CN107365835B - 与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用。分子标记定位于中国南瓜19号连锁群上，分别位于蔗糖/葡萄糖比值基因两侧；其中，分子标记26139包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其同源SNP序列；分子标记13328包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其同源SNP序列。定位的QTL位点对该数量性状存在显著关联关系(p<0.05)，且贡献率较高，分子标记26139的解释概率为11.9％，分子标记13328的解释概率为11.6％，通过这两个分子标记可以预测南瓜蔗糖/葡萄糖比值的高低，可以简便、快速、高通量地应用于南瓜品种改良分子辅助育种，为实现南瓜蔗糖/葡萄糖比值性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术及育种领域，特别涉及一种与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用。
背景技术
糖类是果实的品质成分，南瓜果实中的主要可溶性糖是蔗糖（sucrose）、果糖（fructose）和葡萄糖（glucose）。但这三种糖对南瓜果实的甜度贡献不同，果实的甜度不仅取决于糖的总量，还与糖的组成密切相关。糖含量不仅影响果实的甜味，也是淀粉、维生素和类胡萝卜素等风味物质合成的基础物质，糖类参与机体重要的生理功能代谢途径，为植物生长发育提供必要保障。研究表明中国南瓜积累较多的蔗糖和葡萄糖及少量的果糖，而蔗糖对南瓜的甜度贡献最大，蔗糖含量越高果实越甜，通过计算蔗糖和葡萄糖比值可以判断南瓜果实的甜度。
随着科学研究的深入，社会的需求，人们越来越需要高品质的蔬菜水果，因此，选育高蔗糖低葡萄糖含量南瓜是未来南瓜品质育种的重要目标之一。传统育种方式选育高蔗糖品种虽然可行，但耗时耗力，不利于我国的南瓜育种事业。随着高通量测序技术的成熟，特别是大量的SNP（单碱基扩增多态性）标记的开发，应用高密度遗传图谱的方法开展植物性状基因定位成为挖掘植物基因的热点之一。利用高通量测序技术开发大量的SNP标记，开发性状连锁的分子标记进行品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期提高育种效率。因此，进行南瓜蔗糖/葡萄糖比值含量的基因定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立早期辅助选择技术体系，对选育高蔗糖低葡萄糖南瓜的遗传改良具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其在育种方面的应用。
与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，为分子标记26139或分子标记13328，所述分子标记定位于中国南瓜19号连锁群上，分别位于蔗糖/葡萄糖基因两侧；其中，分子标记26139包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其同源SNP序列；分子标记13328包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其同源SNP序列。
SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第260位碱基是SNP位点，其碱基为G或C。
SEQ ID NO.2所示序列自5’端起第25位碱基是SNP位点，其碱基为A或C。
可识别或扩增上述SNP分子标记的分子探针或引物对。
优选的，引物对为dCAPS引物对。
特别的，用于检测分子标记26139的dCAPS引物对的核苷酸序列如下所示：
F1 ：5’- TCGAATCCTGTTTCTGTTTGAAT -3’ (SEQ ID NO.3)，
R1 ：5’- TATGGTATAATGAAATGGCCGCT -3’（SEQ ID NO.4），
其对应的限制性核酸内切酶为BsrBI。
特别的，用于检测分子标记13328的dCAPS引物对的核苷酸序列如下所示：
F1 ：5’- GAAGTGTTGGAACTCAAACATCTG -3’ (SEQ ID NO.5)，
R1 ：5’- TCCCTTATTGGTGTTCTTCTGAAC -3’（SEQ ID NO.6），
其对应的限制性核酸内切酶为Hpy188I。
识别或检测上述SNP分子标记的分子探针或引物对在选育高蔗糖/葡萄糖比值辅助育种中的应用。
一种用于南瓜高蔗糖/葡萄糖比值辅助育种的试剂盒，其包括识别或扩增上述SNP分子标记的分子探针或引物对。
一种南瓜辅助育种的方法，包括提取南瓜基因组DNA，检测上述SNP分子标记的类型，根据SNP类型确定南瓜品种蔗糖/葡萄糖比值高低。
本发明的有益效果是：
本发明对南瓜蔗糖/葡萄糖比值的数量性状位点进行了QTL定位，并筛选得到了与南瓜蔗糖/葡萄糖比值QTL紧密连锁的分子标记26139和分子标记13328，两标记间的遗传距离为0.229cM，定位的QTL位点对该数量性状存在显著关联关系（p<0.05），且贡献率较高，分子标记26139的解释概率为11.9%，分子标记13328的解释概率为11.6%。通过这两个分子标记可以预测南瓜蔗糖/葡萄糖比值的高低，为实现南瓜蔗糖/葡萄糖比值性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。
