CN117867155A - 一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记及其应用，该SNP分子标记为CaS900025_K01，所述SNP分子标记的SNP位点位于狭叶油茶的7号染色体的第94365530位的碱基处，所述SNP位点的碱基为G或T。本发明的SNP分子标记直接以DNA的形式表现，其基因型与油茶叶片的叶绿素含量高低显著相关，具有鉴定效率高、适用性强等优点；将其用于鉴定或辅助鉴定油茶光合表型叶绿素含量时，不仅可以快捷方便地预测油茶叶片光合表型叶绿素含量，还可以快速精准地筛选出高SPAD含量的油茶品种，从而大量节省传统育种的成本，加快油茶高SPAD含量光合表型新品种的选育进程。
Description
技术领域
本发明属于油茶分子生物学技术领域，具体涉及一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
光合作用在植物生长发育过程中起着极其重要的作用，光合作用强弱不仅影响植物光合速率和作物产量，而且在一定程度上决定植物的品质。光合特性作为植物高产稳产的内在基础，一直以来都作为油茶研究领域的重要内容之一。然而光合作用是由多基因控制的复杂数量性状，对复杂数量性状的解析一直是油茶研究领域的重要内容之一。
由于油茶基因组庞大、遗传背景复杂，因此油茶光合特性的研究主要集中在以生理特性为研究的基础选择育种。但随着测序技术的发展，分子标记技术被广泛用于水稻、小麦等作物的表型变异和基因型相关性分析，并通过分子标记技术发现了一些与光合作用显著相关的数量性状位点。单核苷酸多态性SNP(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，利用SNP分子标记可快速预测油茶叶片叶绿素含量，缩短育种年限，具有较高的遗传稳定性。SNP基因分型主要包括TaqMan探针、限制性片段长度多态性(RFLP)、飞行质谱法(MALDI-TOF MS)、小测序技术(SNaPshot)等方法。然而，TaqMan探针价格昂贵、质量不稳定，RFLP需要特定的酶切位点、容易出现假阳性，飞行质谱法对样本质量的要求较高，SNaPshot技术价格较高。因此，KASP基因分型检测技术作为新型的SNP分型方法，一方面使用通用探针，大大降低试剂成本；另一方面KASP不依赖于凝胶电泳，具有周期短、突变率低、稳定性好等优点，KASP分子标记技术是一种基于荧光的同质基因分型技术，在种质资源鉴定、分子标记辅助育种、基因定位及遗传多样性分析等领域应用广泛，为挖掘与目标性状相关的SNP位点提供技术基础。
叶绿素含量(SPAD)作为光合作用的重要生理指标，对植物产量及品质具有重要影响。SPAD含量的多少直接影响光合作用的强度及效率，一般情况下，叶绿素含量越高植物光合作用能力越强。而目前已鉴定的可用于辅助高SPAD含量油茶育种的功能遗传位点和开发的分子标记很少，大大限制了高光合特性的油茶新品种选育进程。因而，开发与SPAD含量相关的分子标记，可方便快捷的预测油茶叶绿素含量、降低筛选高SPAD含量油茶品种的年限、加快培育高光合效率的油茶新品种。因此，提供一种效率高、适用性强、可快速应用于检测油茶光合表型叶绿素含量相关的分子标记是十分必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种鉴定效率高、适用性强的与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。
一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为CaS900025_K01，所述SNP分子标记的SNP位点位于狭叶油茶的7号染色体的第94365530位的碱基处，所述SNP位点的碱基为G或T。
上述的SNP分子标记，进一步改进的，所述SNP分子标记包括DNA片段1和DNA片段2；所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记在鉴定或辅助鉴定油茶光合表型叶绿素含量、验证油茶品种中的应用。
上述的应用，进一步改进的，包括以下步骤：
S1、提取待测油茶叶片的基因组DNA；
S2、检测待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型；
S3、根据待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型，鉴定或辅助鉴定油茶光合表型叶绿素含量、确定油茶品种。
上述的应用，进一步改进的，待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型为GG型时，所述待测油茶为高SPAD含量表型；待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型为TT型时，所述待测油茶为低SPAD含量表型；
或，待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型为GG型时，所述待测油茶为高SPAD含量的油茶品种；待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型为TT型时，所述待测油茶为低SPAD含量的油茶品种；待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型为GT型时，所述待测油茶为杂合型品种。
