CN117025833A - 一种检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记及其应用。本发明利用高抗枯萎病西瓜材料X97792和感枯萎病西瓜材料DW133构建的遗传分离群体将西瓜抗枯萎病基因Fo‑1精细定位于西瓜1号染色体117kb的区间内。结合2个亲本材料以及12份其他西瓜自交系的基因组重测序数据获得一个与西瓜枯萎病抗性性状共分离的SNP位点，基于该SNP位点开发了一种用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，包括如下三条引物：序列表中序列2所示的正向引物1，序列表中序列3所示的正向引物2和序列表中序列4所示的通用反向引物。本发明还提供了含有上述KASP引物组合的试剂盒，及上述引物组合和试剂盒的应用。本发明提供的引物组合和试剂盒可用于西瓜枯萎病抗性转育的分子标记辅助选择，提高育种效率。
Description
技术领域
本发明属于西瓜分子育种技术领域，具体涉及一种检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记及其在西瓜育种中的应用。
背景技术
我国西瓜栽培面积约2300万亩，是农业经济发展的重要支柱产业之一。根据联合国粮农组织数据库(FAOSTAT)统计，我国西瓜的总生产面积和总产量均位居世界之首，分别占全球的46.58％和60.64％。
西瓜生产中常见的病害包括枯萎病、炭疽病、疫病、蔓枯病等，其中枯萎病是一种极难解决的土传性病害，由该病害导致的连作障碍严重制约西瓜产业的可持续发展。西瓜枯萎病由尖孢镰孢菌西瓜专化型(Fusariurn oxysporum f.sp.niveum，FON)侵染导致，目前已发现4种西瓜枯萎病菌生理小种，其中生理小种1(FON1)是全世界西瓜主产区的优势生理小种。生产上克服西瓜枯萎病的常用方法包括嫁接、土壤消毒、轮作等，但这些栽培方式存在操作繁琐、劳动量大、成本高等问题，不符合未来轻简化栽培发展趋势。培育抗枯萎病西瓜品种是克服西瓜连作障碍最简单高效的手段。西瓜对FON1病菌的抗性由主效基因Fo-1控制(Ren et al.2015；李娜等，2017)，但该基因尚未被克隆，对西瓜枯萎病抗性的检测主要依赖于人工接种鉴定或抗病基因连锁的分子标记。北京市农林科学院、中国农业科学院郑州果树所等单位已开发多个与Fo-1连锁的dCAPS，INDEL等标记，这些标记有效提高了西瓜枯萎病抗性检测效率，但也存在操作繁琐，受材料遗传背景影响等缺点，使用过程存在一定局限性。
利用竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele-Specific PCR，KASP)技术进行基因分型具有操作简单、通量高、成本低等优点。基于Fo-1紧密连锁的SNP开发KASP标记对进一步提高西瓜枯萎病检测效率和培育抗病品种具有重要意义。
发明内容
为提高西瓜枯萎病抗性改良效率，本发明基于与Fo-1基因紧密连锁的SNP提供一种与西瓜FON1抗病性相关的KASP分子标记及其应用。本发明提供以下技术方案：
一种与西瓜FON1抗病性相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于西瓜基因组97103v2版本的1号染色体的第481975碱基处，多态性为A或G；或者为SEQ ID NO.1所示序列的第101碱基处，多态性为A或G。
优选地，所述KASP分子标记为FonC1.481975，其引物组合包括三条引物：正向引物1、正向引物2和通用反向引物；
所述正向引物1序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCACAACTTGTCGAAGAAGAAAG-3’，如SEQ ID NO:2所示；
所述正向引物2序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTCACAACTTGTCGAAGAAGAAAA-3’，如SEQ ID NO:3所示；
所述通用反向引物序列为：5’-TCCTATTCCAAAAATACTCTCATCTCTTC-3’，如SEQ IDNO:4所示。
优选地，所述正向引物1或者所述正向引物2的序列5’端还包括FAM或者HEX荧光接头序列：
优选地，所述正向引物1的5’端包括FAM荧光接头，其序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；
优选地，所述正向引物2的5’端包括HEX荧光接头，其序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
一种检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒，所述试剂盒包含所述的KASP标记引物组合。所述试剂盒还含有高保真DNA聚合酶、dNTP和MgCl2。
一种检测西瓜基因组1号染色体第481975碱基处基因型、或者检测或者辅助检测西瓜枯萎病抗性基因的基因型的方法，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因，包括如下步骤：
以待测西瓜材料基因组DNA为模板，利用所述KASP引物组合或者所述试剂盒进行PCR扩增，读取所得PCR扩增产物的荧光信号，以判断样品基因型。若PCR产物的荧光信号数据显示为红色代表西瓜基因组1号染色体第481975碱基处基因型为GG，判断所述待测西瓜Fo-1基因的基因型为FoFo；若PCR产物的荧光信号数据显示为蓝色代表西瓜基因组1号染色体第481975碱基处基因型为AA，判断所述待测西瓜Fo-1基因的基因型为fofo；若PCR产物的荧光信号数据显示为绿色代表西瓜基因组1号染色体第481975碱基处基因型为GA，判断所述待测西瓜Fo-1基因的基因型为Fofo。
