CN111560460B

CN111560460B - 一组与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的snp标记及其应用

Info

Publication number: CN111560460B
Application number: CN202010511140.0A
Authority: CN
Inventors: 董志敏; 刘念析; 厉志; 刘佳; 衣志刚; 陈亮; 刘浩; 王博
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: CN111560460A

Abstract

本发明提供了一组与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的SNP标记及其应用，涉及SNP标记技术领域。本发明公开了一组与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的SNP标记、检测引物组、试剂盒以及应用，所述的SNP标记，包括第一SNP标记Gm16_33764982和第二SNP标记Gm16_33879496。本发明通过KASP SNP标记技术检测大豆基因型，根据基因型即可不受环境、生育时期和抗病接种相关复杂操作等限制，高效节本地鉴定出抗灰斑病7号生理小种的大豆品种，从而提高大豆抗病育种效率。

Description

一组与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于SNP标记技术领域，具体涉及一组与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的SNP标记及其应用。

背景技术

大豆灰斑病是世界性病害，也是我国黑龙江、内蒙和吉林省大豆主产区的主要流行病害。一般病害发生年份，感病品种可减产12～15％，严重发生年份甚至可减产30～50％；而且种子的蛋白含量平均降低1.2％，脂肪含量平均降低2.9％，种子的出苗率也降低。针对该病害，我国一直采用的是人工接种鉴定抗性的传统抗灰斑病育种方法。但是人工接种的技术含量高，工作量大，周期长，病原菌发病受环境影响，导致传统的大豆抗灰斑病育种效率低。

随着分子生物学技术的飞速发展，分子育种技术大大加快了抗病育种的进程，显著缩短了抗病新品种的选育周期。分子育种的前提是获得与目标性状密切相关的分子标记或功能基因。然而，目前还未找到与大豆灰斑病抗性直接相关的功能基因；即使遗传定位到几个大豆灰斑病抗性相关的分子标记，标记与目标基因距离较远，鉴定抗性不够准确，还难以实现分子水平上较为准确地鉴定大豆抗灰斑病性状。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一组与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的SNP标记及其应用，对大豆性状鉴定不受环境条件和样本组织生育时期的影响，且检测周期短、灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一组与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的SNP标记，所述SNP标记包括第一SNP标记Gm16_33764982和第二SNP标记Gm16_33879496；所述的第一SNP标记Gm16_33764982在大豆基因组的第16号染色体33764982位置的碱基为A或T；所述第二SNP标记Gm16_33879496在大豆基因组的第16号染色体33879496位置的碱基为A或C。

优选的，当所述第一SNP标记Gm16_33764982处碱基和第二SNP标记Gm16_33879496处碱基均为A时，大豆为抗灰斑病7号生理小种；当第一SNP标记Gm16_33764982处碱基为T，且第二SNP标记Gm16_33879496处碱基为C时，大豆为感灰斑病7号生理小种。

优选的，所述大豆基因组的全基因组序列版本为大豆基因组v2.0。

本发明还提供了一组用于检测所述SNP标记的KASP引物组，检测所述第一SNP标记Gm16_33764982的引物组包括：FAM1引物、VIC1引物和COM1引物，所述FAM1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，VIC1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，COM1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

检测所述第二SNP标记Gm16_33879496的引物组包括：FAM2引物、VIC2引物和COM2引物，所述FAM2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，VIC2引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，COM2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一组用于检测大豆抗灰斑病7号生理小种性状的试剂盒，所述试剂盒中包括所述KASP引物组。

本发明还提供了所述SNP标记或所述KASP引物组或所述试剂盒在大豆抗灰斑病性状分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种筛选具有抗灰斑病性状的大豆材料的方法，包括以下步骤：以待检测大豆基因组DNA为模板，利用所述KASP引物组进行PCR扩增反应，对PCR扩增产物进行所述SNP标记的基因分型；当所述第一SNP标记Gm16_33764982处碱基和第二SNP标记Gm16_33879496处碱基均为A时，大豆为抗灰斑病7号生理小种；当第一SNP标记Gm16_33764982处碱基为T，且第二SNP标记Gm16_33879496处碱基为C时，大豆为感灰斑病7号生理小种。