上述的应用，所述高SPAD含量的油茶品种和低SPAD含量的油茶品种是相对于杂合型品种的油茶而言，所述GG型的油茶品种的SPAD平均含量显著高于杂合型品种的油茶，所述TT型的油茶品种的SPAD平均含量显著低于杂合型品种的油茶。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的SNP分子标记的引物组合，所述引物组合包括特异性引物Primer F1、特异性引物Primer F2和通用性引物Primer R；所述特异性引物Primer F1的5’端连接有FAM荧光接头序列，所述FAM荧光接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述特异性引物Primer F2的5’端连接有VIC荧光接头序列，所述VIC荧光接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述通用性引物Primer R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的SNP分子标记的引物组合在鉴定或辅助鉴定油茶光合表型叶绿素含量、验证油茶品种、检测权利要求1或2所述SNP分子标记中的应用。
上述的应用，进一步改进的，所述引物组合用于鉴定或辅助鉴定油茶光合表型叶绿素含量时，包括以下步骤：
(1.1)提取待测油茶叶片的基因组DNA；
(1.2)利用引物组合对待测油茶叶片的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
(1.3)对扩增产物进行荧光数据分析，若扩增产物显示特异性引物Primer F1连接的荧光标记的颜色，则待测油茶为高SPAD含量表型；若扩增产物显示特异性引物Primer F2连接的荧光标记的颜色，则待测油茶为低SPAD含量表型。
上述的应用，进一步改进的，所述引物组合用于验证油茶品种时，包括以下步骤：
(2.1)提取待测油茶叶片的基因组DNA；
(2.2)利用引物组合对待测油茶叶片的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
(2.3)对扩增产物进行荧光数据分析，若扩增产物显示特异性引物Primer F1连接的荧光标记的颜色，则待测油茶为高SPAD含量的油茶品种；若扩增产物显示特异性引物Primer F2连接的荧光标记的颜色，则待测油茶为低SPAD含量的油茶品种；若扩增产物共同显示特异性引物Primer F1连接的荧光标记的颜色和特异性引物Primer F2连接的荧光标记的颜色，则待测油茶为杂合型品种。
上述的应用，进一步改进的，所述引物组合用于检测所述SNP分子标记时，包括以下步骤：
(3.1)提取待测油茶叶片的基因组DNA；
(3.2)利用引物组合对待测油茶叶片的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3.3)对扩增产物进行荧光数据分析，若扩增产物显示特异性引物Primer F1连接的荧光标记的颜色，则待测油茶在所述SNP分子标记的SNP位点处的碱基为G；若扩增产物显示特异性引物Primer F2连接的荧光标记的颜色，则待测油茶在所述SNP分子标记的SNP位点处的碱基为T；若扩增产物共同显示特异性引物Primer F1连接的荧光标记的颜色和特异性引物Primer F2连接的荧光标记的颜色，则待测油茶在所述SNP分子标记的SNP位点处的碱基为G或T。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明提供了一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记，该SNP分子标记直接以DNA的形式表现，其基因型与油茶叶片的叶绿素含量高低显著相关，具有鉴定效率高、适用性强等优点。本发明的与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记在鉴定或辅助鉴定油茶光合表型叶绿素含量时，不仅可以快捷方便地预测油茶叶片光合表型叶绿素含量，还可以快速精准地筛选出高SPAD含量的油茶品种，即筛选出基因型为GG型的油茶品种作为育种亲本，从而大量节省传统育种的成本，加快油茶高SPAD含量光合表型新品种的选育进程。
附图说明
图1为本发明实施例2中利用与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记检测YZ2*HS(F1)油茶的分型结果图。
图2为本发明实施例2中YZ2*HS(F1)油茶的三种基因型的SPAD含量分布图。
图3为本发明实施例3中利用与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记检测YZ2*DY2(BC1F1)油茶的分型结果图。
图4为本发明实施例3中YZ2*DY2(BC1F1)油茶的三种基因型的SPAD含量分布图。
