CN117487947A - 水稻光温敏雄性核不育kasp分子标记、试剂盒和应用 - Google Patents

水稻光温敏雄性核不育kasp分子标记、试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了水稻光温敏雄性核不育KASP分子标记、试剂盒和应用，属于分子标记技术领域。本发明提供的水稻光温敏雄性核不育KASP分子标记，包括组1引物tms5‑KASP‑FAM、tms5‑KASP‑HEX、tms5‑KASP‑R；组2引物pms3‑KASP‑FAM、pms3‑KASP‑HEX、pms3‑KASP‑R的至少一种。本发明应用时安全环境友好、快捷高效、可大规模高通量同时检测两系杂交稻生产中使用的水稻光温敏雄性核不育基因tms5和pms3，能够用于检测区分水稻品种所携带光温敏雄性核不育基因，辅助水稻两系不育系的高效选择、改良及不育系繁制种中种子纯度检测。

Description

水稻光温敏雄性核不育KASP分子标记、试剂盒和应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及水稻光温敏雄性核不育KASP分子标记、试剂盒和应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，养活了世界三分之一人口。基于光温敏雄性核不育系的两系法杂交稻在当今中国水稻生产中占据重要位置。选育遗传背景丰富、综合农艺性状良好的光温敏雄性核不育系是杂交稻发展的主要方向。相较于传统育种方式，分子标记辅助选择技术通过在水稻苗期进行DNA水平上的鉴定和定向选择，避免了传统育种中耗时久、表型精确鉴定难等弊端，有效提高了水稻品种选育的效率，提高了复杂性状改良的可能性，节省了土地、人力、时间成本，是分子育种的主要技术手段之一，是实现“精确育种”的基础。
相较于传统的通过水稻田间表型判断其育性的方法，如抽穗期花粉镜检和套袋收获后结实率检测，使用分子标记辅助选择可在苗期进行大规模的高效筛选，节省时间和田间种植成本。分子标记辅助选择具有更高的准确率，避免了因串粉造成高结实率而误判水稻单株的育性。分子标记检测不受环境影响，避免了因突发低温天气、日长变化造成光温敏不育系结实而误判水稻单株的育性。目前，针对光温敏雄性核不育基因开发了CAPS分子标记，但需经PCR扩增、数小时甚至过夜酶切再跑胶检测，繁琐耗时长、检测效率低；所用的聚丙烯酰胺、甲醛、琼脂糖凝胶染料、跑胶缓冲液等有毒有害试剂危害人体健康且污染环境；只能检测单个光温敏不育基因携带情况；无法满足高通量检测的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种安全环境友好的、快捷高效、可大规模高通量同时检测两系杂交稻生产上使用的所有光温敏雄性核不育基因的KASP分子标记及其试剂盒，能够用于检测区分水稻品种是否携带光温敏不育基因tms5和pms3，辅助水稻两系不育系的高效选择、改良及不育系繁制种中种子纯度检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种水稻光温敏雄性核不育KASP分子标记，包括以下两组引物：组1引物包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示的tms5-KASP-FAM、tms5-KASP-HEX和tms5-KASP-R；组2引物包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示的pms3-KASP-FAM、pms3-KASP-HEX和pms3-KASP-R。
本发明还提供了上述KASP分子标记在制备鉴定水稻光温敏雄性核不育系产品中的应用。
优选的，所述产品包括试剂盒。
本发明还提供了一种鉴定水稻光温敏雄性核不育系的试剂盒，包括上述的KASP分子标记。
优选的，所述组1引物中tms5-KASP-FAM、tms5-KASP-HEX和tms5-KASP-R的摩尔浓度比为12:12:30；所述组2引物中pms3-KASP-FAM、pms3-KASP-HEX和pms3-KASP-R的摩尔浓度比为12:12:30。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照模板DNA和阴性对照，所述阳性对照模板DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-10所示。