优选的，所述PCR扩增的体系包括：模板DNA 1.5μl，2×KASP Master MIX缓冲液1.5μl，KASP引物组0.025μl，ddH₂O 2.0μl。

优选的，所述PCR扩增的程序包括：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃退火延伸60s，每循环降0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，36个循环；35℃2min。

本发明提供了一组与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的SNP标记、检测引物组、试剂盒以及应用，本发明2个SNP分子标记直接以DNA的形式表现，在大豆的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题。利用本发明所述的SNP标记进行大豆抗感病情况，可直接在实验室进行，鉴定快速简单高效，无需复杂的人工接种灰斑病，无需繁琐的病原菌培养，无需限制性的发病环境和较长周期的鉴定过程。

本发明提供的2个SNP标记位于目标基因两侧，物理距离114.514kb，与抗性性状位置非常近，标记与抗性基因间重组几率小，鉴定准确性高。同时，在大豆育种过程中，SNP分子标记能够在种子期进行抗灰斑病的鉴定，在播种前就能淘汰感病材料，大大减少了田间育种面积，减少田间试验材料和劳务成本，显著降低育种费用。

附图说明

图1为全基因组关联分析的大豆20个染色体上个SNP的Δ(SNP-index)拟合曲线；

图2为初步遗传定位连锁图谱；

图3为精细定位的重组位置图；

图4为与大豆抗灰斑病7号生理小种性状紧密连锁标记Gm16_33764982对抗原黒农55的育种组合后代品系的KASP SNP PCR产物的检测；

图5为与大豆抗灰斑病7号生理小种性状紧密连锁标记Gm16_33879496对抗原黒农55的育种组合后代品系的KASP SNP PCR产物的检测。

具体实施方式

本发明在验证大豆抗灰斑病7号生理小种性状时，同时使用两个所述SNP标记，当所述第一SNP标记Gm16_33764982处碱基和第二SNP标记Gm16_33879496处碱基均为A时，大豆为抗灰斑病7号生理小种；当第一SNP标记Gm16_33764982处碱基为T，且第二SNP标记Gm16_33879496处碱基为C时，大豆为感灰斑病7号生理小种。本发明中，所述大豆基因组的全基因组序列版本优选为大豆基因组v2.0。

检测所述第二SNP标记Gm16_33879496的KASP引物组包括：FAM2引物、VIC2引物和COM2引物，所述FAM2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，VIC2引物的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，COM2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明所述引物组优选如下所示：

第一SNP标记GM16_33764982引物对序列：

FAM1(SEQ ID NO.1)：GTAGTGACACTCGAAAGCTTCAAAAAATT；

VIC1(SEQ ID NO.2)：GTAGTGACACTCGAAAGCTTCAAAAAATA；

COM1(SEQ ID NO.3)：GATGAGCTTAAATTGATGGGGATTTATGTA；

第二SNP标记Gm16_33879496引物对序列：

FAM2(SEQ ID NO.4)：TACTATTCGCCATACATGGACG；

VIC2(SEQ ID NO.5)：ATCTTACTATTCGCCATACATGGACT；

COM2(SEQ ID NO.6)：GCTGGACATTGTGAAACACAGCATATTTA。

本发明还提供了一组用于检测大豆抗灰斑病7号生理小种性状的试剂盒，所述试剂盒中包括所述KASP引物组。本发明所述KASP引物组优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述试剂盒中优选还包括KASP MasterMIX缓冲液和ddH₂O。本发明中所述KASP引物组优选为引物混合态，所有的引物都置于一个管内，其余内容单独包装。

本发明对所述检测大豆基因组DNA的来源并没有特殊限定，优选包括从大豆各发育时期的各组织进行提取，所述提取的方法优选包括试剂盒法或CTAB法。

本发明所述PCR扩增的体系以5μl计，优选包括：模板DNA 1.5μl，2×KASPMasterMIX缓冲液1.5μl，KASP引物组0.025μl，ddH₂O 2.0μl。

