CN114836571A - 番茄抗白粉病相关的kasp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了番茄抗白粉病相关的分子标记及其应用。该方法包括检测番茄基因组中SEQ ID No.4的第100‑101位核苷酸是否缺失，根据所述基因型鉴定或辅助鉴定番茄抗白粉病抗性及进行番茄育种，所述基因型为GG或GT的待测番茄为或候选为抗番茄白粉病的番茄；所述基因型为TT的待测番茄为或候选为感白粉病的番茄；所述基因型为GG或GT的待测番茄的白粉病抗性高于所述基因型为TT的待测番茄。可将检测所述番茄基因组中SEQ ID No.4的第100‑101位核苷酸是否缺失的物质与其他物质(如检测其他与番茄抗白粉病相关的分子标记的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备鉴定番茄抗白粉病品种产品。

Description

番茄抗白粉病相关的KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因组序列及植物生物技术领域，具体涉及番茄抗白粉病相关的分子标记及其应用。

背景技术

番茄白粉病是一种真菌性病害，是番茄生产的主要病害之一，严重影响番茄生产，造成巨大的经济损失。番茄白粉病的防治措施主要采用药剂防治、农业措施及种植抗性品种等，其中选育番茄抗白粉病品种是最为有效、环保的方法。在传统抗白粉病品种选育过程中，每代都需要采用田间接种病菌的方法鉴定材料抗性，接种效果易受环境影响，育种效率较低；同时如果接种过程操作不当还会造成病原扩散，不利于白粉病的综合防治，因此抗病品种选育难的问题一直没有彻底解决。

分子标记辅助选择技术(Marker-assisted Selection，MAS)是分子生物学和常规育种相结合的新型育种模式，利用分子标记在植物发育的任何时期从DNA水平对目标植株进行选择(Tanksley等，RFLP mapping in plant breeding:New tools for an oldscience.1989,Biotechnology,7:257-263)，从而弥补传统育种中出现的诸多弊端，是解决抗病品种选育难这一问题的有效途径。其中，利用高通量分子检测平台进行分子标记辅助选择则是增加抗病育种准确度与提高育种效率的有效手段。

目前部分番茄抗白粉病基因已被克隆，如OL-1和OL-2(Huang C C,Cui Y Y,WengC R,et al.Development of diagnostic PCR markers closely linked to the tomatopowdery mildew resistance gene Ol-1on chromosome 6of tomato[J].Theoretical&Applied Genetics,2000,101(5-6):918-924)，相应的SCAR标记也已开发。但上述标记仅为显性标记，无法很好的区分纯合抗病和杂合抗病基因型，同时检测效率相对较低，不适用于高通量的分子检测平台。因此，开发适合于高通量分子检测平台的番茄抗白粉病的分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国的育种效率和育种水平具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的问题是如何鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性。

为了解决以上技术问题，本发明提供番茄抗白粉病相关的KASP分子标记及其应用，并对该标记的实用性进行了验证，为鉴定或辅助培育番茄抗白粉病的品种提供了可靠的分子标记。

本发明首先提供了检测番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸是否缺失的物质在如下任一中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性；

(2)筛选或选育抗白粉病的番茄单株或株系或品系或品种；

(3)筛选或选育感白粉病的番茄单株或株系或品系或品种；

(4)番茄育种；

(5)制备鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性的产品；

(6)制备筛选或选育抗白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品；

(7)制备筛选或选育感白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品；

(8)制备番茄育种的产品。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性的方法，包括检测待测番茄基因组中所述的基因型，根据所述待测番茄的基因型鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性；所述基因型为TT、GG或者GT，所述TT表示番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸为at的纯合型；所述GG基因型表示番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸缺失的纯合型；所述GT基因型表示番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸分别为at和缺失的杂合型。