附图说明
图1 为可溶性糖含量图；
图2 为南瓜蔗糖/葡萄糖比值在高密度遗传连锁图谱的初步定位结果图：横坐标表示连锁群的位置，纵坐标表示LOD值；红线表示所有的LOD值拟合后的结果；虚线标记的阈值是代表p<0.05的关联阈值，表示关联性显著；实线标记的LOD值是该连锁群的阈值；
图3 为南瓜蔗糖/葡萄糖比值所在的19号连锁群的紧密连锁区间，左边为连锁群的遗传距离（cM）, 右边为标记的编号，suc/glu为蔗糖/葡萄糖基因所在位点；
图4为分子标记26139的PCR扩增后酶切结果：P1、P2分别为低蔗糖/葡萄糖比值母本和高蔗糖/葡萄糖比值父本的酶切带型，其中P1不能被酶切，片段长度为285 bp，P2酶切完全，仅有一条259 bp片段；F1部分酶切，存在285 bp和259 bp的片段，F2群体的随机单株中存在P1，P2和F1的三种类型；
图5为分子标记13328的PCR扩增后酶切结果：P1、P2分别为低蔗糖/葡萄糖比值母本和高蔗糖/葡萄糖比值父本的酶切带型，其中P1酶切完全，仅有一条216 bp片段，P2不能被酶切，片段长度为243bp；F1部分酶切，存在216 bp和243 bp的片段，F2群体的随机单株中存在P1，P2和F1的三种类型。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括 DNA 提取、PCR 扩增、PAGE 凝胶电泳、酶切、转化等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社 ) ，或按照制造厂商所建议的条件。
一、遗传群体的构建及遗传分析
1、供试材料：低蔗糖/葡萄糖比值材料是从泰国引进分离获得的高代自交系，命名为CMO-E(P1)，而高蔗糖/葡萄糖比值材料是广东本地获得的高代自交系，命名为CMO-X(P2)。CMO-E和CMO-X杂交获得 F1，F1自交得F2，用作遗传分析和定位群体。
2、供试材料果实蔗糖/葡萄糖比值的确定和遗传规律分析
将200株F2群体单株果实以及父母本粉碎，冷冻干燥后研磨，称取各样品粉末20mg，以乙腈：水（5：5，v:v ，HPLC级）作为提取液，用冷冻离心机（5417R，Eppendorf）在12000 r · min-1、4 ℃下离心15 min，获得可溶性糖提取液，采用高效液相色谱（HPLC）测定果实可溶性糖含量（图1），用测得的蔗糖含量与葡萄糖含量计算出蔗糖/葡萄糖比值，结果如表1所示。
表1 P1、P2、F1及32个F2群体单株果实的蔗糖/葡萄糖比值
| F2株系 | 蔗糖/葡萄糖 | F2株系 | 蔗糖/葡萄糖 | F2株系 | 蔗糖/葡萄糖 |
| P1 | 0.278049932 | 90 | 1.003826531 | 334 | 0.940315201 |
| P2 | 7.258323305 | 92 | 2.484316654 | 347 | 0.909335727 |
| F1 | 2.351181498 | 175 | 6.490124024 | 41 | 4.446123755 |
| 1 | 4.432552624 | 141 | 2.118899522 | 362 | 6.197194719 |
| 9 | 4.826410415 | 217 | 0.664734075 | 8 | 3.117893136 |
| 25 | 2.707757206 | 231 | 2.52532391 | 127 | 3.875064004 |
| 74 | 2.423744721 | 244 | 10.21023428 | 145 | 3.406168111 |
| 30 | 3.651238897 | 184 | 3.309087474 | 154 | 5.548148148 |
| 36 | 1.403899721 | 269 | 1.880741027 | 250 | 1.236064114 |
| 58 | 1.171582278 | 299 | 6.837133183 | 307 | 2.473593372 |
| 59 | 3.036698446 | 292 | 3.234451433 | 332 | 1.590492184 |
| 82 | 2.108345979 | 315 | 2.685942787 |
用Excel 2016处理数据，检测是否服从正态分布。
二、南瓜遗传图谱构建和蔗糖/葡萄糖比值高低的初步定位
1、南瓜基因组DNA的提取
使用CTAB法提取南瓜亲本及200株F2群体基因组DNA，提取的单株DNA用于文库构建。
2、遗传图谱构建
本研究前期委托深圳恒创生物科技有限公司利用ddRAD技术进行高通量测序，一共 202 个样本，采用EcoRI和AlnⅢ进行酶切，末端修复、添加测序接头、 PCR 扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先使用 Qubit2.0 进行初步定量，稀释文库至 1ng/μl，随后使用 Agilent 2100对文库的 insert size 进行检测，以保证文库质量。将合格的文库，根据数据量预算，进行IlluminaHiSeq测序。插入片段长度为 500bp；测序类型为PE150；去掉用于区分样品的标签序列（4～8bp），实际Read 长度为 142～146bp。通过聚类比较检测出RAD-tags 上的 SNPs 集。
