CN116334279A - 一种小麦灌浆后期冠层持绿且偏冷型相关的kasp标记及其应用 - Google Patents

一种小麦灌浆后期冠层持绿且偏冷型相关的kasp标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小麦灌浆后期冠层持绿且偏冷型相关的KASP标记及其应用。本发明提供了检测小麦染色体1B上SNP位点AX‑86174278位点的基因型的物质、检测麦染色体3A上SNP位点AX‑861164768位点的基因型的物质和/或检测小麦染色体4B上SNP位点AX‑109381183位点的基因型的物质，在鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性中的应用；并设计了KASP标记专用引物，可用于鉴定灌浆后期冠层持绿且偏冷型性状，进而用于筛选高产、抗逆、广适型优良的小麦品种，为选育高产稳产品质优良的小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。

Description

一种小麦灌浆后期冠层持绿且偏冷型相关的KASP标记及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种小麦灌浆后期(花后21天)冠层持绿且偏冷型相关的KASP标记及其应用。
背景技术
小麦是全球种植最广泛的作物，是世界人口蛋白质的主要来源，占发展中国家每日摄入量约20％。全球气候变化导致极端高温事件频发，小麦生育后期易遭受到高温胁迫。高温胁迫会加速小麦叶片功能衰退，灌浆持续期短，粒重下降，最终导致减产。因此，防止叶片衰老已经成为小麦增产的重要手段。
持绿且偏冷型小麦品种叶功能期长、叶绿素含量高于非持绿品种，对穗数、千粒重等产量构成影响显著(骆永丽等，2016)，能够减轻灌浆期干旱胁迫引起的负效应。在叶片衰老过程中，叶绿素降解与合成引起含量变化是叶片衰老可见的表型性状，持绿可以修复或减缓这种性状发生。
分子标记辅助选择技术可跟踪转育或聚合持绿基因，为培育具有高产广适型小麦品种提供了有效技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供了三个与小麦灌浆后期(花后21天)冠层持绿和偏冷性状相关的SNP位点，基于上述位点开发了三个KASP标记专用引物，这些KASP标记引物可以用来鉴定或辅助鉴定小麦衰老相关性状。
第一方面，本发明提供了如下A，A和B，或，A、B和C，在如下任一种中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性；
2)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿性；
3)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期的温度；
4)鉴定或辅助鉴定待测小麦灌浆后期的衰老程度；
5)选育冠层灌浆后期持绿偏冷型小麦；
6)选育衰老程度低的小麦；
7)选育产量高的小麦；
8)小麦遗传育种；
所述A为检测小麦染色体1B上SNP位点AX-86174278位点的基因型的物质；
所述B为检测小麦染色体3A上SNP位点AX-861164768位点的基因型的物质；
所述C为检测小麦染色体4B上SNP位点AX-109381183位点的基因型的物质；
所述SNP位点AX-86174278位点为SEQ ID NO:10第36位；
所述SNP位点AX-861164768位点为SEQ ID NO:11反向互补序列的第36位；
所述SNP位点AX-109381183位点为SEQ ID NO:12第36位。
上文所述应用中，
所述SNP位点AX-86174278位点的基因型为TT、CC或CT；
所述SNP位点AX-861164768位点的基因型为AA、GG或AG；
所述SNP位点AX-109381183位点的基因型为AA、GG或AG。
上文所述应用中，
所述检测小麦染色体1B上SNP位点AX-86174278位点的基因型的物质为A1)或A2)：
A1)成套引物1；
A2)含有所述成套引物1的PCR试剂或试剂盒；
所述成套引物1包括引物F1-1、引物F1-2及引物1-R；
所述引物F1-1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1第22-42位所示的序列；
所述引物F1-2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2第22-42位所示的序列；
所述引物1-R的核苷酸序列为SEQ ID NO:3；
所述检测小麦染色体3A上SNP位点AX-861164768位点的基因型的物质为B1)或B2)：
B1)成套引物2；
B2)含有所述成套引物2的PCR试剂或试剂盒；
所述成套引物1包括引物F2-1、引物F2-2及引物2-R；
所述引物F2-1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:4第22-41位所示的序列；
所述引物F2-2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:5第22-41位所示的序列；
所述引物2-R的核苷酸序列为SEQ ID NO:6；
所述检测小麦染色体4B上SNP位点AX-109381183位点的基因型的物质为C1)或C2)：
C1)成套引物3；
C2)含有所述成套引物3的PCR试剂或试剂盒；
所述成套引物3包括引物F3-1、引物F3-2及引物3-R；
所述引物F3-1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:7第22-39位所示的序列；
所述引物F3-2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:8第22-39位所示的序列；
所述引物3-R的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。
