CN109714951A - 与大豆中疾病抗性相关联的新颖的遗传基因座 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用衍生自短绒野大豆PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的标志、基因和染色体区间来鉴定、选择和/或产生疾病抗性大豆植物或种质的方法和组合物。还提供了通过本发明的任何方法鉴定、选择和/或产生的大豆植物或种质。还提供了疾病抗性大豆种子、植物和种质。
Description
相关申请
本申请要求于2016年6月9日提交的美国临时申请号62/347,945的权益，其内容通过引用并入本文。
关于序列表的电子提交的声明
提交以ASCII text格式的、命名为81045SEQ LIST_ST25.txt并且大小是6.90MB、于2017年6月9日生成的序列表，并且电子序列表与本申请一起提交。这个序列表特此通过引用以其披露内容并入本说明书中。
技术领域
本发明涉及用于鉴定、选择和产生增强的疾病和/或病原体抗性大豆植物的组合物和方法。
背景技术
已知植物病原体对重要作物造成相当大的损害，这导致显著的农业损失，伴随着对依赖植物材料的食物供应和其他工业的广泛的后果。同样，长期以来存在降低农业病原体对作物产生的发病率和/或影响的需要。
若干种病原体与对大豆的损害相关联，该损害在美国和全世界范围内单独地和共同地有可能造成重大的产量损失。示例性病原体包括但不限于真菌(例如，疫霉属和亚洲大豆锈菌病豆薯层锈菌)、线虫(例如，根结线虫属，特别是爪哇根结线虫)和大豆茎溃疡病。鉴于这些病原体存在对全球食物供应的显著威胁以及与处理大豆作物以预防产量损失相关联的时间和花费，需要用于产生病原体抗性大豆栽培品种的新方法。所需要的是可以引入商业大豆植物以控制大豆病原体的新颖的抗性基因(本文中，“R基因”)。
发明内容
本概述列出了本披露主题的若干实施例，并且在许多情况下列出了这些实施例的变化和排列。
因此，本披露主题的一个目的是提供用于将病原体抗性传递到非抗性大豆种质或植物品系的方法。另外，本披露主题提供了新颖的大豆(Glycine max)品系，其在其基因组中包含衍生自短绒野大豆(Glycine tomentella)并且进一步在所述新颖的大豆品系中赋予亚洲大豆锈菌病(本文中，“ASR”)抗性的染色体区间、基因座和/或基因。
序列表的简要说明
SEQ ID NO:1和2是衍生自短绒野大豆品系登录PI441001的染色体区间，其分别在本文中称为“支架46840”和“支架49652”。支架49652已经被定位到短绒野大豆染色体5，并且支架46840已经被定位到短绒野大豆染色体5。SEQ ID NO.3是衍生自短绒野大豆品系登录PI 483224的染色体区间，其在本文中称为“支架002687F”。支架002687F已经被定位到短绒野大豆染色体5。SEQ ID NO.4是衍生自短绒野大豆品系登录PI 583970的染色体区间，其在本文中称为“支架001084F”。支架001084F已经被定位到短绒野大豆染色体5。SEQ ID NO:5是衍生自短绒野大豆品系登录PI583970的染色体区间，其在本文中称为“支架000819F”。支架000819F已经被定位到短绒野大豆染色体5。PI441001、PI483224和PI 583970的遗传群体定位研究指示，短绒野大豆染色体5含有与ASR抗性高度相关联的染色体区间(例如，如对应于SEQ ID NO:1-5)。不受理论限制的试验性数据还指示，短绒野大豆登录PI446958和/或PI483224可用作对应于SEQ ID NO 1-5的所述染色体区间的来源。可以将这些染色体区间或其部分引入(即通过使用胚拯救和标志辅助育种(MAB)使基因渗入)到大豆品系中以产生对各种疾病如ASR具有抗性的大豆品系。表1-5表示SEQ ID NO 1-5中与ASR抗性相关联的单核苷酸多态性(SNP)。表1显示SEQ ID NO:1(支架46840)的SNP关联，并且表2显示SEQ IDNO:2(支架49652)的SNP关联。表3显示SEQ ID NO:3(支架002687F)的SNP关联。表4显示SEQID NO:4(支架001084F)的SNP关联。表5显示SEQ ID NO:5(支架000819F)的SNP关联。确定了表1-5中鉴定的SNP的所有等位基因与针对ASR的抗性或易感性显著相关(p<0.05)。
表1：在SEQ ID NO:1中与针对ASR的增加的抗性相关联的SNP位置
表2：在SEQ
ID NO：2中与针对ASR的增加的抗性相关联的SNP位置
表3：在SEQ ID NO：3中与针对ASR的增加的抗性相关联的SNP位置
表4：在SEQ ID NO：4中与针对ASR的增加的抗性相关联的SNP位置
表5：在SEQ ID NO：5中与针对ASR的增加的抗性相关联的SNP位置
可以开发寡核苷酸引物(本文中，“引物”)并将其用于鉴定携带SEQ ID NO:1、2、3、4和/或5中描述的发现与ASR抗性高度相关联的染色体区间中任一个的植物。具体地，关于鉴定或产生具有SEQ ID NO:1、2、3、4或5中描述的与ASR抗性相关联的染色体区间中任一个或一部分的大豆品系，本领域普通技术人员可以开发引物以检测如表1-5中任一个所鉴定的任何单核苷酸多态性(本文中，“SNP”)。测定(例如，通常为两步等位基因鉴别测定或类似测定)、KASPTM测定(通常是下文定义的一步等位基因鉴别测定或类似测定)、或两者均可用于鉴定如本文所披露的与增加的ASR抗性相关联的SNP(例如，如表1-5中描述的有利等位基因)。在示例性两步测定中，使用正向引物、反向引物和两种测定探针(或杂交寡核苷酸)。将正向和反向引物用于扩增包含与ASR抗性基因座相关联的SNP的遗传基因座(例如，表1-5中所示的任何有利等位基因)。然后使用测定引物(在一些实施例中，这些测定引物被用例如荧光团差异标记以允许在单个反应中区分两种测定探针)来测定存在于SNP位置的特定核苷酸，这些测定引物在每对中针对存在于SNP位置的核苷酸而彼此不同(尽管注意到在任何给定的对中，探针在它们的5'或3'末端可以不同而不影响它们区分存在于相应SNP位置的核苷酸的能力)。在一些实施例中，设计测定引物和反应条件使得测定引物将仅与100％完全匹配的序列的反向互补物杂交，从而允许基于杂交的检测来鉴定存在的哪种或哪些等位基因。
提供了用于鉴定、选择和产生具有增强的疾病抗性的大豆属(Glycine)植物(包括野生大豆属(例如短绒野大豆)和大豆品系)的组合物和方法。还提供了疾病抗性大豆植物和种质。
在一些实施例中，提供了鉴定疾病抗性大豆植物或种质的方法。此类方法可以包括在大豆植物或种质中检测与增强的疾病抗性(特别是ASR抗性)相关联的遗传基因座或分子标志(例如SNP或数量性状基因座(QTL))。在一些实施例中，遗传基因座或分子标志与包含SEQ ID NO 1、2、3、4或5的核苷酸序列或其部分的染色体区间的存在相关联，其中其部分与ASR抗性相关联。
在一些实施例中，提供了产生疾病抗性大豆植物的方法。此类方法可以包括在大豆植物或种质中检测与增强的病原体(例如ASR)抗性相关联的遗传基因座和/或遗传标志的存在，以及从所述大豆种质中产生子代植物。
在一些实施例中，提供了选择疾病抗性大豆植物或种质的方法。此类方法可以包括使第一大豆植物或种质与第二大豆植物或种质杂交，其中该第一大豆植物或种质包含衍生自包含与增强的疾病和/或ASR抗性和/或耐受性相关联的SEQ ID NO 1、2、3、4或5中任一个或其部分的植物登录PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224或其子代植物中任一个的遗传基因座，并选择具有遗传基因座的子代植物或种质。
在一些实施例中，提供了将与增强的病原体抗性相关联的、衍生自大豆登录PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的遗传基因座基因渗入到大豆植物或种质的方法。此类方法可以包括将第一大豆植物或种质(该大豆植物或种质包含与增强的病原体抗性相关联的、衍生自大豆登录PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间(例如SEQ ID No:1、2、3、4或5))与第二大豆植物或种质(该大豆植物或种质用缺乏所述基因座)杂交，并任选地将包含所述遗传等位基因的子代植物与第二大豆植物或种质重复回交以产生具有增强的病原体抗性的大豆植物(例如大豆)或种质，该大豆植物或种质包含与增强的ASR抗性相关联的、衍生自大豆登录PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间。包含与增强的病原体抗性相关联的染色体区间的子代可以通过在其基因组中检测与衍生自大豆登录号PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的所述染色体区间相关联或与其遗传连锁的标志的存在来鉴定，其中所述染色体区间包含SEQ ID NO 1、2、3、4或5或其部分，并且该标志可以是如表1-5中描述的有利等位基因中任一个。来自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的R-基因可以通过使用本领域技术人员已知的胚拯救方法(例如如美国专利7,842,850中披露的，其通过引用并入本文)和通过如本文工作实例(其描述胚拯救的替代方法)中描述的方法基因渗入到大豆品系中。
还提供了通过本发明的方法鉴定、产生或选择的大豆植物和/或种质，以及衍生自通过这些方法鉴定、产生或选择的大豆植物或种质的任何子代或种子。在一个实施例中，与SEQ ID NO 1、2、3、4或5中任一个中描述的染色体区间的存在相关联的分子标志可用于鉴定或选择对ASR具有抗性的植物品系。另外的所述分子标志可以位于所述染色体区间的20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、和1cM内，或者来自如表1-5中任一个中描述的与ASR抗性相关联的任何对应的有利等位基因。在另一个实施例中，所述分子标志可以位于如表1-5中任一个中描述的与ASR相关联的任何SNP标志的20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM内。
还提供了非天然存在的大豆种子、植物和/或种质，该大豆种子、植物和/或种质包含与增强的病原体(例如ASR、胞囊线虫、疫霉菌等)抗性相关联的、衍生自植物登录号PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的一个或多个遗传基因座(本文中，“PI441001”、“PI441008”、“PI446958”、“PI509501”、“PI583970”或“PI483224”)。在具体实施例中，所述遗传基因座包含SEQ ID NO 1、2、3、4或5和/或如表1-5中描述的任何有利等位基因。
与增强的病原体(更具体地是ASR)抗性相关联的标志可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与增强的病原体(ASR)抗性相关联的单个等位基因或衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的一个或多个遗传基因座处的等位基因的组合。在一个实施例中，标志在如SEQ ID NO 1、2、3、4或5描述的染色体区间内。在另一个实施例中，标志是如表1-5中描述的有利等位基因中任一个。
上述的以及本发明的其他目的和方面将在以下阐述的附图和说明中进行详细解释。
附图说明
图1显示了位于染色体5上的短绒野大豆基因组支架上与ASR抗性相关联的短绒野大豆SNP的描述。
图2显示了与ASR抗性相关联的支架49652上的0.023-1.16Mb的定位区间。
图3显示了与ASR抗性相关联的支架46840上的0.02-1.19Mb的定位区间。
图4是短绒野大豆(PI441001)的标志关联图，其中条带指示与ASR抗性相关联的对应的染色体的区域/区间。
图5显示了用于测量植物表型的锈病评定量表。
图6显示了短绒野大豆PI583970的ASR抗性QTL的染色体定位。
图7是短绒野大豆(PI583970)的标志关联图，其中条带指示与ASR抗性相关联的对应的染色体的区域/区间。
图8显示了与ASR抗性相关联的支架000819F上的定位区间。
图9显示了短绒野大豆PI483224的ASR抗性QTL的染色体定位。
图10是短绒野大豆(PI483224)的标志关联图，其中条带指示与ASR抗性相关联的对应的染色体的区域/区间。
图11显示了与ASR抗性相关联的支架002687F上的定位区间。
具体实施方式
本披露主题至少部分涉及鉴定衍生自与增强的ASR抗性相关联的短绒野大豆登录品系PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224、PI441008或其子代的基因组区域(即短绒野大豆染色体5上的一个或多个染色体区间)。同样，来自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224、PI441008或其子代的所述染色体区间可以经由体细胞胚拯救(参见例如美国专利公开2007/0261139和本文中描述胚拯救的替代方法的实例)或通过使用已经基因渗入到其基因组来自PI441001、PI441008、PI583970、或PI483224的遗传区域的大豆供体品系而渗入大豆品系中，其中该区域包含SEQ ID NO:1-5中任一个或其部分，其中所述遗传区域的存在与针对例如ASR、SCN、茎终止(Stemtermination)、茎溃疡、细菌性脓疱、根结线虫、褐茎腐病、大豆灰斑病(Frogeye leafspot)或疫霉菌的增加或增强的疾病抗性相关联。在另一个实施例中，衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间被引入不包含所述染色体区间的大豆品系，其中所述引入在大豆品系或其子代中赋予了对疾病(例如ASR)增加的抗性，其中该所述染色体区间衍生自短绒野大豆的染色体5，并且另外，其中所述染色体区间包含与增加的疾病(如ASR)抗性的性状相关联的至少一个等位基因，其中所述等位基因分别是如下等位基因中任一个，这些等位基因分别选自如表1-5中描述的任一个。
本说明不旨在是一个可以实施本发明的所有不同方式，或可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文陈述的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本披露内容，对本文建议的不同实施例的众多变化以及附加对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些具体实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
下面列出的所有参考文献、以及在即时披露中引用的所有参考文献，包括但不限于所有专利、专利申请及其出版物、科学杂志上的文章以及数据库条目(例如，数据库条目及所有在其中可获得的注释)，将其全部内容通过引用并入本文，其并入程度是它们补充、解释、提供一种针对(或传授)本文采用的方法、技术和/或组合物的背景。
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本披露主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。
尽管认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是提出以下定义是为了使本披露主题容易理解。
如本文使用的，术语“一种/一个(a/an)”或“该(the)”可以是指一种/一个或多于一种/一个。例如，“一种/一个”标志可以指一种/一个标志或多种/个标志。
如本文使用的，术语“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。
如本文使用的，术语“约”当关于可测量的值(如质量、剂量、时间、温度等的量)使用时意指涵盖指定量的多达10％的变化。
术语“基本上由……组成”(以及其语法上的变体)当应用于本发明的多核苷酸序列时，意指由所列举的序列(例如，SEQ ID号)以及该列举的序列的5’和/或3’端上的全部十个或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)的另外的核苷酸两者组成的一个多核苷酸序列，这样使得该多核苷酸序列的功能未实质上发生改变。该总共十个或更少的另外的核苷酸包括全部数量的两个端上加在一起的另外的核苷酸。术语“实质上发生改变”，当应用于本发明的多核苷酸时，是指与由所列举的序列组成的多核苷酸序列的表达水平相比，表达多核苷酸序列的能力增加或减少至少约50％或更多。
如本文使用的，关于植物的术语“引入”意指以任何方式完成，该方式包括但不限于：基因渗入、转基因、规律成簇的间隔短回文重复修饰(CRISPR)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)(Feng等人2013,Joung和Sander 2013)、兆核酸酶或锌指核酸酶(ZFN)。
