CN116113317A - 远缘杂交育种 - Google Patents
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Abstract
野生物种中存在的基因可以为家养作物提供有益的性状。例如，如果渗入到大豆中，野生大豆属物种可以为广泛的大豆锈病群体提供抗性。以前，成功的渗入需要远缘杂交授粉、胚胎拯救、和F1幼芽的再生。此外，需要可以通过胚胎的化学处理实现的染色体倍增来获得可育的双二倍体(F1D)。然后需要与大豆进行回交以获得BC1F1遗传学。在此，我们描述了用于大豆与短绒野大豆之间的种间杂交的改进程序。这些程序通过绕过该双二倍体生成来为BC1F1遗传学提供更有效的途径。这些原理可以应用于另外的家养物种及其野生近缘种，诸如芸苔属。
Description
技术领域
本发明涉及植物育种领域。更具体地，本发明涉及通常不能异体受精的植物之间的种间育种(有时被称为“远缘杂交”)。本发明还涉及将家养物种基因组倍增，使其与野生物种基因组杂交时更加兼容且有效。
序列表
本申请附有2021年8月3日创建的命名为82180PCT_ST25.txt的序列表，其大小为大约3千字节。本序列表通过援引以其全文并入本文。本序列表随同此申请经由EFS-Web提交，并且符合37 C.F.R.§1.824(a)(2)-(6)和(b)。
背景技术
大豆是世界上最重要的农作物之一。它在经济上至关重要，因为它是许多领域，诸如食品、蛋白质、油、和其他豆制品的主要来源。大豆属(Glycine)含有2个亚属，由多年生植物(大豆亚属(Glycine))和一年生植物(黄豆亚属(Soja))组成。存在超过26种差异很大的多年生物种。典型地，大部分用于改良品种的大豆育种都是用黄豆亚属完成的；然而，多年生物种具有自己的有用农艺性状，这些农艺性状尚未得到完全探索。如果将这些性状培育成栽培的大豆，这些性状将是有用的，并且多年生大豆属的使用将极大地扩展遗传多样性；然而，通过已建立的方法，一年生植物与多年生植物之间的远缘杂交是困难且低效的。野生多年生大豆属物种的染色体集和染色体数量可能与我们称为家养大豆的家养作物完全不同。通过实例但不受限制，野生短绒野大豆(G.tomentella)具有39条不同的染色体，而驯养的栽培大豆(G.max)具有20条。当前的做法是产生栽培大豆和短绒野大豆的不育杂交种。这是一个已经非常低效的过程(产生少量的不育杂交种)，染色体倍增过程进一步加剧了它的低效-即，不常获得的不育杂交种必须通过化学试剂(典型地是秋水仙碱)使其染色体倍增以使其具有可育性，这被称为F1D或双二倍体植物，然后它才能用栽培大豆培育。很少有植物能在这个过程中幸存下来。
有许多病原体威胁大豆生产，例如亚洲大豆锈病(“ASR”)和大豆胞囊线虫(“SCN”)。报告指出，已发现短绒野大豆品系对ASR和SCN具有抗性。参见美国专利号7,842,850(2006年5月4日提交)，通过援引以其全文并入本文。作为实例，大豆锈病是由两个物种引起的，豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)。由豆薯层锈菌引起的ASR是影响豆科作物的最具破坏性的疾病之一。这种侵袭性病原体起源于东亚，并且于2004年首次在美国大陆被发现。它是一种破坏植物叶子的寄生虫。豆薯层锈菌可以感染超过95种物种，大多数是豆科作物；替代性宿主充当接种物积聚的储存库。病原体感染很快，因为孢子可以直接感染，而无需伤口或开口。如果温度和湿度条件最佳，感染可以在6小时内发生。受感染的植物叶子会出现浸水斑点，然后发展为红棕色或棕褐色病变。受感染的叶子变成青铜色/黄色，并且因此会发生过早落叶，最终影响豆荚数量和种子重量。孢子在空中传播，并且在最佳条件下，植物可以在1-2周内从感染的最初迹象发展到严重落叶。