本发明所述PCR扩增的程序优选包括：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃退火延伸60s，每循环降0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，36个循环；35℃2min。

下面结合实施例对本发明提供的一组与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的SNP标记及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

与大豆灰斑病7号生理小种性状关联染色体区域鉴定

(1)构建遗传群体，遗传群体的母本是94RD6-5，感大豆灰斑病7号生理小种；吉林省农业科学院选育的大豆新品系。遗传群体的父本是黒农55，抗大豆灰斑病7号生理小种；黑龙江省农科院选育的大豆新品种。“黒农55”和“94RD6-5”杂交，单粒传法到F₄代，并繁殖其F_4:6家系。其中243个F₄单株分别提取DNA，用于基因型鉴定。对其F_4:6家系进行灰斑病7号生理小种人工接种，用于F₄代抗病表现型推测。

(2)采用孢子悬浮液，人工接种大豆灰斑病7号生理小种，鉴定243个F_4:6家系灰斑病表型。一般7月初接种，孢子浓度是1*10⁶(10*10视野下)，超低量喷雾，1ml/株；遮荫保湿48小时，隔一周再接种一次。调查株系内20个单株病害情况，无斑或小于1mm的红点为抗病，有明显蛙眼病斑的为感病。株系内的所有单株都为抗病，则其对应F₄单株为抗病表现型；株系内的所有单株都为感病，则其对应F₄单株为感病表现型；株系内有3个或以上感病单株，且10个或以上抗病单株，则其对应F₄单株为杂合抗病表现型；株系内其它表现为不明确。

(3)根据243个F_4:6家系对灰斑病7号生理小种抗性表型鉴定结果，构建抗病/感病基因池。极端抗病20个和极端感病20个家系对应的F₄单株DNA分别等量混合，构建成抗病基因池和感病基因池。

(4)采用第二代测序方法对父母本、抗感池进行全基因组测序。鉴定SNP位点，并采用Δ(SNP-index)方法进行抗病性状与SNP位点的关联分析(图1)。在16号染色体32798754-34225761(v2.0)间，物理距离1.43Mb。

实施例2

遗传连锁初步定位大豆灰斑病7号生理小种抗性位点

(1)针对抗性关联区域16号染色体32798754-34225761(v2.0)区间的SNP位点，设计7个KASP SNP标记，分别是Gm_32798754、Gm_33642486、Gm16_33731422、Gm_33764982、Gm_33879496、Gm_34072369和Gm_34225761。