如本文使用的，术语“野生大豆属”是指多年生大豆属植物，例如灰毛大豆(G.canescens)、银毛大豆(G.argyrea)、澎湖大豆(G.clandestine)、G.latrobeana、白色大豆(G.albicans)、G.aphyonota、沙生大豆(G.arenaria)、弯大豆(G.curvata)、弯裂片大豆(G.cyrtoloba)、扁豆荚大豆(G.dolichocarpa)、镰状大豆(G.falcate)、G.gracei、密毛大豆(G.hirticaulis)、乳绿大豆(G.lactovirens)、阔叶大豆(G.latifolia)、小叶大豆(G.microphylla)、蒙蒂-道格拉斯大豆(G.montis-douglas)、G.peratosa、G.pescadrensis、G.pindanica、G.pullenii、黄紫大豆(G.rubiginosa)、G.stenophita、G.syndetika、或短绒野大豆中任一种。
如本文使用的，术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同核苷酸或核苷酸序列中的一个。
当标志与性状连锁并且当标志的存在指示了所希望的性状或性状形式是否会和/或会以什么程度发生在包含标志的植物/种质中时，则该标志与该性状“相关联”。类似地，当标志与等位基因连锁并且当标志的存在指示了等位基因是否存在于包含该标志的植物/种质中时，则该标志与该等位基因“相关联”。例如，“与增强的病原体抗性相关联的标志”是指其存在或不存在可用于预测植物是否和/或在何种程度上显示病原体抗性表型的标志(例如，与大豆植物中的ASR抗性“相关联的”如表1-5中描述的任何有利SNP等位基因)。
如本文使用的，术语“回交”和“回交的”是指一种方法，凭借该方法将子代植物反复与其亲本之一回交。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待基因渗入的所希望的基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被基因渗入其中的亲本植物。例如，参见Ragot,M.等人，Marker-assistedBackcrossing:A Practical Example,in Techniques et Utilisations des MarqueursMoleculaires Les Colloques[标志辅助回交：实践范例，分子标志技术和应用专题讨论会]第72卷，第45-56页(1995)；以及Openshaw等人，Marker-assisted Selection inBackcross Breeding,in Proceedings of the Symposium“Analysis of MolecularMarker Data,”[回交育种中的标志辅助选择，专题讨论会会议记录“分子标志数据分析”]，第41-53页(1994)。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指第二次使用轮回亲本，“BC2”是指第三次使用轮回亲本，等。
厘摩(“cM”)是重组频率的度量单位。一个cM等于有1％的机会，一个遗传基因座处的标志会由于单代中的交换而与第二基因座处的标志分离。
如本文使用的，关于特定基因座和/或等位基因使用的术语“由……定义并包括其的染色体区间”是指由所述基因座/等位基因限定并涵盖所述基因座/等位基因的染色体区间。
如本文使用的，术语“杂交(cross)”或“经杂交的(crossed)”是指通过授粉融合配子以产生子代(例如，细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一个植物由另一个授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠是来自相同的植物时)两者。术语“使杂交(crossing)”是指通过授粉使配子融合以产生子代的行为。
如本文使用的，术语“栽培品种”和“品种”是指可以通过结构或遗传特点和/或表现与相同物种内的其他品种区别开的一组相似的植物。
如本文使用的，术语“所希望的等位基因”、“有利等位基因”和“目的等位基因”可互换使用以指与所希望的性状(例如ASR抗性)相关联的等位基因。
如本文使用的，术语“增强的病原体抗性”或“增强的疾病抗性”是指与一种或多种对照植物(例如，亲本中的一个或两个、或缺乏与针对对应的病原体/疾病的增强的病原体抗性相关联的标志的植物)相比，尽管感染了疾病(例如亚洲大豆锈病)，植物的耐受和/或繁殖能力的改善、增强或增加。增强的疾病抗性包括减少指示对应的疾病(如亚洲大豆锈病、大豆胞囊线虫、疫霉菌等)感染的症状的表达的任何机制(除了全株植物免疫或抗性)。
“优良品系”或“优良品种”是农艺学上有优势的品系，该品系是从针对有优势的农艺学表现的许多个周期的选育而产生的。众多的优良品系是可获得的并且对于大豆育种领域的普通技术人员是已知的。“优良群体”是一类优良个体或品系，其可以用来代表在给定作物物种(如大豆)的农艺学上有优势的基因型方面的现有技术。类似地，“优良种质”或种质的优良品种是农艺学上有优势的种质，典型地衍生自和/或能够产生具有有优势的农艺学表现的植物，例如现有的或新开发的大豆优良品系。
“优良”植物是来自优良品系的任何植物，因此优良植物是来自优良品种的代表性植物。农民或大豆育种者可商购的优良大豆品种的非限制性实例包括：AG00802、A0868、AG0902、A1923、AG2403、A2824、A3704、A4324、A5404、AG5903、AG6202AG0934；AG1435；AG2031；AG2035；AG2433；AG2733；AG2933；AG3334；AG3832；AG4135；AG4632；AG4934；AG5831；AG6534；和AG7231(阿斯格罗种子公司(Asgrow Seeds)，德梅因(Des Moines)，爱荷华州(Iowa)，美国)；BPR0144RR、BPR 4077NRR和BPR 4390NRR(生物植物研究所(Bio PlantResearch)，营点(Camp Point)，伊利诺伊州(Ill.)，美国)；DKB17-51和DKB37-51(迪卡白遗传公司(DeKalb Genetics)，迪卡尔布(DeKalb)，伊利诺伊州(Ill.)，美国)；DP 4546RR,、和DP 7870RR(三角洲和松树陆地公司(Delta&Pine Land Company)，卢博克市(Lubbock)，德克萨斯州(Tex.)，美国)；JG 03R501、JG 32R606C ADD和JG 55R503C(JGL有限公司(JGLInc.)，格林卡斯尔(Greencastle)，印第安纳州(Ind.)，美国)；NKS 13-K2(先正达种子公司NK部门(NK Division of Syngenta Seeds)，黄金谷(Golden Valley)，明尼苏达洲(Minnesota)，美国)；90M01、91M30、92M33、93M11、94M30、95M30、97B52、P008T22R2；P16T17R2；P22T69R；P25T51R；P34T07R2；P35T58R；P39T67R；P47T36R；P46T21R；和P56T03R2(先锋良种国际有限公司(Pioneer Hi-Bred International)，庄士敦(Johnston)，爱荷华州(Iowa)，美国)；SG4771NRR和SG5161NRR/STS(大豆遗传学有限责任公司(Soygenetics,LLC,)，拉斐特(Lafayette)，印第安纳州(Ind.)，美国)；S00-K5、S11-L2、S28-Y2、S43-B1、S53-A1、S76-L9、S78-G6、S0009-M2；S007-Y4；S04-D3；S14-A6；S20-T6；S21-M7；S26-P3；S28-N6；S30-V6；S35-C3；S36-Y6；S39-C4；S47-K5；S48-D9；S52-Y2；S58-Z4；S67-R6；S73-S8；和S78-G6(先正达种子公司(Syngenta Seeds)，亨德森市(Henderson)，肯塔基州(Ky.)，美国)；Richer(北极星种业有限责任公司(Northstar Seed Ltd.)，亚伯达省(Alberta)，加拿大)；14RD62(斯汀种子公司(Stine Seed Co.)，爱荷华州(Ia.)，美国)；或Armor 4744(阿莫尔种子有限责任公司(Armor Seed,LLC)，阿拉斯加州(Ar.)，美国)。
如本文使用的，术语“农艺学上优良的”意指具有许多可区分性状(例如出苗、活力、营养活力、疾病抗性、结实(seed set)、可立性、产量和脱粒性)的基因型，其允许生产者收获具有商业意义的产物。
如本文使用的，术语“商业上显著的产量”或“农艺学上可接受的产量”是指商业对比(check)品种如AG2703或DKB23-51的至少100％的谷物产量。
如本文使用的，术语“外来的”、“外来的品系”和“外来的种质”是指不是优良的任何植物、品系或种质。通常，外来的植物/种质不是衍生自任何已知的优良植物或种质，而是选择的以将一个或多个所希望的遗传元件引入育种程序(例如，将新颖的等位基因引入育种程序中)。
“遗传图谱”是对给定物种内的一个或多个染色体上的基因座之间的遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格形式描绘。对于每个遗传图谱，基因座之间的距离是通过它们之间的重组频率来测量的。基因座之间的重组可以使用各种标志来检测。遗传图谱是定位群体、所用标志的类型以及不同群体之间每个标志的多态性潜力的产物。一个遗传图谱与另一个遗传图谱的基因座之间的顺序和遗传距离可以不同。
如本文使用的，术语“基因型”是指与可观察到的和/或可检测的和/或所表现的性状(表型)形成对照，在一个或多个遗传基因座处的个体(或个体组)的遗传组成。基因型由个体遗传自其亲本的一个或多个已知基因座的一个或多个等位基因定义。术语基因型可以用来指单一基因座处、多个基因座处的个体的遗传组成，或者更普遍地，术语基因型可以用来指其基因组中所有基因的个体遗传构成。可以例如使用标志来间接表征基因型和/或通过核酸测序来直接表征基因型。
如本文使用的，术语“种质”是指属于或来自个体(例如，植物)、个体群体(例如，植物品系、品种或家族)、或衍生自品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的部分，或可以从该生物或细胞中分离。通常，种质提供了具有特定分子构成的遗传物质，该分子构成提供了对于生物体或细胞培养物的一些或所有遗传品质而言的物理基础。如本文使用的，种质可以是指可以从中生长新植物的种子、细胞(包括原生质体和愈伤组织)、或组织，以及可以培养成全株植物的植物部分(例如，茎、芽、根、叶等)。
“单倍型”是多个遗传基因座处个体的基因型，即等位基因的组合。典型地，定义单倍型的遗传基因座在物理和遗传上是连锁的，即在同一染色体区段上。术语“单倍型”可以指特定基因座(例如单标志基因座)处的多态性，或者是沿着染色体区段的多个基因座处的多态性。
如本文使用的，术语“杂合的”是指如下遗传状态，其中不同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座处。
如本文使用的，术语“纯合的”是指如下遗传状态，其中相同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座处。
如本文使用的，术语“杂种”是指当至少两个遗传上不相同的亲本杂交时产生的种子和/或植物。
如本文使用的，术语“近交”是指基本上纯合的植物或品种。术语可以是指在整个基因组中基本上纯合的植物或品种，或者相对于特别感兴趣的基因组部分是基本上纯合的植物或植物品种。
如本文使用的，术语“indel”是指在一对核苷酸序列中的插入或缺失，其中第一序列可被称为具有相对于第二序列的插入，或第二序列可被称为具有相对于第一序列的删除。
如本文使用的，术语“基因渗入(introgression)”、“使基因渗入(introgressing)”和“经基因渗入的(introgressed)”是指使一个或多个遗传基因座的所希望的等位基因或所希望的等位基因的组合从一个遗传背景到另一个遗传背景的自然和人工传送。例如，可以通过相同物种的两个亲本之间的有性杂交将指定基因座处的所希望的等位基因传送给至少一个子代，其中这些亲本中的至少一个在其基因组内具有该所希望的等位基因。可替代地，例如，等位基因的传送可以通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所希望的等位基因。所希望的等位基因可以是标志的经选择的等位基因、QTL、转基因等。包括所希望的等位基因的后代可以重复地与具有一个所希望的遗传背景的品系回交，并且对于所希望的等位基因进行选择，其中结果是所希望的等位基因变得在一个所希望的遗传背景中是固定的。例如，与增强的ASR耐受性相关联的标志可以从供体基因渗入到不具有疾病抗性的轮回亲本中。然后可以将得到的子代重复回交并选择，直到该子代在轮回亲本背景中具有一个或多个ASR耐受性等位基因。
如本文使用的，术语“连锁”是指一个标志基因座与另一个标志基因座或一些其他基因座(例如，ASR耐受性基因座)的相关联程度。分子标志与表型之间的连锁关系可以作为“概率”或“调整的概率”给出。连锁可以表示为所希望的限值或范围。例如，在一些实施例中，当标志以小于约50、40、30、25、20或15个图距单位(或cM)分开时，则任何标志与任何其他标志(遗传上和物理上)连锁。例如，本发明的实施例提供了与ASR抗性染色体区间(其包含SEQ ID NO 1-5的任一个的核苷酸序列)紧密连锁的标志基因座。
在本发明的一些方面中，限定连锁的包括范围(例如，从约10cM和约20cM、从约10cM和约30cM、或从约10cM和约40cM)是有利。标志与第二基因座的连锁越紧密，标志对第二基因座的指示效果越好。因此，“紧密连锁的基因座”(如标志基因座和第二基因座)展示约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、或2％或更少的基因座间重组频率。在一些实施例中，相关的基因座展示约1％或更少(例如，约0.75％、0.5％、0.25％或更少)的重组频率。定位于相同染色体并且具有使得两个基因座之间的重组以小于约10％(例如，约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、或0.25％或更少)的频率发生的距离的所述两个基因座也可被认为是彼此“邻近的”。因为一个cM是显示1％的重组频率的两个标志之间的距离，因此任何标志与紧密接近(例如，以等于或小于约10cM的距离)的任何其他标志紧密连锁(遗传上和物理上)。在同一染色体上的两个紧密连锁的标志可以相互定位为约9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更少。
如本文所使用的，术语“连锁不平衡”是指遗传基因座或性状(或两者)的非随机分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关联的基因座沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以高于随机(即非随机)的频率一起分离(在共分离的性状的情况下，控制这些性状的基因座彼此足够接近)。显示连锁不平衡的标志被认为是连锁的。连锁的基因座超过50％的时间(例如从约51％至约100％的时间)进行共分离。换句话说，共分离的两个标志具有小于50％(并且根据定义，在相同染色体上分离小于50cM)的重组频率。如本文使用的，连锁可以存在于两个标志之间，或可替代地，标志和表型之间。标志基因座可以与性状(例如亚洲大豆锈病)“相关联”(连锁)。例如，分子标志与目的性状的连锁的程度被测量为该分子标志与该表型的共分离的统计概率。
连锁不平衡最常见地用量度r2评估，该量度r2使用以下文献中描述的公式计算：Hill和Robertson,Theor.Appl.Genet.[理论和应用遗传学]38:226(1968)。当r2＝1时，两个标志基因座间存在完全的连锁不平衡，意味着所述标志还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r2大于1/3的值指示足够强的连锁不平衡对于定位是有用的。Ardlie等人,Nature Reviews Genetics[遗传学自然评论]3:299(2002)。因此，当成对标志基因座间的r2值大于或等于约0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。
如本文使用的，术语“连锁平衡”描述其中两个标志独立地分离的情况，即，在后代中随机分配。显示连锁平衡的标志被认为是不连锁的(无论它们是否位于相同染色体上)。
“基因座”是基因或标志或等位基因所在的染色体上的位置。在一些实施例中，基因座可以涵盖一个或多个核苷酸。