可选地，根据上述方法，所述鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性可为如下任一种方式：

1)所述基因型为GG或GT的待测番茄为或候选为抗番茄白粉病的番茄；

2)所述基因型为TT的待测番茄为或候选为感白粉病的番茄；

3)所述基因型为GG或GT的待测番茄的白粉病抗性高于所述基因型为TT的待测番茄。

本发明还提供了番茄育种的方法。

本发明所提供的番茄育种的方法为M1或M2：

M1、所述方法包括检测番茄基因组中所述基因型，选择所述基因型为GG或GT的番茄作为亲本进行育种，所述GG是所述番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸缺失的纯合型，所述GT是所述番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸分别为at和缺失的杂合型，所述方法育种的目的包括选育具有白粉病抗性的番茄；

M2、所述方法包括检测番茄基因组中所述基因型，选择所述基因型为TT的番茄作为亲本进行育种，所述TT是所述番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸为at的纯合型，所述方法育种的目的包括选育感白粉病的番茄。

作为一种实施方法，番茄育种的方法可包括如下步骤：

(1)以待测番茄的基因组DNA为模板，采用引物组进行KASP；所述引物组合物由引物A、引物B和引物C组成；

所述引物A为核苷酸序列是序列表中序列1的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列1的第22-42位的单链DNA；

所述引物B为核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-40位的单链DNA；

所述引物C为核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA分子。

(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测番茄所述位点的基因型；

(3)选择GG基因型番茄进行抗白粉病育种。

所述方法中，引物溶解与配制方法可为：先将3条引物分别用ddH₂O稀释成100mmol·L^-1，分别得到引物A溶液、引物B溶液和引物C溶液。再按如下配制引物工作液：引物A12μL、引物B12μL、引物C 30μL、ddH₂O 46μL。

所述方法中，5μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL，LGC公司2×KASP Mix(Low Rox)2.5μL，其余为ddH₂O。

所述方法中，KASP可在荧光定量PCR仪AB-Q6仪器上进行。

所述方法中，KASP的反应程序可为：

扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。

所述方法中，确定所述番茄基因组中InDel-AT位点的基因型的方法为：在AB-Q6荧光定量PCR仪进行荧光读板，温度为58℃，保持30s，采用终末端读取荧光值进行基因分型。

本发明还提供了用于检测番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸是否缺失的产品。

本发明所提供的用于检测番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸是否缺失的产品，为上述检测番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸是否缺失的物质，所述产品可为任一种：

C1)检测番茄白粉病抗性相关的单核苷酸是否缺失的产品；

C2)鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性的产品；

C3)用于番茄育种的产品；

C4)筛选或选育抗白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品；

C5)筛选或选育感白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品。

上述应用、方法和产品中，所述物质可为通过下述至少一种方法确定所述位点核苷酸是否缺失所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

可选地，所述物质可为如下任一种：D1)所述物质为扩增包含番茄基因组中SEQ IDNo.4的第100-101位核苷酸的番茄基因组DNA片段的引物组合物；

D2)所述物质为含有D1)所述引物组合物的PCR试剂；

D3)所述物质为含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。

可选地，所述扩增可为PCR扩增。所述引物组合物由引物A、所述引物B和所述引物C组成。

所述引物A为核苷酸序列是序列表中序列1的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列1的第22-42位的单链DNA；

所述引物B为核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-40位的单链DNA；

所述引物C为核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA分子。

D3)所述试剂盒还可包括特异探针组。所述特异探针组包括荧光探针A、淬灭探针A、荧光探针B和淬灭探针B；荧光探针A如序列表的序列5所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针B如序列表的序列6所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针A和荧光探针B中的荧光基团不同；淬灭探针A如序列表的序列7所示，3’末端连接淬灭基团；淬灭探针B如序列表的序列8所示，3’末端连接淬灭基团。荧光探针A具体可连接FAM荧光基团。荧光探针B具体可连接HEX荧光基团。淬灭探针A具体可连接淬灭基团BHQ。淬灭探针B具体可连接淬灭基团BHQ。

