CN111621586B - 一种南瓜黄茎性状紧密连锁的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南瓜黄茎性状紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记为SNP14g15598654，且核苷酸多态性为A/T、核苷酸序列如SEQ ID NO.2‑4所示。本发明首次公开控制南瓜黄茎性状的基因座位及与其紧密连锁的SNP分子标记，该分子标记能够准确、快速地鉴别出黄茎南瓜品种和个体，可用于南瓜黄茎种质资源的预测和筛选，以及用于进行分子辅助育种创制黄茎南瓜品种。

Description

一种南瓜黄茎性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学与植物分子育种领域，具体涉及与南瓜黄茎性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

南瓜是全球广泛栽培的园艺作物，其常见的栽培种有中国南瓜(Cucurbitamoschata)、美洲南瓜(即西葫芦，Cucurbita pepo)和印度南瓜(Cucurbita maxima)。黄茎南瓜是一种稀有的南瓜种质资源，其茎蔓因富含叶黄素而呈现鲜艳的黄色。叶黄素是重要的天然色素类和天然保健品，具有保护视力、抗氧化、抗癌、减少患糖尿病风险等作用料。随着人们生活水平的提高，食物越来越丰富多样，南瓜苗作为叶菜日渐得到消费者的喜爱。黄茎南瓜因独特的营养价值，将其作为食用南瓜苗的专用品种，具有很高的开发潜力。

利用与目标性状调控基因连锁的分子标记进行辅助选择育种，对提高育种效率有重要意义。近年来，基于高通量测序技术进行混合样本分组分析(Bulked segregantanalysis by sequencing,BSA-seq)的基因定位方法，在动植物遗传研究中已得到广泛应用。同时，BSA-seq定位目的基因之后，即可根据测序数据获得的单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism，SNP)、插入/缺失(Insertion or deletion,Indel)或简单重复序列变异(Simple sequence repeats,SSR)，迅速开发连锁分子标记应用于分子辅助育种。可见，利用BSA-seq定位控制南瓜黄色茎蔓的相关基因，并开发连锁分子标记应用于育种实践，将在很大程度提高黄茎南瓜品种的育种效率。

发明内容

为进一步优化现有技术，本发明的目的在于提供控制南瓜黄茎性状的基因座位、提供与控制南瓜黄茎性状的基因紧密连锁的SNP标记及扩增该分子标记的特异引物并且提供本发明的SNP标记的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种南瓜黄茎性状紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记为SNP14g15598654，且核苷酸多态性为A/T、核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示。

优选地，所述SNP分子标记由三条引物组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示。

本发明提供利用本发明SNP分子标记用于鉴定黄茎南瓜品种或个体的方法，所述方法包括以下步骤：

S1提取待测南瓜的基因组DNA；

S2以待测南瓜提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-4所示的特异性引物，在扩增试剂中进行PCR扩增反应；

S3采用荧光检测平台对步骤S2的产物进行分型，若产物荧光信号为HEX(对应碱基为A)则该样品为绿茎，若产物荧光信号为FAM(对应碱基为T)或杂合型则该样品为黄茎。

进一步的，本发明提供SNP分子标记在南瓜分子辅助育种中的应用。

进一步的，本发明提供SNP分子标记选育黄茎南瓜品种中的应用。

进一步的，本发明提供SNP分子标记在筛选预测南瓜黄茎品种中的应用。

本发明有益效果在于，首次公开控制南瓜黄茎性状的基因座位及与其紧密连锁的SNP分子标记，该分子标记能够准确、快速地鉴别出黄茎南瓜品种和个体，可用于南瓜黄茎种质资源的预测和筛选，以及用于进行分子辅助育种创制黄茎南瓜品种。

附图说明

图1为通过BSA-seq计算G’value将黄茎基因定位于中国南瓜第14染色体。

图2为F2群体黄茎个体混合池和绿茎个体混合池在中国南瓜第14染色体15,598,634-15,598,674区间测序数据的可视化分析。在第14染色体15598654处存在A/T的SNP。

图3为分子标记SNP14g15598654在回交一代群体中黄茎个体的分型结果。绿茎亲本指回交一代群体的绿茎自交系，黄茎个体指回交一代群体中的黄茎单株。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

本发明为一种南瓜黄茎性状紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记为SNP14g15598654，且核苷酸多态性为A/T、核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示。