对初始 SNP 集进行过滤，可得到较为可靠的基因型数据。共开发18314个SNP标记，缺失率小于20%，选取3470个高质量SNP，利用Joinmap软件将LOD值设为6.0构建高密度分子标记遗传图谱，图谱共分为20个连锁群，总图距3087.03cM，平均标记间图距0.89cM，最短连锁群87.30cM，最长274.47cM。
3、蔗糖/葡萄糖比值基因suc/glu的精细定位
利用 MapQTL5 软件采用复合区间作图法(MQM) 对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算以获得性状相关的 QTL，置换检验次数设为 1000，QTL 判断标准为：p 值小于 0.05时对应的 LOD 值作为筛选的阈值，图中以虚线表示。超过阈值表示为一个基因的连锁定位区间，虚线的LOD值为7.2，一个group代表一个连锁群，以3.0作为group的LOD阈值，超过阈值表示为1个QTL，将蔗糖/葡萄糖比值基因suc/glu精细定位在19号连锁群（图2），定位在两个SNP标记26139和13328之间，区间从110.009 cM到110.238 cM（图3），其中SNP标记26139包括序列：
TCGAATCCTGTTTCTGTTTGAATATGTAGGAAACTTATCGAATTTTTAGTAGGTTTAGGTCGAGCTCGATTATAGACATTATTCGCTATAGAAACTGTTGAATTTTCAATTGATTGCTGCAAAATATGGATTATGACTTGATCTTCAAGAAGAGGGAAATGTCTGAATATATATGATAGATATGAAAAAGAGGAGGCTAGATGTACTTAATTTCTTCTTTGATTTTAATTGAAGAAGCCTATATTGTTAACTCTGTATTGAATGGCCATTTCATTATACCATA（SEQ ID NO: 1），其中下划线标记的G具有G→C的变化（即自5’端起第260位碱基是SNP位点，其碱基为G或C）。
SNP标记13328包括序列：
GAAGTGTTGGAACTCAAACACTTGATGTTCTTGATTTTCCAAAAACCTCTGGATATCGAGTTCCATTCGCAGAACTATGGTGACAATTAAACTACAATGAGCAGAGAAAATCTAACAAAAGCATAACTCAACGAACAAAAACCTAAAGTAAATGGCCATAAGATCTAAGAGTACTAAGCATAGGGCATCAAAATTGGGGCAAAAACTGAAACCCTTCGTTCAGAAGAACACCAATAAGGGA（SEQ ID NO: 2），其中下划线标记的A具有A→C的变化（即自5’端起第25位碱基是SNP位点，其碱基为A或C）。
三、dCAPS分子标记开发、扩增、酶切验证
根据分子标记26139和分子标记13328的SNPs标记信息，使用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm)和Genetool分别设计衍生的酶切多态性扩增序列（dCAPS）引物的错配引物和另一侧的引物，完成从SNPs向dCAPS标记的转化。26139和13328的错配碱基数都为2个。
用于扩增分子标记26139的引物序列如下所示：
F1 ：5’- TCGAATCCTGTTTCTGTTTGAAT -3’ (SEQ ID NO.3)，
R1 ：5’- TATGGTATAATGAAATGGCCGCT -3’（SEQ ID NO.4）；
当该SNP位点在两个等位基因中的碱基均为G时，PCR产物可被限制性核酸内切酶BsrBI识别并切割，产生259bp的片段，可以判断与分子标记26139紧密连锁的蔗糖/葡萄糖比值在果实中为高蔗糖/葡萄糖比值；当该SNP位点在两个等位基因中的碱基均为C时，PCR产物不能被限制性核酸内切酶BsrBI识别并切割，具有285 bp的片段，可以判断南瓜果实具有低蔗糖/葡萄糖比值；当该SNP位点在两个等位基因中的碱基一个为G一个为C时，则存在259 bp和285 bp的片段，南瓜果实具有高蔗糖/葡萄糖比值。
用于扩增分子标记13328的引物序列如下所示：
F1 ：5’- GAAGTGTTGGAACTCAAACATCTG -3’ (SEQ ID NO.5)，
R1 ：5’- TCCCTTATTGGTGTTCTTCTGAAC -3’（SEQ ID NO.6），
当该SNP位点在两个等位基因中的碱基均为A时，PCR产物可被限制性核酸内切酶Hpy188I识别并切割，产生216bp的片段，可以判断与分子标记13328紧密连锁的南瓜蔗糖/葡萄糖比值在果实中为低比值蔗糖/葡萄糖；当该SNP位点在两个等位基因中的碱基均为C时，PCR产物不能被限制性核酸内切酶Hpy188I识别并切割，只有243 bp的片段，可以判断南瓜果实为高蔗糖/葡萄糖比值南瓜；当该SNP位点在两个等位基因中的碱基一个为A一个为C时，则存在216 bp和243 bp的片段，南瓜果实含有高蔗糖/葡萄糖比值。
