CN113699271B - 用于检测小麦镰刀菌苗枯病QTL Qfsb.hbaas-1DL的分子标记及其应用 - Google Patents

用于检测小麦镰刀菌苗枯病QTL Qfsb.hbaas-1DL的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测抗镰刀菌苗枯病QTL Qfsb.hbaas‑1DL的分子标记及其应用。本发明提供了检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性中的应用；还提供了检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性产品中的应用。本发明通过全基因组关联分析(GWAS)发现了位于小麦1D染色体长臂上抗镰刀菌苗枯病位点Qfsb.hbaas‑1DL，进一步将其关联SNP IWB41243转化为普通PCR标记KASP‑Fsb1DL，两者对240份材料分型一致率为97.9％。该标记可用于检测抗镰刀菌苗枯病QTL Qfsb.hbaas‑1DL的基因型，并用于抗镰刀菌苗枯病分子育种。

Description

用于检测小麦镰刀菌苗枯病QTL Qfsb.hbaas-1DL的分子标记 及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测抗小麦镰刀菌苗枯病QTLQfsb.hbaas-1DL的分子标记及其应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的粮食作物之一，对保障粮食安全具有重要意义。小麦镰刀菌苗枯病(Fusarium seedling blight，FSB)和赤霉病(Fusariumhead blight，FHB)主要由镰刀菌病原体引起，是全球小麦和其他小粒谷物作物的破坏性病害。小麦苗枯病会对生长中的幼苗造成损害或在生长季节后期腐烂，从而导致出苗减少和生长发育迟缓，从而导致产量损失。此外，小麦苗枯病可以为随后的小麦赤霉病感染提供病原体来源，导致小麦减产和食品安全危害。近年来，由于全球气候和耕作制度的变化，小麦苗枯病和赤霉病经常达到流行水平，并在全球小麦产区造成数百万公顷的巨大产量损失。此外，小麦苗枯病和赤霉病在感染过程中都会产生各种真菌毒素，这些毒素对人类和家畜都具有高毒性，威胁人类健康。
培育抗病小麦品种是减轻小麦苗枯病危害最经济和有效的手段。利用分子标记辅助育种是抗病育种的有效手段，而相关分子标记的定位与开发至关重要。同小麦赤霉病相比，小麦苗枯病并未受到太多关注，目前国内外仅有少量研究关注小麦苗枯病抗性的QTL。前人利用一个包含91份材料双单倍体(DH)群体，鉴定出一个在5B染色体上控制小麦苗枯病抗性的QTL，连锁标记WMC75解释了13.8％的表型变异。Ren等(2016)利用一个包含110份材料DH群体，分别在染色体1AL和2BS上定位了由病原菌Microdochium nivale和Microdochium majus引起的小麦苗枯病抗性的单个主要QTL。上述研究均为利用遗传群体(DH群体)进行分子标记定位，都没有开发出适宜大规模检测的可用于分子标记辅助育种的可靠标记。
发明内容
为了挖掘小麦抗镰刀菌苗枯病位点并开发其分子标记，本发明的一个目的是检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型物质的用途。
本发明提供了检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性中的应用；
和/或，本发明提供了检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性产品中的应用；
本发明还提供了检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质在选育抗镰刀菌苗枯病小麦品种中的应用；
和/或，本发明还提供了检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质在制备选育抗镰刀菌苗枯病小麦产品中的应用。
本发明还提供了检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质在抗镰刀菌苗枯病小麦育种中的应用；
和/或，本发明还提供了检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质在制备抗镰刀菌苗枯病小麦育种产品中的应用。
上述应用中，所述SNP IWB41243位点为位于小麦染色体1DL上，物理位置为458.9Mb的位点；
所述SNP IWB41243位点的基因型为GG或AA。
上述应用中，所述检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质，为特异性引物组，包括序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链DNA分子。
上述应用中，所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列；
所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列；
所述荧光基团序列为荧光序列FAM或荧光序列HEX。
所述物质具有如下1)或2)或3)至少一种功能：
1)鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性；
2)选育镰刀菌苗枯病小麦；
3)抗镰刀菌苗枯病小麦育种。
本发明另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品，其为上述检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质；
所述产品具有如下1)或2)或3)至少一种功能：
1)鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性；