上文所述应用中，
所述引物F1-1的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
所述引物F1-2的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
或，所述引物F2-1的核苷酸序列为SEQ ID NO:4；
所述引物F2-2的核苷酸序列为SEQ ID NO:5；
或，所述引物F3-1的核苷酸序列为SEQ ID NO:7；
所述引物F3-2的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。
上述每组所述成套引物组还包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B；
所述荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B的核苷酸序列依次为SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:16；
所述荧光探针A和所述荧光探针B的末端标记不同的荧光基团；
所述淬灭探针A和所述淬灭探针B的末端标记不同的淬灭基团。
第二方面，本发明提供了如下任一物质：
第一方面中所述成套引物1；
或第一方面中所述成套引物1和所述成套引物2；
或第一方面中所述成套引物1、所述成套引物2和所述成套引物3；
或含有第一方面中所述的成套引物的PCR试剂或试剂盒；
或SEQ ID NO:10所示DNA片段；
或SEQ ID NO:11或其反向互补序列所示DNA片段；
或SEQ ID NO:12所示DNA片段；
所述PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2和PCR试剂3组成；
所述PCR试剂1包括所述引物F1-1、所述引物F1-2、所述引物1-R、荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；
所述PCR试剂2包括所述引物F2-1、所述引物F2-2、所述引物2-R、所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B；
所述PCR试剂3包括所述引物F3-1、所述引物F3-2、所述引物3-R、所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B；
所述荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B的核苷酸序列依次为SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:16；
所述荧光探针A和所述荧光探针B的末端标记不同的荧光基团；
所述淬灭探针A和所述淬灭探针B的末端标记不同的淬灭基团。
上述每个PCR试剂中，所述引物F1、所述引物F2和所述引物R的摩尔比为0.1344：0.1344：0.336。，在本发明的实施例中，所述引物F1、所述引物F2在PCR扩增体系中的终浓度均为0.1344μM，引物R在PCR扩增体系中的终浓度为0.336μM。
第三方面，本发明提供了第一方面中所述成套引物1、所述成套引物2、所述成套引物3、第二方面中所述PCR试剂或所述试剂盒在如下任一或者制备具有如下任一特征的产品中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性；
2)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿性；
3)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期的温度；
4)鉴定或辅助鉴定待测小麦灌浆后期的衰老程度；
5)选育冠层灌浆后期持绿偏冷型小麦；
6)选育衰老程度低的小麦；
7)选育产量高的小麦；
8)小麦遗传育种。
上文中，待测小麦灌浆后期的衰老程度通过冠层灌浆后期持绿性、温度和/或持绿且偏冷型特性体现；
冠层灌浆后期持绿性高的小麦的衰老程度低于冠层灌浆后期持绿性低的小麦；
或，冠层灌浆后期温度低的小麦的衰老程度低于冠层灌浆后期温度高的小麦；
或，冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大的小麦的衰老程度低于持绿且偏冷型特性小的小麦。
上述持绿性通过冠层灌浆后期的叶绿素含量体现，冠层灌浆后期持绿性高具体为冠层灌浆后期叶绿素含量高。
上述持绿且偏冷型特性大通过冠层灌浆后期持绿性高且温度低体现。
上文中的遗传育种为与高通量表型无人机平台结合，加快了无人机光谱在小麦遗传育种。
第三方面，本发明提供了如下任一方法：
A、一种鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性的方法，为如下方法A1，或，如下方法A1和A2，或，如下方法A1、A2和A3：
A1)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT，TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于CC或CT基因型的待测小麦；
A2)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
A3)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
B、一种鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿性的方法，为如下方法B1，或，如下方法B1和B2，或，如下方法B1、B2和B3：
B1)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT，TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿性大于或候选大于CC或CT基因型的待测小麦；
