CN116574828B - 与南瓜可溶性固形物含量主效qtl连锁的kasp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与南瓜可溶性固形物含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用，属于分子生物学检测技术及南瓜遗传育种技术领域。所述分子标记包括分子标记345661和分子标记345718中的至少一种；分子标记345661的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子标记345718的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记345661和分子标记345718定位于南瓜15号染色体，且位于4849183‑4939469bp区段内。本发明的分子标记与南瓜果肉可溶性固形物含量呈现紧密连锁标记特征，通过KASP技术获得SNP分型，可以灵敏、高效、低成本的预测果实可溶性固形物含量，推动南瓜分子育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术及南瓜遗传育种技术领域，特别是涉及与南瓜可溶性固形物含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用。
背景技术
南瓜是葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbita)的一年生草本作物，是一种重要菜粮兼用作物，在我国南北方具有较大的种植面积，其果实富含类胡萝卜素、多糖、碳水化合物和人体所需的17种氨基酸，具有抗细菌、降胆固醇、抗氧化、降血糖、免疫调节、抗突变、驱虫和抗癌等功能，具有极高的食用、药用和保健价值。可溶性固形物是指液体或流体食品中所有溶解于水的化合物的总称，包括糖(多糖、单双糖、果胶)、酸、维生素、矿物质等。可溶性固形物含量是影响果肉口感和风味的重要因素，是果实内部品质检测和评价的重要指标，也一直是南瓜品种改良过程中非常重要的目标性状。
单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括碱基的颠换、转换、插入和缺失。SNP在植物基因组中出现频率高，作为新一代的分子标记，可高效检测群体内变异情况。QTL mapping是在全基因组范围内推断一组数量性状的不同基因组位置的基因型与表型之间的关系，即QTL的数量、基因组位置、效应和相互作用。QTL图谱的主要目的是对显著影响群体中数量性状变异的染色体区域进行定位。竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR，KASP)是一种基于荧光的同质基因分型技术，在DNA样品中对特定位点上的SNPs和InDels进行精准的双等位基因检测。通过上述标记的筛选，可提高南瓜可溶性固形物含量筛选的效率，节约育种成本，最终提高南瓜的经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供与南瓜可溶性固形物含量主效QTL连锁的KASP分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的分子标记与南瓜果肉可溶性固形物含量呈现紧密连锁标记特征，通过KASP技术获得SNP分型，可以准确、高效、低成本的鉴定南瓜果实可溶性固形物含量性状，为南瓜品种的选育提供有力的技术支持，从而推动南瓜品质育种改良的进程。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种与南瓜可溶性固形物含量主效QTL连锁的分子标记，所述分子标记包括分子标记345661和分子标记345718中的至少一种；所述分子标记345661的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记345718的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述分子标记345661和分子标记345718定位于南瓜15号染色体上，且均位于4849183-4939469bp区段内。
进一步地，所述分子标记345661在第151位碱基处存在A/G突变；所述分子标记345718在第151位碱基处存在C/G突变。
本发明还提供一种检测所述分子标记的KASP引物组，检测所述分子标记345661的KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物R；
检测所述分子标记345718的KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物R。
本发明还提供一种所述分子标记的检测试剂或检测试剂盒，包所述的KASP引物组。
本发明还提供一种所述的分子标记、所述的KASP引物组或所述的检测试剂或检测试剂盒的应用，用于如下任一项应用中：
(1)鉴定南瓜可溶性固形物含量；
(2)筛选高低可溶性固形物含量的南瓜品种或品系；
(3)南瓜分子标记辅助育种；
(4)改良南瓜种质资源。
本发明还提供一种鉴定南瓜可溶性固形物含量高低的方法，包括如下步骤：
以待测南瓜样品的基因组DNA作为模板，利用所述的KASP引物组或所述的检测试剂或检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果判断南瓜可溶性固形物含量高低。
进一步地，在利用分子标记345661基因分型检测可溶性固形物含量分布时，当分子标记345661所在的等位基因中均为A时，检测样品会与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR反应的指数增长，蓝色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中可溶性固形物含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAM)；当所在位点的等位基因碱基均为G时，检测样品会与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着PCR循环数的增加，绿色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实高可溶性固形物含量的基因型(KASP标记的分型结果定义为：HEX)；