本发明还提供了上述KASP分子标记或上述试剂盒在鉴定水稻光温敏雄性核不育系中的应用。
本发明还提供了一种鉴定水稻光温敏雄性核不育系的方法，包括如下步骤：以待测水稻基因组为模版，采用上述的KASP分子标记或上述试剂盒对模板进行PCR扩增，扩增结束后进行荧光数据快速读取和基因聚类分型；
检测结果判定为：若样品发荧光的圆点分布靠近X-FAM轴，则判断该水稻样品为纯合野生型可育株；若样品发荧光的圆点分布靠近Y-HEX轴，则判断该水稻样品为纯合突变型光温敏雄性核不育株；若样品发荧光的圆点分布靠近X-FAM轴与Y-HEX轴的对称区域轴，则判断该水稻样品为杂合型可育株。
优选的，所述PCR扩增的体系以10μL计，包括样品DNA模板5μL，KASP PCR MIX 4.86μL和引物0.14μL。
优选的，所述PCR扩增的程序为：94℃15min，1个循环；94℃20s，62℃，每经历一个循环降低0.6℃，60s，10个循环；94℃20s，56℃60s，28个以上循环。
本发明的有益效果：
本发明相较于传统的田间表型判断水稻育性的方法，可在苗期进行大规模的高效筛选，节省时间和田间种植成本；具有更高的准确率，避免了因串粉造成高结实率而误判水稻单株的育性。本发明提供的分子标记检测不受环境影响，避免了因突发低温天气造成温敏不育系结实而误判水稻单株的育性。相较于SSR、CAPS等传统PCR分子标记，本发明KASP标记检测不依赖酶切、凝胶电泳等繁琐耗时步骤，检测效率高，重复性好，可高通量规模化筛查(每2-5秒钟可完成94或382个样本的荧光数据读取和基因分型)。无需使用EB、TAE、TBE、聚丙烯酰胺、甲醛等危害人体健康，污染环境的有毒有害试剂。本发明相较于测序，更便宜、仪器设备要求低。本发明相较于单一光温敏核不育基因检测分子标记，可一次检测目前两系不育系生产上使用的所有光温敏不育基因，辅助选育聚集多个光温敏不育基因的、不育起点温度更低、育性更稳定的不育系。
附图说明
图1为组1引物混合物检测结果，其中靠近X-FAM轴显示蓝色的圆点表示纯合TMS5TMS5野生型的可育株，靠近Y-HEX轴显示红色的圆点表示纯合tms5tms5突变型的不育株，靠近X-FAM轴与Y-HEX轴对称区域显示绿色的圆点表示TMS5tms5杂合型的可育株，黑色圆点表示该样品不发荧光，是NTC；
图2为花粉镜检和测序结果，其中A-M为花粉镜检结果(A.滇屯502、B.云籼650、C.云恢290、D.云恢9801、E.中恢8015、F.七S、G.1892S、H.C815S、I.广占63S、J.云13S、K.F1-1、L.F1-2、M.F1-3)，N-R为不育系tms5基因测序结果(N.七S、O.1892S、P.C815S、Q.广占63S、R.云13S)；
图3为组1引物混合物检测结果，靠近X-FAM轴显示蓝色的圆点表示该样品是纯合TMS5TMS5野生型的可育株，靠近Y-HEX轴显示红色的圆点表示该样品是纯合tms5tms5突变型的不育株，靠近X-FAM轴与Y-HEX轴对称区域显示绿色的圆点表示该样品是TMS5tms5杂合型的可育株，黑色圆点表示该样品不发荧光，是NTC；
图4为图3检测结果中的不育株系tms5基因测序结果(A.孔B1、B.孔B3、C.孔B4、D.孔B8、E.孔B10、F.孔C5、G.孔D5、H.孔F9)；
图5为组2引物混合物检测结果，靠近X-FAM轴显示蓝色的圆点表示该样品是纯合PMS3PMS3野生型的可育株，靠近Y-HEX轴显示红色的圆点表示该样品是纯合pms3pms3突变型的不育株，靠近X-FAM轴与Y-HEX轴对称区域显示绿色的圆点表示该样品是PMS3pms3杂合型的可育株，黑色圆点表示该样品不发荧光，是NTC；
图6为花粉镜检和测序结果，其中A-M为花粉镜检结果(A.滇屯502、B.云籼650、C.云恢290、D.云恢41、E.云恢501、F.95076S、G.N5088S、H.七S、I.云粳216S、J.云粳218S、K.F1-1、L.F1-2、M.F1-3)，N-R为不育系pms3基因测序结果(N.95076S、O.N5088S、P.七S、Q.云粳216S、R.云粳218S)；
图7为组2引物混合物检测结果，靠近X-FAM轴显示蓝色的圆点表示该样品是纯合PMS3PMS3野生型的可育株，靠近Y-HEX轴显示红色的圆点表示该样品是纯合pms3pms3突变型的不育株，靠近X-FAM轴与Y-HEX轴对称区域显示绿色的圆点表示该样品是PMS3pms3杂合型的可育株，黑色圆点表示该样品不发荧光，是NTC；
