CN116004889A

CN116004889A - 一种水稻育性基因的kasp分子标记及其应用

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Publication number: CN116004889A
Application number: CN202211240765.3A
Authority: CN
Inventors: 许作鹏; 张宏根; 李锡煦; 杜圆月; 汤述翥
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-10-11
Filing date: 2022-10-11
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明公开了一种水稻育性基因的KASP分子标记及其应用，属于基因组序列及植物生物技术领域；分子标记的引物包括Primer X、Primer Y和Primer R，利用引物进行分子标记的方法检测水稻基因组第1号染色体的第27607862‑27607863位碱基，本发明利用KASP分子技术对与水稻育性基因紧密连锁的InDel位点进行基因快速分型鉴定，可用于高通量分子育种；KASP分子标记的育性选择效率较高，可在育种早期进行分子标记辅助选择，降低育种成本，加快水稻不育系育种进程。

Description

一种水稻育性基因的KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因组序列及植物生物技术领域，具体涉及水稻育性基因位点Ms-1的KASP分子标记及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是我国三大主要粮食作物之一，我国约六成以上人口以稻米为主食。通过杂交优势提高产量是作物上常用的方法，三系杂交法对于杂种水稻制种尤为重要。因此，选育不育型材料是水稻育种的重要方向。分子标记辅助选择技术(Marker-assisted Selection，MAS)是现代分子生物学和传统遗传育种相结合的新型育种模式，通过利用分子标记在植物发育初期在DNA水平对植株进行定向选择，弥补了传统育种中出现的诸多弊端，是提高水稻育种效率的有效途径(马小倩,杨涛,张全,等.水稻新型育种技术研究现状与展望[J].中国农业科技导报,2022,24(1):7.)。

目前，多个水稻不育基因已被定位克隆，如SAW1、pms3、CMS-WA、OsRPA2c、OsNMS(祝钦泷,刘耀光,陈乐天,等.一种水稻育性基因SAW1及其应用:2021；吴昌银,李兴旺,常玉晓.一个控制水稻育性基因OsRPA2c的克隆及应用:2014；李香花,王伏林,陆青,等.水稻光敏核不育基因pms3的精细定位[J].作物学报,2002,28(3):5.)。很多基因都开发了相应的Indel、SSR或CAPS分子标记，但由于SSR、InDel等标记检测效率低，同时还会产生气溶胶污染环境，并不适用于高通量的分子检测平台。

因此，开发适合于高通量分子检测平台的水稻育性分子标记对于推广普及分子标记技术的应用，提高我国优质水稻的育种效率和育种水平具有重要意义。

发明内容

本发明针对上述背景技术所提及的技术问题，采用以下技术方案来实现：

一种用于检测水稻育性基因组中Ms-1位点的分子标记的引物，所述引物包括Primer X、Primer Y和Primer R，所述Primer X的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Primer Y的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Primer R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种利用权利要求1所述的引物进行分子标记的方法，其特征在于：所述方法用于检测水稻基因组第1号染色体的第27607862-27607863位碱基。

优选的，所述方法的具体步骤如下：

步骤1)：提取待检测水稻的DNA；

步骤2)：KASP反应测试，取50ng/μL基因组DNA 0.8μL、引物混合液0.03μL进行PCR扩增；

步骤3)：采用荧光检测分析仪分析扩增产物基因型。

优选的，步骤2)中所述引物混合液的配比为正向引物100pmol·L^-1Primer X、100pmol·L^-1Primer Y各12μL，反向引物100pmol·L^-1Primer R30μL，ddH₂O 46μL。

优选的，所述步骤2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃退火60s，40个循环。

所述的方法在鉴定或辅助鉴定水稻育性中的应用。

所述的方法在鉴定或辅助鉴定不育型水稻产品中的应用。

所述的方法在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用。

所述的方法在选育不育型水稻资源中的应用。

所述检测水稻基因组中Ms-1位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述Ms-1位点在内的水稻基因组DNA片段的PCR引物，所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQID No.1的第22-46位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-46位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA组成的引物组；所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和由序列表中SEQID No.3所示的单链DNA组成的引物组。

所述基因位点Ms-1是水稻基因组中的一个InDel位点，其核苷酸种类为GT(+)或缺失(-)，为序列表中SEQ ID No.4的第101-102位核苷酸。

当所述Ms-1位点的基因型为-/-基因型时，水稻为不育或者候选为不育，其中，所述-/-基因型表示水稻基因组中所述Ms-1位点的核苷酸种类为缺失(-)的纯合型。

当所述Ms-1位点的基因型为+/+基因型或+/-基因型时，水稻为可育或者候选为可育，其中，所述+/+基因型表示水稻基因组中所述Ms-1位点的核苷酸种类为GT(+)的纯合型；所述+/-基因型表示水稻基因组中所述Ms-1位点的核苷酸种类为GT(+)和缺失(-)的杂合型。