图5为本发明实施例4中利用与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记检测DY2*HS(BC1F1)油茶的分型结果图。
图6为本发明实施例4中DY2*HS(BC1F1)油茶的三种基因型的SPAD含量分布图。
图7为本发明实施例5中利用与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记检测YZ2*DY2(BC1F1)油茶的分型结果图。
图8为本发明实施例5中YZ2*DY2(BC1F1)油茶的三种基因型的SPAD含量分布图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记的获得方法，包括以下步骤：
(1)以亲本攸杂2(YZ2)、亲本华硕(HS)及YZ2*HS(F1)个体作为试验群体，首先使用便携式叶绿素含量测定仪测定上述试验群体的SPAD含量，通过定位与目标性状关联的候选区域物理位置，根据BSA重测序结果，筛选到一个与油茶叶片SPAD含量显著相关的SNP分子标记，该SNP分子标记为CaS900025_K01，CaS900025_K01的多态性位点位于参考基因组狭叶油茶的7号染色体94365530位的碱基处，存在G/T多态性。其中，SNP分子标记包括DNA片段1和DNA片段2。
DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，具体为：
CATTGGCCTAACACTTGTTACATGGGTTAATTAGAAAGCTTAAAAGATCCACTCATAAAAAATAAAAAATAAAAGTTTTGAACCCATGTTTGATTTCAAAGACTCAAGGCACTTAGTTGTTGGAAGTTAATACTTGAGTAAGAGATGTTGTCTTTCTTTCCACATCAAATCTCACTTTACATGAAAGCAACATGTTAGGGG。
DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
CATTGGCCTAACACTTGTTACATGGGTTAATTAGAAAGCTTAAAAGATCCACTCATAAAAAATAAAAAATAAAAGTTTTGAACCCATGTTTGATTTCAAATACTCAAGGCACTTAGTTGTTGGAAGTTAATACTTGAGTAAGAGATGTTGTCTTTCTTTCCACATCAAATCTCACTTTACATGAAAGCAACATGTTAGGGG。
(2)将SNP分子标记的前后侧翼序列提取出来，进行引物设计，包括特异性引物Primer F1、特异性引物Primer F2、通用性引物Primer R；特异性引物Primer F1的5’端连接有FAM荧光接头序列，特异性引物Primer F2的5’端连接有VIC荧光接头序列。其中，特异性引物Primer F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，特异性引物Primer F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，通用性引物Primer R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，结果如表1所示。
表1SNP分子标记的信息
实施例2：
一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记在鉴定油茶光合表型叶绿素含量中的应用，包括以下步骤：
(1)样品DNA提取：
取444株YZ2*HS(F1)的油茶叶片作为待测样品，采用简化CTAB法提取待测样品的基因组DNA。
(2)KASP反应测试：
利用与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物。
KASP反应测试，在Douglas Arraytape基因分型平台上进行。
KASP反应体系为：20ng-50ng基因组DNA(干燥)，100μM两条特异性引物(PrimerF1、Primer F1)各0.0013μL，100μM通用引物(Primer R)0.0033μL，2×KASP Master Mix0.3945μL，加0.3996μL超纯水至总体积0.8μL，具体信息如表2所示。PCR扩增在水浴热循环仪中完成。
表2KASP反应体系
| 终浓度 | 实际用量 | |
| 100μM Primer R | 0.42μM | 0.0033μL |
| 100μM Primer F1 | 0.17μM | 0.0013μL |
| 100μM Primer F2 | 0.17μM | 0.0013μL |
| 2×KASP Master Mix | 1× | 0.3945μL |
| 超纯水 | 0.3996μL | |
| 基因组DNA | 20ng-50ng | |
| 总体积 | 0.8μL |
KASP PCR反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环。
(3)数据分析：
利用Arraytape扫描系统对扩增产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形，即进行KASP反应验证，如图1所示。