B2)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
B3)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
C、一种鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期的温度的方法，为如下方法C1，或，如下方法C1和C2，或，如下方法C1、C2和C3：
C1)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT，TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期的温度低于或候选低于CC或CT基因型的待测小麦；
C2)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期的温度低于或候选低于GG或AG基因型的待测小麦；
C3)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期的温度低于或候选低于GG或AG基因型的待测小麦；
D、一种鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期衰老程度的方法，为如下方法D1，或，如下方法D1和D2，或，如下方法D1、D2和D3：
D1)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT，TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期衰老程度小于或候选小于CC或CT基因型的待测小麦；
D2)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期衰老程度小于或候选小于GG或AG基因型的待测小麦；
D3)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期衰老程度小于或候选小于GG或AG基因型的待测小麦。
上文所述方法中，
所述检测待测小麦基因组中SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT的方法如下：以待测小麦基因组为模板，用第二方面中所述PCR试剂1进行KASP检测，获得基因型；
或，所述检测待测小麦基因组中SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG的方法如下：以待测小麦基因组为模板，用第二方面中所述PCR试剂2进行KASP检测，获得基因型；
或，所述检测待测小麦基因组中SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG的方法如下：以待测小麦基因组为模板，用第二方面中所述PCR试剂3进行KASP检测，获得基因型。
在本发明方法中，获得基因型为利用KlusterCallerTM软件根据荧光信号判断基因型。
上述KASP检测可以采用Touch down PCR扩增程序，具体如下：94℃预变性15min；(Touch down程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。
第四方面，本发明提供了一种选育冠层灌浆后期衰老程度低的小麦的方法，为如下1)、2)或/和3)：
1)选育第三方面中所述方法中的SNP位点AX-86174278基因型是TT的小麦；
2)选育第三方面中所述方法中的SNP位点AX-861164768的基因型是AA的小麦；
3)选育第三方面中所述方法中的SNP位点AX-109381183的基因型是AA的小麦。
第五方面，本发明提供了一种选育冠层灌浆后期产量高的小麦的方法，为如下1)、2)或/和3)：
1)选育第三方面中所述方法中的SNP位点AX-86174278基因型是TT的小麦；
2)选育第三方面中所述方法中的SNP位点AX-861164768的基因型是AA的小麦；
3)选育第三方面中所述方法中的SNP位点AX-109381183的基因型是AA的小麦。
在本发明中，小麦包括但不限于如下品种中的任一种或任几种：中麦175/轮选987RIL群体(148份)，广泛种植于黄淮麦区的自然群体(160份)。
本发明的有益效果
本研究将灌浆后期旗叶叶绿素含量(CHL)和冠层温度(CT)两种性状进行整合，利用中麦175/轮选987RIL群体，定义了一个CHL/CT新指标，用来筛选灌浆后期“持绿”且“偏冷型”性状，挖掘QTL位点。根据紧密连锁的SNP标记转化为KASP标记，为选育高产稳产品质优良的小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。
本发明涉及三个与小麦灌浆后期持绿偏冷型性状相关的SNP位点，该位点分别位于小麦1B,3A和4B染色体551.01，557.96和443.45Mb位置处。本发明还基于这些SNP位点开发了KASP标记专用引物、包含该KASP标记引物的试剂盒。本发明的KASP标记专用引物可用于鉴定待测小麦的基因型，根据待测小麦的基因型进而用于筛选持绿产量潜力大的小麦品种。利用本发明的KASP标记专用引物可用于鉴定灌浆后期冠层持绿且偏冷型性状，进而用于筛选高产、抗逆、广适型优良的小麦品种，为选育高产稳产品质优良的小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。
附图说明
图1为SNP标记与QTL-caas-1B,QTL-caas-3A,QTL-caas-4B2基因的连锁图。