D3)所述试剂盒还可包括KASP HiGeno 2x Probe Mix。

上述应用、方法和产品中，所述引物组合物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。如所述引物组合物可为由核苷酸序列是序列表中序列1的第22-42位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中序列2的第22-40位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA组成的引物组合物，所述引物组合物也可为由序列表中序列1所示的单链DNA、序列表中序列2所示的单链DNA和由序列表中序列3所示的单链DNA的引物组。序列表中序列1由42个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为FAM序列(作为标记物)，第22-42位核苷酸为特异序列；序列表中序列2由40个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为HEX序列(作为标记物)，第22-40位核苷酸为特异序列。

本发明还提供了核苷酸序列是序列表中的SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的DNA分子的应用。

所述应用具体可为在如下任一中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性；

(2)筛选或选育抗白粉病的番茄单株或株系或品系或品种；

(3)筛选或选育感白粉病的番茄单株或株系或品系或品种；

(4)番茄育种；

(5)制备鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性的产品；

(6)制备筛选或选育抗白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品；

(7)制备筛选或选育感白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品；

(8)制备番茄育种的产品。

可选地，在上述应用中，该DNA分子作为检测靶标。

本发明提供了一种番茄抗白粉病相关的分子标记及其应用，所述分子标记是番茄抗白粉病基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸的是否缺失的位点。该标记基于KASP技术开发，可高通量检测番茄基因组第6号染色体的第40254943位碱基。本发明应用KASP技术对番茄基因组中InDel-AT位点的分子标记进行基因分型，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定等优点，可精准检测番茄抗白粉病基因，对改良番茄品系的白粉病抗性具有重要意义。

附图说明

图1为番茄基因组中6个多态性位点。

图2为KASP检测8份品种材料的分型图；其中红色的数据点代表具有等位位点G-VIC的材料集合，蓝色的数据点代表具有等位位点T-FAM的材料集合，绿色的数据点代表同时具有G-VIC和T-FAM的材料集合。

图3为KASP检测分离群体的分型图；其中红色的数据点代表具有等位位点G-VIC的材料集合，蓝色的数据点代表具有等位位点T-FAM的材料集合，绿色的数据点代表同时具有G-VIC和T-FAM的材料集合。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的番茄白粉病菌为番茄白粉病菌(Erysiphe polygoni DC.)(郑坤,姜景彬,康立功,等.番茄白粉病苗期抗病性鉴定方法及抗病种质资源筛选[J].植物保护,2012,38(5):4)，公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的番茄白粉病田间抗性测定方法如下：田间试验采用随机区组设计，共设三个重复区。对于n(自然数)个待测番茄家系，每个重复区设n个小区，每个家系1个小区。每个小区15株幼苗。每株幼苗接种番茄白粉病菌，接种后在相对湿度80％～90％下保持48h，接种14d后调查所有接菌时展开的叶片，记录发病情况、统计发病程度、计算病情指数。