在利用分子标记345718基因分型检测可溶性固形物含量分布时，当分子标记345718所在的等位基因中均为C时，检测样品会与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR循环数的增加，蓝色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中可溶性固形物含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAM)；当分子标记345718所在的等位基因中均为G时，检测样品会与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着PCR反应的指数增长，绿色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中可溶性固形物含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：HEX)。
进一步地，所述荧光定量PCR扩增的程序为：94℃预变性15min，94℃变性20s，65-75℃梯度复性/延伸1min，10个循环；94℃变性20s，57℃复性/延伸1min，30个循环。
进一步地，所述荧光定量PCR扩增的体系为：2×PARMS master mix 5μL，上游引物F1 0.15μL，上游引物F2 0.15μL，下游引物R 0.4μL和DNA模板10-100ng，总体积为10μL。
本发明公开了以下技术效果：
本发明首次对南瓜的RIL群体的南瓜可溶性固形物含量进行了数量性状定位，筛选得到了两个与南瓜可溶性固形物含量连锁的分子标记345661和分子标记345718，针对分子标记345661和分子标记345718进行KASP标记开发，通过KASP技术获得SNP分型，能快速批量的对南瓜可溶性固形物含量性状进行鉴定，为南瓜品种的选育提供有力的技术支持，有助于南瓜的分子育种改良，与传统育种筛选相比，本方法可快速筛选与鉴定高可溶性固形物含量的材料，既避免了环境因素对可溶性固形物含量性状的影响，又极大的缩短了育种周期，是一种高效、先进的育种手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为南瓜可溶性固形物基因在高密度遗传连锁图谱的初步定位结果图：横坐标表示连锁群的位置，纵坐标表示LOD值；灰色横线标记的阈值是代表P<0.05的关联阈值，表示关联性显著；
图2为分子标记345661的荧光信号基因分型结果，绿色为基因型HEX，蓝色为基因型FAM；
图3为分子标记345718的荧光型号基因分型结果，绿色为基因型HEX，蓝色为基因型FAM。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1遗传群体的构建及遗传分析
(1)供试植物材料的选择：
在下述实施例中，供试植物材料以中国南瓜高代自交系COM-E(高可溶性固形物P1)和COM-X(低可溶性固形物P2)为亲本构建含有122个株系的重组自交群体F8(材料由广东省农业科学院蔬菜研究所钟玉娟研究员提供)，于2019年春季种植于广东省农业科学院蔬菜研究所白云基地试验田内。
(2)南瓜果实可溶性固形物含量的测定和遗传规律分析：
将上述122株RIL群体单株南瓜新鲜果肉，用搅拌机磨成匀浆后尼龙纱网过滤，将过滤后的南瓜液置于手持糖量折光仪上，测定其可溶性固形物(Brix)含量，试验重复3次，测定南瓜果实鲜样品中可溶性固形物的含量，结果如表1。
表1 122份RIL群体单株南瓜果实鲜样品中可溶性固形物的含量
实施例2南瓜遗传图谱构建和可溶性固形物含量高低的初步定位
(1)南瓜基因组DNA的提取：
后续文库构建需要的DNA使用本领域常规的CTAB法提取。分别提取南瓜亲本(COM-E和COM-X)及122株RIL群体的基因组DNA。
(2)遗传图谱的构建：
利用重测序技术和HighMap软件对上述中国南瓜RIL重组自交群体开发高密度SNP，并进行遗传图谱的构建。
(3)可溶性固形物含量基因的QTL定位：
利用MapQTL5软件采用复合区间作图法(MQM)对上述收集得到的群体表型数据和遗传图谱信息进行分析和计算，以获得性状相关的QTL。通过置换检测(Permutationtest，PT)检验1000次，以进行阈值设定。其中，QTL判断标准为：p值小于0.05时对应的LOD值作为筛选的阈值。
如图1所示，图中灰色的部分为筛选的阈值范围。而超过阈值表示为一个基因的连锁定位区间，从图1可以看出，可溶性固形物基因定位在15号染色体，定位在15号染色体的两个SNP标记345661和345718之间，区间从4849183bp到4939469bp。
其中，经过测序可得SNP标记345661的序列为：
其中，下划线加粗标记的A具有A→G的变化(即自SEQ ID NO.1所示序列的5’端起第151位碱基是SNP位点，其碱基为A或G)。
SNP标记345718的序列为：
其中，下划线加粗标记的C具有C→G的变化(即自SEQ ID NO.2所示序列的5’端起第151位碱基是SNP位点，其碱基为C或G)。
实施例3KASP分子标记的开发和验证
1.KASP分子标记的开发
根据上述实施例中获得的分子标记345661和分子标记345718的SNPs标记信息，设计KASP引物。在发明实施实例中，其设计得到的KASP引物由3条序列组成：上游引物F1、上游引物F2和下游引物R。其中，上游引物F1和F2分别带有FAM(下划曲线部分)和HEX(下划虚线部分)荧光接头。下游引物R与普通PCR引物结构一样。上游引物(上游引物F1和上游引物F2)则由依次由3个部分组成：通用接头序列、普通扩增引物序列和分型位点序列。
其中，用于扩增分子标记345661的具体KASP引物序列如下所示：
上游引物F1：
上游引物F2：
其中，上游引物中的下划直线部分为通用接头序列，斜体部分为普通扩增引物序列，3’末尾的加粗的一个碱基A(针对SEQ ID NO.3)和G(针对SEQ ID NO.4)为分型位点(序列)。
下游引物R：5’-AATCTTATGAAGGGACCATAGGATT-3’(SEQ ID NO.5)。
用于扩增分子标记345718的具体KASP引物序列如下所示：
上游引物F1：
上游引物F2：
其中，上游引物中的下划直线部分为通用接头序列，斜体部分为普通扩增引物序列，3’末尾的加粗的一个碱基C(针对SEQ ID NO.6)和G(针对SEQ ID NO.7)为分型位点(序列)。
下游引物R：5’-GGTTTCCTTTTCACTTTTCTGATC-3’(SEQ ID NO.8)。
分别利用分子标记345661和分子标记345718基因分型检测可溶性固形物含量分布，PCR检测体系如表2所示，反应条件如表3所示，PCR完成后，使用TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果(图2和图3)。