2)选育镰刀菌苗枯病小麦；
3)抗镰刀菌苗枯病小麦育种。
本发明提供的产品为如下1)或2)或3)：
1)成套引物，所述成套引物包括序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链DNA分子；
2)含有所述成套引物的PCR试剂；
3)含有1)或2)的试剂盒。
本发明第3个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性的方法。
本发明提供的方法，为检测待测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型为GG还是AA，根据基因型判断所述待测小麦的镰刀菌苗枯病抗性；
SNP IWB41243位点的基因型为AA的待测小麦镰刀菌苗枯病抗性高于SNPIWB41243位点的基因型的基因型为GG的待测小麦。
本发明第4个目的是提供一种选育抗镰刀菌苗枯病小麦的方法。
本发明提供的方法，为检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型为GG还是AA，选育基因型为AA的待测小麦，得到抗镰刀菌苗枯病的小麦。
上述方法中，所述检测待测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型为GG还是AA的方法为如下A)或B)：
A)90K SNP芯片分析；
B)用上述成套引物对所述待测小麦基因组DNA对所述待测小麦基因组DNA进行KASP反应，对产物进行基因分型。
所述基因分型的方法如下：采用荧光酶标仪照射产物，若所述产物仅显示序列1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则所述待测小麦SNP位点IWB41243的基因型为AA；若所述产物仅显示序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则所述待测小麦SNP位点IWB41243的基因型为GG。
本研究在室内培养箱条件下鉴定了一个由240个中国栽培品种(系)为主组成自然群体的小麦苗枯病抗性，并利用小麦90K单核苷酸多态性(SNP)芯片进行基因分型。在小麦1DL上定位到一个稳定的抗小麦苗枯病位点QTL Qfsb.hbaas-1DL，并开发了可用于大规模检测的KASP标记。
以上任一所述小麦可为但不限于实施例部分表1中所示的240份小麦品种(系)。
本发明专利通过全基因组关联分析(GWAS)发现了位于小麦1DL染色体上抗镰刀菌苗枯病位点Qfsb.hbaas-1DL，解释表型变异5.3％，在3次重复中，含抗病等位基因材料平均病斑长度比含感病等位基因材料低11.3％–40.0％。本发明专利进一步将其关联SNPIWB41243转化为KASP(kompetitive allele specific PCR)标记KASP-Fsb1DL，两者对240份材料分型一致率为97.9％。该标记可用于检测抗镰刀菌苗枯病QTL Qfsb.hbaas-1DL的基因型，并用于抗镰刀菌苗枯病分子育种。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
镰刀菌病原菌黄冈1号：参考文献：朱展望,杨立军,佟汉文,等.湖北省小麦品种(系)的赤霉病抗性分析[J].麦类作物学报,2014,34(1):137–142.公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
实施例1、Qfsb.hbaas-1DL及其关联SNP标记的发现
供试材料：国内外小麦品种(系)240份组建的自然群体，见表1。所用材料记载于文献：朱展望,徐登安,程顺和,等.中国小麦品种抗赤霉病基因Fhb1的鉴定与溯源[J].作物学报,2018,44(4):473–482.公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
表1 240个品种(系)及其来源和基因型
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a为90K SNP芯片分型结果；b为KASP标记检测结果；c 3次重复镰刀菌苗枯病(FSB)病斑长度(cm)，“NN”为芯片数据缺失。
一、Qfsb.hbaas-1DL及其关联SNP标记的发现
1、镰刀菌苗枯病抗性鉴定
于室内培养箱内连续3次进行镰刀菌苗枯病接种鉴定，病原菌菌株为黄冈1号。每次设3次重复，每个重复20株。采用胚芽鞘接种法接种，接种后7d调查发病病斑长度，病斑长度越长，说明小麦镰刀菌苗枯病抗性越差。以每个重复的平均值作为该次重复的鉴定结果，然后计算3次重复的平均值。
2、基因型分析
自然群体用90K SNP芯片进行基因型分析，选择其中22922个分型结果好的SNP用于后续分析，去掉缺失率超过20％、最小等位基因频率小于5％的标记，共剩余19803个SNP用于GWAS。
3、GWAS分析
采用Tassel v5.0软件kinship(K)+PCA方法的混合线性模型进行关联分析。当P≤0.001时，认为该标记与性状显著关联。
4、Qfsb.hbaas-1DL及其连锁SNP标记
关联分析发现位于1DL上抗镰刀菌苗枯病位点，在第二次重复和平均值两个环境下显著，解释表型变异5.3-5.7％，代表性关联标记为IWB41243，其侧翼序列为：5’-tctaaccaagcttcctcctcacatgcatttagccacctttcaactcgctc[A/G]agtatatccttcctgctaaaagcatcttctttaactgttgcgatgtatg-3’(序列4，SNP位点在序列4第51位)。在小麦品种中国春参考基因组序列(IWGSC，http://www.wheatgenome.org)上物理位置为458.9Mb(表2)。在2个环境下，含抗病等位基因材料平均FSB病斑长度比含感病等位基因材料低11.3％–40.0％％(表3)。
表2Qfsb.hbaas-1DL及其连锁SNP标记
