CN106636393B

CN106636393B - 与南瓜皮色基因连锁的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN106636393B
Application number: CN201611178535.3A
Authority: CN
Inventors: 钟玉娟; 黄河勋; 罗少波; 吴廷全; 李俊星
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2016-12-19
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2036-12-19
Also published as: CN106636393A

Abstract

本发明公开了与南瓜皮色基因连锁的SNP分子标记及其应用。本发明所筛选得到的分子标记63809和分子标记30774与南瓜果皮皮色基因紧密连锁，两标记间的遗传距离为1.04cM，可直接用于果皮皮色基因分子标记辅助育种体系的建立。根据两分子标记设计的dCAPS扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于南瓜品种改良分子辅助育种，为南瓜外观品质分子育种提供技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。

Description

与南瓜皮色基因连锁的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及与南瓜皮色基因连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

果皮颜色是果实外观品质的重要指标，也是影响商品价值的重要因素。中国南瓜是南瓜属的三个栽培种之一，国外的中国南瓜多为纯色的黄皮品种或者墨绿皮品种，而我国主要栽培的是浅黄花斑皮品种，而不带花斑的品种较少。近年来，纯色的黄皮或墨绿皮品种较受欢迎，但由于目前我国的资源大多是带花斑的浅黄或橙色品种，尚不能解决市场的纯色皮的需求，为了满足消费市场的需求，我国引进了部分墨绿色品种。开展品质优良的纯色品种选育是未来南瓜品质育种的重要目标之一。传统育种方式选育纯色品种虽然可行，但是耗时费力，大大影响我国的南瓜育种事业。随着高通量测序技术的成熟，特别是大量的SNP(单碱基扩增多态性)标记的开发，应用高密度遗传图谱的方法开展植物性状基因定位成为挖掘植物基因的热点之一。特别是南瓜的全基因组测序尚未完成，利用高通量测序技术开发大量的SNP标记，开发性状连锁的分子标记进行品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期提高育种效率。因此，进行南瓜果皮颜色的基因定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立早期辅助选择技术体系，对果皮颜色的遗传改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供与南瓜皮色基因连锁的SNP标记位点，dCAPS标记开发及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

与南瓜皮色基因紧密连锁的SNP分子标记，其为分子标记63809或分子标记30774，定位于中国南瓜8号连锁群上，分别位于皮色基因两侧。

所述分子标记63809包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第195位碱基是SNP位点，其碱基为C或T；当SNP所在位点全为C时，与分子标记63809紧密连锁的南瓜皮色基因在果实中的表型为墨绿色，当SNP所在位点全为T或者为C/T时，则果实表型为浅绿色。

所述分子标记30774包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.2所示序列自5’端起第32位碱基是SNP位点，其碱基为A或T；当SNP所在位点全为A时，与分子标记30774紧密连锁的南瓜皮色基因在果实中的表型为墨绿色，当SNP位点的基因型全为T或者为A/T时，则果实表型为浅绿色。。

用于扩增以上所述的SNP分子标记的引物对。

作为优选的，所述引物对为dCAPS引物对。

进一步优选的，用于检测分子标记63809的dCAPS引物对的核苷酸序列如下所示：

F1：5’-TTCCAACAATTTCCCTCTACTGCGG-3’(SEQ ID NO.3),

R1：5’-TTGCTATTTTCTTGCATTCGATATCCAT-3’(SEQ ID NO.4)，

其对应的限制性核酸内切酶为NlaIII。

用于检测分子标记30774的dCAPS引物对的核苷酸序列如下所示：

F2：5’-CTTGATGAAATTTCCAGAGCCAAAAAGTCAG-3’(SEQ ID NO.5)，

R2：5’-TGCAAAAGATGGAGCGGCGTGTC-3’(SEQ ID NO.6)，

其对应的限制性核酸内切酶为Hpy188I。

以上所述的SNP分子标记、引物对在南瓜果皮颜色辅助育种中的应用。

一种用于南瓜果皮颜色辅助育种的试剂盒，其包括用于检测分子标记63809和/或分子标记30774SN的试剂。

一种南瓜果皮颜色辅助育种的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测南瓜基因组DNA；

(2)利用特异性引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR产物进行测序，确定SNP位点的基因型，从而判断果皮颜色；或者使用对应

的限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切，根据酶切结果判断果皮颜色。

本发明的有益效果是：

本发明所筛选得到的分子标记63809和分子标记30774与南瓜果皮皮色基因紧密连锁，两标记间的遗传距离为1.04cM，可直接用于果皮皮色基因分子标记辅助育种体系的建立。根据两分子标记设计的dCAPS扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于南瓜品种改良分子辅助育种，为南瓜外观品质分子育种提供技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。

附图说明

图1为墨绿果皮的母本(P1)和浅绿果皮的父本(P2)；

图2为南瓜墨绿皮基因在高密度遗传连锁图谱的初步定位结果图：横坐标表示连锁群的位置，纵坐标表示LOD值；红线表示所有的LOD值拟合后的结果；虚线标记的阈值是代表p<0.001的关联阈值，表示关联性极可靠；