图2为自然群体品种灌浆后期冠层持绿偏冷型的KASP标记检测结果，A、B和C分别为AX-86174278(图中记作AX-86174278-1B)、AX-861164768(图中记作AX-861164768-3A)，AX-109381183(图中记作AX-109381183-4B2)的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。下述实施例中的定量试验，均设置两次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的所有引物均由北京华大生物技术有限责任公司合成；KASP分型所用试剂由北京嘉城生物科技有限公司提供。
实施例1、与小麦冠层持绿和偏冷型性状相关的KASP标记专用引物的获得
一、冠层持绿和偏冷型性状调查及SNP标记分析
1、叶绿素含量和冠层温度性状调查
选用中麦175/轮选987的RIL群体，包括亲本共148个家系作为实验材料进行衰老性状试验，对灌浆后期小麦旗叶叶绿素含量(CHL)和冠层温度(CT)进行调查。
试验以小区种植，小区面积3.6m2(1.2*3.0)。具体步骤如下：尽可能减少边际效应，用SPAD502(Konica Minolta,Japan)于灌浆后期对每个小区非边行区域，长势一致的6株小麦旗叶叶片进行测量叶绿素含量，取平均值作为该家系的叶绿素含量。选取晴朗无风的中午(11:00-13:00)，用红外测温枪(Spectrum Tech.,Inc.Aurora IL,USA)对每个小区的冠层温度进行测量，测量角度要保持一致。具体性状调查参考(Pask,Pietragalla,etal.,2012)。
灌浆后期叶绿素含量CHL越高，代表其具有更高的产量潜力；灌浆后期冠层温度CT越低，代表其具有更高的产量潜力。
针对高产家系往往具有“持绿”且“偏冷型”冠层温度的特性，将小麦旗叶叶绿素含量和冠层温度进行整合，构建了一个能综合反应小麦家系灌浆后期“持绿”且“偏冷型”的指标CHL/CT,公式如下：
Figure BDA0004094973290000081
N代表总的小区数目，i代表第几个小区，j代表灌浆后期；CHL/CT比值越高，则代表叶片更持绿且冠层温度更低，说明该家系具有更高的产量潜力。
2、SNP标记分析
SNP(单核苷酸多态性)标记在博奥生物有限公司(CapitalBio Corporation,Beijing,China；http://bioservices.capitalbio.com)利用Illumina SNP基因分型检测，对中麦175/轮选987RIL群体进行50k SNP芯片分型。
二、基因定位和连锁标记AX-86174278,AX-861164768,AX-109381183的发现
利用Icimapping 4.1软件,结合50k SNP芯片分型数据和表型结果定位关联位点。发掘出与目标性状相关的QTL(QTL-caas-1B,QTL-caas-3A,QTL-caas-4B2)。
根据International Wheat Genome Sequencing Consortium(IWGSC)RefSeg 1.0(IWGSC,2018)http://plants.ensembl.org/index.html)，确定QTL-caas-1B,QTL-caas-3A,QTL-caas-4B2在染色体上的物理位置。并确定3个SNP位点AX-86174278,AX-861164768,AX-109381183(图1)。
SNP位点AX-86174278(又记作AX-86174278-1B)为SEQ ID NO:10第36位，该位点的碱基N为C或T,来自待测小麦1B染色体551.01Mb位置处的基因(Chinese Spring genomeV1.0)，该位点的基因型为TT、CC或CT。
SNP位点AX-861164768(又记作AX-861164768-3A)为SEQ ID NO:11反向互补序列的第36位，该位点的碱基N为A或G,来自小麦3A染色体557.96Mb位置处的基因(ChineseSpring genome V1.0)，该位点的基因型为AA、GG或AG。
SNP位点AX-109381183(又记作AX-109381183-4B2)为SEQ ID NO:12第36位，该位点的碱基N为A或G,来自小麦4B染色体443.45Mb Mb位置处的基因(Chinese Spring genomeV1.0)，该位点的基因型为AA、GG或AG。
三、KASP标记专用引物的开发
1、KASP标记专用引物的设计
本发明针对上述二得到的SNP位点开发KASP标记专用引物，KASP标记专用引物序列如下表1所示。
SNP位点开发的KASP标记专用引物由2条上游引物即引物F1和引物F2，以及1条下游引物即引物R组成。
表1为标记引物序列信息
Figure BDA0004094973290000091
上表中，每个F1引物的第1-21位均为FAM荧光序列，其余为特异引物；每个F2引物的第1-21位均为HEX荧光序列，其余为特异引物。
其中，对于AX-86174278标记来说引物F1与引物R组合可以扩增SNP位点基因型为CC的片段(具有SEQ ID NO:10的片段，且36位为C)，引物F2与引物R组合可以扩增SNP位点基因型为TT的片段(具有SEQ ID NO:10的片段，且36位为T)。AX-86174278位点开发的KASP标记引物F1和引物F2是作为正向引物，引物R是反向引物。
对于AX-86164768标记来说引物F1与引物R组合可以扩增SNP位点基因型为CC的片段(具有SEQ ID NO:11反向互补序列的片段，且SEQ ID NO:11反向互补序列的36位为G)，引物F2与引物R组合可以扩增SNP位点基因型为TT的片段(具有SEQ ID NO:11反向互补序列的片段，且SEQ ID NO:11反向互补序列的36位为A)。AX-86164768位点开发的KASP标记引物F1和引物F2是作为反向引物，引物R是正向引物。
对于AX-109381183标记来说引物F1与引物R组合可以扩增SNP位点基因型为AA的片段(具有SEQ ID NO:12的片段，且36位为A)，引物F2与引物R组合可以扩增SNP位点基因型为GG的片段(具有SEQ ID NO:12的片段，且36位为G)。AX-109381183位点开发的KASP标记引物F1和引物F2是作为正向引物，引物R是反向引物。
2、KASP标记专用引物扩增