据报道，由于ASR，产量损失高达80％(参见Kawashima等人(2016)Nat.Biotechnol.[自然生物技术]34：661-65)。有几种用于ASR的主要控制措施：作物监测、化学杀菌剂、培育抗性大豆品种、和特定栽培方法。植物疾病的发病率可以通过农艺实践来控制，包括常规育种技术、作物轮作、和使用合成农用化学品。然而，常规育种方法非常耗时，并且随着植物病原体的进化，需要不断努力来维持疾病抗性。参见Grover和Gowthaman(2003)Curr.Sci.[当代科学]84：330-340。
进一步，还有许多其他生物胁迫、真菌以及细菌(例如，细菌性脓疱)、病毒(例如，大豆花叶病毒)、和线虫(例如，大豆胞囊线虫“SCN”)会给大豆生产带来问题。还需要针对非生物胁迫(例如，耐旱性)和各种农艺性状(例如，育种以提高产量以及蛋白质和油含量)的改进。为了帮助解决这些问题以及其他问题，用野生多年生大豆属培育一年生大豆属可能是一个有用的工具。野生多年生大豆属包含广泛范围的基因组学、细胞学和形态学多样性，其可以提供有用的种质来源。
将有用性状培育到植物中的困难不仅仅是大豆存在的问题。在培育家养和野生物种时出现此类问题的另一个实例包括芸苔属植物(Brassica species)。典型地，芸苔属物种中的一个亚种是性相容的。然而，不同的芸苔属物种并不总是表现出相同的相容性。作为实例，野生物种芜菁(B.rapa)具有10条染色体，而家养物种甘蓝(B.oleracea)具有9条染色体。这种染色体差异使两者在性方面不相容。与大豆一样，这种不相容性使得很难将来自一个芸苔属物种的性状转移到另一个物种。
考虑到植物病原体、害虫、和其他胁迫对于大豆和其他作物产量和质量的显著影响，需要其他方法进行控制。由于培育一年生和多年生大豆属很困难，所以需要额外的方法进行两者之间的远缘杂交。因此，本发明提供了一种使该物种与可育植物杂交的解决方案。
发明内容
在此，我们提供了通过使用四倍体大豆在家养大豆与野生多年生大豆属之间高效产生可育杂交种的方法。这些方法产生可育杂交种，这些可育杂交种可以进一步与大豆回交，以将来自该野生大豆属的希望的基因和性状转移到该家养大豆中。这产生了具有希望的野生型性状的家养大豆，而无需人工基因修饰或基因编辑。
还提供了一种在野生大豆属物种(例如，短绒野大豆)与家养大豆(即，栽培大豆)之间产生至少一个杂交后代的方法。通过这种方法产生的杂交植物是通过将倍增家养大豆与野生大豆属杂交而生成的。首先通过应用抗微管剂(例如，秋水仙碱)生成倍增家养大豆。然后将此倍增大豆与野生大豆属杂交，并且任选地施加生长素以获得至少一个可育杂交后代。F1杂交后代含有2nD条家养大豆染色体和1nW条野生大豆属染色体。可以将此杂交后代杂交到大豆植物上(产生BC1植物)，并且然后将该F1杂交植物与野生大豆属植物杂交。在该方法中，倍增大豆植物和短绒野大豆可以在杂交期间充当雄株或雌株。图1例示了参考四倍体大豆属物种，特别是短绒野大豆的当前发明。此过程可以与其他一年生物种，诸如野生大豆(G.soja)和其他野生多年生物种一起使用。此外，该过程可以用于家养芸苔属物种。例如，该过程可以使用甘蓝和芜菁进行。
此过程是一种改进的方法，用于产生含有来自家养大豆最初缺乏的野生大豆属物种的性状、等位基因、或表型的家养大豆品系。这种性状、等位基因、或表型的一个实例是对大豆锈病等病原体的增加抗性。这些方法包括将来自野生大豆属的性状、等位基因、或表型渗入到家养大豆植物中。
对序列表中的序列的简述
SEQ ID NO：1-2是TaqMan测定ID 3289中使用的引物。
SEQ ID NO：3是TaqMan测定ID 3289中使用的探针。
SEQ ID NO：4-5是TaqMan测定ID 3316中使用的引物。
SEQ ID NO：6是TaqMan测定ID 3316中使用的探针。
SEQ ID NO：7-8是TaqMan测定ID 3434中使用的引物。
SEQ ID NO：9是TaqMan测定ID 3434中使用的探针。
SEQ ID NO：10-11是TaqMan测定ID 3435中使用的引物。