图8为图7检测结果中的不育株系pms3基因测序结果(A.孔A4、B.孔B11、C.孔C6、D.孔D5、E.孔E5、F.孔F5、G.孔G5、H.孔H6)；
图9为其他引物部分分型结果，其中A-D为tms5其他引物及扩增条件分型结果，E-H为pms3其他引物及扩增条件分型结果。
具体实施方式
本发明提供了一种水稻光温敏雄性核不育KASP分子标记，包括以下两组引物：组1引物包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示的tms5-KASP-FAM、tms5-KASP-HEX和tms5-KASP-R；组2引物包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示的pms3-KASP-FAM、pms3-KASP-HEX和pms3-KASP-R。
在本发明所述的组1引物中tms5-KASP-FAM的核苷酸序列为5`-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTaccgggtcggccgaagtc-3`(SEQ ID NO.1)，tms5-KASP-HEX的核苷酸序列为5`-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTaccgggtcggccgaagta-3`(SEQ ID NO.2)，tms5-KASP-R的核苷酸序列为5`-agatgccctccacggggta-3`(SEQ ID NO.3)。在本发明所述的组2引物中pms3-KASP-FAM的核苷酸序列为5`-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgcaaagaagtgcattgtttgtc-3`(SEQ ID NO.4)，pms3-KASP-HEX的核苷酸序列为5`-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgcaaagaagtgcattgtttgtg-3`(SEQ ID NO.5)，pms3-KASP-R的核苷酸序列为5`-agtatctgaactgcgtgttgat-3`(SEQ IDNO.6)。在本发明上述核苷酸序列中，大写碱基为接头序列，用于与荧光标签结合，小写碱基为设计的与目的基因配对的序列。
本发明还提供了上述KASP分子标记在制备鉴定水稻光温敏雄性核不育系产品中的应用。在本发明中，所述产品的种类优选的包括试剂盒。
本发明还提供了一种鉴定水稻光温敏雄性核不育系的试剂盒，包括上述的KASP分子标记。
在本发明所述试剂盒中，组1引物和组2引物分别采用不同的管装，装有组1引物的管中，tms5-KASP-FAM、tms5-KASP-HEX和tms5-KASP-R的摩尔浓度比优选为12:12:30；装有组2引物的管中，pms3-KASP-FAM、pms3-KASP-HEX和pms3-KASP-R的摩尔浓度比优选为12:12:30。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括阳性对照模板DNA和阴性对照，所述阳性对照模板DNA优选的包括tms5-c-fertility模板DNA(SEQ ID NO.7)、tms5-a-sterility模板DNA(SEQ ID NO.8)、pms3-c-fertility模板DNA(SEQ ID NO.9)和pms3-g-sterility模板DNA(SEQ ID NO.10)，上述阳性对照模板DNA的浓度均优选为20ng/ul。在本发明中，所述阴性对照优选的为ddH2O。
本发明还提供了上述KASP分子标记或上述试剂盒在鉴定水稻光温敏雄性核不育系中的应用。
本发明还提供了一种鉴定水稻光温敏雄性核不育系的方法，包括如下步骤：以待测水稻基因组为模版，采用上述的KASP分子标记或上述试剂盒对模板进行PCR扩增，扩增结束后进行荧光数据读取和基因聚类分型；
检测结果判定为：若样品发荧光的圆点分布靠近X-FAM轴，则判断该水稻样品为纯合野生型可育株；若样品发荧光的圆点分布靠近Y-HEX轴，则判断该水稻样品为纯合突变型光温敏雄性核不育株；若样品发荧光的圆点分布靠近X-FAM轴与Y-HEX轴的对称区域轴，则判断该水稻样品为杂合型可育株。