分别提取各个品种小麦叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别采用不同的SNP位点对应的KASP标记专用引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。其中，携带荧光序列FAM的PCR扩增产物经荧光照射显示红色，而携带荧光序列HEX的PCR扩增产物经荧光照射显示蓝色。
上述PCR扩增体系如下(总体积为5.0μl)：50ng/μl模板DNA 2.0μl，2×KASPreaction mix 1.5μl，引物混合试剂(Assay mix)0.0336μl，ddH2O 1.4664μl。
2×KASP reaction mix试剂：使用北京嘉城生物科技有限公司生产的AQP基因分型通用试剂盒(18241211/2218)，产品包含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B、以及HiGeno DNA Polymerase、PCR buffer和dNTP。具体原理和产品信息详见网址：http://www.jasongen.com/newsdetail.aspx？channel_id＝1017&id＝1
上述荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′(SEQ ID NO:13)，5′末端连接1个荧光基团FAM；
上述荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′(SEQ ID NO:14)，5′末端连接1个荧光基团HEX；
上述淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′(SEQ ID NO:15)，3′末端连接淬灭基团BHQ；
上述淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′(SEQ ID NO:16)，3′末端连接淬灭基团BHQ。
上述引物混合试剂(Assay mix)配方：12.0μM浓度引物F1、12.0μM浓度引物F2、30.0μM浓度引物R，余量为水；且引物F1和引物F2在上述PCR扩增体系中的浓度均为0.1344μM，引物R在PCR扩增体系中的终浓度为0.336μM。
上述PCR扩增反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，采用Touch down PCR扩增程序为：94℃预变性15min；(Touch down程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。
将PCR扩增产物在PHERAstarplus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCallerTM软件读取分型后的数据，实现检测AX-86174278、AX-86164768和AX-109381183位点的基因型。
四、AX-86174278、AX-861164768，AX-109381183位点的等位基因特异标记鉴定分别提取2019新乡灌溉的160个自然群体(表4)的全基因组DNA。
以各个基因组DNA为模板，用SNP标记AX-86174278、AX-861164768，AX-109381183位点对应的KASP标记专用引物用上述三中2的方法进行基因分型检测，检测不同品种的基因型。
结果如图2和表2所示，可以看出，表明SNP标记能够有效鉴定小麦AX-86174278、AX-861164768，AX-109381183位点基因型。
表2为AX-86174278、AX-861164768，AX-109381183标记等位变异在自然群体分离情况
标记名称 基因型 个数a
AX-86174278 TT 105
CC 45
CT 0
？ 10
AX-109381183 AA 53
GG 101
AG 0
？ 6
AX-861164768 GG 133
AA 23
AG 3
？ 1
a对应基因型的个数
表3为AX-86174278，AX-861164768,AX-109381183标记等位变异在自然群体四个环境中的分离情况
Figure BDA0004094973290000111
/>
Figure BDA0004094973290000121
/>
Figure BDA0004094973290000131
a对应基因型的个数
bE1-E4,分别对应2019新乡灌溉，2019新乡节水，2019漯河灌溉，2019漯河节水c平均值±标准差
d两组表型数据t检验.*和**,分别代表在0.05个0.01水平下差异显著
表4为自然群体信息
Figure BDA0004094973290000132
/>
Figure BDA0004094973290000141
/>
Figure BDA0004094973290000151
/>
Figure BDA0004094973290000161
/>
Figure BDA0004094973290000171
/>
Figure BDA0004094973290000181
因此，上述结果可以看出，SNP标记AX-86174278,AX-861164768,AX-109381183均可以对自然群体中个体进行分型，且AX-86174278标记有利基因型TT在自然群体中广泛应用，而AX-861164768和AX-109381183有利基因型AA这两个标记在自然群体中较少，说明具有巨大的改良潜力，可以对待测小麦灌浆后期(花后21天)叶片持绿，冠层偏冷性状进行定量，具体分析如下：
1)检测待测小麦SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT，判断如下：
TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿性大于或候选大于CC或CT基因型的待测小麦；