如本文使用的，术语“标志”和“遗传标志”可互换使用，以指已经与表型、性状或性状形式相关联的核苷酸和/或核苷酸序列。在一些实施例中，标志可以与等位基因或目的等位基因相关联，并且可以指示细胞或生物体中等位基因或目的等位基因的存在或不存在。标志可以是但不限于等位基因、基因、单倍型、限制性片段长度多态性(RFLP)、简单重复序列(SSR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、酶切扩增多态性序列(CAPS)(Rafalski和Tingey，Trends in Genetics[遗传学趋势]9:275(1993))、扩增片段长度多态性(AFLP)(Vos等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]23:4407(1995))、单核苷酸多态性(SNP)(Brookes，Gene[基因]234:177(1993))、序列特征性扩增区域(SCAR)(Paran和Michelmore，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]85:985(1993))、序列标签位点(STS)(Onozaki等人，Euphytica[荷兰植物育种杂志]138:255(2004))、单链构象多态性(SSCP)(Orita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2766(1989))、简单重复序列区间(ISSR)(Blair等人，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]98:780(1999))、逆转座子间扩增多态性(IRAP)、逆转座子微卫星扩增多态性(REMAP)(Kalendar等人，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]98:704(1999))、染色体区间或RNA切割产物(例如Lynx标签)。标志可以存在于基因组核酸或表达的核酸(例如EST)中。术语标志还可以指用作根据本领域熟知的方法用于扩增、杂交和/或检测核酸分子的用作探针或引物(例如引物对)的核酸。大量的大豆分子标志是本领域已知的，并且是已公开的或可以从各种来源如SoyBase互联网资源获得。
可以通过本领域中公认的方法检测对应于群体成员之间的遗传多态性的标志。这些方法包括，例如核酸序列、杂交方法、扩增方法(例如基于PCR的序列特异性扩增方法)、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标志检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、和/或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已知公认的方法也用于检测表达的序列标签(EST)和衍生自EST序列的SSR标志，以及随机扩增多态性DNA(RAPD)。
“标志等位基因”，也描述为“标志基因座的等位基因”，可以指在群体中对标志基因座而言是多态性的该标志基因座处发现的多个多态性核苷酸序列中的一个。
“标志辅助选择”(MAS)是基于标志基因型选择表型的方法。在一些实施例中，标志基因型用于鉴定将被选择用于育种程序或用于种植的植物。在一些实施例中，标志基因型用于鉴定将不被选择用于育种程序或用于种植的植物(即，反选植物(counter-selectedplant))，允许它们从育种/种植群体中去除。
如本文使用的，术语“标志基因座(marker locus和marker loci)”是指在其中可以找到一个或多个特异性标志的生物基因组中的一个或多个特定染色体定位。标志基因座可用于追踪第二连锁基因座(例如编码或有助于表型性状表达的连锁基因座)的存在。例如，标志基因座可以用来监测在基因座(如QTL或单一基因)处的等位基因的分离，这些等位基因遗传地或物理地连锁至该标志基因座上。
如本文使用的，术语“标志探针”和“探针”是指可用于检测标志基因座内一个或多个特定等位基因的存在的核苷酸序列或核酸分子(例如，通过核酸杂交与该标志或标志基因座中的所有或部分互补的核酸探针)。包含约8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个连续核苷酸的标志探针可用于核酸杂交。可替代地，在一些方面，标志探针是指能够区别(即基因分型)存在于标志基因座处的特定等位基因的任何类型的探针。
如本文使用的，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标志”或“基因标志”可以用于指如上文定义的遗传标志，或其用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。分子标志能够源自基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如来自剪接的RNA、cDNA等)。该术语也指与标志序列互补或与其侧接的核苷酸序列，如用作能够扩增该标志序列的探针和/或引物的核苷酸序列。当核苷酸序列在溶液中特异性杂交时，这些核苷酸序列是“互补的”(例如，根据沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对原则)。当位于indel区域上时，本文所述的标志中的一些也称为杂交标志。这是因为，根据定义，该插入区域是关于不具有该插入的植物的多态性。因此，该标志仅需要指示该indel区域是否存在。可以使用任何合适的标志检测技术来鉴定这种杂交标志，例如，用于本文提供的实例中的SNP技术。
“非天然存在的大豆品种”是自然界中不存在的任何品种的大豆。可以通过本领域已知的任何方法产生“非天然存在的大豆品种”，该方法包括但不限于转化大豆植物或种质、转染大豆植物或种质并将天然存在的大豆品种与非天然存在的大豆品种杂交。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含天然存在的核苷酸序列的一个或多个非天然存在的拷贝(即天然存在于大豆中的基因的外来拷贝)。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含两种或多种天然存在的核苷酸序列的非天然组合(即，在同一大豆中不天然存在的两种或多种天然存在的基因，例如在大豆品系中未发现的基因)。
如本文使用的，术语“引物”是指当置于诱导合成引物延伸产物的条件(例如在核苷酸和用于聚合的试剂(如DNA聚合酶)的存在下并且在合适的温度和pH)下时能够退火至核酸靶并用作DNA合成的启动点的寡核苷酸。为了在延伸和/或扩增中获得最大效率，在一些实施例中，引物(在一些实施例中是延伸引物，并且在一些实施例中是扩增引物)是单链的。在一些实施例中，引物是寡脱氧核苷酸。引物通常足够长以在用于聚合的试剂存在下引发延伸和/或扩增产物的合成。引物的最小长度可以取决于许多因素，包括但不限于该引物的温度和组成(A/T对比G/C含量)。在扩增引物的情况下，这些扩增引物通常作为由一个正向和一个反向引物组成的一对双向引物提供，或作为DNA扩增领域中(例如在PCR扩增中)常用的一对正向引物提供。如此，应该理解的是，如本文使用的术语“引物”可以指超过一种引物，特别是在关于待扩增的靶区域的一个或多个末端序列的信息中存在一些歧义的情况下。因此，“引物”可以包括含有代表该序列中的可能变异的序列的引物寡核苷酸的集合，或包括允许典型的碱基配对的核苷酸。可以通过任何本领域已知的合适的方法来制备引物。用于制备特异性序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的，并且包括例如适当的序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学合成方法可以包括例如美国专利号4,458,066中披露的磷酸二酯或三酯法、二乙基氨基磷酸酯法和固相支持体法。若需要，可以通过并入可检测部分，例如光谱部分、荧光部分、光化学部分、生物化学部分、免疫化学部分或化学部分来标记引物。可以对如表1-5中任一个中描述的任何有利SNP产生诊断ASR抗性(即能够基于ASR抗性等位基因的存在来鉴定或选择)的引物。PCR方法在手册中已经很好地描述，并且是本领域技术人员已知的。通过PCR扩增后，可以通过与探针多核苷酸杂交来检测靶多核苷酸，所述探针多核苷酸在严格至中度严格的杂交和洗涤条件下与靶序列形成稳定的杂交体。如果预期探针与靶序列基本上完全互补(即，约99％或更多)，则可以使用严格条件。如果预期有一些错配，例如如果预期变体品种会导致探针不完全互补，则可以降低杂交的严格性。在一些实施例中，选择条件以排除非特异性/偶然结合。影响杂交的条件和针对非特异性结合选择的条件是本领域已知的，并且描述于例如以下文献中：Sambrook和Russell(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第三版,ColdSpring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港(Cold SpringHarbor),纽约,美国。通常，较低的盐浓度和较高温度的杂交和/或洗涤增加了杂交条件的严格性。
如本文使用的，术语“表型”、“表型性状”或“性状”是指生物体的一种或多种性状和/或表现。表型是对于裸眼或通过本领域已知的任何其他评价手段(例如，显微术、生物化学分析、或电子机械测定)可以观察的表现。在一些情况中，表型或性状直接由单一基因或遗传基因座控制，即，“单基因性状”。在其他情况下，表型或性状是多个基因的结果。应当指出，如本文使用的，术语“疾病抗性表型”考虑了可能影响对应的疾病的环境条件，这样使得该效应是真实且是可重复的。
如本文所使用的，术语“植物”可以是指全株植物、其任何部分、或从植物衍生的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可以指以下任一个：全株植物、植物组分或器官(例如，根、茎、叶、芽、花、豆荚等)、植物组织、种子和/或植物细胞。植物细胞是从植物取得的植物细胞，或者是通过培养从取自植物的细胞衍生的植物细胞。因此，术语“大豆植物”可以是指整株大豆植物、大豆植物的一个或多个部分(例如，根、根尖、茎、叶、芽、花、豆荚、种子、子叶等)、大豆植物细胞、大豆植物原生质体和/或大豆植物愈伤组织。
如本文所使用的，术语“植物部分”包括但不限于胚、花粉、种子、叶、花(包括但不限于花药、胚珠等)、果实、茎或枝、根、根尖、细胞(包括在植物和/或植物部分中完整的细胞)、原生质体、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块等。因此，植物部分包括可以再生成大豆植物的大豆组织培养物。另外，如本文所使用的，“植物细胞”是指植物的结构和生理学单位，包括细胞壁并且也可以指原生质体。本发明的植物细胞可以处于分离的单细胞形式，或者可以是培养的细胞，或者可以是作为较高级的组织单位(例如像，植物组织或植物器官)的一部分。
如本文使用的，术语“多态性”是指基因座处的核苷酸序列中的变异，其中所述变异太常见，而不仅仅是由于自发突变。多态性可以是单核苷酸多态性(SNP)或插入/缺失多态性(本文中也称为“indel”)。另外，该变异可以在转录谱或甲基化模式中。可以通过在两个或更多个种质条目中的一个或多个基因座处进行核苷酸序列比较来确定核苷酸序列的一个或多个多态性位点。
如本文使用的，术语“紧密连锁”是指连锁标志在给定标志的情况下显示约10％或更低的交换频率(例如，该给定标志在紧密连锁的ASR标志的约10cM内)。换言之，紧密连锁的位点在至少约90％的时间共分离。关于染色体上的物理位置，可以将紧密连锁的标志分开例如约1兆碱基(Mb；1百万个核苷酸)、约500千碱基(Kb；1000个核苷酸)、约400Kb、约300Kb、约200Kb、约100Kb、约50Kb、约25Kb、约10Kb、约5Kb、约4Kb、约3Kb、约2Kb、约1Kb、约500个核苷酸、约250个核苷酸或更少。
如本文使用的，术语“群体”是指共享共同的遗传衍生(genetic derivation)的植物的遗传上异质的集合。
如本文使用的，术语“子代”和“子代植物”是指由一种或多种亲本植物无性或有性繁殖产生的植物。子代植物可以通过克隆或单一亲本植物自交，或者通过两种亲本植物杂交来获得。
如本文使用的，术语“参比序列”是指用作核苷酸序列比较的基础的确定的核苷酸序列。例如通过对在一个或多个目的基因座处的多个品系进行基因分型、在序列比对程序中比对这些核苷酸序列并且然后可以获得比对的共有序列来获得标志的参比序列。因此，参比序列鉴定基因座处等位基因中的多态性。参比序列可以不是来自任何特定生物体的实际核酸序列的拷贝；然而，对于设计针对一个或多个基因座中的实际多态性的引物和探针是有用的。
如本文使用的，术语“疾病耐受性”和“疾病抗性”是指尽管感染了对应的疾病，植物的耐受和/或繁殖能力。当关于种质使用时，这些术语是指尽管感染了对应的疾病，由该种质产生的植物的耐受和/或繁殖能力。在一些实施例中，感染的疾病抗性大豆植物可以与未感染的大豆植物一样(或几乎同样)产生。通常，如果植物或种质显示“增强的病原体抗性”，则标记为“疾病抗性”。
标志的“不利等位基因”是与所述不利植物表型分离的标志等位基因，因此提供了鉴定能从育种程序或种植中去除的植物的益处。例如，人们可以从植物育种程序计划中消除携带针对ASR抗性不利等位基因的植物品系。
“PI441001、PI441008、PI583970或PI483224”是指短绒野大豆植物登录PI441001、PI441008、PI583970或PI483224。
遗传作图
与特定表型(如疾病抗性)相关联的遗传基因座可以被定位到生物体的基因组中。通过鉴定与目的性状共分离的标志或标志簇，育种人员能够通过选择合适的标志(称为标志辅助选择或“MAS”的方法)来迅速选择所希望的表型。育种人员也可以使用此类标志来在计算机上模拟设计基因型并实施全基因组选择。
本发明提供了与增强的疾病抗性相关联的标志。可以使用这些标志和/或其他连锁标志的检测来鉴定、选择和/或生产疾病抗性(更具体地ASR抗性)植物和/或从育种程序或种植中消除不具有疾病抗性的植物。
与增强的疾病抗性相关联的短绒野大豆遗传基因座
本文鉴定了与增强的疾病抗性相关联的标志(参见表1-5，指示与增强的ASR抗性相关联的有利标志)。本发明的标志可以包含一个或多个遗传基因座处的单个等位基因或等位基因的组合(例如，来自表1-5的有利标志的任何组合)。例如，标志可以包含位于第一染色体区间(例如SEQ ID NO:1)内的一个或多个标志等位基因和位于第二染色体区间(例如SEQ ID NO:2)内的一个或多个标志等位基因。
标志辅助选择
标志可以用于各种植物育种应用。参见，例如Staub等人,Hortscience[园艺科学]31:729(1996)；Tanksley,Plant Molecular Biology Reporter[植物分子生物学导报]1:3(1983)。主要的目的领域之一是使用标志辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。通常，MAS利用已被鉴定为具有与所希望的性状共分离的显著可能性的遗传标志。推测此类标志位于产生所希望的表型的基因中/附近，并且它们的存在表明该植物将具有所希望的性状。预计具有该标志的植物将所希望的表型转移到它们的子代中。
展示出与影响所希望的表型性状的基因座连锁的标志为在植物群体中选择性状提供了有用工具。在表型难以测定或在植物发育的后期阶段发生的情况下，尤其如此。由于DNA标志测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的群体，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶区段的重组体的概率。连锁越紧密，标志越有用，这是因为重组不太可能发生于该标志与造成或引起该性状的基因之间。使用侧翼标志降低发生误报选择的几率。理想情况是致病性基因本身内具有标志，使得标志和基因之间的重组不能发生。此类标志称为“完美标志”。
当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域。Gepts,Crop Sci[作物科学]42:1780(2002)。这称为“连锁累赘”。在供体植物与受体植物极不相关联的情况下，这些侧接区域携带可以编码农艺学上不需要的性状的附加基因。即便与优良大豆品系回交多个周期后，该“连锁累赘”也可以导致产量下降或其他负面农艺学特征。这有时也称为“产量累赘”。侧接区域的大小可以通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域或重组断点的大小。Young等人,Genetics[遗传学]120:579(1998)。在经典育种中，通常只是偶然地，选择了有助于减小供体区段大小的重组。Tanksley等人,Biotechnology[生物技术]7:257(1989)。即使在20次回交后，可能找到相当大的仍然与所述基因连锁的供体染色体碎片被选择。然而如果使用标志的话，就可以选取那些在目的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植物中，有95％的机会，至少一株植物将经历该基因的1cM(基于单次减数分裂图距)内的杂交。标志允许明确鉴定这些个体。使用300株植物的一次附加回交，在该基因另一侧的1cM单次减数分裂图距内有95％的杂交概率，从而产生在基于单次减数分裂图距的小于2cM的靶基因附近的区段。这用标志可以在两代中实现，而不用标志时则需要平均100代。参见Tanksley等人，同上。当基因的确切定位已知时，围绕该基因的侧接标志可用于在不同的群体大小中对重组进行选择。例如，在更小的群体中，预期重组可以进一步远离该基因，因此需要更远端的侧接标志来检测该重组。