本发明对于待测水稻基因组的具体获取方法没有特殊限定，采用本领域常规基因组提取方法即可。在本发明中，进行PCR扩增时，PCR扩增的体系以10μL计，优选的包括样品DNA模板5μL，KASP PCRMIX 4.86μL和引物0.14μL。在本发明中，所述KASP PCRMIX来自于成都瀚辰光翼2×Master Mix forASPCR V1试剂盒。所述PCR扩增的程序优选为：94℃15min，1个循环；94℃20s，62℃(每经历一个循环降低0.6℃)60s，10个循环；94℃20s，56℃60s，28个以上循环。
扩增结束后优选的用具有FAM，HEX荧光读取能力的酶标仪、读板机或荧光定量PCR进行数据读取和基因聚类分型。在本发明中，由于采用不同的聚类分析软件产生的散点图对圆点会赋予不同的颜色，所以本发明通过是否发荧光以及圆点靠近X-FAM轴还是Y-HEX轴对待测样品进行分类。组1引物检测结果判定为：若样品发荧光的圆点分布靠近X-FAM轴，表示仅检测到tms5-KASP-FAM对应的碱基c，则判断该水稻单株为纯合野生型，为可育株。若样品发荧光的圆点分布靠近Y-HEX轴，表示仅检测到tms5-KASP-HEX对应的碱基a，则判断该水稻单株为纯合突变型，为温敏雄性核不育株。若样品发荧光的圆点分布靠近X与Y轴对称区域，表示同时检测到tms5-KASP-FAM对应的碱基c和tms5-KASP-HEX对应的碱基a，则判断该水稻单株为杂合型，为可育株，其自交下一代中会分离出现纯合突变型不育株。组2引物检测结果判定为：若样品发荧光的圆点分布靠近X-FAM轴，表示仅检测到pms3-KASP-FAM对应的碱基c，则判断该水稻单株为纯合野生型，为可育株。若样品发荧光的圆点分布靠近Y-HEX轴，表示仅检测到pms3-KASP-HEX对应的碱基g，则判断该水稻单株为纯合突变型，为光敏雄性核不育株。若样品发荧光的圆点分布靠近X与Y轴对称区域，表示同时检测到pms3-KASP-FAM对应的碱基c和pms3-KASP-HEX对应的碱基g，则判断该水稻单株为杂合型，为可育株，其自交下一代中会分离出现纯合突变型不育株。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
采用组1引物混合物(混合物体积100μL，其中tms5-KASP-FAM浓度12μM，tms5-KASP-HEX浓度12μM，tms5-KASP-R浓度30μM)检测七S、1892S、C815S、广占63S、云13S共5个携带纯合tms5tms5突变型的温敏雄性不育系和滇屯502、云籼650、云恢290、云恢9801、中恢8015共5个携带纯合TMS5TMS5野生型的常规稻和恢复系，以及云13S与云恢9801杂交F1代的分型结果。
(1)2023年在云南省水富市正季播种以上10个品种及F1代(4月16日播种)，孕穗期日平均气温28℃以上。抽穗后进行套袋，收获统计结实率。取苗龄14天的幼苗叶片，用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取基因组DNA，DNA浓度稀释至20ng/ul。
(2)用瀚辰光翼2×Master Mix forASPCR V1试剂盒中的KASP PCR MIX按表1所述的扩增体系进行PCR扩增，PCR扩增的反应程序如表2所示。每个品种设2个技术重复，以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的tms5-c-fertility模板DNA、tms5-a-sterility模板DNA做阳性对照，用ddH2O替代DNA模板做为阴性对照(NTC)。DNA样品排布见表3。
表1 PCR扩增体系
成分 体积用量(μL)
DNA模板 5
KASP PCR MIX 4.86
Primer mix 0.14
表2 PCR扩增的反应程序
步骤 温度/时间/循环数
1 94℃15min，1个循环
2 94℃20s，62℃(每经历一个循环降低0.6℃)60s，10个循环
3 94℃20s，56℃60s，28个以上循环(可根据实际需要适当提高)
表3 DNA样品排布
表3中B行表示的是云13S与云恢9801杂交F1代中选取的11株，分别表示为F1-1、F1-2以此类推。