图1为本发明实施例2中利用与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记检测YZ2*HS(F1)油茶的分型结果图。图2为本发明实施例2中YZ2*HS(F1)油茶的三种基因型的SPAD含量分布图。亲本华硕(HS)的SPAD含量为78.1，为高SPAD含量油茶品种，在目标位点的基因型显示为GG型；亲本攸杂2(YZ2)位点SPAD含量为61.6，为低SPAD含量油茶品种，在目标位点的基因型显示为TT型。结合图1和图2可知，444株子代YZ2*HS(F1)油茶在目标位点的基因型出现3种分型，其中184株呈现红色，即基因型为GG型，其叶片SPAD含量的平均值为67.34，这些油茶为高SPAD含量油茶；190株呈现紫色，即基因型为GT型，其叶片SPAD含量的平均值为66.28；70株呈现蓝色，即基因型为TT型，其叶片SPAD含量的平均值为61.28。可见，本发明的与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记能够有效区分2种纯合基因型(GG型和TT型)，且能够鉴别出杂合基因型，具有共显性特点。
实施例3：
一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记在鉴定油茶光合表型叶绿素含量中的应用，具体为采用实施例2的方法检测335株YZ2*DY2(BC1F1)的油茶叶片，其中，DY2是YZ2和HS的后代。
图3为本发明实施例3中利用与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记检测YZ2*DY2(BC1F1)油茶的分型结果图。图4为本发明实施例3中YZ2*DY2(BC1F1)油茶的三种基因型的SPAD含量分布图。结合图3和图4可以看出，335株YZ2*DY2(BC1F1)油茶的基因型呈现3种类型，其中88株呈现红色，即基因型为纯合型GG，其叶片SPAD含量的平均值为63.86，这些油茶为高SPAD含量油茶；92株呈现紫色，即基因型为杂合型GT，其叶片SPAD含量的平均值为62.16；155株呈现蓝色，即基因型为纯合型TT，其叶片SPAD含量的平均值为61.41。
实施例4：
一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记在鉴定油茶光合表型叶绿素含量中的应用，具体为采用实施例2的方法检测84株DY2*HS(BC1F1)的油茶叶片。
图5为本发明实施例4中利用与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记检测DY2*HS(BC1F1)油茶的分型结果图。图6为本发明实施例4中DY2*HS(BC1F1)油茶的三种基因型的SPAD含量分布图。结合图5和图6可以看出，84株DY2*YZ2(BC1F1)油茶的基因型呈现呈现3种类型，其中20株呈现红色，即基因型为纯合型GG，其叶片SPAD含量的平均值为65.27，这些油茶为高SPAD含量油茶；24株呈现紫色，即基因型为杂合型GT，其叶片SPAD含量的平均值为63.38；40株呈现红色，即基因型为纯合型TT，其叶片SPAD含量的平均值为60.60。
实施例5：
一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记在鉴定油茶光合表型叶绿素含量中的应用，具体为采用实施例2的方法检测148株DY2*YZ2(BC1F1)的油茶叶片。
图7为本发明实施例5中利用与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记检测YZ2*DY2(BC1F1)油茶的分型结果图。图8为本发明实施例5中YZ2*DY2(BC1F1)油茶的三种基因型的SPAD含量分布图。结合图7和图8可以看出，148株DY2*HS(BC1F1)油茶的基因型呈现呈现3种类型，其中123株呈现红色，即基因型为纯合型GG，其叶片SPAD含量的平均值为73.11，这些油茶为高SPAD含量油茶；19株呈现紫色，即基因型为杂合型GT，其叶片SPAD含量的平均值为72.89；6株呈现蓝色，即基因型为纯合型TT，叶片SPAD含量平均值为64.44。可见，基因型为TT型的油茶叶片普遍低于GG型和GT型的油茶叶片SPAD含量。
综上所述，本发明的与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记在多种油茶群体中均可适用，且适用性良好，在检测油茶光合表型叶绿素含量时具有高特异性，可准确并高效地鉴别油茶中SPAD含量，筛选高SPAD含量的油茶品种。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (10)
1.一种与油茶光合表型叶绿素含量相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为CaS900025_K01，所述SNP分子标记的SNP位点位于狭叶油茶的7号染色体的第94365530位的碱基处，所述SNP位点的碱基为G或T。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记包括DNA片段1和DNA片段2；所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.一种如权利要求1或2所述的SNP分子标记在鉴定或辅助鉴定油茶光合表型叶绿素含量、验证油茶品种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待测油茶叶片的基因组DNA；