包含密度增强的公开大豆标志的大豆基因组的整合连锁图谱的可用性促进了大豆遗传定位和MAS。
在所有分子标志类型中，SNP是最丰富的，并且具有提供最高遗传图谱分辨率的潜力。Bhattramakki等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]48:539(2002)。能以所谓的“超高通量”方式测定SNP，因为它们不需要大量的核酸，并且该测定的自动化是直接的。SNP也有成为相对低成本的系统的益处。这三个因素一起使得将SNP用于MAS中具有高度的吸引力。可利用如下几种方法用于SNP基因分型，包括但不限于：杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶切割、微测序和编码球(coded sphere)。此类方法已经在各种公开中综述：Gut,Hum.Mutat.[人类突变]17:475(2001)；Shi,Clin.Chem.[临床化学]47:164(2001)；Kwok,Pharmacogenomics[药物基因组学]1:95(2000)；Bhattramakki和Rafalski,Discovery andapplication of single nucleotide polymorphism markers in plants[单核苷酸多态性标志在植物中的发现和应用],在Plant Genotyping:The DNA Fingerprinting ofPlants[植物基因分型：植物DNA指纹图谱]中,CABI Publishing[CABI出版社],瓦林福德(Wallingford)(2001)。大范围的可商购的技术利用这些和其他方法询问SNP，包括MasscodeTM(德国凯杰公司(Qiagen)，Germantown，MD)、(好乐杰公司(Hologic)，麦迪逊，WI)、(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特市，CA)、(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特市，CA)和BeadarraysTM(亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)。
可以使用序列内或跨连锁序列的许多SNP等位基因一起来描述任何特定基因型的单倍型。Ching等人,BMC Genet.[BMC遗传学]3:19(2002)；Gupta等人,(2001),Rafalski,Plant Science[植物科学]162:329(2002b)。单倍型可以比单个SNP更具信息性，并且可以更详细地描述任何特定的基因型。例如，对于特定的疾病抗性品系或品种，单个SNP可以是等位基因“T”，但等位基因“T”也可以出现在用于轮回亲本的大豆育种群体中。在这种情况下，连锁SNP的等位基因的组合可以更具信息性。一旦将独特的单倍型分配给供体染色体区域，该单倍型可以用于该群体或其任何亚群中以确定个体是否具有特定的基因。使用本领域普通技术人员已知的自动化高通量标志检测平台使得该方法高效且有效。
本发明的标志可以用于标志辅助选择方案中以鉴定和/或选择具有增强的亚洲大豆锈病抗性的子代。此类方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：将第一大豆植物或种质与第二大豆植物或种质杂交，其中该第一大豆植物或种质包含衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基1251375一致，或其中该染色体区间与SEQ ID NO:2的核苷酸碱基1至核苷酸碱基2515428一致，并且选择具有该标志的子代植物。第一和第二大豆植物之一或两者可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，第二大豆植物或种质是优良大豆品种的第二大豆植物或种质。在一些实施例中，第二大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。在另一个实施例中，第一大豆植物包含如下染色体区间：衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基1251375一致，或其中该染色体区间与SEQ ID NO:2的核苷酸碱基1至核苷酸碱基2515428一致，其中该染色体区间进一步包含如表1-5中任一个描述的至少一个等位基因。
用于鉴定和/或选择疾病抗性大豆植物或种质的方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：检测与增强的ASR耐受性相关联的标志的存在。标志可以在从植物或种质取得的任何样品中检测到，该植物或种质包括但不限于整个植物或种质、所述植物或种质的一部分(例如来自所述植物或种质的种子切片、叶片冲压片(leaf punch disk)或细胞)或来自所述植物或种质的核苷酸序列。可以使用本领域已知的任何现有或未来的方法(包括但不限于自动化方法：用锋利的刀片去除一部分胚乳、在种子中钻一个小孔并收集所得粉末，用激光切割这些种子并冲压叶圆片)从植物或种质中取得这种样品。大豆植物可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，在样品中检测的标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于染色体区间内的一种或多种标志等位基因，该染色体区间选自下组，该组由以下组成：
1)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基1251375一致；或
2)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:2的核苷酸碱基1至核苷酸碱基2515428一致；或
3)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:3的核苷酸碱基1至核苷酸碱基365842一致；或
4)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:4的核苷酸碱基1至核苷酸碱基646429一致；
5)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:5的核苷酸碱基1至核苷酸碱基750080一致；或
6)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1-5中显示的任何有利SNP标志。
用于产生疾病抗性大豆植物的方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：在种质中检测与增强的疾病(例如ASR)抗性相关联的标志，其中所述标志选自表1-5，或其中该标志是与表1-5中任一个中描述的并从所述种质产生大豆植物的任何标志的紧密连锁的基因座。标志可以在从种质取得的任何样品中检测到，该种质包括但不限于所述种质的一部分(例如来自所述种质的种子切片或细胞)或来自所述种质的核苷酸序列。可以使用本领域已知的任何现有或未来的方法(包括但不限于自动化方法：用锋利的刀片去除一部分胚乳、在种子中钻一个小孔并收集所得粉末，用激光切割这些种子并冲压叶圆片)从种质中取得这种样品。种质可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。然后，从根据本领域熟知的用于育种和从种质产生植物的方法鉴定为具有与增强的疾病(例如ASR)抗性相关联的标志的种质来产生疾病抗性大豆植物。
在一些实施例中，在种质中检测的标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于染色体区间内的一种或多种标志等位基因，该染色体区间选自下组，该组由以下组成：
1)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基1251375一致；或
2)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:2的核苷酸碱基1至核苷酸碱基2515428一致；或
3)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:3的核苷酸碱基1至核苷酸碱基365842一致；或
4)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:4的核苷酸碱基1至核苷酸碱基646429一致；
5)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:5的核苷酸碱基1至核苷酸碱基750080一致；或
6)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1-5中显示的任何有利SNP标志。
在一些实施例中，在种质中检测的标志可以包含选自表1-5的任一个的一个或多个标志等位基因、基本上由其组成、或由其组成。
用于产生和/或选择亚洲大豆锈病抗性/耐受性大豆植物或种质的方法可以包括使第一大豆植物或种质与第二大豆植物或种质杂交，其中所述第一大豆植物或种质包含选自下组的染色体区间，该组由以下组成：
1)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基1251375一致；或
2)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:2的核苷酸碱基1至核苷酸碱基2515428一致；或
3)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:3的核苷酸碱基1至核苷酸碱基365842一致；或
4)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:4的核苷酸碱基1至核苷酸碱基646429一致；或
5)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:5的核苷酸碱基1至核苷酸碱基750080一致；或
6)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1-5中显示的任何有利SNP标志；并且与不包含该染色体区间的第二大豆植物杂交，然后产生具有增加的ASR抗性的子代植物。第一或第二大豆植物或种质之一或两者可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，第二大豆植物或种质是优良大豆品种的第二大豆植物或种质。在一些实施例中，第二大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
本文还提供了将与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)抗性/耐受性相关联的等位基因渗入到大豆植物中的方法。用于将与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)抗性/耐受性相关联的等位基因渗入到大豆植物或种质中的此类方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：将包含所述等位基因(供体)(其中所述等位基因选自表1或表2中列出的任何等位基因)或与表1-5中列出的标志“紧密接近”的标志的第一大豆植物或种质与缺乏所述等位基因的第二大豆植物或种质(轮回亲本)杂交，并且将包含所述等位基因的子代与轮回亲本反复回交。可以通过在其基因组中检测与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)抗性/耐受性相关联的标志的存在来鉴定包含所述等位基因的子代。标志可以在从子代取得的任何样品中检测到，该子代包括但不限于所述子代的一部分(例如来自所述植物或种质的种子切片、叶片冲压片或细胞)或来自所述子代的核苷酸序列。可以使用本领域已知的任何现有或未来的方法(包括但不限于自动化方法：用锋利的刀片去除一部分胚乳、在种子中钻一个小孔并收集所得粉末，用激光切割这些种子并冲压叶圆片)从子代中取得这种样品。供体或轮回亲本之一或两者可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，轮回亲本是优良大豆品种。在一些实施例中，轮回亲本的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，用于鉴定包含与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)抗性/耐受性相关联的等位基因的子代的标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于选自下组的染色体区间内的一个或多个等位基因，该组由以下组成：
1)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基1251375一致；或
2)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:2的核苷酸碱基1至核苷酸碱基2515428一致；
3)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:3的核苷酸碱基1至核苷酸碱基365842一致；或
4)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:4的核苷酸碱基1至核苷酸碱基646429一致；
5)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:5的核苷酸碱基1至核苷酸碱基750080一致；或
6)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1-5中显示的任何SNP标志或与所述区间1)-5)紧密接近的任何紧密连锁的标志。
在一些实施例中，标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于至少两个不同染色体区间的标志等位基因。例如，标志可以包含位于由表1中的任何两个标志、位于表2中的任何两个标志、表3中的任何两个标志或表4和/或表5中的任何两个标志定义并包括其的染色体区间中的一个或多个等位基因。
以下是本发明所考虑和涵盖的所有实施例：
1.一种优良大豆植物，其基因组中具有来自野生大豆属植物的染色体区间，其中该染色体区间包含在所述植物中赋予ASR抗性的SEQ ID NO:1-5中任一个或其功能部分；在一些情况中，野生大豆属植物是短绒野大豆，并且在另外的情况下，野生大豆属植物选自植物登录PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224中任一个，其中与不包含所述染色体区间的对照植物相比，所述染色体区间赋予增加的亚洲大豆锈菌病(ASR)抗性；另外，在实施例1的变化中，所述优良大豆属植物通过以下产生：a)在大豆植物和短绒野大豆植物之间进行非天然杂交，其中“非天然杂交”意指两个没有进一步干预(例如，如实例3中描述的胚拯救)则不会产生活的后代的物种之间的杂交，例如：a)基本上如实例3描述的进行胚拯救以产生双二倍体植物；b)将b)的双二倍体植物与大豆植物回交至少1个回交代(优选BC4)，导致产生在其基因组中基因渗入一个或多个所述染色体区间的优良大豆植物；另外，所述优良大豆植物可以具有20个染色体对或可维持来自短绒野大豆且继承所述区间的染色体对以在所述优良大豆植物中赋予ASR抗性。
2.如实施例1所述的植物，其中该染色体区间包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或其任何部分，其中所述部分赋予优良大豆植物ASR抗性。
3.如实施例1-2所述的植物，其中该染色体区间包含与增加的ASR抗性相关联的SNP标志，其中所述SNP标志与如表1-5中所列出的有利SNP标志中任一个一致；或者在另一个变化中，单倍型包含至少2个与ASR抗性相关联的SNP标志，并且另外，其中该至少2个SNP标志选自如表1-5中列出的任何有利SNP标志。
4.如实施例1-3所述的植物，其中该染色体区间衍生自在0.02-1.19Mb的近似定位区间的短绒野大豆染色体5。
5.如实施例1-5所述的植物，其中该染色体区间对应于包含SEQ ID NO:1-5或其部分的野生大豆属和/或短绒野大豆基因组内位置，其中所述部分在所述优良大豆植物中赋予了增加的ASR抗性。