表2 PCR检测体系
| 试剂 | 体积 | 终浓度 |
| 2×PARMS master mix | 5μL | 1× |
| 上游分型F1(10μM) | 0.15μL | 150nM |
| 上游分型F2(10μM) | 0.15μL | 150nM |
| 下游引物R(10μM) | 0.4μL | 400nM |
| DNA template | 10-100ng | 10-100nM |
| ddH2O | 补至10μL |
表3 PCR反应条件
由图2可知，在利用分子标记345661基因分型检测可溶性固形物含量分布时，当分子标记345661所在的等位基因中均为A时，检测样品会与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR反应循环数的增加，蓝色荧光信号增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中可溶性固形物含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAM)。当该位点的等位基因碱基均为G时，检测样品与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着PCR反应循环数的增加，绿色荧光信号被增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中可溶性固形物含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：HEX)。
由图3可知，在利用分子标记345718基因分型检测可溶性固形物含量分布时，当分子标记345718所在的等位基因中均为C时，检测样品与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR反应循环数的增加，蓝色荧光信号增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中可溶性固形含量低的基因型(KASP标记的分型结果定义为：FAM)。当分子标记345718所在的等位基因中均为G时，检测样品与特定的HEX检测引物结合并释放出绿色荧光基团，随着PCR反应循环数的增加，绿色荧光信号增强，从而可以通过荧光颜色判断其为南瓜果实中可溶性固形物含量高的基因型(KASP标记的分型结果定义为：HEX)。
2.KASP分子标记的验证
采用本文所用的两个分子标记345661和分子标记345718的荧光信号对122份RIL群体单株南瓜果实鲜样品进行KASP分型分析，分子标记345661和分子标记345718都将高可溶性固形物含量的材料归于HEX中，低可溶性固形物量的材料归于FAM中。
实验结果显示本文所用的两个标记的荧光信号可对RIL群体中122个样本进行有效的分群，并且分群结果能将高可溶性固形物含量和低可溶性固形物含量区分开，其中低可溶性固形物含量的样本归为两个标记的同一个基因型FAM中，高可溶性固形物含量的样本归为两个标记的同一个基因型HEX中，从而表明两个标记可以用于高可溶性固形物含量材料的筛选。
若使用其他公知的方法对分子标记345661和分子标记345718进行检测，确定其SNP情况，也可以达到相同的目的。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种与南瓜可溶性固形物含量主效QTL连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括分子标记345661和分子标记345718中的至少一种；所述分子标记345661的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，在第151位碱基处存在A/G突变；所述分子标记345718的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示，在第151位碱基处存在C/G突变。
2.一种检测权利要求1所述分子标记的KASP引物组，其特征在于，检测所述分子标记345661的KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO .5所示的下游引物R；检测所述分子标记345718的KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO .6所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO .7所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQ ID NO .8所示的下游引物R。
3.一种权利要求1所述分子标记的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的KASP引物组。
4.一种权利要求2所述的KASP引物组或权利要求3所述的检测试剂盒的应用，其特征在于，用于如下任一项应用中：
(1)鉴定南瓜可溶性固形物含量；
(2)筛选高低可溶性固形物含量的南瓜品种或品系。
5.一种鉴定南瓜可溶性固形物含量高低的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测南瓜样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求2所述的KASP引物组或权利要求3所述的检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果判断南瓜可溶性固形物含量高低；
若扩增结果显示释放出绿色荧光，则判断待测南瓜样品可溶性固形物含量高；若扩增结果显示释放出蓝色荧光，则判断待测南瓜样品可溶性固形物含量低。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的程序为：94℃预变性15min，94℃变性20s，65-75℃梯度复性/延伸1min，10个循环；94℃变性20s，57℃复性/延伸1min，30个循环。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的体系为：2×PARMSmastermix 5μL，上游引物F1 0.15μL，上游引物F2 0.15μL，下游引物R 0.4μL和DNA模板10-100ng，总体积为10μL。
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