图3为南瓜墨绿皮基因所在的8号连锁群的紧密连锁区间，左边为连锁群的遗传距离(cM),右边为标记的编号，Gr为皮色基因所在位点；

图4为分子标记63809的PCR扩增后酶切结果：P1、P2分别为墨绿母本和浅绿有斑父本的酶切带型，其中P1酶切完全，仅有一条195bp片段，P2不能被酶切，片段长度为228bp；F1部分酶切，存在195bp和228bp的片段，F2群体的随机单株中存在P1，P2和F1的三种类型；

图5为分子标记30774的PCR扩增后酶切结果：P1、P2分别为墨绿母本和浅绿有斑父本的酶切带型；其中P1酶切完全，仅有一条277bp片段，P2不能被酶切，片段长度为308bp；F1部分酶切，存在308bp和277bp的片段，F2群体的随机单株中存在P1，P2和F1的三种类型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳、酶切、转化等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、遗传群体的构建及遗传分析

1、供试材料植物材料：墨绿果皮材料是从泰国引进分离获得的高代自交系，命名为CMO-E(P1)，而浅绿果皮材料是广东本地获得的高代自交系，命名为CMO-X(P1)。CMO-E和CMO-X杂交获得F1，F1自交得F2，用作遗传分析和定位群体。

2、供试材料果实皮色的确定和遗传规律分析

对200株F2群体单株，待果实长出，且分别在果实开花后2-10天的幼果和30-40天的成熟果进行颜色调查，200个单株中同时调查了幼果颜色和成熟果色的148株中，107株为浅绿花斑，而41株为深绿无斑，浅绿对深绿比符合3：1(X² _3：1＝0.57，P＝0.45)，分析结果表明浅绿花斑果皮性状可能由一个显性单基因控制。

二、南瓜遗传图谱构建和果皮颜色的初步定位

1、南瓜基因组DNA的提取

使用CTAB法提取南瓜亲本及200株F2群体基因组DNA，提取的单株DNA用于文库构建；

2、遗传图谱构建

本研究前期委托深圳恒创生物科技有限公司利用ddRAD技术进行高通量测序，一共202个样本，采用EcroI和AlnⅢ进行酶切，末端修复、添加测序接头、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，以保证文库质量。将合格的文库，根据数据量预算，进行IlluminaHiSeq测序。插入片段长度为500bp；测序类型为PE150；去掉用于区分样品的标签序列(4～8bp)，实际Read长度为142～146bp。通过聚类比较检测出RAD-tags上的SNPs集(采用软件为自主研发，聚类不受亲本限制)。

对初始SNP集进行过滤，可得到较为可靠的基因型数据。共开发18314个SNP标记，缺失率小于10％，选取2441个高质量SNP，利用Joinmap软件将LOD值设为6.0构建高密度分子标记遗传图谱，图谱共分为20个连锁群，总图距2879.55cM，平均标记间图距1.29cM，最短连锁群94.42cM，最长226.30cM。

3、皮色基因Gr的精细定位

利用MapQTL5软件采用复合区间作图法(MQM)对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算以获得性状相关的QTL，置换检验次数设为1000，QTL判断标准为：p值小于0.01时对应的LOD值作为筛选的阈值，图中以虚线表示。超过阈值表示为一个基因的连锁定位区间，虚线的LOD值为25.1，一个group代表一个连锁群，将皮色基因Gr精细定位在8号连锁群(图2)，定位在两个SNP标记63809和37704之间，区间从82.897cM到83.941cM,两个标记的遗传距离为1.04cM(图3)，其中SNP标记63809发生的C→T的变化，37704发生的A→T的变化。

三、dCAPS分子标记开发、扩增、酶切验证

根据分子标记63809和分子标记37704的SNPs标记信息，使用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm)和Genetool分别设计衍生的酶切多态性扩增序列(dCAPS)引物的错配引物和另一侧的引物，完成从SNPs向dCAPS标记的转化。63809的错配碱基数为1个，37704的错配碱基数量为2个。

用于扩增分子标记63809的引物序列如下所示：

F1：5’-TTCCAACAATTTCCCTCTACTGCGG-3’(SEQ ID NO.3)；

R1：5’-TTGCTATTTTCTTGCATTCGATATCCAT-3’(SEQ ID NO.4)；

若SNP位点碱基为C时，PCR产物可被限制性核酸内切酶NlaIII识别并切割，产生195bp的片段，可以判断与分子标记63809紧密连锁的南瓜皮色基因在果实中的表型为墨绿色；当SNP位点全为T时，PCR产物不能被限制性核酸内切酶NlaIII识别并切割，只有228bp的片段，可以判断南瓜果实表型为浅绿色有斑；当SNP位点为C/T时，则存在192bp和228bp的片段，南瓜果实表型为浅绿色有斑。