优选地，所述PCR扩增的反应程序为：阶段1：95℃预变性15min；阶段2：95℃20s；61-55℃1min，共循环10次，每个循环降0.6℃；阶段3：95℃20s，55℃1min，共循环35次。
优选地，所述PCR扩增反应中，所述KASP引物组合的摩尔比为：正向引物1：正向引物2：通用反向引物＝1：1：3。
上述西瓜基因组1号染色体第481975碱基处基因型、或者KASP标记引物组合，或者上述用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒应用：
(1)鉴定或辅助鉴定西瓜单株、株系、品系或者品种的枯萎病抗性；
(2)培育具有西瓜枯萎病抗性的单株、株系、品系或者品种；其中，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因。
本发明的有益效果：
本发明筛选鉴定到一个与西瓜枯萎病抗性基因Fo-1紧密连锁的SNP位点，该位点可用于鉴定或辅助鉴定西瓜枯萎病抗性。初步研究结果表明，GG基因型西瓜材料具有枯萎病抗性。利用该位点开发的KASP引物组合进行西瓜枯萎病抗性检测、抗病材料筛选和培育具有检测通量高、时间短、成本低等优点。本发明为抗枯萎西瓜种质创制和新品种培育奠定一定理论基础和技术基础。
附图说明
图1为实施例2中西瓜KASP标记对西瓜基因组1号染色体第481975碱基处基因型检测的结果；图中，黑色表示空白对照，红色为纯合基因型GG，蓝色为纯合基因型AA，绿色为杂合基因型GA，黑色“×”为基因型不明确。
具体实施方式
下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
本发明涉及的西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的耗材、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、西瓜枯萎病抗性检测KASP标记开发
一、抗枯萎病关联SNP位点获取
本发明以高抗枯萎病西瓜材料(X97792)和感病西瓜材料(DW133)杂交得到F1杂合后代，再对F1单株自交构建F2遗传分离群体，并用于Fo-1基因的精细定位。同时，对亲本材料X97792和DW133进行全基因组重测序，将测序reads比对到参考基因组(97103v2)，利用软件GATK(Genome Analysis ToolKit)检测两个亲本材料之间的变异位点。
对F2分离群体的150个单株进行枯萎病人工接种(耿丽华等，2010)，利用包含西瓜基因组449个位点的SNP-Panel对其中96个感病或者高抗病单株进行基因分型，QTL分析表明该群体的主效抗病基因与前人定位的Fo-1基因位点重合。进一步利用927个F2单株进行精细定位，将Fo-1基因定位于西瓜1号染色体117kb的区间内(Chr01:461151-578640)，比前人定位区间缩小140kb。
结合本实验室前期对其他12份栽培西瓜的基因组重测序数据，本实验定位区间内的西瓜1号染色体第481975碱基与96个F2分离群体单株和14份西瓜自交系的枯萎病抗性性状表现为共分离(表1)，其中基因型为GG的表现为抗枯萎病，基因型为AA的表现为感枯萎病。
具体步骤如下：
1.基因组DNA提取
采用CTAB(Paterson et al.1993)法提取上述西瓜自交系和F2单株DNA。
2.枯萎病抗性人工接种
采用伤根法(耿丽华等，2010)对上述F2群体单株进行人工接种鉴定。
3.基因分型和重测序分析
对上述步骤1提取的西瓜基因组DNA进行基因分型或重测序。基因分型和重测序由分子标记(武汉)生物育种有限公司完成。
表1 14份西瓜材料的枯萎病抗性和基因分型信息
编号SNP_481975苗期接种抗性鉴定
89001AA感病
97005AA感病
DW133 AA感病
DW206-3 AA感病
G261 GG抗病
HSH-F AA感病
J157 AA感病
TL-DF AA感病
W22 AA感病
W73 AA感病
W80 AA感病
WM107 AA感病
X97792 GG抗病
三白瓜AA感病
二、KASP标记开发
基于KASP原理，设计针对所述西瓜枯萎病抗性关联的KASP标记引物组合，具体如下：
正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCACAACTTGTCGAAGAAGAAAG-3’(SEQ IDNO2)，(5’端“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”序列为FAM标记序列)。
正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTCACAACTTGTCGAAGAAGAAAA-3’(SEQ IDNO3)，(5’端“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”序列为HEX标记序列)。
通用反向引物：5’-TCCTATTCCAAAAATACTCTCATCTCTTC-3’(SEQ ID NO4)。
上述引物均由北京擎科新业生物技术有限公司武汉合成部合成。
实施例2、KASP引物检测西瓜枯萎病抗性的方法
采用CTAB法提取待测西瓜材料的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计检测DNA浓度，确保满足扩增要求。按照实施例1中所设计引物组合，以提取的基因组DNA为模板，对不同西瓜样品进行PCR(采用ABI QuantStudio5实时荧光定量PCR仪)检测分析，最终确定实施例1所述西瓜1号染色体第481975碱基处核苷酸序列。
具体PCR扩增时，扩增体系可参考设计如下：
10μL扩增体系：KASP Mix(2X)，5μL；Primer Mix，0.5μL；DNA，50ng；ddH2O，补充至10μL；