分子标记：广义的分子标记是指可遗传并能检测的DNA序列或蛋白质，狭义的分子标记是指能反应生物个体或种群基因组中某种差异的特异性DNA片段。

本发明的有益效果是：(1)本发明分子标记KASP的表型选择效率较高，可在水稻的不同种质资源中快速、精准的检测水稻育性基因位点Ms-1；并且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及溴化乙锭EB(Ethidium bromide)等有毒物的使用，可在育种早期进行分子标记辅助选择，减小育种群体的田间种植规模，降低育种成本，加快育种进程。

(2)本发明利用KASP技术对与水稻育性基因位点Ms-1进行基因快速分型鉴定，与SSR、InDel、CAPS分子标记相比，KASP标记高效、无污染，易于规模化应用，极大提高了分子检测的效率，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台，可应用在高通量分子育种中。

附图说明

图1.基因位点Ms-1的KASP分子标记优化效果图。a)为分型良好的KASP分子标记，b)、c)、d)为分型较差的KASP分子标记。

图2.Ms-YJ113-F2分离群体基因型检测结果图。

具体实施方式

为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

水稻不同育性材料的鉴定和育性基因定位群体的制备

对粳稻品种扬粳9538进行EMS诱变获得基因突变群体，筛选发现一株不育突变体，该突变体败育率高，并且可以稳定遗传，将此突变体命名为ms-1。ms-1突变体与正常育性水稻杂交，获得的F1群体育性正常。为获取水稻育性差异材料，首先对8份水稻品种材料进行田间种植，每份品种设置3个小区重复，每个小区种植8行(每行20株，株距为13.5cm，行距为16.5cm)，常规栽培和管理，种植工作在扬州大学田间试验基地开展；然后，对8份水稻品种材料进行育性调查。水稻育性以自交结实率为评价指标，自交结实率低于5％则为不育型。自交结实率测量方法如下：在穗抽尖时进行套袋，每个品种选取20个单株进行套袋。籽粒成熟后，按单株收获套袋的水稻，统计每个单株所有穗子的总籽粒数后，通过风选法筛去空颖壳籽粒，再次统计每个单株剩余的真实籽粒数，通过公式(结实率P＝真实籽粒数N/总籽粒数N₀)计算每个单株的结实率，然后以平均数代表每个品种的自交结实率。通过自交结实率调查，突变体ms-1自交结实率较低，为不育系，7份对照品种结实率均正常。

表1.8份测试水稻品种的表型信息

序号

品种名称

结实率(％)

育性

序号

品种名称

结实率(％)

育性

No.01

扬粳9538

93.73±7.43

Ms

No.05

嘉丰优2号

88.79±8.09

Ms

No.02

扬粳687

89.69±5.39

Ms

No.06

吉粳816

78.83±6.81

Ms

No.03

南粳46

91.62±6.79

Ms

No.07

扬粳113

76.39±5.62

Ms

No.04

扬粳5118

78.58±5.62

Ms

No.08

ms-1

3.39±0.77

ms

注：Ms：可育；ms：不育。

为制备基因定位群体，以扬粳687为父本，ms-1为母本进行杂交，获得一个包含113个单株的杂交群体。连续自交至F2代，获得F2代定位群体，用于基因定位。种植与杂交工作在扬州大学田间试验基地开展，常规栽培和管理。

实施例2

连锁基因位点MS-1定位和KASP标记优化

为获得与水稻育性连锁的基因位点，首先对上述F2代定位群体进行田间种植和育性数据调查，田间种植工作在扬州大学田间试验基地开展，育性表型测量方法参照实施例1。然后，利用实验室自研的34对水稻背景遗传标记对29份不育单株进行基因型检测。基因型检测方法如下：

1)提取待检测水稻的DNA：采用常规CTAB法从水稻叶片中提取基因组DNA；

2)KASP反应测试，取50ng/μL基因组DNA 0.8μL、引物混合液0.03μL进行PCR扩增，KASP反应测试选择Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测；

3)采用荧光检测分析仪分析扩增产物基因型。

1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL0.8μL，引物混液0.03μL(优选引物混合液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L^-1各12μL，反向引物Primer R 100pmol·L^-1 30μL,ddH₂O 46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Std Rox)0.8μL，根据ArrayTape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。

以上反应体系为Douglas Scientific公司ArrayTape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。

其中，2×KASP Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg²⁺等组成，荧光探针A的核苷酸序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接一个VIC荧光基团；荧光探针B的核苷酸序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其5’端连接一个FAM荧光基团；淬灭探针A的核苷酸序列为：5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为：5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ。扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。

经表型测量与分析，113份F2分离群体中，有29份单株为不育，有84份单株为可育。对29份水稻不育单株进行基因型检测，连锁分析采用QTL IciMapping3.0软件进行。经分析，标记OsMs071与控制水稻育性的基因遗传距离为0.15cM(数据见表2)，表明该位点与水稻育性基因遗传连锁度高，可以用于水稻育性标记检测。将上述标记OsMs071对应的基因位点命名为Ms-1，该位点锚定在水稻1号染色体27607862-27607863位碱基位置上。