番茄白粉病病情分级标准如下：

0级：不发病。

1级：叶片有粉斑，茎秆、叶柄无病斑。

2级：叶片有粉斑，叶柄病斑≤5％，茎秆上无病斑。

3级：叶片有粉斑，5％＜叶柄病斑≤30％，茎秆上无病斑。

4级：叶片有粉斑，叶柄病斑＞30％，茎秆上有病斑。

5级：叶片干枯，茎秆上有病斑。

病情指数(DI)＝[(Σ各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)]×100。

病情指数≤40为抗病，病情指数＞40为感病。

实施例1、利用InDel分子标记检测番茄对白粉病抗性

1、检测番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸(5′-at-3′)是否缺失的物质对农博粉霸1726(石家庄农博士科技开发有限公司)进行番茄白粉病抗性鉴定，结果表明农博粉霸1726对番茄白粉病菌(Erysiphe polygoni DC.)具有抗性，对农博粉霸1726进行测序分析，结果发现其基因组第6号染色体存在SEQ ID No.4的DNA片段，GenbankAccession Number为NC_015443.3的第40254843-40255042位之间(SEQ ID No.4的DNA片段)与核苷酸序列是SEQ ID No.5存在6个多态性位点(图1，箭头示6个多态性位点)。针对其中的5个多态性位点共设计5组KASP引物，只有针对图1中左起第5个多态性位点(即SEQ IDNo.4的第100-101位核苷酸(5′-at-3′)是否缺失的InDel分子标记)的KASP引物与番茄白粉病抗性相关。将该分子标记命名为InDel-AT。检测番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸(5′-at-3′)是否缺失的物质在本实施例中具体为KASP-InDel-AT引物组。KASP-InDel-AT引物组由两条上游引物(引物A和引物B)和一条下游引物(引物C)组成。

引物A：5’-gaaggtcggagtcaacggattCAGGAGGAGCACAATGAGAAG-3’(SEQ ID No.1，小写字母部分为特异荧光标签序列VIC)；

引物B：5’-gaaggtgaccaagttcatgctTAGGGGGCACGATGAGAAT-3’(SEQ ID No.2，小写字母部分为特异荧光标签序列FAM)；

引物C：5’-CACTACTAGAGCCCTGATCTT-3’(SEQ ID No.3)。

引物B和引物C扩增番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸为5′-at-3′的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到FAM基团的荧光信号；

引物A和引物C扩增番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸缺失的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到VIC基团的荧光信号。

2、利用InDel分子标记检测番茄对白粉病抗性的方法的建立

以表1的8份番茄品种作为测试品种，利用InDel分子标记建立检测番茄对白粉病抗性的方法。采用常规CTAB法从番茄叶片中提取基因组DNA。按照如下方法进行KASP反应测试：

配制引物混液：先将引物A、引物B和引物C这3条引物分别用ddH₂O稀释成100mmol·L^-1，分别得到引物A溶液、引物B溶液和引物C溶液。取引物A溶液12μL、引物B溶液12μL、引物C溶液30μL，加入ddH₂O 46μL，得到引物混液。

2.1荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex检测：

5μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL，LGC公司2×KASP Mix(Low Rox)2.5μL，其余为ddH₂O。按照荧光定量PCR仪AB-Q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。

以上反应体系为AB-Q6 Flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

2.2选择Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测

1.63μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL 0.8μL，引物混液0.03μL，LGC公司2×KASP Mix(Std Rox)0.8μL。根据ArrayTape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。

以上反应体系为Douglas Scientific公司ArrayTape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。

其中，2×KASP Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg²⁺等组成。荧光探针A的核苷酸序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接一个VIC荧光基团；荧光探针B的核苷酸序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其5’端连接一个FAM荧光基团；淬灭探针A的核苷酸序列为：5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为：5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ。

扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。

实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测番茄基因组中InDel-AT位点的基因型(即检测番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸(5′-at-3′)是否缺失)，若所述待测番茄的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近X轴(VIC信号)，则待测番茄基因组中InDel-AT的基因型为GG(即番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸(5′-at-3′)缺失的纯合型)；若待测番茄的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近Y轴(FAM信号)，则待测番茄基因组中InDel-AT的基因型为TT(即番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸为at的纯合型)；若待测番茄的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析位于X轴和Y轴中间(VIC和FAM信号)，则待测番茄基因组中InDel-AT的基因型为GT(即番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸分别为at和缺失的杂合型杂合型)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。

2.3标记分型数据分析

按照步骤2.2的方法测定表1的8个番茄品种的基因型。根据基因型结果进行鉴定待测番茄品种的番茄白粉病抗性：若待测番茄品种的基因型为GT或GG，则该待测番茄品种为抗番茄白粉病番茄，若待测番茄品种的基因型为TT，则该待测番茄品种为感番茄白粉病番茄。所述抗番茄白粉病番茄的番茄白粉病抗性高于所述感番茄白粉病番茄。