用于扩增分子标记30774的引物序列如下所示：

F2：5’-CTTGATGAAATTTCCAGAGCCAAAAAGTCAG-3’(SEQ ID NO.5)；

R2：5’-TGCAAAAGATGGAGCGGCGTGTC-3’(SEQ ID NO.6)。

若SNP位点碱基为A时，PCR产物可被限制性核酸内切酶Hpy188I识别并切割，产生277bp的片段，可以判断与分子标记30774紧密连锁的南瓜皮色基因在果实中的表型为墨绿色；当SNP位点碱基为T时，其不能被限制性核酸内切酶Hpy188I识别并切割，只有308bp的片段，南瓜果实表型为浅绿有斑；当SNP位点的碱基为A/T时，则存在308bp和277bp的片段，南瓜果实表型为浅绿有斑。

PCR扩增体系使用20μL的扩增体系，包含1U Taq酶，1μL模板DNA，1μL的dNTP，1.5μL引物，2μL的10×PCR buffer，加ddH₂O至20μL。PCR扩增程序为：94℃3min，循环过程为94℃30s、退火30s、72℃1min、30个循环，最后72℃延伸10min。63809引物的退火温度为60℃，37704引物的退火温度为63℃。

在两亲本间进行PCR扩增，分别经过限制性内切酶NlaIII和Hpy188I进行酶切后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，亲本间表现特异，鉴定F2群体单株40个，两个标记的结果一致，且果实皮色与双酶切结果一致，上述两个SNP标记可以将果皮深绿与果皮浅绿有斑区分开。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 与南瓜皮色基因连锁的SNP分子标记及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 228

<212> DNA

<213> Cucurbita moschata (Duch. ex Lam.) Duch. ex Poiret

<400> 1

ttccaacaat ttccctctac tgcggtagaa ctcctcaaca ggttgactct aatgccatac 60

acaaataagc aaaagaaaga gaaaacaaga aaccatcaat ttctttaata ccatcaaaag 120

atgaacacca cagcacgtaa aaagaaaagt tctaagtatt actggaagcc tactgaaaac 180

cttttatttt cttccatgga tatcgaatgc aatgcaagaa aatagcaa 228

<210> 2

<211> 308

<212> DNA

<213> Cucurbita moschata (Duch. ex Lam.) Duch. ex Poiret

<400> 2

cttgatgaaa tttccagagc caaaaagcca aatagtgtga catattgagg aaggagattg 60

gagggaagaa tgtataaatc ggtggtttac caaggggatg agctactggg ggaggtagag 120

atttacccag aagaaaagaa tggctacaag aacatcgaag tgaaggaaat cagaataagt 180

cacttctcgc aaccgagtga gaggtgccca ccacttgcgg tgcttcatac cattgcagcc 240

tctggaattt gcttcaaaat ggagtcaaag acctcgcagt cacaggacac gccgctccat 300

cttttgca 308

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttccaacaat ttccctctac tgcgg 25

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgctatttt cttgcattcg atatccat 28

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cttgatgaaa tttccagagc caaaaagtca g 31

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgcaaaagat ggagcggcgt gtc 23

Claims

1.与南瓜皮色基因紧密连锁的SNP分子标记，其为分子标记63809或分子标记30774，其特征在于，所述分子标记定位于中国南瓜8号连锁群上，分别位于皮色基因两侧；

所述分子标记63809的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第195位碱基是SNP位点，其碱基为C或T；

所述分子标记30774的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2所示序列自5’端起第32位碱基是SNP位点，其碱基为A或T。

2.用于扩增权利要求1所述的SNP分子标记的引物对。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述引物对为dCAPS引物对。

4.根据权利要求3所述的dCAPS引物对，其特征在于，用于检测分子标记63809的dCAPS引物对的核苷酸序列如下所示：

F1：5’-TTCCAACAATTTCCCTCTACTGCGG-3’(SEQ ID NO.3),

R1：5’-TTGCTATTTTCTTGCATTCGATATCCAT-3’(SEQ ID NO.4)，

其对应的限制性核酸内切酶为NlaIII。

5.根据权利要求3所述的dCAPS引物对，其特征在于，用于检测分子标记30774的dCAPS引物对的核苷酸序列如下所示：

F2：5’-CTTGATGAAATTTCCAGAGCCAAAAAGTCAG-3’(SEQ ID NO.5)，

R2：5’-TGCAAAAGATGGAGCGGCGTGTC-3’(SEQ ID NO.6)，

其对应的限制性核酸内切酶为Hpy188I。

6.权利要求1所述的SNP分子标记、权利要求2-5任一项所述的引物对在南瓜果皮颜色辅助育种中的应用。

7.一种用于南瓜果皮颜色辅助育种的试剂盒，其包括权利要求2-5任一项所述的引物对。

8.一种南瓜果皮颜色辅助育种的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测南瓜基因组DNA；

(2)利用权利要求2-5任一项所述的引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR产物进行测序，确定SNP位点碱基，从而判断果皮颜色；或者使用对应的限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切，根据酶切结果判断果皮颜色。