针对上述7个KASP SNP标记设计引物，如下所示：

Gm16-32798754引物对序列：

FAM(SEQ ID NO.7)：CAAAGATAAGTTTAGTCCAAACGCATG；

VIC(SEQ ID NO.8)：CAAAGATAAGTTTAGTCCAAACGCATC；

COM(SEQ ID NO.9)：CCAAAATATTAGAGTGCGTTTGACATGTTA；

Gm16-33642486引物对序列：

FAM(SEQ ID NO.10)：TTTTTAAGAGAAATTGTTAGTTGGCTCCTT；

VIC(SEQ ID NO.11)：TTTTAAGAGAAATTGTTAGTTGGCTCCTA；

COM(SEQ ID NO.12)：TGGTGCAAATCAAAGTTCTATAAGCACATT；

GM16_33764982引物对序列：

FAM(SEQ ID NO.1)：GTAGTGACACTCGAAAGCTTCAAAAAATT；

VIC(SEQ ID NO.2)：GTAGTGACACTCGAAAGCTTCAAAAAATA；

COM(SEQ ID NO.3)：GATGAGCTTAAATTGATGGGGATTTATGTA；

Gm16_33879496引物对序列：

FAM(SEQ ID NO.4)：TACTATTCGCCATACATGGACG；

VIC(SEQ ID NO.5)：ATCTTACTATTCGCCATACATGGACT；

COM(SEQ ID NO.6)：GCTGGACATTGTGAAACACAGCATATTTA；

Gm16_34072369引物对序列：

FAM(SEQ ID NO.13)：CTTCTCTTCCTACTTCCCGTC；

VIC(SEQ ID NO.14)：CTCTTCTCTTCCTACTTCCCGTA；

COM(SEQ ID NO.15)：GGGAGGAGCAAAGAGAGAAGGAAAT；

Gm16_34225761引物对序列：

FAM(SEQ ID NO.16)：TAAACGAACAATCTTGGACAAGCATGT；

VIC(SEQ ID NO.17)：ACGAACAATCTTGGACAAGCATGC；

COM(SEQ ID NO.18)：CAGAGATATCAATACAAATGACATGAGTTA；

Gm16_33731422引物对序列：

FAM(SEQ ID NO.19)：GTACCGTTCCTCCAATTCCTTTAAATA；

VIC(SEQ ID NO.20)：GTACCGTTCCTCCAATTCCTTTAAATT；

COM(SEQ ID NO.21)：GGAAGATCTTCTCGAACGCATGCTT。

(2)对243个F₄个体进行KASP SNP PCR扩增，鉴定F₄个体基因型。PCR扩增反应体系(5μl)：DNA 1.5μl(5-30ng/μl)，2×KASP Master MIX缓冲液1.5μl，KASP引物组0.025μl，ddH₂O 2.0μl；PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，61℃退火延伸60秒(每循环降0.6度)，10个循环；94℃变性20秒，55℃退火延伸60秒，36个循环；35℃2min。最后降温到40℃以下。读数时35℃激发信号1分钟，利用LightCycler480软件(v1.5)的Endpoint分析模块检测PCR扩增产物，根据荧光信号表现区分基因型。

(3)采用JoinMap4.1软件，对243个F₄个体的基因型和表现型进行连锁分析，将抗性基因定位到16号染色体33642486-33764982(33879496)(v2.0)间，物理距离237kb(图2)。

实施例3

遗传重组分析精细定位大豆灰斑病7号生理小种抗性位点

(1)筛选出初步定位区间SNP标记是杂合基因型F₄个体10个。

(2)抗病鉴定杂合基因型F₄的488个F₅单株表现型，单株的抗感标准按照实施例1中的条件进行。

(3)KASP SNP PCR获得其6个标记Gm16_33642486，Gm16_33731422、Gm16_3376498、Gm16_338794962、Gm16_34072369和Gm_34225761的基因型。KASP SNP PCR反应体系、反应条件和基因型分析方法按照实施例2中的条件进行。

(4)对照F₅单株表现型和基因型数据，分析F₅个体重组位置(图3)，将抗性位点精细定位GM16_33764982和Gm16_338794962两个标记之间。两个标记分别位于大豆16号染色体基因组(v2.0)的33764982和338794962位置。

实施例4

与大豆抗灰斑病7号生理小种紧密连锁的2个SNP标记鉴定效果的验证

(1)对以黒农55为抗原的140个已知抗性高代品系，采用CTAB法提取大豆DNA，进行KASP SNP PCR反应。KASP SNP PCR反应体系、反应条件和基因型检测方法按照实施例2中的条件进行。

(2)扩增效率分析发现(图4～5)，对于标记Gm16_33764982而言，共67个绿色信号，51个蓝色信号，19个红色信号，3个粉色信号或其它，扩增效率为97.86％；对于Gm16_33879496而言，74个绿色信号，50个蓝色信号，14红色信号，2个粉色信号或其它，扩增效率为98.57％。其中，绿信号为感病基因型(ss)，蓝信号为抗病基因型(RR)，红信号杂合基因型(Rs)，粉色信号或其它为无法确定基因型或无信号(unknown或negtive)；备注：扩增效率＝(绿+蓝+红)/粉色及其它。

(3)统计抗病鉴定符合率发现，对于Gm16_33764982而言，51个表现蓝色信号的抗病基因型(RR)的个体中49个是抗病品系，抗病鉴定准确率为96.08％。对于Gm16_33879496而言，50个表现蓝色信号的抗病基因型(RR)的个体中50个是抗病品系，鉴定准确率100％。