PCR扩增体系使用20 μL的扩增体系，包含1U Taq酶，1 μL模板DNA，1 μL的dNTP，1.5 μL引物，2 μL的10 QUOTE×PCR buffer，加ddH2O至20 μL。PCR扩增程序为：94℃ 3min，循环过程为 94℃ 30s、退火30 s、72℃ 1 min、30个循环，最后 72℃延伸 10 min。26139引物的退火温度为54℃，13326的退火温度为54℃。
在两亲本间进行PCR扩增，分别经过限制性内切酶BsrBI和Hpy188I进行酶切后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（图4和图5）。
实验数据表明亲本间表现特异，鉴定F2群体单株32个，两个标记的结果一致，且果实蔗糖/葡萄糖比值与双酶切结果一致，上述两个SNP标记可以将高蔗糖/葡萄糖比值和低蔗糖/葡萄糖比值区分开。
使用其他公知的方法对分子标记26139和分子标记13328进行检测，确定其SNP情况，也可以达到相同的目的。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
序列表
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所
<120> 与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用
<141> 2017-06-21
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 283
<212> DNA
<213> 南瓜
<220>
<221> allele
<222> (260)..(260)
<223> SNP位点，G/C
<400> 1
tcgaatcctg tttctgtttg aatatgtagg aaacttatcg aatttttagt aggtttaggt 60
cgagctcgat tatagacatt attcgctata gaaactgttg aattttcaat tgattgctgc 120
aaaatatgga ttatgacttg atcttcaaga agagggaaat gtctgaatat atatgataga 180
tatgaaaaag aggaggctag atgtacttaa tttcttcttt gattttaatt gaagaagcct 240
atattgttaa ctctgtattg aatggccatt tcattatacc ata 283
<210> 2
<211> 241
<212> DNA
<213> 南瓜
<220>
<221> allele
<222> (25)..(25)
<223> SNP位点，C/A
<400> 2
gaagtgttgg aactcaaaca cttgatgttc ttgattttcc aaaaacctct ggatatcgag 60
ttccattcgc agaactatgg tgacaattaa actacaatga gcagagaaaa tctaacaaaa 120
gcataactca acgaacaaaa acctaaagta aatggccata agatctaaga gtactaagca 180
tagggcatca aaattggggc aaaaactgaa acccttcgtt cagaagaaca ccaataaggg 240
a 241
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
tcgaatcctg tttctgtttg aat 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
tatggtataa tgaaatggcc gct 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
gaagtgttgg aactcaaaca tctg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
tcccttattg gtgttcttct gaac 24
Claims (7)
1.可识别或扩增与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记的分子探针或引物对，所述分子标记为分子标记26139或分子标记13328，定位于中国南瓜19号连锁群上，分别位于蔗糖/葡萄糖基因两侧；其中，分子标记26139包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其同源SNP序列，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第260位碱基是SNP位点，其碱基为G或C；分子标记13328包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其同源SNP序列，SEQ IDNO.2所示序列自5’端起第25位碱基是SNP位点，其碱基为A或C。
2.根据权利要求1所述的分子探针或引物对，其特征在于：引物对为dCAPS引物对。
3.根据权利要求2所述的分子探针或引物对，其特征在于：用于检测分子标记26139的dCAPS引物对的核苷酸序列如下所示：
F1 ：5’- TCGAATCCTGTTTCTGTTTGAAT -3’ (SEQ ID NO.3)，