a代表性SNP标记，b下划线所示为抗病等位基因，c中国春参考基因组物理位置(IWGSC，http://www.wheatgenome.org)，d解释表型变异。
SNP位点IWB41243位于1DL染色体物理位置为458.9Mb，其多态性为A/G，该SNP位点的基因型为AA或GG，SNP位点IWB41243也是序列4第51位。
表3 90K芯片不同基因型品种镰刀菌苗枯病抗性差异
注：aa和ab分别表示两种基因型材料间表型在0.05水平差异不显著和显著。
二、KASP-Fsb1DL标记专用引物的设计及其方法的建立
1、基因组特异引物设计
用SNP IWB41243的侧翼序列，在EnsemblPlants数据库(http://plants.ensembl.org)比对，获取其同源序列，设计其1DL染色体特异引物P41243(序列1、序列2和序列3)，又名KASP-Fsb1DL标记，由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。
鉴定SNP位点IWB41243的KASP引物为P41243引物组，该引物组包括5’末端添加特异荧光序列FAM的DNA分子、5’末端添加特异荧光序列HEX的DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子；
5’末端添加特异荧光序列FAM的DNA分子为在序列1所示的单链DNA分子的5’末端添加特异荧光序列FAM得到；
5’末端添加特异荧光序列HEX的DNA分子为在序列2所示的单链DNA分子的5’末端添加特异荧光序列HEX得到；
P41243A：5’-CCACCTTTCAACTCGCTCA-3’(序列1)；
P41243B：5’-CCACCTTTCAACTCGCTCG-3’(序列2)；
P41243C：5’-CTCACTTCTTCTAGAACAAATCGAA-3’(序列3)。
特异荧光序列FAM为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；
特异荧光序列HEX为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’；
上述5’端添加特异荧光序列FAM序列1所示的单链DNA分子与序列3所示的单链DNA分子扩增SNP位点基因型为AA的片段，携带FAM的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示蓝色；
上述5’端添加特异荧光序列HEX序列2所示的单链DNA分子与序列3所示的单链DNA分子扩增SNP位点基因型为GG的片段，携带HEX的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示绿色。
2、检测方法建立
供试材料：国内外小麦品种(系)240份(表1)组成的自然群体。
提取待测小麦的基因组DNA，加ddH2O稀释其浓度至30ng/μL作为模板，采用包括引物P41243A、引物P41243B和引物P41243C的引物对进行KASP反应。
上述KASP反应体系如表4所示；
表4引物P41243的KASP反应体系
KASP反应程序：95℃热激活15min；95℃变性20s，65℃退火延伸30s，共10个touchdown循环，每个循环降低0.6℃；然后95℃变性20s，57℃退火延伸1min，共32个循环；4℃保存。
KASP反应产物用PHERAstar Plus(BMG LABTECH,Ortenberg,Germany)读取荧光，用KlusterCaller软件(LGC Genomics,Teddington,UK)进行分型。蓝色基因型为AA，绿色基因型为GG。该标记可以区分IWB41243基因型，并进一步区分抗镰刀菌苗枯病QTL Qfsb.hbaas-1DL的等位基因，该标记标记命名为KASP-Fsb1DL。
该标记在该自然群体检测结果与SNP IWB41243分型结果一致率为97.9％，说明该标记转化成功。
因此，SNP IWB41243标记可用于辅助检测待测小麦是否抗镰刀菌苗枯病，并用于抗镰刀菌苗枯病分子育种；具体方法如下：
检测待测小麦基因组中SNP位点IWB41243的基因型，按照如下方法判断：
SNP位点IWB41243基因型为AA的待测小麦的镰刀菌苗枯病抗性高于或候选高于IWB41243基因型为GG的待测小麦。
上述检测待测小麦基因组中SNP位点IWB41243的基因型的方法如下：
1)90K SNP芯片分析；
2)引物P41243A、引物P41243B和引物P41243C进行KASP反应，用PHERAstar Plus对产物进行检测，用KlusterCaller软件进行数据分析；若颜色为蓝色，则所述待测小麦SNP位点IWB41243的基因型为AA；若为绿色，则所述待测小麦SNP位点IWB41243的基因型为GG。
实施例2、实际样本检测
供试材料：表1所示的自然群体品种。
一、镰刀菌苗枯病抗性鉴定
同实施例1。
二、KASP-Fsb1DL标记检测
用KASP-Fsb1DL标记按照实施例1中的方法，对表1所示的240个品种进行KASP反应，检测KASP反应产物；用PHERAstar Plus对产物进行检测，用KlusterCaller软件进行数据分析；若颜色为蓝色，则所述待测小麦SNP位点IWB41243的基因型为AA；若为绿色，则所述待测小麦SNP位点IWB41243的基因型为GG。
240份小麦品种标记检测结果和FSB index平均值如表1所示。将表1的结果进行统计分析，得到表5的结果。
表5 KASP-Fsb1DL不同基因型品种镰刀菌苗枯病抗性差异
从上述可以看出，SNP位点IWB41243为AA基因型待测小麦的镰刀菌苗枯病抗性高于或候选高于SNP位点IWB41243为GG的基因型待测小麦。
序列表
<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所
<120> 用于检测小麦镰刀菌苗枯病QTL Qfsb-1DL的分子标记及其应用
<140> 2021110476599
<141> 2021-09-08