因此，通过对大豆灰斑病7号生理小种抗性表现型测定结果和KASP SNP基因型分型结果的统计分析，证明这2个SNP标记能够非常好地对大豆材料扩增，并高度准确地对大豆抗灰斑病7号生理小种抗性进行良好分型。利用这两个标记在目标基因两侧同时鉴定分析灰斑病7号生理小种抗病基因，将更为准确地对大豆抗灰斑病7号生理小种抗性进行良好分型。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林省农业科学院

<120> 一组与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的SNP标记及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtagtgacac tcgaaagctt caaaaaatt 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtagtgacac tcgaaagctt caaaaaata 29

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatgagctta aattgatggg gatttatgta 30

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tactattcgc catacatgga cg 22

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcttactat tcgccataca tggact 26

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctggacatt gtgaaacaca gcatattta 29

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaagataag tttagtccaa acgcatg 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caaagataag tttagtccaa acgcatc 27

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccaaaatatt agagtgcgtt tgacatgtta 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttttaagag aaattgttag ttggctcctt 30

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttttaagaga aattgttagt tggctccta 29

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggtgcaaat caaagttcta taagcacatt 30

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttctcttcc tacttcccgt c 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctcttctctt cctacttccc gta 23

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gggaggagca aagagagaag gaaat 25

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taaacgaaca atcttggaca agcatgt 27

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgaacaatc ttggacaagc atgc 24

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagagatatc aatacaaatg acatgagtta 30

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtaccgttcc tccaattcct ttaaata 27

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtaccgttcc tccaattcct ttaaatt 27

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggaagatctt ctcgaacgca tgctt 25

Claims

1.一组用于检测与大豆抗灰斑病7号生理小种性状相关的SNP标记的KASP引物组，其特征在于，所述SNP标记包括第一SNP标记Gm16_33764982和第二SNP标记Gm16_33879496；所述的第一SNP标记Gm16_33764982在大豆基因组的第16号染色体33764982位置的碱基为A或T；所述第二SNP标记Gm16_33879496在大豆基因组的第16号染色体33879496位置的碱基为A或C；

当所述第一SNP标记Gm16_33764982处碱基和第二SNP标记Gm16_33879496处碱基均为A时，大豆为抗灰斑病7号生理小种；当第一SNP标记Gm16_33764982处碱基为T，且第二SNP标记Gm16_33879496处碱基为C时，大豆为感灰斑病7号生理小种；

所述大豆基因组的全基因组序列版本为大豆基因组v2.0；

检测所述第一SNP标记Gm16_33764982的引物组包括：FAM1引物、VIC1引物和COM1引物，所述FAM1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，VIC1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，COM1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

检测所述第二SNP标记Gm16_33879496的引物组包括：FAM2引物、VIC2引物和COM2引物，所述FAM2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，VIC2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，COM2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一组用于检测大豆抗灰斑病7号生理小种性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述KASP引物组。

3.权利要求1所述KASP引物组或权利要求2所述试剂盒在大豆抗灰斑病7号生理小种性状分子标记辅助育种中的应用。

4.一种筛选具有抗灰斑病性状的大豆材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待检测大豆基因组DNA为模板，分别利用权利要求1所述KASP引物组中检测所述第一SNP标记Gm16_33764982的引物组或检测所述第二SNP标记Gm16_33879496的引物组进行PCR扩增反应，对PCR扩增产物进行所述SNP标记的基因分型；当所述第一SNP标记Gm16_33764982处碱基和第二SNP标记Gm16_33879496处碱基均为A时，大豆为抗灰斑病7号生理小种；当第一SNP标记Gm16_33764982处碱基为T，且第二SNP标记Gm16_33879496处碱基为C时，大豆为感灰斑病7号生理小种。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系包括：模板DNA 1.5μl，2×KASP Master MIX 缓冲液1.5μl，检测所述第一SNP标记Gm16_33764982的引物组或检测所述第二SNP标记Gm16_33879496的引物组 0.025μl，ddH₂O 2.0μl。

6.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃退火延伸60s，每循环降0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，36个循环；35℃ 2min。