或，TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期的温度低于或候选低于CC或CT基因型的待测小麦；
或，TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于CC或CT基因型的待测小麦；
2)检测待测小麦SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
或，AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期的温度低于或候选低于GG或AG基因型的待测小麦；
或，AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
3)检测待测小麦SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期的持绿性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
或，AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期的温度低于或候选低于GG或AG基因型的待测小麦；
或，AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦。
上述持绿性通过叶绿素含量体现，叶绿素含量越高，表明持绿性越大；
上述持绿且偏冷型特性通过叶绿素含量与冠层温度的比值(CHL/CT，公式见前面一所述)体现，比值越高，表明持绿且偏冷型特性越好，即叶片更持绿且冠层温度更低，说明该家系具有更高的产量潜力。
实施例2、小麦冠层持绿和偏冷型性状相关的KASP标记专用引物的应用
选用自然群体对标记AX-86174278,AX-861164768,AX-109381183位点进行t-检验，验证KASP标记有效性，辅助育种决策。
一、检测不同品种的小麦灌溉后期的冠层温度和叶绿素含量
方法与实施例1相同，冠层温度(CT)和叶绿素含量(CHL)和冠层持绿且偏冷型特性(CHL/CT)结果如表3所示。
二、检测不同品种小麦SNP位点的基因型
分别提取2019新乡灌溉、2019新乡节水、2019漯河灌溉、2019漯河节水种植的160个自然品种(前述表4所示)的基因组DNA。
以基因组DNA为模板，分别用SNP标记AX-86174278,AX-861164768,AX-109381183位点对应的KASP标记专用引物用实施例1的三中2的方法采用KASP标记专用引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。其中，携带荧光序列FAM的PCR扩增产物经荧光照射显示红色，而携带荧光序列HEX的PCR扩增产物经荧光照射显示蓝色。
上述PCR扩增体系如下(总体积为5.2μl)：20ng/μl模板DNA 3.0μl，2×KASPreaction mix 2.0μl，引物混合试剂(Assay mix)0.1μl，ddH2O 0.1μl。2×KASP reactionmix包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。
上述荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′(SEQ ID NO:13)，5′末端连接1个荧光基团FAM；
上述荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′(SEQ ID NO:14)，5′末端连接1个荧光基团HEX；
上述淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′(SEQ ID NO:15)，3′末端连接淬灭基团BHQ；
上述淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′(SEQ ID NO:16)，3′末端连接淬灭基团BHQ。
上述引物混合试剂中包括引物F1、引物F2和引物R，引物F1和引物F2在PCR扩增体系中的终浓度均为0.1344μM，引物R在PCR扩增体系中的终浓度为0.336μM。
PCR扩增反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，采用Touch down PCR扩增程序为：94℃预变性15min；(Touch down程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。
将PCR扩增产物在PHERAstarplus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCallerTM软件读取分型后的数据。
判断方式如下：
1)检测待测小麦SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT，判断如下：
TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于CC或CT基因型的待测小麦；
2)检测待测小麦SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
3)检测待测小麦SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦。
对各小麦品种PCR扩增产物进行两两比较，根据颜色进行t-test。三个标记在自然群体四个环境基因分型结果及其持绿偏冷型性状验证见表3和图2所示。
以上结果表明：AX-86174278位点的基因型仅为TT时、AX-861164768和AX-109381183位点的基因型仅为AA的小麦品种具有较高的叶绿素含量较低的冠层温度，说明该位点能够快速、准确地鉴定小麦衰老相关性状(具体体现在高叶绿素含量和/或低的冠层温度)或预测其产量，辅助育种决策。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.如下A，A和B，或，A、B和C，在如下任一种中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性；