6.如实施例1-5所述的植物，其中该优良大豆植物进一步显示出对选自以下的任一个胁迫的抗性：病害(如白粉病、终极腐霉菌、疫霉根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、根结线虫、大豆胞囊线虫、大豆脉坏死病毒、大豆茎溃疡、大豆猝死综合征、叶瘟和穗瘟、锈病、蛙眼叶斑病、褐茎腐病、镰刀菌或纹枯病)；昆虫有害生物(如粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫)；非生物胁迫(如耐旱性、水淹、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、缺铁失绿症或耐寒性(即极端温度))，并且另外，其中从所述染色体区间赋予了所述对胁迫的抗性。
7.如实施例1-6所述的植物，其中通过分子标志选择来选择或鉴定所述植物的至少一个亲本品系，其中基于位于所述染色体区间内或与其紧密相关联的分子标志的存在来选择或鉴定所述亲本品系，所述染色体区间对应于SEQ ID NO:1-5中任一个。
8.如实施例7所述的植物，其中该分子标志是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状基因座(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
9.如实施例7-8所述的植物，其中该分子标志是SNP标志，并且该分子标志是如表1-5中所示的任何有利标志。
10.如实施例1-9中任一项所述的植物，其中该植物是农艺学上优良的大豆植物，该大豆植物具有商业上显著的产量以及商业上易感的活力、结实、可立性或脱粒性。
11.如实施例1-10中任一项所述的植物，其中所述区间通过大豆和短绒野大豆品系之间的“非天然”远缘杂交而引入所述植物基因组中，然后进行随后的胚拯救(例如，如实例3中描述的)并且然后将所得植物与大豆品系(即在一些情况中为轮回大豆品系)回交至少一次，更优选至少四次回交(BC4)，以产生优良或农艺学上优良的大豆品系。
12.如实施例1-10中任一项所述的植物，其中所述区间通过序列的转基因表达或基因组编辑而引入所述植物基因组中，该序列对应于并包含SEQ ID NO:1-5中任一个或其部分，其中所述部分在引入易感品系时保留ASR抗性。
13.如实施例12所述的植物，其中该区间通过以下而引入：与对应于SEQ ID NO:1-5的任一个区间同源的大豆基因组区域或对应于SEQ ID NO:1-5的任一个区间的直系同源物的基因组编辑，并且进一步对所述大豆基因组区域进行至少一个基因编辑以包括对应于如表1-5中任一个中描述的任何有利等位基因的至少1个等位基因改变，其中所述大豆基因组区域在基因组编辑之前不包含所述等位基因改变，并且与对照植物相比，所述基因组编辑在植物中赋予了增加的ASR抗性。
14.如实施例13所述的植物，其中该基因编辑通过CRISPR、TALEN、兆核酸酶或通过基因组核酸的修饰来完成。
15.如实施例1-14所述的植物，其中该染色体区间包含以下核苷酸碱基对位置中任一个或其部分(其中所述部分保留ASR抗性)：SEQ ID NO:1的1-1251375；SEQ ID NO:2的1-2515428；SEQ ID NO:3的1-365842；SEQ ID NO:4的1-646429或SEQ ID NO:5的1-750080。
16.一种具有商业上显著的产量的ASR抗性农艺学上优良的大豆植物，其中所述植物包含来自野生大豆属植物的染色体区间的基因渗入，其中所述染色体区间对应于和/或包含SEQ ID NO:1-5中任一个；在一些情况中，所述野生大豆属植物是短绒野大豆，在另外的情况下，野生大豆属植物是登录PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224中任一个或其子代，其中所述基因渗入包含赋予与位于等同于短绒野大豆染色体5的染色体上的至少一个标志连锁的QTL的ASR抗性。
17.如实施例16所述的ASR抗性优良大豆植物，其中所述QTL是纯合的。
18.如实施例16-17所述的植物，其中所述ASR抗性农艺学上的优良大豆植物的亲本植物是大豆和短绒野大豆亲本品系之间的远缘杂交；在一个变化中，亲本品系是大豆和短绒野大豆亲本品系之间的双二倍体杂种(本文中，“双二倍体杂种”)。
19.一种具有商业上显著的产量的农艺学上优良的大豆植物，其包含赋予针对ASR增加的抗性的ASR抗性等位基因，并且其中该ASR等位基因包含选自下组的至少一种单核苷酸多态性(SNP)，该组由以下组成：表1-5中任一个中描述的有利SNP，并且另外，其中所述植物在其基因组中包含来自短绒野大豆或其子代(如双二倍体杂种)的染色体区间(即，如SEQID NO:1-5中任一个)。
20.一种具有商业上显著的产量的农艺学上优良的大豆植物，其包含来自短绒野大豆染色体5的染色体区间，该染色体区间包含选自表1-5中任一个的至少一个有利SNP标志；在一个变化中，该染色体区间是SEQ ID NO:1-5中的任一个。
21.如实施例20所述的植物，其中来自短绒野大豆染色体5的所述染色体区间衍生自植物登录PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224中任一个或其子代(例如像双二倍体杂种)。
22.如实施例20-21所述的植物，其中该染色体区间包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或其部分，其中与不包含所述染色体区间的对照植物相比，所述染色体区间在所述植物中赋予了增加的ASR抗性。
23.一种衍生自如实施例1-22所述的植物或种子的植物细胞或植物部分；在一些情况中，植物细胞或植物部分不能用于再生植物(例如因此植物细胞或植物部分不能用于从实施例1-22的植物或种子再生植物)。
24.一种来自如实施例1-22中任一项所述的子代植物或种子。
25.如实施例1-22所述的大豆植物，其中所述植物具有20个染色体对和/或40个配对染色体，或者在一些情况中，所述植物维持衍生自野生大豆属品系的染色体对。
26.如实施例1-25所述的大豆植物，其中与对照植物相比没有产量累赘或负面农艺学效应。
27.一种产生对亚洲大豆锈菌病(ASR)具有增加的抗性的大豆植物(在一些情况中为“双二倍体杂种”)的方法，该方法包括以下步骤：
a.将大豆植物与ASR抗性的野生大豆属植物(在一些情况中是短绒野大豆植物)杂交；
b.从a)的杂交中产生大豆豆荚；
c.从b)的豆荚中分离胚并将所述胚置于胚拯救培养基上(在一些情况中，该胚拯救培养基包含或具有基本上等同于以下的组成：3.1g B5基础盐，Gamborg的1ml B5维生素1000X,40g蔗糖[C12H22O11]，0.25g酪蛋白水解物，0.25mg BAP，0.75g MgCl2*6H20，20ml谷氨酰胺25mg/ml，0.1g丝氨酸[C3H7NO3]，4ml天冬酰胺25mg/ml，0.05ml的IBA 1mg/ml，以及2.0g Gelzan)；或Murashige和Skoog培养基(MS)或Gamborg的B-5培养基(Bridgen公司，1994))，其中在该步骤c)中没有引起的或引发的愈伤组织诱导；
d.将c)的胚转移到萌发培养基或伸长培养基(在一些情况中，萌发培养基包含或具有基本上等同于以下的组成：3.2g Schenk和Hilderbrandt基础盐混合物，1g肌醇[C6H12O6]，5ml硫胺素1mg/ml，0.5ml吡哆醇1mg/ml，10g蔗糖[C12H22O11]，以及7.5g纯化琼脂)，或伸长培养基(其包含或具有基本上等同于以下的组成：4.3g MS基础盐混合物[MSP01]，5ml MS铁200X，30g蔗糖[C12H22O11]，1g MES[C6H13NO4S]，8g纯化琼脂，1ml B5维生素100X，2ml谷氨酰胺25mg/ml，0.50ml玉米素核苷，反式异构体1mg/ml，0.1ml IAA 1mg/ml，0.2ml GA3)；以及从所述胚中收集枝条；
e.在萌发或伸长培养基上生长d)的收集的枝条；以及
f.将已建立的e)的枝条转移到土壤中，从而产生对ASR具有增加的抗性的大豆植物(在优选的情况下，枝条在伸长或萌发培养基上生根以形成小植株并随后硬化)。
28.如实施例27所述的方法，其中步骤a)的野生大豆属植物或短绒野大豆植物在其基因组中包含与SEQ ID NO:1-5中的任一个或其部分对应并由其定义的染色体区间(在本文中，“由其定义的染色体”意指该区间是从对应的SEQ ID NO:的第一核苷酸至最终核苷酸的核苷酸碱基的跨度)，其中所述部分在植物中赋予了增加的ASR抗性。
29.如实施例27-28所述的方法，其该短绒野大豆植物在其基因组中包含与ASR抗性相关联的等位基因，其中所述等位基因对应于表1-5中列出的任何有利等位基因或者是包含SEQ ID NO:1-5中任一个的任何染色体区间内的等位基因或SNP，其中所述等位基因或SNP与植物中的ASR抗性相关联或紧密连锁。
30.如实施例27-29所述的方法，其中野生大豆属或短绒野大豆植物是PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224中任一个或其子代(在一些情况中，该子代是双二倍体杂种)。
31.如实施例30所述的方法，其中该子代植物是大豆和短绒野大豆亲本品系之间的远缘杂交。
32.如实施例27-31的方法，其进一步包括分子标志选择的步骤，其中来自以下中任一个的分离的基因组核酸：a)的亲本植物、c)的胚或f)的枝条或所得植物被分离并针对与增加的ASR抗性相关联的等位基因的存在进行分析(例如基因分型)，并且另外，其中所述等位基因与SEQ ID NO:1-5对应并由其定义的染色体区间(例如，如表1-5中任一个中描述的任何有利等位基因)密切相关。
33.如实施例32所述的方法，其中该等位基因对应于表1-5中列出的有利等位基因中任一个。
34.如实施例27-33所述的方法，其中a)的大豆植物具有3.7-4.8的相对成熟度，或者在其他变化中，大豆植物可选自大豆成熟组000，X。
35.如实施例27-34所述的方法，其中a)的大豆植物用作雌性植物，并且所述野生大豆属或短绒野大豆植物是花粉供体；可替代地，在一些情况中，a)的大豆植物可用作雄性花粉供体植物，并且野生大豆属或短绒野大豆植物用作雌性植物。
36.如实施例27-35所述的方法，其中将b)的豆荚用包含GA3、NAA和激动素的激素混合物处理(在一些实施例中，100mg GA3，25mg NAA和5mg激动素/L，并且另外，在一些情况中，其中将所述激素处理每天喷洒在豆荚上直至收获)。
37.如实施例27-36所述的方法，其中这些豆荚在授粉后19天之前收集。
38.如实施例27-37所述的方法，其中在步骤e)-h)的任一个中用染色体加倍剂处理胚和/或枝条，以产生能够与非野生(domestic)一年生大豆属栽培品种回交以产生至少一个回交代(在一些情况中，BC4代)的双二倍体植物(或双二倍体杂种)，另外，其中该双二倍体植物在其基因组中还包含有利农艺学性状，如遗传自野生大豆属或短绒野大豆亲本的ASR抗性；在其他情况下，这些双二倍体植物与轮回大豆亲本品系回交，然后进行胚拯救(例如，如实施例65-83中描述)以产生BC1并重复多次以产生BC4代，其中所述BC4代是可育的(即不需要胚拯救以产生植物)并且能够产生ASR抗性的大豆子代植物。
39.如实施例38所述的方法，其中该染色体加倍剂是秋水仙碱或氟乐灵；另外，可以用于实施例38的预期的染色体加倍剂可以包含氨磺灵。
40.如实施例27-39所述的方法，其中c)的胚在约24℃在胚拯救培养基上保留至少约20天。
41.如实施例27-39所述的方法，其中d)的胚在约24℃在萌发或伸长培养基上保持至少约20天。
42.如实施例41所述的方法，其中该胚拯救培养基是大豆ER1-1，其中该大豆ER1-1包括以下：3.1g B5基础盐，Gamborg的1ml B5维生素1000X，40g蔗糖[C12H22O11]，0.25g酪蛋白水解物，0.25ml BAP，0.75g MgCl2*6H20，20ml谷氨酰胺25mg/ml，0.1g丝氨酸[C3H7NO3]，4ml天冬酰胺25mg/ml以及0.05ml的IBA 1mg/ml(本文中，“大豆ER1-1”)。
43.一种产生对亚洲大豆锈菌病(ASR)具有增加的抗性的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a.提供第一大豆植物，其在其基因组中包含对应于SEQ ID NO:1-5中任一个的染色体区间，其中所述第一大豆植物对ASR具有增加的抗性；
b.将a)的大豆植物与不包含所述染色体区间的第二大豆植物杂交；
c.(在一些实施例中，省略该步骤)通过从所述子代植物中分离核酸并在所述核酸内检测与增加的ASR抗性相关联的等位基因，从b)的杂交中选择子代植物，并且另外，其中所述等位基因与对应于SEQ ID NO:1-5的染色体区间紧密连锁，
d.从而产生对ASR具有增加的抗性的大豆植物。
44.如实施例43所述的方法，其中c)中的等位基因对应于如表1-5的任一个中描述的任何有利等位基因。
45.如实施例43-44所述的方法，其中第一或第二大豆植物是优良大豆植物；另外，第一或第二大豆植物也可以是具有商业上显著的产量的优良大豆植物，并且在另外的实施例中是农艺学上优良的大豆植物。
46.如实施例43-45所述的方法，其中该子代植物进行一代或多代回交，在一些情况中至少四次(BC4)回交；在另外的情况中，BC1、BC2、BC3代之后是如实例3或下文实施例65-82中描述的胚拯救。
47.如实施例27-46所述的方法，其中该染色体区间对应于位于在0.02-1.19Mb的近似定位区间的短绒野大豆染色体5的短绒野大豆染色体区间，并且另外的，包括SEQ IDNO:1-5中任一个或其部分，其中该部分赋予了ASR抗性或与ASR抗性相关联。
48.如实施例47所述的方法，其中所述短绒野大豆染色体区间衍生自以下植物登录中的任一个：PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224或其子代，在一些情况中，子代包含双二倍体杂种植物。
49.如实施例48所述的方法，其中该子代植物是大豆和短绒野大豆亲本品系之间的远缘杂交。
50.一种产生具有增加的ASR抗性的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)从大豆植物中分离核酸；
b)在a)的核酸中检测与增加的ASR相关联的至少一种分子标志，其中所述分子标志位于20cM、10cM、5cM、1cM 0.5cM内，或与对应于来自包含SEQ ID NO:1-5中任一个、或其部分的野生大豆属植物或短绒野大豆植物的基因组区域的染色体区间紧密连锁；
c)基于b)中检测的分子标志的存在而选择植物，另外地使所选这的植物与不包含所述染色体区间的第二植物(例如，大豆植物)杂交；以及
d)从鉴定为具有与增加的ASR抗性相关联的所述等位基因和/或与第二植物杂交的c)的植物产生大豆子代植物。
51.如实施例50所述的方法，其中该分子标志与如表1-5中描述的有利等位基因中的任一个紧密连锁或与其对应，和/或所述分子标志在来自短绒野大豆的与SEQ ID NO:1-5对应和/或由其定义的染色体区间内。
52.一种鉴定和/或选择具有ASR抗性的植物(在一些实施例中为大豆或短绒野大豆植物)的方法，该方法包括以下步骤：
a.从大豆植物或植物部分分离核酸；
b.在该核酸中检测与增加的ASR抗性相关联的分子标志的存在，其中该分子标志位于如表1-5中任一个中描述的标志的20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM内，或在另一个实施例中，分子标志与对应于和/或包含SEQ ID NO:1-5中任一个的染色体区间紧密连锁、与其紧密接近、与其紧密相关联、或在其内；以及
c.基于b)中检测的分子标志来鉴定或选择具有增加的ASR抗性的大豆植物，从而鉴定和/或选择具有ASR抗性的植物。
53.如实施例52所述的方法，其中b)中检测的分子标志由表1-5中任一个中描述的任何有利标志或与ASR相关联的等位基因或分子标志组成，其中该等位基因或分子标志位于包含SEQ ID NO:1-5中任一个或由其定义的染色体区间内。
54.如实施例50-53所述的方法，其中该分子标志是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状基因座(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
55.如实施例50-54中任一项所述的方法，其中该检测包括扩增标志基因座或标志基因座的一部分并检测所得的扩增的标志扩增子(在一些实施例中，该扩增子包含如SEQID NO 1-5中任一个所示的核苷酸序列；另外，在另一个实施例中，能够退火至所述标志基因座并扩增所述基因座从而允许检测所得的扩增的标志扩增子的引物)。
56.如实施例55所述的方法，其中该扩增包括：a)将扩增引物或扩增引物对与从第一大豆植物或种质分离的核酸混合，其中该引物或引物对与标志基因座的至少一部分互补或部分互补，并且能够使用该大豆核酸作为模板，通过DNA聚合酶启动DNA聚合；以及b)在包含DNA聚合酶和模板核酸的DNA聚合反应中延伸该引物或引物对以产生至少一个扩增子；另外的实施例，包括在所述DNA聚合反应中使用的引物对和/或包含所述引物对的组合物。
57.如实施例32-56所述的方法，其中核酸选自DNA或RNA，在一些实施例中选自分离的基因组DNA和/或RNA。