扩增产物放入Omega F读板机，点击“Measurement one plate”读取数据，用KlusterCaller软件读取SNP数据，分型生成聚类图。分型聚类图如图1所示。花粉镜检结果和测序结果如图2所示，田间套袋结实率结果如表4所示。表4中品种滇屯502、云籼650、云恢290、云恢9801、中恢8015为常规稻/恢复系，品种七S、1892S、C815S、广占63S、云13S为温敏不育系，品种F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8、F1-9、F1-10、F1-11为温敏不育系与恢复系杂交F1代。
表4田间套袋结实率
图1中孔A2-A11样品为常规稻和恢复系，KASP分型检测结果显示为靠近X-FAM轴显示蓝色的圆点，说明为可育株。花粉镜检结果显示均为圆形可染的可育花粉，套袋结实率均高于70％，KASP分型结果与花粉镜检和套袋结实率相符，证明本发明方法准确可靠(图2A-图2E，表4)。
图1中孔C2-C11样品为已鉴定的、在我国水稻两系生产上使用的温敏核不育系品种，KASP分型显示为靠近Y-HEX轴显示红色的圆点，说明为温敏雄性核不育系。花粉镜检结果显示为无花粉型(七S和广占63S)和典败型(1892S、C815S、云13S)不育花粉；套袋结实率为0；为明确不育系tms5基因突变类型进行了测序，发现以上不育系同安农S-1突变类型相同(第71位碱基为A)。KASP分型结果与花粉镜检、套袋结实率及测序结果相符，证明本发明方法准确可靠(图2F-图2J、图2N-图2R，表4)。
图1中孔B1-B11样品为温敏核不育系云13S与恢复系云恢9801杂交F1代，KASP分型显示为靠近X-FAM轴与Y-HEX轴对称区域显示绿色的圆点，说明为杂合可育株。花粉镜检结果显示均为圆形可染的可育花粉；套袋结实率介于79.93％-83.62％间；KASP分型结果与花粉镜检和套袋结实率相符，证明本发明方法准确可靠(图2K-2M，表4)。
实施例2
采用组1引物混合物(混合物体积100μL，其中tms5-KASP-FAM浓度12μM，tms5-KASP-HEX浓度12μM，tms5-KASP-R浓度30μM)检测温敏雄性核不育系云13S与云恢9801构建的F2群体的分型结果。
2023年在云南省水富市正季播种F2群体(4月16日播种)，孕穗期日平均气温28℃以上。用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取F2群体中随机抽取的92个单株苗期叶片基因组DNA，DNA浓度稀释至20ng/ul。PCR扩增体系和扩增程序同实施例1。以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的tms5-c-fertility模板DNA、tms5-a-sterility模板DNA做阳性对照(图3孔A1、A2)，用ddH2O替代DNA模板做为阴性对照(NTC)(图3孔H11、H12)。
扩增产物放入Omega F读板机，点击“Measurement one plate”读取数据，用KlusterCaller软件读取SNP数据，分型生成聚类图(见图3)。根据苗期KASP分型结果，选取不育系株系在抽穗后套袋统计结实率。
结果显示，F2群体单株中25株显示为靠近X-FAM轴显示蓝色的圆点，说明为纯合可育株。53株显示为靠近X-FAM轴与Y-HEX轴对称区域显示绿色的圆点，说明为杂合可育株。14株显示为靠近Y-HEX轴显示红色的圆点，说明为纯合温敏雄性核不育株。随机抽取其中8株不育株，对其tms5基因进行测序，发现所有不育株的第71碱基与亲本云13S一样均为A(图4)。统计KASP鉴定出的14株不育株的套袋结实率，均为0。证明本发明方法准确可靠，可用于已有温敏不育系的改良，从其改良杂交群体中快速准确检测携带温敏不育基因的不育株系。
实施例3
以组2引物混合物(组2引物混合物体积100μL，其中pms3-KASP-FAM浓度12μM，pms3-KASP-HEX浓度12μM，pms3-KASP-R浓度30μM)检测95076S、N5088S、七S、云粳216S、云粳218S共5个携带纯合pms3pms3突变型的光敏雄性不育系和滇屯502、云籼650、云恢290、云恢41、云恢501共5个携带纯合PMS3PMS3野生型的常规稻和恢复系，以及云粳216S与云恢41杂交F1代的分型结果。