按照上述番茄白粉病田间抗性测定方法对表1的8个番茄测试品种进行番茄白粉病抗性鉴定，每个番茄测试品种作为一个家系。8个番茄品种的基因型和番茄白粉病抗性结果如表1所示，农博粉霸1726的基因型为GT，其番茄白粉病抗性为R；其它7个番茄品种的基因型均为TT，其番茄白粉病抗性为S。根据结果表明8份材料的田间番茄白粉病抗性鉴定与基因型的番茄白粉病抗性鉴定结果一致。

表1. 8个番茄品种的表型与基因型信息

3、利用KASP-InDel-AT引物组检测番茄白粉病抗性

按照如下方法获得农博粉霸1726的F5家系：农博粉霸1726(F1)连续自交，在F₃即分株行种植，以后各世代均从每一个株行中随机选择一个单株，衍生出下一世代。自F₄世代同一个家系内随机选择5个单株，种子混合，不同家系分别种植，获得由36个F₅株系组成的重组自交系群体，编号分别为F5_01至F5_36。其中，杂交方式均为自交。

按照步骤2的方法检测农博粉霸1726(F1)和36个F₅株系的基因型，根据基因型结果进行鉴定待测番茄品种的番茄白粉病抗性(图3)：若待测番茄品种的基因型为GT或GG，则该待测番茄品种为抗番茄白粉病番茄，若待测番茄品种的基因型为TT，则该待测番茄品种为感番茄白粉病番茄。所述抗番茄白粉病番茄的番茄白粉病抗性高于所述感番茄白粉病番茄。

按照上述番茄白粉病田间抗性测定方法对其进行番茄白粉病抗性鉴定，每个株系作为一个家系。

结果如表2所示，家系F5_01、F5_02、F5_03、F5_04、F5_05、F5_08、F5_09、F5_10、F5_11、F5_13、F5_15、F5_16、F5_17、F5_18、F5_21、F5_22、F5_24、F5_25这18个家系以及农博粉霸1726均为抗番茄白粉病番茄，家系F5_06、F5_07、F5_12、F5_14、F5_19、F5_20、F5_23、F5_26、F5_27、F5_28、F5_29、F5_30、F5_31、F5_32、F5_33、F5_34、F5_35、F5_36这18个家系为非抗番茄白粉病番茄(感番茄白粉病番茄)。结果表明37份材料的田间番茄白粉病抗性鉴定与基因型的番茄白粉病抗性鉴定结果一致。因此，本发明所述的InDel-AT标记和KASP-InDel-AT引物组可用于番茄白粉病抗性分子标记辅助育种。在选育番茄白粉病抗性番茄的育种中，可选择基因型为GG或GT的番茄作为亲本进行育种；在选育感番茄白粉病的育种中，可选择基因型为TT的番茄作为亲本进行育种。

表2. 37个番茄株系的表型与基因型信息

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京通州国际种业科技有限公司

<120> 番茄抗白粉病相关的KASP分子标记及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtcgga gtcaacggat tcaggaggag cacaatgaga ag 42

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc ttagggggca cgatgagaat 40

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cactactaga gccctgatct t 21

<210> 4

<211> 200

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 4

gcagaaatag atattgaact gataacaaga atcccaattt tataatacac atgtctaact 60

acaaaaatga tcttggacca ggtagggggc acgatgagaa tagtctttgg gggaaaagat 120

cagggctcta gtagtgacag caaaacaatc aaataactga gctaatacct caactcaata 180

ggagtagcaa tgaagttagc 200

<210> 5

<211> 195

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 5

gcagaaatag atattgaact gataacaaga atcccaattt tataatacac atgtctaact 60

acaaaaaaga tcttggacca ggaggagcac aatgagaagt ctttggggaa aagatcaggg 120

ctctagtagt gacagcaaaa caatcaaata actgagctaa tacctcaact caataggagt 180

agcaatgaag ttagc 195

Claims (9)