表2.29份水稻育性单株的表型与基因型信息

注：Ms：可育；ms：不育；‘+/+’表示纯合可育基因型；‘-/-’表示纯合不育基因型；‘+/-’表示杂合可育基因型；‘*’表示无检测信号。

为更好地应用基因位点Ms-1进行水稻育性选育，对该位点分子标记进行优化，方法如下：从NCBI数据库下载Ms-1基因位点的侧翼序列，并利用Primer5.0软件，共设计5组KASP引物，利用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测后，挑选出1套多态性良好的KASP引物用于后续验证，所述用于检测水稻育性基因位点Ms-1的InDel标记引物具体如下：

Primer X：5’-gaaggtcggagtcaacggattTTGATCTGACTTCACTGAGATTCCA-3’(SEQ IDNo.1，小写字母部分为特异荧光标签序列VIC)；

Primer Y：5’-gaaggtgaccaagttcatgctTTGATCTGACTTCACTGAGATTCCC-3’(SEQ IDNo.2，小写字母部分为特异荧光标签序列FAM)；

Primer R：5’-ATTTCCTAAACTGGATTTGGTTCCG-3’(SEQ ID No.3)。

所述引物对应的InDel位点为水稻基因组第1号染色体的第27607862-27607863位碱基(对应序列表中SEQ ID No.4中第101-102位核苷酸)；

SEQ ID No.4：

TCGTGGATTCTTGCTCCATTCATTTTTAATCCTTCAGGATTGGATTGGCTGAAGAATTTTAATGATTTTGAGGATTTCCTAAACTGGATTTGGTTCCGGGGGAATCTCAGTGAAGTCAGATCAAAGCTGGGAGAAGTGGTGGGAAGAAGAAACTGATCATCTTCGGACAACTGGTCTGTTTGGGAGCATATTGGAAATCA。

对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测水稻基因组中Ms-1位点的基因型(即检测水稻基因组第1号染色体的第27607862-27607863位碱基是+还是-)，若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近X轴(VIC信号)，则待测水稻基因组中Ms-1位点的基因型为+/+纯合型(即水稻基因组第1号染色体的第27607862-27607863位碱基为+纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近Y轴(FAM信号)，则待测水稻基因组中Ms-1位点的基因型为-/-纯合型(即水稻基因组第1号染色体的第27607862-27607863位碱基为-纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析位于X轴和Y轴中间(VIC和FAM信号)，则待测水稻基因组中MS-1位点的基因型为+/-杂合型(即水稻基因组第1号染色体的第27607862-27607863位碱基为+和-的杂合型)。

开发后的5对KASP分子标记在Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测，分型效果如图1所示，b图和c图引物的扩增结果基因分型较为松散，会导致边缘结果无法判读，因此不推荐作为该位点标记；d图引物的扩增结果则由于引物扩增效率不同，导致杂合基因型分型松散，因此也不推荐作为该位点的标记；a图引物的扩增结果分型较为明确，各基因型结果分布紧密，同时杂合基因型两条探针扩增效率较为平衡，适合作为基因位点Ms-1的引物。

实施例3

与水稻育性连锁基因位点Ms-1的KASP标记在分子标记辅助选择不育水稻植株中的应用

为检测本发明Ms-1位点的实用性，利用育性材料扬粳113与不育材料ms-1杂交获得F1群体，通过F1天然自交产生F2自然分离群体81株，对分离群体进行KASP标记检测和育性表型验证(表3)，标记检测和育性表型验证实施方法参考实施例1(图2)，对分离群体进行表型与基因型检测和分析，基因型为+/+和+/-的单株可育比例为96.67％，基因型为-/-的单株不育比例为95.65％，基因型为-/-的单株不育比例显著高于+/+和+/-基因型，表明基因位点Ms-1在水稻育性植株筛选中具有较高的实用性。

表3.水稻分离群体的表型与基因型信息表

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种用于检测水稻育性基因组中Ms-1位点的分子标记的引物，其特征在于：所述引物包括Primer X、Primer Y和Primer R，所述Primer X的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Primer Y的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Primer R的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

2.一种利用权利要求1所述的引物进行分子标记的方法，其特征在于：所述方法用于检测水稻基因组第1号染色体的第27607862-27607863位碱基。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

步骤1)：提取待检测水稻的DNA；

步骤2)：KASP反应测试，取50ng/μL基因组DNA0.8μL、引物混合液0.03μL进行PCR扩增；

步骤3)：采用荧光检测分析仪分析扩增产物基因型。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述引物混合液的配比为正向引物100pmol·L^-1 Primer X、100pmol·L^-1 Primer Y各12μL，反向引物100pmol·L^-1 PrimerR 30μL，ddH₂O 46μL。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃退火60s，40个循环。

6.权利要求2所述的方法在鉴定或辅助鉴定水稻育性中的应用。

7.权利要求2所述的方法在鉴定或辅助鉴定不育型水稻产品中的应用。

8.权利要求2所述的方法在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用。

9.权利要求2所述的方法在选育不育型水稻资源中的应用。