2023年在云南省水富市正季播种以上10个品种及F1代(4月16日播种)，孕穗期日平均气温28℃以上，日照时长13.4小时以上。抽穗后进行套袋，收获统计结实率。取苗龄14天的幼苗叶片，用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取基因组DNA，DNA浓度稀释至20ng/ul。PCR扩增体系和扩增程序同实施例1。每个品种设2个技术重复，以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的pms3-c-fertility模板DNA和pms3-g-sterility模板DNA做阳性对照，用ddH2O替代DNA模板做为阴性对照(NTC)。DNA样品排布见表5。
表5 DNA样品
扩增产物放入Omega F读板机，点击“Measurement one plate”读取数据，用KlusterCaller软件读取SNP数据，分型生成聚类图。分型聚类图如图5所示，花粉镜检结果和测序结果如图6所示，田间套袋结实率如表6所示。表6中品种滇屯502、云籼650、云恢290、云恢41、云恢501为常规稻/恢复系，品种95076S、N5088S、七S、云粳216S、云粳218S为温敏不育系，品种F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8、F1-9、F1-10、F1-11为温敏不育系与恢复系杂交F1代。
表6田间套袋结实率
结果显示图5中孔A2-A11样品为常规稻和恢复系，KASP分型检测结果显示为靠近X-FAM轴显示蓝色的圆点，说明为可育株。花粉镜检结果显示均为圆形可染的可育花粉，套袋结实率均高于70％，KASP分型结果与花粉镜检和套袋结实率相符，证明本发明方法准确可靠(图6A-图6E，表6)。
图5中孔C2-C11样品为已鉴定的、在我国水稻两系生产上使用的光敏核不育系品种，KASP分型显示为靠近Y-HEX轴显示红色的圆点，说明为光敏雄性核不育株。花粉镜检结果显示为无花粉型(七S)和典败型不育花粉；套袋结实率为0；为明确不育系pms3基因突变类型进行了测序，发现以上不育系同农垦58S突变类型相同(第789位碱基为G)。KASP分型结果与花粉镜检、套袋结实率及测序结果相符，证明本发明方法准确可靠(图6F-6J、6N-6R，表6)。
图5中孔B1-B11样品为光敏不育系云粳216S与恢复系云恢41杂交F1代，KASP分型显示为靠近X-FAM轴与Y-HEX轴对称区域显示绿色的圆点，说明为杂合可育株。花粉镜检结果显示均为圆形可染的可育花粉；套袋结实率介于71.13％-78.54％间；KASP分型结果与花粉镜检和套袋结实率相符，证明本发明方法准确可靠(图6K-6M，表6)。
实施例4
以组2引物混合物(组2引物混合物体积100μL，其中pms3-KASP-FAM浓度12μM，pms3-KASP-HEX浓度12μM，pms3-KASP-R浓度30μM)检测光敏不育系云粳216S与云恢41杂交构建的F2群体的分型结果。
2023年在云南省水富市正季播种F2群体(4月16日播种)，孕穗期日平均气温28℃以上，日照时长13.4小时以上。用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取F2群体中随机抽取的92个单株苗期叶片基因组DNA，DNA浓度稀释至20ng/ul。PCR扩增体系和扩增程序同实施例1。以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的pms3-c-fertility模板DNA和pms3-g-sterility模板DNA做阳性对照(图7孔A1、A2)，用ddH2O替代DNA模板做为阴性对照(NTC)(图7孔H11、H12)。
扩增产物放入Omega F读板机，点击“Measurement one plate”读取数据，用KlusterCaller软件读取SNP数据，分型生成聚类图(图7)。根据苗期KASP分型结果，选取不育株系在抽穗后套袋统计结实率。
结果显示F2群体单株中20株显示为靠近X-FAM轴显示蓝色的圆点，说明为纯合可育株。44株显示为靠近X-FAM轴与Y-HEX轴对称区域显示绿色的圆点，说明为杂合可育株。28株显示为靠近Y-HEX轴显示红色的圆点，说明为纯合光敏雄性核不育株。随机抽取其中8株不育株，对其pms3基因进行测序，发现所有不育株的第789碱基与亲本云粳216S一样均为G(图8)。统计KASP鉴定出的28株不育株的套袋结实率，均小于2％。证明本发明方法准确可靠，可用于已有光敏不育系的改良，从其改良杂交群体中快速准确检测携带光敏不育基因pms3的不育株系。