58.如实施例55-57所述的方法，其中该扩增包括采用聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，使用分离自大豆植物或种质的核酸作为该PCR或LCR中的模板，另外的实施例，其中所述大豆植物是大豆或短绒野大豆。
59.一种诊断ASR抗性的引物，其中所述引物可用于PCR反应以指示与ASR抗性相关联的等位基因的存在，其中所述等位基因是如表1-5中描述的任何有利等位基因和/或所述引物包含核苷酸序列(该核苷酸序列包括SEQ ID NO:1-5中任一个)，其中引物用于PCR反应以产生诊断与ASR抗性相关联的至少一个等位基因的扩增子；进一步，包括所述引物的组合物。
60.如实施例27-58所述的方法，其中通过所述方法产生或鉴定的植物进一步赋予针对以下中任一个的增加的抗性：大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、IDC、根结线虫、大豆灰斑病、疫霉菌、褐茎腐病、线虫、锈病、黑粉病、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜和桃蚜、或其组合。
61.一种通过如实施例27-58或60所述的方法产生的植物、种子或植物部分。
62.如实施例61所述的植物，其中该植物是优良大豆植物，在一些实施例中，该植物是具有商业上显著的产量的优良大豆植物。
63.如实施例62所述的植物，其中该植物是农艺学上优良的大豆植物，并且在一些情况中，该农艺学上优良的大豆植物显示出商业上显著的产量。
64.如实施例61-63所述的植物，其中与对照和/或对比植物相比，所述植物显示没有产量累赘或负面农艺学效应；或者在其他情况下与商业对比相比具有易感的商业表现。
65.一种用于产生在野生多年生大豆属物种的第一亲本植物和作为非野生一年生大豆属栽培品种的第二亲本植物之间的至少一个杂种的方法，其中所述大豆属栽培品种能够与非野生一年生大豆属栽培品种回交以产生第一回交代或其能育子代的至少一个植物，所述方法包括以下步骤：
a.提供至少一种野生大豆属植物(wg)和至少一种非野生一年生大豆属亲本植物(dg)；
b.允许亲本植物开花；
c.将所述wg植物与dg植物杂交(在大多数实施例中，该杂交是“非天然杂交”，因此不能产生活的/可育的后代)；
d.从c)的杂交中产生豆荚；
e.从d)的豆荚中分离胚并将所述胚置于胚拯救培养基上，其中没有愈伤组织诱导；
f.将e)的胚转移到萌发培养基或伸长培养基上并从所述胚中收集枝条；
g.在萌发或伸长培养基上生长f)的收集的枝条；以及
h.将已建立的e)的枝条转移到土壤中，从而产生在野生多年生大豆属物种的第一亲本植物和作为非野生一年生大豆属的第二亲本植物之间的杂种；在一些实施例中，该杂种是能够与大豆植物回交至少1代的双二倍体杂种。
66.如实施例65所述的方法，其中所述野生大豆属品系选自下组，该组由以下组成：灰毛大豆、银毛大豆、澎湖大豆、G.latrobeana、白色大豆、G.aphyonota、沙生大豆、弯大豆、弯裂片大豆、扁豆荚大豆、镰状大豆、G.gracei、密毛大豆、乳绿大豆、阔叶大豆、小叶大豆、蒙蒂-道格拉斯大豆、G.peratosa、G.pescadrensis、G.pindanica、G.pullenii、黄紫大豆、G.stenophita、G.syndetika和短绒野大豆。
67.如实施例65-66所述的方法，其中该野生大豆属亲本植物是短绒野大豆。
68.如实施例65-66所述的方法，其中该野生多年生大豆属携带所希望的农艺学性状，如疾病(例如ASR)抗性和/或非生物胁迫抗性(例如抗旱性)和/或昆虫抗性(例如蚜虫抗性)和/或更高的产量。
69.如实施例68所述的方法，其中该所希望的性状选自下组，该组由以下组成：疾病抗性，包括但不限于针对以下的抗性：大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、根结线虫、大豆灰斑病、疫霉菌、褐茎腐病、线虫、锈病、黑粉病、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜或桃蚜；增加的产量，针对缺铁失绿症的增加的抗性或耐受性，以及增加的耐旱性或耐热性。
70.如实施例65-69所述的方法，其中该非野生一年生大豆属是大豆。
71.如实施例65-70所述的方法，其中该dg植物用作雌性植物，并且所述wg植物是花粉供体，或者可替代地，该dg植物可以用作花粉供体(即雄性品系)并且wg用作雌性品系。
72.如实施例65-71所述的方法，其中将d)的豆荚用包含GA3、NAA和激动素的激素混合物处理(在一些实施例中，100mg GA3，25mg NAA和5mg激动素/L，并且另外，在一些情况中，其中将所述激素处理每天喷洒在豆荚上直至收获)。
73.如实施例65-72所述的方法，其中这些豆荚在授粉后19天之前收集。
74.如实施例65-73所述的方法，其中在步骤e)-h)的任一个中用染色体加倍剂处理这些胚和/或枝条，以产生能够与非野生一年生大豆属栽培品种回交以产生至少一个回交代的双二倍体植物。
75.如实施例74所述的方法，其中该染色体加倍剂是秋水仙碱、氨磺灵或氟乐灵。
76.如实施例65-75所述的方法，其中e)的胚在约24℃在胚拯救培养基上保留至少约20天。
77.如实施例65-76所述的方法，其中f)的胚在约24℃在萌发或伸长培养基上保持至少约20天。
78.如实施例76所述的方法，其中该胚拯救培养基是大豆ER1-1。
79.如实施例65-78所述的方法，其中c)的杂交不需要花的去雄。
80.如实施例65-79所述的方法，其中c)的杂交是非天然杂交，其中在没有进一步干预的情况下不产生活的和/或可育的后代，像例如步骤d)-h)。
81.如实施例65-80所述的方法，其中该方法进一步包括步骤i)，其中h)的杂种植物与大豆植物至少回交一次，在大多数实施例中，回交保留来自所述wg的有利遗传农艺学性状，例如，该有利农艺学性状可以是疾病(例如ASR)抗性和/或非生物胁迫抗性(例如抗旱性)和/或昆虫抗性(例如蚜虫抗性)和/或更高产量；在另外的实例中，回交进行四代(BC4)，产生包含所述有利遗传农艺学性状的可育dg子代植物，其中该回交进展遵循wg和dg植物之间的远缘杂交，然后如实施例65中那样进行胚拯救，从而产生重复持续BC2、BC3和在优选情况中BC4的回交植物，以产生包含所述有利遗传农艺学性状的可育子代植物。
82.如实施例65-81所述的方法，其中该方法进一步包括步骤j)，其中h)的杂种植物多次回交，并且另外，其中基于衍生自所述wg品系的有利农艺学性状来选择每个回交(BC)代；在一些情况中，(a-h)后每次回交四代(BC4)，从而产生可育的杂种后代/子代植物。
83.如实施例65-82所述的方法，其中该方法进一步包括步骤k)计数至少一个BC代中的染色体的数目，并选择具有40个配对染色体、20个染色体对或不包含未配对染色体的品系，或在一些情况中，该植物有超过20个染色体对。
84.如实施例65-82所述的方法，其中该方法进一步包括步骤k)计数至少一个BC代中染色体的数目，并选择不具有未配对染色体的品系并将这些品系进行进一步育种。
85.一种通过如实施例65-85所述的方法产生的双二倍体植物。
86.一种衍生自如实施例86所述的植物的非野生一年生大豆属植物。
87.如实施例87所述的非野生一年生大豆属植物，其中该大豆属植物遗传了来自多年生野生大豆属亲本的所希望的农艺学性状，例如，所希望的农艺学性状可以是疾病(例如ASR)抗性和/或非生物胁迫抗性(例如抗旱性)和/或昆虫抗性(例如蚜虫抗性)和/或更高的产量。
88.如实施例88所述的非野生一年生大豆属植物，其中该所希望的农艺学性状是增加针对以下任一个的疾病抗性：大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、根结线虫、大豆灰斑病、疫霉菌、褐茎腐病、线虫、锈病、黑粉病、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜或桃蚜。
89.如实施例88-89所述的非野生一年生大豆属植物，其中该所希望的农艺学性状相对于以下任一个具有更好的田间或商业表现：增加的产量，倒伏，株高，田间出苗，针对除草剂、细菌、真菌、病毒和线虫的抗性或耐受性，耐旱性，耐热性，耐寒性或耐冷性，过量水分，盐胁迫，氧化胁迫，食物含量和组成，物理外观，雄性不育，干倒，可立性，繁殖力，糖特性，生物质，油质量或生产，蛋白质质量和总体质量。
90.一种来自实施例85-90的任何植物的植物细胞、植物部分；在一些实施例中，所述植物细胞不能产生植物。
91.一种在田间控制ASR的方法，该方法包括种植来自实施例1-21；24-26；61-64或85-89中描述的植物中任一个的种子的步骤。
疾病抗性大豆植物和种质
本发明提供了疾病抗性大豆植物和种质。如上所述，本发明的方法可用于鉴定、产生和/或选择疾病抗性大豆植物或种质(例如针对亚洲大豆锈病具有抗性或增加的耐受性的大豆植物)。除了上述方法，疾病抗性大豆植物或种质可以通过任何方法产生，借这些方法将与增强的疾病耐受性相关联的标志引入大豆植物或种质中，这些方法包括但不限于转化、原生质体转化、或融合，双单倍体技术，胚拯救，基因编辑，和/或通过任何其他核酸转移系统产生。
在一些实施例中，大豆植物或种质包含非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
疾病抗性大豆植物或种质可以是优良大豆品种和包含与增强的疾病(例如ASR)耐受性相关联的等位基因的大豆品种之间的杂交的子代，其中该等位基因在选自下组的染色体区间内，该组由以下组成：
1)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基1251375一致；或
2)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:2的核苷酸碱基1至核苷酸碱基2515428一致；
3)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:3的核苷酸碱基1至核苷酸碱基365842一致；或
4)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:4的核苷酸碱基1至核苷酸碱基646429一致；
5)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:5的核苷酸碱基1至核苷酸碱基750080一致；或
6)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或很靠近的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1-5中显示的任何有利SNP标志。
疾病抗性大豆植物或种质可以是基因渗入的子代，其中轮回亲本是优良大豆品种，并且供体包含与增强的疾病耐受性和/或抗性相关联的等位基因，其中该体携带包含SEQ ID NO:1-4中任一个的染色体区间或其部分，并且其中该染色体区间包含分别选自表1-5的至少一个等位基因。
疾病抗性大豆植物或种质可以是第一优良大豆品种(例如，测试品系)之间的杂交的子代，和第二优良大豆品种(例如，轮回亲本)与包含与增强的ASR耐受性相关联的等位基因的大豆品种(例如，供体)之间的杂交的子代。
疾病抗性大豆植物或种质可以是第一优良大豆品种与基因渗入的子代之间杂交的子代，其中轮回亲本是第二优良大豆品种，并且供体包含与增强的ASR耐受性相关联的等位基因。
本发明的疾病抗性大豆植物和种质可以包含一种或多种本发明的标志(例如表1-5中描述的任何标志；或与如表1-5中描述的任何标志紧密接近的任何标志)。
在一些实施例中，疾病抗性大豆植物或种质可在其基因组内包含与增强的ASR耐受性相关联的标志，其中所述标志位于选自下组的染色体区间内，该组由以下组成：
1)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基1251375一致；或
2)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:2的核苷酸碱基1至核苷酸碱基2515428一致；
3)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:3的核苷酸碱基1至核苷酸碱基365842一致；或
4)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:4的核苷酸碱基1至核苷酸碱基646429一致；
5)5)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:5的核苷酸碱基1至核苷酸碱基750080一致；或
6)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或很靠近的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1-5中显示的任何有利SNP标志。
在一些实施例中，疾病抗性大豆植物或种质可在其基因组内包含标志，该标志包含位于至少两个不同染色体区间中的标志等位基因、基本上由其组成或由其组成。例如，标志可以包含位于由表1中的两个标志的任何组合定义并包括其的染色体区间中的一个或多个等位基因，和位于由表2中的两个标志的任何组合定义并包括其的染色体区间中的一个或多个等位基因。
疾病抗性大豆种子
本发明提供了疾病抗性大豆种子。如上所述，本发明的方法可用于鉴定、产生和/或选择疾病抗性大豆种子。除了上述方法，疾病抗性大豆种子可以通过任何方法产生，借这些方法将与增强的ASR耐受性相关联的标志引入大豆种子中，这些方法包括但不限于转化、原生质体转化或融合，双单倍体技术，胶原蛋白拯救，基因编辑(例如CRISPR或TALEN或兆核酸酶)，和/或通过任何其他核酸转移系统产生。
在一些实施例中，疾病抗性大豆种子包含非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆种子与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
疾病抗性大豆种子可以由通过本发明的方法鉴定、产生或选择的疾病抗性大豆植物产生。在一些实施例中，疾病抗性大豆种子由包含对应于SEQ ID NO:1-5的染色体区间中任一个的疾病抗性大豆或野生大豆属植物(例如短绒野大豆菌)植物产生。
本发明的疾病抗性大豆种子可以包含来自本发明的表1-5的一种或多种标志、通过使用其选择或通过使用其产生。
在一些实施例中，疾病抗性大豆种子可在其基因组内包含与增强的ASR耐受性相关联的标志，其中所述标志位于选自下组的染色体区间内，该组由以下组成：
1)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基1251375一致；或
2)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:2的核苷酸碱基1至核苷酸碱基2515428一致；
3)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:3的核苷酸碱基1至核苷酸碱基365842一致；或
4)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:4的核苷酸碱基1至核苷酸碱基646429一致；
5)衍生自PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:5的核苷酸碱基1至核苷酸碱基750080一致；
6)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或很靠近的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1-5中显示的任何有利SNP标志。
实例
以下实例不旨在是一个本发明得以实施的所有不同方式或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。本领域的技术人员将理解到可以在不偏离本发明的情况下对不同实施例作出众多变化和添加。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些具体实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
实例1.ASR抗性野生大豆属品系鉴定
针对在各种环境中收集的十六种锈菌株的ASR抗性，评估多种野生大豆属(短绒野大豆菌)品系。使用来自USDA-ARS(FL Q09、FL Q12、LABR13、FLQ11)的单个脓包衍生的分离物和田间群体(FL Q15、FLQ16、RTP1、RTP2、Vero、GA15、UBL、BR南(BR south)和BR中心(BRcentral))单个脓包衍生的分离株生成锈病数据，在封闭的设施中进行筛选。针对ASR抗性筛选短绒野大豆品系，以下短绒野大豆品系显示针对所有测试的ASR菌株的广泛抗性：PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970和PI483224。
在多天的感染过程中评估每个短绒野大豆品系，并使用基于Burdon和Speer,TAG,1984修改的分组的锈病评定量表，在不同时间点评级(参见图6)。使用锈病分离株的大量不同的组，在北美和南美洲，将每种短绒野大豆登录筛选>2次，每次约4种植物。