优选地，所述SNP分子标记由三条引物组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示。

本发明提供利用本发明SNP分子标记用于鉴定黄茎南瓜品种或个体的方法，所述方法包括以下步骤：

S1提取待测南瓜的基因组DNA；

S2以待测南瓜提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-4所示的特异性引物，在扩增试剂中进行PCR扩增反应；

S3采用荧光检测平台对步骤S2的产物进行分型，若产物荧光信号为HEX(对应碱基为A)则该样品为绿茎，若产物荧光信号为FAM(对应碱基为T)或杂合型则该样品为黄茎。

进一步的，本发明提供SNP分子标记在南瓜分子辅助育种中的应用。

进一步的，本发明提供SNP分子标记选育黄茎南瓜品种中的应用。

进一步的，本发明提供SNP分子标记在筛选预测南瓜黄茎品种中的应用。

实施例

1、南瓜黄茎性状的遗传研究和基因定位

利用南瓜黄茎品种与1个普通绿茎南瓜品种杂交，杂交F1表现为黄茎，说明黄茎相对绿茎为显性性状。令F1自交获得F2种子，F2播种后形成F2群体共150株，在移栽30天后调查发现有110株表现为黄茎，40株为绿茎，黄茎与绿茎的分离比符合单基因控制的遗传模式。

在F2群体中，选取有代表性的绿茎(隐性)和黄茎(显性)个体各20株，分别提取DNA混合绿茎个体和黄茎个体混合池。对黄茎品种、绿茎品种和两个混合池进行基因组重测序和BSA分析，利用QTLseq-R计算两个混合池的G’value，将黄茎基因定位在中国南瓜第14号染色体14.05Mb至14.97Mb区间，如图1所示。

2、与南瓜黄茎性状紧密连锁SNP标记的开发

对上述黄茎基因定位区间内绿茎个体和黄茎个体混合池的测序数据进行可视化分析挖掘，发现chr14:15598654存在一个SNP与黄茎表型呈现紧密连锁。该SNP多态性为A/T，其中绿茎品种为T，而黄茎品种碱基为A；F2群体的绿茎个体混合池测序碱基都为T，而黄茎个体混合池测序的碱基为杂合型，如图2所示。

针对该SNP，设计等位基因特异性引物进行扩增和检测，获得分子标记SNP14g15598654。所述分子标记，其预测扩增片段长度为74个碱基，序列如SEQ NO.1所示，A/T SNP位于第50个碱基；扩增的正向引物为SEQ NO.2，反向引物为两个分别与A和T结合的特异性引物，序列分别为SEQ NO.3和SEQ NO.4。在两条特异性反向引物的5’端添加荧光报告基团，其中SEQ NO.3的5’端含有HEX基团(对应碱基为A)，而SEQ NO.4的5’端含有FAM基团(对应碱基为T)，从而通过与PARMS或KASP兼容的荧光检测平台进行分型。

3、与南瓜黄茎性状连锁SNP标记的应用

构建黄茎品种与绿茎品种的回交一代群体(绿茎品种作为轮回亲本)，利用上述分子标记SNP14g15598654对48个黄茎个体进行检测，发现全部黄茎个体荧光信号均为HEX(对应碱基为A)或者杂合型，而绿茎亲本为FAM(对应碱基为T)，如图3所以。进一步利用上述分子标记对发明人收集的绿茎南瓜品种共122个进行检测，发现121个品种荧光信号为HEX(对应碱基为T)，这121个品种茎蔓为绿色；有且仅有1个品种荧光信号为FAM(对应碱基为A)，该品种即为发明人选育的黄茎南瓜自交系。说明利用本发明提供的分子标记SNP14g15598654能够准确、快速地鉴别出黄茎南瓜品种和个体，可用于南瓜黄茎种质资源的预测和筛选，以及用于进行分子辅助育种创制黄茎南瓜品种。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种南瓜黄茎性状紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为一段74个碱基的核苷酸片段，包含位于中国南瓜(Cucurbita moschata)第14号染色体的第15598654位碱基的SNP位点，所述SNP位点位于所述核苷酸片段的第50位，且核苷酸多态性为A/T。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记在南瓜分子辅助育种中的应用。

3.根据权利要求1所述的SNP分子标记在选育黄茎南瓜品种中的应用。

4.根据权利要求1所述的SNP分子标记在筛选和预测南瓜黄茎品种中的应用。

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