S2、检测待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型；
S3、根据待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型，鉴定或辅助鉴定油茶光合表型叶绿素含量、确定油茶品种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型为GG型时，所述待测油茶为高SPAD含量表型；待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型为TT型时，所述待测油茶为低SPAD含量表型；
或，待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型为GG型时，所述待测油茶为高SPAD含量的油茶品种；待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型为TT型时，所述待测油茶为低SPAD含量的油茶品种；待测油茶基因组DNA中所述SNP分子标记的SNP位点的基因型为GT型时，所述待测油茶为杂合型品种。
6.一种用于检测如权利要求1或2所述的SNP分子标记的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括特异性引物Primer F1、特异性引物Primer F2和通用性引物Primer R；所述特异性引物Primer F1的5’端连接有FAM荧光接头序列，所述FAM荧光接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述特异性引物Primer F2的5’端连接有VIC荧光接头序列，所述VIC荧光接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述通用性引物Primer R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
7.一种如权利要求6所述的引物组合在鉴定或辅助鉴定油茶光合表型叶绿素含量、验证油茶品种、检测权利要求1或2所述SNP分子标记中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述引物组合用于鉴定或辅助鉴定油茶光合表型叶绿素含量时，包括以下步骤：
(1.1)提取待测油茶叶片的基因组DNA；
(1.2)利用引物组合对待测油茶叶片的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
(1.3)对扩增产物进行荧光数据分析，若扩增产物显示特异性引物Primer F1连接的荧光标记的颜色，则待测油茶为高SPAD含量表型；若扩增产物显示特异性引物Primer F2连接的荧光标记的颜色，则待测油茶为低SPAD含量表型。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述引物组合用于验证油茶品种时，包括以下步骤：
(2.1)提取待测油茶叶片的基因组DNA；
(2.2)利用引物组合对待测油茶叶片的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
(2.3)对扩增产物进行荧光数据分析，若扩增产物显示特异性引物Primer F1连接的荧光标记的颜色，则待测油茶为高SPAD含量的油茶品种；若扩增产物显示特异性引物PrimerF2连接的荧光标记的颜色，则待测油茶为低SPAD含量的油茶品种；若扩增产物共同显示特异性引物Primer F1连接的荧光标记的颜色和特异性引物Primer F2连接的荧光标记的颜色，则待测油茶为杂合型品种。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述引物组合用于检测权利要求1或2所述SNP分子标记时，包括以下步骤：
(3.1)提取待测油茶叶片的基因组DNA；
(3.2)利用引物组合对待测油茶叶片的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3.3)对扩增产物进行荧光数据分析，若扩增产物显示特异性引物Primer F1连接的荧光标记的颜色，则待测油茶在所述SNP分子标记的SNP位点处的碱基为G；若扩增产物显示特异性引物Primer F2连接的荧光标记的颜色，则待测油茶在所述SNP分子标记的SNP位点处的碱基为T；若扩增产物共同显示特异性引物Primer F1连接的荧光标记的颜色和特异性引物Primer F2连接的荧光标记的颜色，则待测油茶在所述SNP分子标记的SNP位点处的碱基为G或T。
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