实例2.针对PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、或PI483224ASR
基因座的等位基因挖掘和关联
将抗性亲本品系(即PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970和PI483224)与易感的短绒野大豆品系杂交并产生F1植物(参见表5)。F1植物自花受精以产生F2种子。从自交F1植物收获F2种子。播种大约200个F2种子并收集来自每株植物的叶组织用于基因分型研究。每个品系用豆薯层锈菌孵育以确定每个F2个体的抗性/易感表型。将来自50个抗性F2和50个易感F2的组织在分开的库中组合，并从每个库制备基因组DNA。针对这些库中的每个，从DNA制备Illumina测序文库，并且在两个Illumina HiSeq2000 2x100bp配对末端(PE)泳道中对每个文库进行测序。每个样品的平均产量为3.83亿读取对，这相当于每个文库77千兆碱基(gigabase)的序列。调整测序读数以除去PHRED质量分数<15的碱基。
使用GSNAP(WU和NACU 2010)作为配对末端片段，将质量调整的读数与PI441001、PI441008、PI583970和PI483224参比基因组序列进行比对。如果一对读数不能一起比对，则将它们作为单体处理以进行比对。如果读数唯一地定位到参考，则将它们用于随后的分析(每36bp≤2个错配，并且每75bp少于5个碱基作为尾部)。
基于读取深度，在BSA分析之前过滤SNP，其中保留具有40至200x读取深度的SNP。使用卡方检验(Chi-square)来选择两个库中两个等位基因之间具有显著不同读数的SNP。使用经验贝叶斯方法(LIU等人,2012)来估计在抗性库和易感库两者中每个SNP标志与因果基因座(causal locus)之间不存在重组的条件概率。SNP和因果基因之间连锁的概率是这两个条件概率的几何平均值。发现大约1000个SNP可能与靶基因座连锁。使用表型F2个体，将这些假定连锁的SNP的子集用于精细定位基因座。参见参考文献：LIU,S.,C.-T.YEH,H.M.TANG,D.NETTLETON和P.S.SCHNABLE,2012Gene Mapping via Bulked Segregant RNA-Seq(BSR-Seq)[经由混合集群RNA-Seq(BSR-Seq)进行基因定位].PLoS ONE[公共科学图书馆期刊]7:e36406和Wu,T.D.以及S.Nacu,2010Fast and SNP-tolerant detection ofcomplex variants and splicing in short reads[快速和SNP耐受的复杂变体检测和短读取中的剪接].Bioinformatics[生物信息学]26:873-881。
表5：植物杂交和研究类型
1.PI441001 Data2Bio LLC(埃姆斯(Ames)，爱荷华州(Iowa))用于四倍体大豆的
gBSA-Seq分析的实验室方法。
使用Data2Bio的基因组群体分离分析(gBSA)技术进行四倍体大豆群体(PI441001)中的因果基因座的染色体发现。理论上，ASR抗性由单个显性等位基因控制。从两个易感组织库和两个抗性组织库中提取的DNA样品产生四个文库。然后在八(8)个Illumina HiSeq2000 2x100bp配对末端(PE)泳道中对这些库进行测序。在图1-5中针对群体441001展示了用于随后的分析、从原始数据到质量调整的读取处理、比对、SNP发现和SNP影响的参比基因组的概述。在各种过滤步骤之后，在PI441001基因组中鉴定出110,503个信息性SNP与ASR抗性显著相关联。然后使用贝叶斯方法计算性状相关联概率。接下来，创建了顶部重叠群(top contig)的性状相关联SNP(概率截止值为0.01)的物理图谱(图1)。在PI441001中鉴定了两个支架46840和49652(分别为SEQ ID NO:1和2)。来自这些富集支架的SNP被定位到公开大豆基因组。在两个群体中，来自顶部支架的大多数SNP聚集在Chr05和Chr08的小部分上(参见图4)。
2.PI583970
Data2Bio
LLC(埃姆斯(Ames)，爱荷华州(Iowa))用于四倍体大豆的
gBSA-Seq分析的实验室方法
使用Data2Bio的基因组群体分离分析(gBSA)技术进行四倍体大豆群体(PI583970)中的基因座的染色体发现。从一个易感组织库和一个抗性组织RNA库中提取的RNA样品产生两个文库。在各种过滤步骤之后，在PI583970基因组中鉴定出与ASR抗性显著相关联的59,014个信息性SNP。然后使用贝叶斯方法计算性状相关联概率。接下来，创建了重叠群上性状相关联的SNP的物理图谱。这些SNP的聚类表明抗性基因座位于支架000819F中或其附近(参见图7；支架001084F是SEQ ID NO:4)。将与这些SNP相关联的背景序列也与公开大豆基因组比对，以产生对定位区间的染色体水平的理解。然后以图形方式显示性状(ASR抗性)相关联的SNP的染色体位置。来自支架001084F的大多数SNP定位并聚集在Chr05的小区域上(参见图8)。数据表明负责ASR抗性的基因座在支架001084F上的0.11至0.30Mbp区间内或附近定位(图9)。
3.PI483224
Data2Bio
LLC(埃姆斯(Ames)，爱荷华州(Iowa))用于四倍体大豆的
gBSA-Seq分析的实验室方法
使用Data2Bio的基因组群体分离分析(gBSA)技术进行四倍体大豆群体(PI483224)中的因果基因座的染色体发现。从一个易感组织库和一个抗性组织库(PI483224)中提取的DNA样品产生两个文库。在各种过滤步骤之后，在PI483224基因组中鉴定出428,263个信息性SNP与ASR抗性显著相关联。然后使用贝叶斯方法计算性状相关联概率。接下来，创建了重叠群上性状相关联的SNP的物理图谱。这些SNP的聚类指示ASR抗性基因座位于支架002687F上或其附近(参见图10)。将与这些SNP相关联的背景序列也与公开大豆基因组比对，以产生对定位区间的染色体水平的理解。以图形方式显示性状(ASR抗性)相关联的SNP的染色体位置。来自支架002687F的大多数SNP定位到Chr05的小区域上(参见图11)。数据指示ASR基因座可以在支架002687F上在0.17至0.36MB的区间内或其附近定位(参见图12和SEQ ID NO:3)。
实例3.胚拯救和将R基因区间基因渗入到大豆品系中
进行胚拯救(如下所述)并施加化学处理以诱导染色体加倍以产生双二倍体枝条。如果该双二倍体植物是可育的，则将它们用于与大豆进行回交。需要进行与大豆进行回交并随后进行胚拯救持续若干代，以逐步消除多年生短绒野大豆染色体，最终导致ASR抗性大豆植物。
使用优良先正达(Elite Syngenta)大豆(大豆)品系(RM 3.7至4.8)进行远缘杂交。将优良大豆品系用作雌性(花粉接种者)，并将短绒野大豆的多种登录用作雄性或花粉供体。在适当的发育阶段从含有花药的短绒野大豆植物中选择花是重要的。新鲜、全开、鲜艳的花朵保持具有成熟花粉的花药。花粉应呈现松散的黄色尘状。将这些花从短绒野大豆植物中除去并与优良大豆植物杂交以进行授粉。来自短绒野大豆植物的花粉应在除花后30分钟内使用。鉴定和选择可供授粉的优质大豆花芽也很重要。当与未成熟的芽相比时，当大豆花芽的尺寸较大时，其通常是可供使用的(ready)。大豆花的萼片颜色较浅，并且花瓣刚刚开始出现。首先，使用一对细尖的镊子小心地从花芽上分离萼片，露出外层花瓣。然后，轻轻地抓住并去除花上的花瓣(总共5篇)，露出雌蕊周围的雄蕊环。由于在花药开始脱落花粉前1天，柱头受到花粉，因此认识到“雌性可供使用，雄性未能供使用(not ready)”的阶段性发育是很重要的。当在这个发育阶段授粉大豆花时，没有必要去除雌花。找到优良大豆花上的柱头。然后使用1朵雄花，小心地剥离花瓣以暴露花药，并将花粉粒轻轻地撒在大豆花的柱头上。在此过程中，应随时注意不要损害柱头。在授粉后的第二天开始，将激素混合物喷洒在授粉的花上，并且最终每天发育F1豆荚1X直至收获。授粉的花或豆荚充满了激素混合物的轻雾，注意不要使花/豆荚过早地从植物上脱落。该混合物含有100mg GA3，25mg 1-萘乙酸(NAA)和5mg激动素/L蒸馏水。这些激素的应用有助于保持豆荚发育和增加的豆荚生长。上述远缘杂交方法导致成功率显著高于文献中报道的成功率。另外，雌性花不需要去雄，这节省了时间并降低了对柱头损害的风险。
收获：授粉后大约14至16天收获来自远缘杂交的豆荚。(文献中的收获日期显示19至21天，然而上述方法允许更快的收获时间和更强健的豆荚)。收集豆荚并根据远缘杂交组合进行计数以确定杂交成功。多个大豆雌性和短绒野大豆的5个不同的登录的平均杂交成功率大约为40％。远缘杂交豆荚可以含有1至3个种子，但通常在每个F1荚中发现2个种子。上述方法允许在授粉后14至16天收获豆荚，比文献中描述的早约5天。
胚拯救：将收获的豆荚收集并带回实验室进行灭菌。首先用70％EtOH冲洗豆荚2至3分钟，然后在平台振荡器上以大约130RPM将其置于10％Clorox漂白剂中持续另外30分钟。最后，用无菌水冲洗豆荚多次以除去任何残留的漂白剂。在豆荚灭菌后可以立即开始胚分离，或者在胚分离之前豆荚可以在4℃储存长达24小时。接下来，将灭菌的豆荚放入层流净化罩中，在其中可以拯救胚。将个体豆荚置于无菌培养皿中并使用手术刀和镊子打开。沿着远缘杂交豆荚的长度远离种子做一个切口。然后可以容易地打开豆荚以暴露种子。可替代地，可以使用两对镊子来分离豆荚壳。小心地从豆荚中取出种子，并在解剖显微镜下放入无菌培养皿中。需要非常精细的镊子将胚与种子分离。用一只手握住镊子，轻轻地将种子的一侧远离胚，使脐带朝上。另一只手使用另一对镊子从含有胚的种子一侧除去种皮。剥掉胚周围的膜，并将胚从底部向上推。胚应该经过球状发育阶段，并且优选地经过早期心(heart)发育阶段(中期到晚期心阶段、子叶阶段和早期成熟阶段胚是所希望的)。将分离的胚转移至胚拯救培养基，如大豆ER1-1(即，3.1g B5基础盐，Gamborg的1ml B5维生素1000X，40g蔗糖[C12H22O11]，0.25g酪蛋白水解物，0.25ml BAP，0.75g MgCl2*6H20，20ml谷氨酰胺25mg/ml，0.1g丝氨酸[C3H7NO3]，4ml天冬酰胺25mg/ml以及0.05ml的IBA 1mg/ml)。Murashige和Skoog培养基(MS)以及Gamborg的B-5培养基(Bridgen,1994))也可用作胚拯救培养基。此时可以处理胚以诱导染色体加倍。(有关染色体加倍的详细信息，参见下文)将分离的胚在24℃在胚拯救培养基上保留21至30天。胚可以在ER1-1的整个孵育中保持在黑暗中，它们也可以在黑暗中孵育，并且然后在光照下完成孵育，或者可以在光照下进行整个孵育。在该方案中没有愈伤组织诱导阶段，枝条直接从胚发育，这允许更快的周转时间、小植株存活和更好的质量结果。上述胚拯救方法涉及从胚直接枝条再生，而不是通过胚发生再生，从而使植物恢复更快(与文献中报道的长达1年时间线相比，枝条在大约2-3个月内恢复)。另外，以下方案在转移至萌发培养基后不需要在黑暗中培养，上述方案也不需要转移至生根培养基。
染色体加倍处理：秋水仙碱或氟乐灵可用于诱导染色体加倍。理想地，对晚期心阶段远缘杂交胚(或更大)进行化学处理以在分离长达1周后的任何时间紧接分离进行诱导染色体加倍。双倍剂可以在固体或液体培养基中混合并施用数小时或长达几天。氟乐灵在固体或液体培养基中以10-40μM浓度使用。可替代地，秋水仙碱在固体或液体培养基中以0.4-1mg/ml的浓度使用。化学处理后，将胚转移到新鲜胚拯救培养基中。
枝条再生：将发育中的胚从拯救培养基转移至萌发培养基，如SoyER GSMv2(即3.2g Schenk和Hilderbrandt基础盐混合物，1g肌醇[C6H12O6]，5ml硫胺素1mg/ml，0.5ml吡哆醇1mg/ml，10g蔗糖[C12H22O11]以及7.5g纯化琼脂)，在24℃光照下持续大约3至5周。可替代地，可以将发育中的胚从拯救培养基转移至伸长培养基，如大豆E1 0No TCV(即4.3gMS基础盐混合物[MSP01]，5ml MS铁200X，30g蔗糖[C12H22O11]，1g MES[C6H13NO4S]，8g纯化琼脂，1ml B5维生素100X，2ml谷氨酰胺25mg/ml，0.50ml玉米素核苷，反式异构体1mg/ml，0.1ml IAA 1mg/ml，0.2ml GA3 5mg/ml，1.5ml特美汀100mg/ml，0.3ml头孢噻肟250mg/ml，0.5ml万古霉素100mg/ml)。在24℃光照下，可将枝条保持在培养基上约3至5周。发育中的枝条可以从培养基平板转移到含有萌发或伸长培养基的Phytocons中，用于进一步枝条发育。将具有合适根的已建立的枝条移至土壤中。
倍性分析：使用流式细胞仪进行倍性分析。从培养物中或在土壤中建立后的小枝条中收集用于倍性分析的叶组织。将组织在干冰上收集并储存在-80℃直至分析，或在湿冰上收集并在同一天进行分析。0.5cm2的样品尺寸是足够的。根据Sysmex试剂盒(希森美康有限公司(Sysmex Inc.)，日本神户(Kobe Japan))中的说明书制备样品。每个样品组含有未处理的F1植物(未处理以诱导染色体加倍)作为对照。
实例4.ASR抗性性状基因渗入
将从远缘杂交(即短绒野大豆与大豆杂交)以及随后如实例3描述的胚拯救而产生的双二倍体品系与轮回优良大豆品系回交多次。本领域已知需要多次回交以产生可育的杂种品系，特别是文献表明BC3代是必需的。在这种情况下，确定需要另外的回交，在短绒野大豆x大豆以产生可育的杂种植物的情况下，需要BC4。通过如上所述的方法产生的F1杂种植物由包含PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970和PI483224的远缘杂交产生。接下来将F1植物作为雌性与雄性轮回大豆植物杂交，以进行第一次回交(BC1子代)。将BC1子代进一步回交多代(例如BC2)。评估BC植物的ASR抗性、染色体数目，并且在一些情况中，通过使用如本文所述的分子标志对品系进行基因分型，以检测对应于SEQ ID NO 1-5的染色体区间的存在或表1-5中鉴定的任何标志。
以上实例清楚地说明本发明的优点。虽然已经参考某些实施例的具体细节描述本发明，但不希望此类细节被视为对本发明范围的限制，除非它们被包括在所附权利要求书中或到它们被包括在所附权利要求书中的程度。
在整个申请中，引用了各种专利、专利出版物和非专利出版物。这些专利、专利出版物和非专利出版物的披露内容通过引用以其整体在此并入本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的现状。
Claims (92)
1.一种优良大豆植物，其基因组中具有来自野生大豆属植物的染色体区间，其中与不包含所述染色体区间的对照植物相比，所述染色体区间赋予了增加的亚洲大豆锈菌病(ASR)抗性。
2.如权利要求1所述的植物，其中该染色体区间包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或其任何部分，其中所述部分在所述植物中赋予了增加的ASR抗性。
3.如权利要求1-2所述的植物，其中该染色体区间包含与增加的ASR抗性相关联的SNP标志，其中所述SNP标志与如表1-5中所列出的有利SNP标志中任一个一致。
4.如权利要求1-3所述的植物，其中该染色体区间衍生自在0.02-1.19Mb的近似定位区间的短绒野大豆染色体5。
5.如权利要求1-5所述的植物，其中该染色体区间对应于包含SEQ ID NO:1-5中任一个的短绒野大豆基因组内的位置。
6.如权利要求1-5所述的植物，其中该植物进一步显示出对选自以下的任一个胁迫的抗性：病害(如白粉病、终极腐霉菌、疫霉根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、根结线虫、大豆胞囊线虫、大豆脉坏死病毒、大豆茎溃疡、大豆猝死综合征、叶瘟和穗瘟、锈病、蛙眼叶斑病、褐茎腐病、镰刀菌或纹枯病)；昆虫有害生物(如粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫)；非生物胁迫(如耐旱性、水淹、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、缺铁失绿症或耐寒性(即极端温度))。
7.如权利要求1-6所述的植物，其中通过分子标志选择来选择或鉴定所述植物的至少一个亲本品系，其中基于位于所述染色体区间内或与其紧密连锁的分子标志的存在来选择或鉴定所述亲本品系，所述染色体区间对应于SEQ ID NO:1-5中任一个，其中所述分子标志与增加的ASR抗性相关联。
8.如权利要求7所述的植物，其中该分子标志是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状基因座(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
9.如权利要求7-8所述的植物，其中该分子标志是SNP标志，并且该分子标志是如表1-5中所示的任何有利标志。