SEQ ID NO：12是TaqMan测定ID 3435中使用的探针。
SEQ ID NO：13-14是TaqMan测定ID 3537中使用的引物。
SEQ ID NO：15是TaqMan测定ID 3537中使用的探针。
SEQ ID NO：16-17是TaqMan测定ID 3538中使用的引物。
SEQ ID NO：18是TaqMan测定ID 3538中使用的探针。
附图说明
图1是显示出两种方法之间的差异的图：传统上将野生大豆属基因渗入到家养大豆中和使用本文所述的倍增大豆的更有效方法。一旦获得了倍增大豆，当前方法就避免了标准过程中最限速的步骤：秋水仙碱处理。该方法跳过了最耗时的第一代，其需要4至12个月才能完成。对于胚胎拯救方案的需要减少，并且使种子成熟时间更快。图1例示了参考四倍体大豆属物种，特别是短绒野大豆的当前方法。此过程可以与其他一年生物种，诸如野生大豆(G.soja)和其他野生多年生物种一起使用。此外，该过程可以用于家养芸苔属物种。例如，该过程可以使用甘蓝和芜菁进行。
图2展示了使用染色体复染DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)在405nm激发下79条F1染色体分散的共聚焦图像。根材料来自F1植物，来自倍增大豆(4n＝80)x短绒野大豆(2n＝78)杂交。
图3展示了使用Alexa
488在488nm激发下具有标记的大豆着丝粒的40条大豆染色体的标记着丝粒的共聚焦图像。根材料来自F1植物，来自倍增大豆(4n＝80)x短绒野大豆(2n＝78)杂交。
图4展示了用着丝粒标记的40条大豆染色体和没有着丝粒标记的39条短绒野大豆染色体分散的合并共聚焦图像。根材料来自F1植物，来自倍增大豆(4n＝80)x短绒野大豆(2n＝78)杂交(n＝40+39)。
定义
如本文所用，“野生大豆属物种”是指任何未经驯养的多年生或一年生大豆属物种。如本文所用，“野生多年生大豆属物种”是指超过26种具有不同基因组(例如，2n＝38、40、78、80)的野生多年生大豆属物种中的任一种。一种示例性物种是短绒野大豆。如本文所用，“nW”是指野生多年生大豆属物种中存在的不同染色体的数量。通过实例的方式并且不受限制，短绒野大豆典型地具有39条不同染色体的两个拷贝(包括D基因组和E基因组)，因此，其nW为39，而其2nW为78。因此，短绒野大豆具有DDEE基因组。术语“野生一年生大豆属物种”是指例如野生大豆。
如本文所用，“家养一年生大豆属物种”包括主要的驯养大豆属物种，栽培大豆(Glycine max)。栽培大豆典型地具有20条不同染色体的两个拷贝(各自来自G基因组)，因此，其nD为20，而其2nD为40。如本文所用，“二倍体大豆植物”或“2nD”是指栽培大豆植物，它具有20条不同染色体的两个拷贝，因此，其nD为20，而其2nD为40。如本文所用，“nD”是指驯养的大豆属物种中存在的不同染色体的数量。因此，栽培大豆具有GG基因组。此术语还可以是指包含先前渗入的祖先基因、同时维持GG基因组的大豆植物。术语大豆(soy)、大豆(soybean)、二倍体大豆植物、栽培大豆、和家养一年生大豆属物种在全文中可互换使用。
如本文所用，“倍增大豆植物”或“四倍体大豆植物”或“4nD”是指倍增的家养一年生大豆属植物。典型的家养一年生大豆属植物具有20条不同染色体的两个拷贝(各自来自G基因组)，因此，其nD为20，而其2nD为40，具有GG基因组。这些术语还可以是指包含先前渗入的祖先基因、同时维持GG基因组的倍增大豆植物。“倍增大豆植物”或“四倍体大豆植物”通过典型地使用染色体倍增剂(“CDA”)，例如秋水仙碱破坏纺锤体纤维形成而使其染色体倍增，从而产生4nD，其中其4nD为80并且具有GGGG基因组。“倍增大豆植物”或“四倍体大豆植物”也可以被称为“受体基因组”。