实施例5
本发明针对tms5和pms3基因突变碱基分别设计了6对和8对KASP引物，并摸索了不同的扩增条件，但因前引物所在区域碱基序列GC含量过高或过低，引物特异性差等原因，除本发明所述的引物序列及与之匹配的扩增条件外，其余引物及反应条件扩增后都无法正确聚类分型，即聚类分型结果显示不满足靠近X-FAM轴、X-FAM轴与Y-HEX轴对称区域、Y-HEX轴的分散的显示粉色的圆点，代表无法进行聚类分型的样品(原因可能为引物GC含量过高或前后引物退火温度差异过大)；所有品种样本无论突变型还是野生型都为靠近X-FAM轴与Y-HEX轴对称区域的显示绿色的圆点、基因分型结果与实际碱基结果不相符、圆点位置聚合不佳(原因可能为引物特异性差，产生非特异性扩增)，其中部分分型结果见图9。图9A-9D为tms5其他引物及扩增条件分型结果。图9E-9H为pms3其他引物及扩增条件分型结果。每行前6孔为6个可育品种，后6孔为6个不育品种。4行为4个技术重复。设2孔NTC。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种水稻光温敏雄性核不育KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记包括以下两组引物中的至少一种：组1引物包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示的tms5-KASP-FAM、tms5-KASP-HEX和tms5-KASP-R；组2引物包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示的pms3-KASP-FAM、pms3-KASP-HEX和pms3-KASP-R。
2.权利要求1所述KASP分子标记在制备鉴定水稻光温敏雄性核不育系产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒。
4.一种鉴定水稻光温敏雄性核不育系的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的KASP分子标记。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述组1引物中tms5-KASP-FAM、tms5-KASP-HEX和tms5-KASP-R的摩尔浓度比为12:12:30；所述组2引物中pms3-KASP-FAM、pms3-KASP-HEX和pms3-KASP-R的摩尔浓度比为12:12:30。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照模板DNA和阴性对照，所述阳性对照模板DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-10所示。
7.权利要求1所述KASP分子标记或权利要求4-6任意一项所述试剂盒在鉴定水稻光温敏雄性核不育系中的应用。
8.一种鉴定水稻光温敏雄性核不育系的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测水稻基因组为模版，采用权利要求1所述的KASP分子标记或权利要求4-6任意一项所述试剂盒对模板进行PCR扩增，扩增结束后进行荧光数据快速读取和基因聚类分型；
检测结果判定为：若样品发荧光的圆点分布靠近X-FAM轴，则判断该水稻样品为纯合野生型可育株；若样品发荧光的圆点分布靠近Y-HEX轴，则判断该水稻样品为纯合突变型光温敏雄性核不育株；若样品发荧光的圆点分布靠近X-FAM轴与Y-HEX轴的对称区域轴，则判断该水稻样品为杂合型可育株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系以10μL计，包括样品DNA模板5μL，KASP PCR MIX 4.86μL和引物0.14μL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃15min，1个循环；94℃20s，62℃，每经历一个循环降低0.6℃，60s，10个循环；94℃20s，56℃60s，28个以上循环。
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