10.如权利要求1-9中任一项所述的植物，其中该植物是农艺学上优良的大豆植物，该大豆植物具有商业上显著的产量和/或商业上易感的活力、结实、可立性或脱粒性。
11.如权利要求1-10所述的植物，其中所述区间通过大豆和短绒野大豆品系之间的远缘杂交而引入所述植物基因组中，然后进行胚拯救以产生能够与大豆品系回交的双二倍体杂交品系，以产生优良大豆植物。
12.如权利要求1-10所述的植物，其中所述区间通过对应于并包含SEQ ID NO:1-5中任一个的序列的转基因表达或基因组编辑而引入所述植物基因组中。
13.如权利要求12所述的植物，其中该区间通过以下而引入：与对应于SEQ ID NO:1-5的任一个区间同源的大豆基因组区域或对应于SEQ ID NO:1-5的任一个区间的直系同源物的基因组编辑，并且进一步对所述大豆基因组区域进行至少一个基因组编辑以包括对应于如表1-5中任一个中描述的任何有利等位基因的至少1个等位基因改变，其中所述大豆基因组区域在基因组编辑之前不包含所述等位基因改变，并且另外，其中所述基因组编辑在植物中赋予了增加的ASR抗性。
14.如权利要求13所述的植物，其中该基因组编辑通过CRISPR、TALEN、兆核酸酶或通过基因组核酸的修饰来完成。
15.如权利要求1-14所述的植物，其中该染色体区间包含如下核苷酸碱基对位置中的任一个或一部分：SEQ ID NO:1的1-1251375；SEQ ID NO:2的1-2515428；SEQ ID NO:3的1-365842；SEQ ID NO:4的1-646429或SEQ ID NO:5的1-750080，其中所述区间或部分在所述植物中赋予了增加的ASR抗性。
16.一种具有商业上显著的产量的ASR抗性农艺学上优良的大豆植物，其中所述植物包含来自短绒野大豆登录PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224或其子代的基因渗入，其中该基因渗入包含赋予与位于等同于大豆染色体5的染色体上的至少一个标志连锁的QTL的ASR抗性，并且其中所述标志与SEQ ID NO:1-5中任一个对应并由其定义的染色体区间紧密连锁或位于该染色体区间内。
17.如权利要求16所述的ASR抗性优良大豆植物，其中所述QTL是纯合的。
18.如权利要求16-17所述的植物，其中所述ASR抗性农艺学上优良的大豆在其系谱内具有双二倍体杂种亲本植物，该双二倍体杂种亲本植物在其基因组内包含对应于SEQ IDNO:1-5中任一个的染色体区间。
19.一种农艺学上优良的大豆植物，其包含赋予针对ASR的增加的抗性的ASR抗性等位基因，并且其中该ASR抗性等位基因包含至少一种选自表1-5中任一个中描述的有利单核苷酸多态性(SNP)的组的SNP。
20.一种具有商业上显著的产量的农艺学上优良的大豆植物，其包含来自短绒野大豆染色体5的染色体区间，该染色体区间包含选自表1-5中任一个的至少一个有利SNP标志。
21.如权利要求20所述的植物，其中来自短绒野大豆的所述染色体区间衍生自植物登录PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224中任一个或其子代。
22.如权利要求20-21所述的植物，其中该染色体区间包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或其部分，其中与不包含所述染色体区间的对照植物相比，所述染色体区间或其部分在所述植物中赋予了增加的ASR抗性。
23.一种衍生自如权利要求1-22所述的植物的植物细胞、种子或植物部分。
24.一种来自如权利要求1-22中任一项所述的子代植物。
25.如权利要求1-22和24所述的大豆植物，其中所述植物具有20个染色体对，40个配对染色体或不具有未配对的染色体。
26.如权利要求1-25所述的大豆植物，其中与对照植物相比，没有产量累赘或负面农艺学效应。
27.一种产生对亚洲大豆锈菌病(ASR)具有增加的抗性的大豆属植物的方法，该方法包括以下步骤：
a.将大豆植物与ASR抗性短绒野大豆植物杂交；
b.从a)的杂交中产生大豆豆荚；
c.从b)的豆荚中分离胚并将所述胚置于胚拯救培养基上，其中没有愈伤组织诱导；
d.将c)的胚转移到萌发培养基或伸长培养基上并从所述胚中收集枝条；
e.在萌发或伸长培养基上生长d)的收集的枝条；以及
f.将已建立的e)的枝条转移到土壤中，从而产生对ASR具有增加的抗性的大豆属植物。
28.如权利要求27所述的方法，其中步骤a)的短绒野大豆植物在其基因组中包含对应于SEQ ID NO:1-5中任一个或其部分的染色体区间。
29.如权利要求27-28所述的方法，其中该短绒野大豆植物在其基因组中包含与ASR抗性相关联的等位基因，其中所述等位基因对应于表1-5中列出的任何有利等位基因。
30.如权利要求27-29所述的方法，其中该短绒野大豆品系是PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224中任一个或其子代或双二倍体杂种。
31.如权利要求30所述的方法，其中该子代植物是大豆和短绒野大豆亲本品系之间的远缘杂交。
32.如权利要求27-31所述的方法，其进一步包括分子标志选择的步骤，其中针对与增加的ASR抗性相关联的等位基因的存在来分析来自a)的亲本植物、c)的胚或f)的枝条或所得植物的分离的基因组核酸，并且另外，其中所述等位基因与对应于SEQ ID NO:1-5的染色体区间紧密连锁或位于其中。
33.如权利要求32所述的方法，其中该等位基因对应于表1-5中列出的有利等位基因中任一个。
34.如权利要求27-33所述的方法，其中a)的大豆植物具有3.7至4.8的相对成熟度。
35.如权利要求27-34所述的方法，其中a)的大豆植物用作雌性植物，并且所述短绒野大豆植物用作花粉供体(雄性品系)。
36.如权利要求27-35所述的方法，其中b)的豆荚用包含GA3、NAA和激动素的激素混合物处理。
37.如权利要求27-36所述的方法，其中这些豆荚在授粉后19天之前收集。
38.如权利要求27-37所述的方法，其中在步骤e)-h)的任一个中用染色体加倍剂处理这些胚和/或枝条，以产生能够与非野生一年生大豆属栽培品种回交以产生至少一个回交代(BC1)的双二倍体植物。
39.如权利要求38所述的方法，其中该染色体加倍剂是秋水仙碱或氟乐灵。
40.如权利要求27-39所述的方法，其中c)的胚在约24℃在胚拯救培养基上保留至少约20天。
41.如权利要求27-40所述的方法，其中d)的胚在约24℃在萌发或伸长培养基上保持至少约20天。
42.如权利要求27-41所述的方法，其中该胚拯救培养基是大豆ER1-1。
43.一种产生对亚洲大豆锈菌病(ASR)具有增加的抗性的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a.提供第一大豆植物，其在其基因组中包含对应于SEQ ID NO:1-5中任一个的染色体区间，其中所述第一大豆植物对ASR具有增加的抗性；
b.将a)的大豆植物与不包含所述染色体区间的第二大豆植物杂交；
c.通过从所述子代植物中分离核酸并在所述核酸内检测与增加的ASR抗性相关联的等位基因，从b)的杂交中选择子代植物，并且另外，其中所述等位基因与对应于SEQ ID NO:1-5中任一个的染色体区间紧密连锁或位于其中，从而产生对ASR具有增加的抗性的大豆植物。
44.如权利要求43所述的方法，其中该等位基因对应于如表1-5的任一个中描述的有利等位基因中的任一个。
45.如权利要求43-44所述的方法，其中该第一或第二大豆植物是优良大豆植物。
46.如权利要求43-45所述的方法，其中该子代植物进行一代或多代回交。
47.如权利要求27-46所述的方法，其中该染色体区间对应于位于在0.02-1.19Mb的近似定位区间的染色体5上的短绒野大豆染色体区间。
48.如权利要求43-47所述的方法，其中该短绒野大豆染色体区间衍生自植物登录PI441001、PI441008、PI446958、PI509501、PI583970、PI483224或其子代中任一个。
49.如权利要求48所述的方法，其中该子代植物是大豆和短绒野大豆亲本品系之间的远缘杂交。
50.一种产生具有增加的ASR抗性的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)从大豆植物中分离核酸；
b)在a)的核酸中检测与增加的ASR相关联的至少一种分子标志，其中所述分子标志位于20cM、10cM、5cM、1cM 0.5cM内，或与对应于来自包含SEQ ID NO:1-5中任一个、或其部分的短绒野大豆染色体5的基因组区域的染色体区间紧密连锁，其中所述部分赋予植物增加的ASR抗性；
c)基于b)中检测的分子标志的存在，选择植物；以及
d)从鉴定为具有与增加的ASR抗性相关联的所述等位基因的c)的植物产生大豆子代植物。
51.如权利要求50所述的方法，其中该分子标志与如表1-5中描述的有利等位基因中任一个紧密连锁或由其组成。
52.一种鉴定或选择具有增加的ASR抗性的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a.从大豆植物中分离核酸；
b.在该核酸中检测与增加的ASR抗性相关联的分子标志的存在，其中该分子标志位于如表1-5中任一个中描述的标志的20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM内；以及
c.基于在b)中检测的分子标志，鉴定或选择具有增加的ASR抗性的大豆植物。
53.如权利要求52所述的方法，其中在b)中检测的等位基因由如表1-5中任一个中描述的任何有利标志组成。
54.如权利要求50-53所述的方法，其中该分子标志是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状基因座(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
55.如权利要求50-54中任一项所述的方法，其中该检测包括扩增标志基因座或该标志基因座的一部分，并检测得到的扩增的标志扩增子。
56.如权利要求55所述的方法，其中该扩增包括：a)将扩增引物或扩增引物对与从第一大豆植物或种质分离的核酸混合，其中该引物或引物对与标志基因座的至少一部分互补或部分互补，并且能够使用该大豆核酸作为模板，通过DNA聚合酶启动DNA聚合；以及b)在包含DNA聚合酶和模板核酸的DNA聚合反应中延伸该引物或引物对以产生至少一个扩增子。
57.如权利要求32-56所述的方法，其中该核酸选自DNA或RNA。
58.如权利要求55-56所述的方法，其中该扩增包括采用聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，使用分离自大豆植物或种质的核酸作为该PCR或LCR中的模板。
59.一种诊断ASR抗性的引物，其中所述引物可用于PCR反应以指示与ASR抗性相关联的等位基因的存在，其中所述等位基因是如表1-5中描述的任何有利等位基因。
60.如权利要求27-58所述的方法，其中通过所述方法产生或鉴定的植物进一步赋予针对以下中任一个的增加的抗性：大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、IDC、根结线虫、大豆灰斑病、疫霉菌、褐茎腐病、线虫、锈病、黑粉病、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜和桃蚜、或其组合。
61.一种通过如权利要求27-58所述的方法产生的植物、种子或植物部分。
62.如权利要求61所述的植物，其中该植物是优良大豆植物。
63.如权利要求62所述的植物，其中该植物是农艺学上优良的大豆植物。
64.如权利要求61-63所述的植物，其中与对照植物相比，所述植物显示没有产量累赘或负面农艺学效应。
65.一种用于产生在野生多年生大豆属物种的第一亲本植物和作为非野生一年生大豆属栽培品种的第二亲本植物之间的杂种的方法，其中所述杂种能够与非野生一年生大豆属栽培品种回交以产生第一回交代或其子代的至少一个植物，所述方法包括：
a.提供至少一种野生多年生大豆属亲本植物(wg)和至少一种非野生一年生大豆属亲本植物(dg)；
b.允许亲本植物开花；
c.将wg植物与dg植物杂交；
d.从c)的杂交中产生豆荚；
e.从d)的豆荚中分离胚并将所述胚置于胚拯救培养基上，其中没有愈伤组织诱导；
f.将e)的胚转移到萌发培养基或伸长培养基上并从所述胚中收集枝条；
g.在萌发或伸长培养基上生长f)的收集的枝条；以及
h.将已建立的e)的枝条转移到土壤中，从而产生在野生多年生大豆属物种的第一亲本植物和作为非野生一年生大豆属的第二亲本植物之间的杂种。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述wg选自下组，该组由以下组成：灰毛大豆、银毛大豆、澎湖大豆、G.latrobeana、白色大豆、G.aphyonota、沙生大豆、弯大豆、弯裂片大豆、扁豆荚大豆、镰状大豆、G.gracei、密毛大豆、乳绿大豆、阔叶大豆、小叶大豆、蒙蒂-道格拉斯大豆、G.peratosa、G.pescadrensis、G.pindanica、G.pullenii、黄紫大豆、G.stenophita、G.syndetika和短绒野大豆。
67.如权利要求65-66所述的方法，其中该野生多年生大豆属亲本植物是短绒野大豆。
68.如权利要求65-67的方法，其中该野生多年生大豆属具有所希望的农艺学性状。
69.如权利要求68所述的方法，其中该所希望的性状选自下组，该组由以下组成：疾病抗性，包括但不限于针对以下的抗性：大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、根结线虫、大豆灰斑病、疫霉菌、褐茎腐病、线虫、锈病、黑粉病、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜或桃蚜；增加的产量，针对缺铁失绿症的增加的抗性或耐受性，以及增加的耐旱性或耐热性。
70.如权利要求65-69所述的方法，其中该非野生一年生大豆属是大豆。
71.如权利要求65-70所述的方法，其中该dg植物用作雌性植物，并且所述wg植物是花粉供体。
72.如权利要求65-71所述的方法，其中d)的豆荚用包含GA3、NAA和激动素的激素混合物处理。
73.如权利要求65-72所述的方法，其中这些豆荚在授粉后19天之前收集。
74.如权利要求65-73所述的方法，其中在步骤e)-h)的任一个中用染色体加倍剂处理这些胚和/或枝条。
75.如权利要求74所述的方法，其中该染色体加倍剂是秋水仙碱或氟乐灵。
76.如权利要求65-75所述的方法，其中e)的胚在约24℃在胚拯救培养基上保留至少约20天。
77.如权利要求65-76所述的方法，其中f)的胚在约24℃在萌发或伸长培养基上保持至少约20天。
78.如权利要求76-77所述的方法，其中该胚拯救培养基是大豆ER1-1。
79.如权利要求65-78所述的方法，其中c)的杂交不需要花的去雄。
80.如权利要求65-79所述的方法，其中c)的杂交是非天然杂交。
81.如权利要求65-80所述的方法，其中该方法进一步包括步骤i)，其中h)的杂种植物与大豆植物至少回交一次。
82.如权利要求65-81所述的方法，其中该方法进一步包括步骤j)，其中h)的杂种植物多次回交，并且另外，其中基于衍生自所述wg品系的有利农艺学性状来选择每个回交(BC)代。
83.如权利要求65-82所述的方法，其中该方法进一步包括步骤k)计数至少一个BC代中染色体的数目，并选择具有20个染色体对或40个配对染色体的那些。
84.如权利要求65-82所述的方法，其中该方法进一步包括步骤k)计数至少一个BC代中染色体的数目，并选择不具有未配对染色体的品系并将这些品系进行进一步育种。
85.一种通过如权利要求65-84所述的方法产生的双二倍体植物。
86.一种衍生自如权利要求85所述的植物的非野生一年生大豆属植物。
87.一种通过如权利要求65-84所述的方法产生的优良大豆植物。
88.一种通过如权利要求65-84所述的方法产生的具有商业上显著的产量的农艺学上优良的大豆。
89.如权利要求85-88所述的植物，其中该植物遗传了来自多年生野生大豆属亲本的所希望的农艺学性状。
90.如权利要求89所述的植物，其中该所希望的农艺学性状是针对以下中的任一个的增加的疾病抗性：大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、根结线虫、大豆灰斑病、疫霉菌、褐茎腐病、线虫、锈病、黑粉病、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜或桃蚜。
91.如权利要求89-90所述的植物，其中该所希望的农艺学性状相对于以下任一个具有更好的田间或商业表现：增加的产量，倒伏，株高，田间出苗，针对除草剂、细菌、真菌、病毒和线虫的抗性或耐受性，耐旱性，耐热性，耐寒性或耐冷性，过量水分，盐胁迫，氧化胁迫，食物含量和组成，物理外观，雄性不育，干倒，可立性，繁殖力，糖特性，生物质，油质量或生产，蛋白质质量和总体质量。
92.一种来自如权利要求85-91所述的植物中的任一个的植物细胞、种子或植物部分。
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