5μL扩增体系：KASP Mix(2X)，2.5μL；Primer Mix，0.25μL；DNA，20ng；ddH2O，补充至5μL；
所述Primer Mix，每100μL中：正向引物1，10μM、20μL；正向引物2，10μM、20μL；通用反向引物，10μM、60μL。
PCR反应程序参考(可根据扩增结果适当调整)为：
95℃变性15min；95℃、20s，61℃退火1min(10个循环，每个循环降低0.6℃)；
95℃变性20s，55℃延伸1min，35个循环；30℃延伸30s。
扩增程序结束，按照PCR仪读取的荧光信号值得高低，确定待测西瓜1号染色体第481975碱基处基因型和西瓜枯萎病抗性基因的具体基因型(图1)：聚合在接近X轴、显示红色的样本为连接FAM荧光标签序列的纯合等位基因型GG，则所述待测西瓜Fo-1基因的基因型为FoFo；聚合在接近Y轴、显示蓝色的样本为连接HEX荧光标签序列的纯和等位基因型AA，则所述待测西瓜Fo-1基因的基因型为fofo；聚合在X轴和Y轴中间、显示绿色的样本为杂合基因型GA，则所述待测西瓜Fo-1基因的基因型为Fofo；图中左下角显示黑色的样本为空白对照；图中黑色“×”表示待测样品分型不明确。
实施例3、KASP引物组合在西瓜枯萎病抗性转育中的应用
以高抗FON1的西瓜材料为供体亲本，优质感枯萎病西瓜材料为轮回亲本进行抗性转育，在回交转育过程中使用实施例1所述KASP引物组合进行抗病材料的分子辅助选择，包括以下步骤：
1.DNA提取：采用实施例1所述方法，在苗期提取回交后代单株的基因组DNA；
2.使用实施例2所述方法检测回交后代单株的Fo-1基因关联位点的基因型，每一代选择基因型为杂合(GA)的单株进行下一轮回交；
3.经连续6-8代回交后，再进行一次自交，利用KASP标记对自交后代进行基因型检测，选择纯合基因型为GG的单株进行自交留种，保留下来的材料即为抗病自交系。
利用KASP标记在苗期进行抗病性检测和抗病单株筛选具有鉴定结果准确，操作简易、成本低、极大减少工作量等优点，显著提高育种效率。
上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，但其并非用以限定本发明。任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。
序列表
湖北省农业科学院经济作物研究所
一种检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记及其应用
1
200bp
DNA
西瓜(Citrullus lanatus)
2
46bp
DNA
人工序列
3
46bp
DNA
人工序列
4
29bp
DNA
人工序列
Claims (6)
1.与西瓜枯萎病抗性相关的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点位于西瓜1号染色体的第481975碱基处，西瓜1号染色体的第481975碱基处多态性表现为A或G；或者为SEQ IDNO.1所示序列的第101碱基处，多态性为A或G。
2.一种与西瓜枯萎病抗性相关的KASP标记组合FonC1.481975，其特征在于，所述成套KASP引物包含正向引物1、正向引物2和通用反向引物；所述正向引物1为SEQ ID No.2的单链DNA；所述正向引物2为SEQ ID No.3的单链DNA；所述通用反向引物为SEQ ID No.4的单链DNA。
3.根据权利要求2所述的成套KASP引物，其特征在于，所述正向引物1的第1-21位核苷酸序列为FAM荧光接头序列，所述正向引物2的第1-21位核苷酸序列为HEX荧光接头序列。
4.一种用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2所述的成套KASP引物。
5.一种检测西瓜抗枯萎病基因的基因型的方法，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因，其特征在于，包括如下步骤：
以待测西瓜基因组DNA为模板，采用权利要求2所述成套KASP引物或权利要求4所述试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，根据分析结果确定所述待测西瓜Fo-1基因的基因型：
若扩增产物的荧光信号数据显示为红色，则所述待测西瓜基因组中Fo-1基因的基因型是FoFo；
若扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测西瓜基因组中Fo-1基因的基因型是fofo；
若扩增产物的荧光信号数据显示为绿色，则所述待测西瓜基因组中Fo-1基因的基因型是Fofo。
6.权利要求1所述西瓜基因组1号染色体第481975碱基处SNP位点、或权利要求2所述KASP标记引物组合，或权利要求4所述用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒在如下任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定西瓜单株、株系、品系或者品种的枯萎病抗性；
(2)培育具有西瓜枯萎病抗性的单株、株系、品系或者品种；其中，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因。
Priority Applications (1)
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| CN202311210311.6A CN117025833A (zh) | 2023-09-19 | 2023-09-19 | 一种检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记及其应用 |
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