 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tccttcaaca gttggcgact 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
cgccttgagt gggctatagg 20
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
agaatcaaca tgagaatgca aca 23
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
atcaaaggac gagccctcac 20

Claims (8)

1.与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5'端起第266位碱基为SNP位点，所述SNP位点位于西瓜基因组的第4号染色体第48456位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP位点的碱基为C的西瓜的果皮底色为黄色，SNP位点的碱基为T的西瓜的果皮底色为绿色。
3.权利要求1～2任一项所述的与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记在西瓜分子标记辅助选择育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记在西瓜分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记用于鉴定西瓜的黄色果皮底色和绿色果皮底色。
5.用于检测与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物是根据西瓜基因组的第4号染色体第48456位核苷酸上游的序列进行设计，下游引物是根据西瓜基因组第4号染色体第48456位核苷酸下游的序列进行设计。
6.根据权利要求5所述的用于检测与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对由两条单链DNA组成， 上游引物为5'-TGCATGATGAGCCTTCTTTGAA-3'，如SEQ ID NO.2所示；下游引物为5'-TAGACGGGGCTCACAAGTCA-3'，如SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求5～6任一项所述的用于检测与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的引物对在西瓜分子标记辅助选择育种中的应用。
8.用于鉴定西瓜果皮底色的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求5或6所述的引物对。
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