1.检测番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸是否缺失的物质在如下任一中的应用，

(1)鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性；

(2)筛选或选育抗白粉病的番茄单株或株系或品系或品种；

(3)筛选或选育感白粉病的番茄单株或株系或品系或品种；

(4)番茄育种；

(5)制备鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性的产品；

(6)制备筛选或选育抗白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品；

(7)制备筛选或选育感白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品；

(8)制备番茄育种的产品。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物质为下述任一种：

D1)所述物质为扩增包含番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸的番茄基因组DNA片段的引物组合物；

D2)所述物质为含有D1)所述引物组合物的PCR试剂；

D3)所述物质为含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物组合物由引物A、引物B和引物C组成；

所述引物A为核苷酸序列是序列表中序列1的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列1的第22-42位的单链DNA；

所述引物B为核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-40位的单链DNA；

所述引物C为核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA分子。

4.鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性的方法，包括检测待测番茄的基因型，根据待测番茄的基因型鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性；所述基因型为TT、GG或者GT，所述TT表示番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸为at的纯合型；所述GG基因型表示番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸缺失的纯合型；所述GT基因型表示番茄基因组中SEQID No.4的第100-101位核苷酸分别为at和缺失的杂合型。

所述鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性为如下任一种方式：

1)所述基因型为GG或GT的待测番茄为或候选为抗番茄白粉病的番茄；

2)所述基因型为TT的待测番茄为或候选为感白粉病的番茄；

3)所述基因型为GG或GT的待测番茄的白粉病抗性高于所述基因型为TT的待测番茄。

5.番茄育种的方法，其特征在于：所述方法为M1或M2：

M1、所述方法包括检测番茄基因组中权利要求4中所述基因型，选择所述基因型为GG或GT的番茄作为亲本进行育种，所述GG是所述番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸缺失的纯合型，所述GT是所述番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸分别为at和缺失的杂合型，所述方法的育种的目的包括选育具有白粉病抗性的番茄；

M2、所述方法包括检测番茄基因组中权利要求4中所述基因型，选择所述基因型为TT的番茄作为亲本进行育种，所述TT是所述番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸为at的纯合型，所述方法的育种的目的包括选育感白粉病的番茄。

6.用于检测番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸是否缺失的产品，其特征在于：所述产品为权利要求1中所述物质，所述产品为任一种：

C1)检测番茄白粉病抗性相关的单核苷酸是否缺失的产品；

C2)鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性的产品；

C3)用于番茄育种的产品；

C4)筛选或选育抗白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品；

C5)筛选或选育感白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述物质为下述任一种：

D1)所述物质为扩增包含番茄基因组中SEQ ID No.4的第100-101位核苷酸的番茄基因组DNA片段的引物组合物；

D2)所述物质为含有D1)所述引物组合物的PCR试剂；

D3)所述物质为含有D1)所述引物组合物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的应用或产品，其特征在于：所述引物组合物由引物A、引物B和引物C组成；

所述引物A为核苷酸序列是序列表中序列1的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列1的第22-42位的单链DNA；

所述引物B为核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-40位的单链DNA；

所述引物C核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA分子。

9.DNA分子在如下任一中的应用，

(1)鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性；

(2)筛选或选育抗白粉病的番茄单株或株系或品系或品种；

(3)筛选或选育感白粉病的番茄单株或株系或品系或品种；

(4)番茄育种；

(5)制备鉴定或辅助鉴定番茄白粉病抗性的产品；

(6)制备筛选或选育抗白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品；

(7)制备筛选或选育感白粉病的番茄单株或株系或品系或品种的产品；

(8)制备番茄育种的产品。

所述DNA分子的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID No.4或SEQ ID No.5。

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