R1 ：5’- TATGGTATAATGAAATGGCCGCT -3’（SEQ ID NO.4），
其对应的限制性核酸内切酶为BsrBI。
4.根据权利要求2所述的分子探针或引物对，其特征在于：用于检测分子标记13328的dCAPS引物对的核苷酸序列如下所示：
F1 ：5’- GAAGTGTTGGAACTCAAACATCTG -3’ (SEQ ID NO.5)，
R1 ：5’- TCCCTTATTGGTGTTCTTCTGAAC -3’（SEQ ID NO.6），
其对应的限制性核酸内切酶为Hpy188I。
5.识别或检测与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记的分子探针或引物对在选育高蔗糖/葡萄糖比值辅助育种中的应用，所述分子标记为分子标记26139或分子标记13328，定位于中国南瓜19号连锁群上，分别位于蔗糖/葡萄糖基因两侧；其中，分子标记26139包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其同源SNP序列，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第260位碱基是SNP位点，其碱基为G或C；分子标记13328包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其同源SNP序列，SEQ ID NO.2所示序列自5’端起第25位碱基是SNP位点，其碱基为A或C。
6.一种用于南瓜高蔗糖/葡萄糖比值辅助育种的试剂盒，其包括识别或扩增与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记的分子探针或引物对，所述分子标记为分子标记26139或分子标记13328，定位于中国南瓜19号连锁群上，分别位于蔗糖/葡萄糖基因两侧；其中，分子标记26139包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其同源SNP序列，SEQID NO.1所示序列自5’端起第260位碱基是SNP位点，其碱基为G或C；分子标记13328包含SEQID NO.2所示的核苷酸序列或其同源SNP序列，SEQ ID NO.2所示序列自5’端起第25位碱基是SNP位点，其碱基为A或C。
7.一种南瓜辅助育种的方法，包括提取南瓜基因组DNA，检测与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记的类型，根据SNP类型确定南瓜品种蔗糖/葡萄糖比值高低，其中，所述分子标记为分子标记26139或分子标记13328，定位于中国南瓜19号连锁群上，分别位于蔗糖/葡萄糖基因两侧；其中，分子标记26139包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其同源SNP序列，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第260位碱基是SNP位点，其碱基为G或C；分子标记13328包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其同源SNP序列，SEQ ID NO.2所示序列自5’端起第25位碱基是SNP位点，其碱基为A或C。
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| CN201710474621.7A CN107365835B (zh) | 2017-08-28 | 2017-08-28 | 与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN201710474621.7A CN107365835B (zh) | 2017-08-28 | 2017-08-28 | 与南瓜蔗糖/葡萄糖比值主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其应用 |
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2017
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Non-Patent Citations (3)
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| A genetic map of melon highly enriched with fruit quality QTLs and EST markers, including sugar and carotenoid metabolism genes;R. Harel-Beja et al.;《Theor Appl Genet》;20101231;第121卷;第511–533页 * |
| 南瓜作物分子标记辅助育种研究进展;谭行之等;《中国瓜菜》;20101231;第23卷(第3期);第37-40页 * |
| 南瓜遗传连锁图谱的构建及粒宽性状的ＱＴＬ定位;谭行之等;《西北植物学报》;20131231;第33卷(第4期);第697-702页 * |
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