2)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿性；
3)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期的温度；
4)鉴定或辅助鉴定待测小麦灌浆后期的衰老程度；
5)选育冠层灌浆后期持绿偏冷型小麦；
6)选育衰老程度低的小麦；
7)选育产量高的小麦；
8)小麦遗传育种；
所述A为检测小麦染色体1B上SNP位点AX-86174278位点的基因型的物质；
所述B为检测小麦染色体3A上SNP位点AX-861164768位点的基因型的物质；
所述C为检测小麦染色体4B上SNP位点AX-109381183位点的基因型的物质；
所述SNP位点AX-86174278位点为SEQ ID NO:10第36位；
所述SNP位点AX-861164768位点为SEQ ID NO:11反向互补序列的第36位；
所述SNP位点AX-109381183位点为SEQ ID NO:12第36位。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述SNP位点AX-86174278位点的基因型为TT、CC或CT；
所述SNP位点AX-861164768位点的基因型为AA、GG或AG；
所述SNP位点AX-109381183位点的基因型为AA、GG或AG。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述检测小麦染色体1B上SNP位点AX-86174278位点的基因型的物质为A1)或A2)：
A1)成套引物1；
A2)含有所述成套引物1的PCR试剂或试剂盒；
所述成套引物1包括引物F1-1、引物F1-2及引物1-R；
所述引物F1-1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1第22-42位所示的序列；
所述引物F1-2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2第22-42位所示的序列；
所述引物1-R的核苷酸序列为SEQ ID NO:3；
所述检测小麦染色体3A上SNP位点AX-861164768位点的基因型的物质为B1)或B2)：
B1)成套引物2；
B2)含有所述成套引物2的PCR试剂或试剂盒；
所述成套引物1包括引物F2-1、引物F2-2及引物2-R；
所述引物F2-1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:4第22-41位所示的序列；
所述引物F2-2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:5第22-41位所示的序列；
所述引物2-R的核苷酸序列为SEQ ID NO:6；
所述检测小麦染色体4B上SNP位点AX-109381183位点的基因型的物质为C1)或C2)：
C1)成套引物3；
C2)含有所述成套引物3的PCR试剂或试剂盒；
所述成套引物3包括引物F3-1、引物F3-2及引物3-R；
所述引物F3-1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:7第22-39位所示的序列；
所述引物F3-2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:8第22-39位所示的序列；
所述引物3-R的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述引物F1-1的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
所述引物F1-2的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
或，所述引物F2-1的核苷酸序列为SEQ ID NO:4；
所述引物F2-2的核苷酸序列为SEQ ID NO:5；
或，所述引物F3-1的核苷酸序列为SEQ ID NO:7；
所述引物F3-2的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。
5.如下任一物质：
权利要求3或4中所述成套引物1；
或权利要求3或4中所述成套引物1和所述成套引物2；
或权利要求3或4中所述成套引物1、所述成套引物2和所述成套引物3；
或含有权利要求3或4中所述的成套引物的PCR试剂或试剂盒；
或SEQ ID NO:10所示DNA片段；
或SEQ ID NO:11或其反向互补序列所示DNA片段；
或SEQ ID NO:12所示DNA片段；
所述PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2和PCR试剂3组成；
所述PCR试剂1包括所述引物F1-1、所述引物F1-2、所述引物1-R、荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；
所述PCR试剂2包括所述引物F2-1、所述引物F2-2、所述引物2-R、所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B；
所述PCR试剂3包括所述引物F3-1、所述引物F3-2、所述引物3-R、所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B；
所述荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:16；
所述荧光探针A和所述荧光探针B的末端标记不同的荧光基团；
所述淬灭探针A和所述淬灭探针B的末端标记不同的淬灭基团。