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccacctttca actcgctca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ccacctttca actcgctcg 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctcacttctt ctagaacaaa tcgaa 25
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tctaaccaag cttcctcctc acatgcattt agccaccttt caactcgctc aagtatatcc 60
ttcctgctaa aagcatcttc tttaactgtt gcgatgtatg 100

Claims (9)

1.一种检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的物质，所述物质具有如下1）或2）或3）至少一种功能：
1）鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性；
2）抗镰刀菌苗枯病小麦育种；
3）选育抗镰刀菌苗枯病小麦；
所述物质为特异性引物组，包括序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链DNA分子；
所述SNP IWB41243位点位于小麦染色体1DL上，物理位置为458.9Mb的位点；所述SNPIWB41243位点对应的是序列4的第51位，所述SNP IWB41243位点的基因型为GG或AA；
所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列；
所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为序列2所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列。
2.根据权利要求1所述的物质，其特征在于，所述荧光序列为荧光序列FAM或荧光序列HEX。
3.一种检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的产品，其特征在于，
为成套引物，所述成套引物包括序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链DNA分子；所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列；所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为序列2所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列；
或，为含有所述成套引物的PCR试剂；
或，为含有所述成套引物或者所述PCR试剂的试剂盒；
所述SNP IWB41243位点位于小麦染色体1DL上，物理位置为458.9Mb的位点，所述SNPIWB41243位点对应的是序列4的第51位，所述SNP IWB41243位点的基因型为GG或AA。
4.根据权利要求1或2所述的物质或权利要求3所述的产品在检测小麦染色体1DL的SNPIWB41243位点的应用，所述SNP IWB41243位点为位于小麦染色体1DL上，物理位置为458.9Mb的位点，所述SNP IWB41243位点对应的是序列4的第51位，所述SNP IWB41243位点的基因型为GG或AA。
5.根据权利要求1或2所述的物质或权利要求3所述的产品在鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性中的应用；
和/或，在制备鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性产品中的应用；
和/或，在抗镰刀菌苗枯病小麦育种中的应用；
和/或，在制备抗镰刀菌苗枯病小麦育种产品中的应用；
和/或，在选育抗镰刀菌苗枯病小麦中的应用；
和/或，在制备选育抗镰刀菌苗枯病小麦产品中的应用。
6.根据权利要求5中所述的鉴定或辅助鉴定小麦镰刀菌苗枯病抗性的应用，包括检测待测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型为GG还是AA，根据基因型判断所述待测小麦的镰刀菌苗枯病抗性；
SNP IWB41243位点的基因型为AA的待测小麦的镰刀菌苗枯病抗性高于SNP IWB41243位点的基因型为GG的待测小麦。
7.根据权利要求5中所述的选育抗镰刀菌苗枯病小麦的应用，包括检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型为AA还是GG，选育基因型为AA的待测小麦，得到抗镰刀菌苗枯病的小麦。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其中检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型为AA还是GG的方法为如下A）或B）：
A）90K SNP芯片分析；
B）用权利要求4中的所述的检测小麦染色体1DL的SNP IWB41243位点的基因型的产品对所述待测小麦基因组DNA进行KASP反应，对产物进行基因分型。
9.根据权利要求8所述的应用，还包括基因分型的方法如下：采用荧光酶标仪照射产物，若所述产物仅显示序列1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则所述待测小麦SNP位点IWB41243的基因型为AA；若所述产物仅显示序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则所述待测小麦SNP位点IWB41243的基因型为GG。
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