6.权利要求3或4中所述成套引物1，所述成套引物1和所述成套引物2，所述成套引物1、所述成套引物2和所述成套引物3，或，权利要求5所述PCR试剂或所述试剂盒，在如下任一或者制备具有如下任一特征的产品中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性；
2)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿性；
3)鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期的温度；
4)鉴定或辅助鉴定待测小麦灌浆后期的衰老程度；
5)选育冠层灌浆后期持绿偏冷型小麦；
6)选育衰老程度低的小麦；
7)选育产量高的小麦；
8)小麦遗传育种。
7.如下任一：
A、一种鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性的方法，为如下方法A1，或，如下方法A1和A2，或，如下方法A1、A2和A3：
A1)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT，TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于CC或CT基因型的待测小麦；
A2)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
A3)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿且偏冷型特性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
B、一种鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期持绿性的方法，为如下方法B1，或，如下方法B1和B2，或，如下方法B1、B2和B3：
B1)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT，TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿性大于或候选大于CC或CT基因型的待测小麦；
B2)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
B3)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期持绿性大于或候选大于GG或AG基因型的待测小麦；
C、一种鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期的温度的方法，为如下方法C1，或，如下方法C1和C2，或，如下方法C1、C2和C3：
C1)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT，TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期的温度低于或候选低于CC或CT基因型的待测小麦；
C2)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期的温度低于或候选低于GG或AG基因型的待测小麦；
C3)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期的温度低于或候选低于GG或AG基因型的待测小麦；
D、一种鉴定或辅助鉴定待测小麦冠层灌浆后期衰老程度的方法，为如下方法D1，或，如下方法D1和D2，或，如下方法D1、D2和D3：
D1)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT，TT基因型的待测小麦的冠层灌浆后期衰老程度小于或候选小于CC或CT基因型的待测小麦；
D2)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期衰老程度小于或候选小于GG或AG基因型的待测小麦；
D3)所示的方法包括如下步骤：检测待测小麦基因组中SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG，判断如下：
AA基因型的待测小麦的冠层灌浆后期衰老程度小于或候选小于GG或AG基因型的待测小麦。
8.根据权利要求7中所述的方法，其特征在于：
所述检测待测小麦基因组中SNP位点AX-86174278基因型是TT、CC或CT的方法如下：以待测小麦基因组为模板，用权利要求5中所述PCR试剂1进行KASP检测，获得基因型；
或，所述检测待测小麦基因组中SNP位点AX-861164768的基因型是AA、GG或AG的方法如下：以待测小麦基因组为模板，用权利要求5中所述PCR试剂2进行KASP检测，获得基因型；
或，所述检测待测小麦基因组中SNP位点AX-109381183的基因型是AA、GG或AG的方法如下：以待测小麦基因组为模板，用权利要求5中所述PCR试剂3进行KASP检测，获得基因型。
9.一种选育冠层灌浆后期衰老程度低的小麦的方法，为如下1)、2)或/和3)：
1)选育权利要求7中所述方法中的SNP位点AX-86174278基因型是TT的小麦；
2)选育权利要求7中所述方法中的SNP位点AX-861164768的基因型是AA的小麦；
3)选育权利要求7中所述方法中的SNP位点AX-109381183的基因型是AA的小麦。
10.一种选育冠层灌浆后期产量高的小麦的方法，为如下1)、2)或/和3)：
1)选育权利要求7中所述方法中的SNP位点AX-86174278基因型是TT的小麦；
2)选育权利要求7中所述方法中的SNP位点AX-861164768的基因型是AA的小麦；
3)选育权利要求7中所述方法中的SNP位点AX-109381183的基因型是AA的小麦。
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