如本文所用，“受体物种”是指一个物种，其中此物种的基因组倍增，以允许与替代物种(例如，野生物种)更有效地杂交。例如，受体物种可以是栽培大豆(nD为20并且2nD为40)或甘蓝(nD为9并且2nD为18)。这些物种实例可以分别与例如短绒野大豆(nW为39并且2nW为78)或芜菁(nW为10并且2nW为20)基因组杂交。“受体物种”的染色体可以倍增，以便与野生物种有效杂交；例如，倍增的栽培大豆产生4nD＝80，或者甘蓝产生4nD＝36。在受体物种基因组没有D上标或没有W上标的情况下，即“n”表示单倍体基因组，“2n”表示二倍体基因组等，符号反映了受体物种可能是家养物种或野生物种的可能性。
如本文所用，“供体物种”是指该物种在与受体物种杂交时充当染色体供体的物种。例如，供体物种可以是短绒野大豆，其中nW＝39。短绒野大豆可以例如与nD为20并且2nD为40的倍增栽培大豆(受体物种)杂交。在供体物种基因组没有D上标或没有W上标的情况下，即“n”表示单倍体基因组，“2n”表示二倍体基因组等，符号反映了供体物种可能是家养物种或野生物种的可能性。
如本文所用，“杂交种”是指通过杂交两株遗传上不同的亲本植物而产生的子代。
如本文所用，“杂交后代”是指由倍增的家养大豆属与野生大豆属物种之间的杂交产生的子代。
如本文所用，“生长素”是指有助于最终调节植物生长的细胞伸长的植物激素。用于本发明的生长素可以包括但不限于天然或合成生长素，诸如麦草畏(3，6-二氯-20甲氧基苯甲酸)、IAA(吲哚-3-乙酸)、NAA(1-萘乙酸)、和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
如本文所用，染色体倍增剂(“CDA”)或“抗微管剂”是指用于干扰纺锤体纤维形成的化合物，诸如但不限于秋水仙碱、氟乐灵、拿草特、甲基胺草磷(APM)、氟硫草定、卡草胺、氯酞酸二甲酯、异丙乐灵、甲磺乐灵、和一氧化二氮。应理解，抗微管剂包括例如通过阻止微管蛋白聚合来损害微管功能的任何蛋白质、肽、化学物、或其他分子。破坏微管形成最终导致染色体迁移的抑制，从而产生染色体数量倍增的细胞。
如本文所用，“倍性”是指生物体的一个或多个细胞中的染色体集数。
如本文所用，“基因型”是指生物体的基因组成。
如本文所用，“所需的性状、等位基因、或表型”是指野生大豆属物种中的感兴趣的特征，该特征是家养大豆属物种中所需的。这种“性状、等位基因、或表型”可以包括对亚洲大豆锈病、大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、炭腐病、根腐病、和茎渍疡的抗性。可替代地，这种性状、等位基因、或表型可以包括改善的产量、蛋白质含量、油含量、耐旱性、和开花时间。
如本文所用，“渗入”是指将来自一种植物(即，一种野生植物，即野生大豆属)的基因组的性状、等位基因、或表型引入到缺乏这种性状、等位基因、或表型的另一种植物(即，家养大豆属)的基因组中。
如本文所用，如本领域公认的，“染色体”是指细胞核中含有细胞DNA并具有线性基因阵列的自我复制的基因结构。
如本文所用，“自体受精(self或selfing)”是指通过自体受精或自体授粉来产生种子，即，花粉和胚珠是来自同一植物。
如在此所用，“F1D”或“双二倍体”是指具有来源于每个亲本物种的一组完整二倍体染色体的种间杂交种。
具体实施方式
我们提供了一种在野生多年生大豆属物种与家养一年生大豆属物种之间产生至少一个杂交后代的方法。在一个实施例中，该方法包括a)获得倍增的家养一年生大豆属植物，b)将该倍增大豆植物与具有2nW条染色体的野生多年生大豆属物种植物杂交，c)施加生长素，以及d)从中获得至少一个杂交后代，其中该杂交后代包含2nD条家养大豆属染色体和1nW条野生大豆属染色体。在一方面，该方法包括将该至少一个杂交后代杂交到二倍体大豆植物上以获得BC1F1杂交植物。在一个单独实施例中，该方法包括将该F1杂交植物与该野生大豆属植物杂交。该方法的至少一个杂交后代是可育的。
在另一个实施例中，该倍增大豆植物是通过使用抗微管剂获得的，其中该试剂选自由秋水仙碱、氟乐灵、和拿草特组成的组。该倍增大豆植物或植物细胞是栽培大豆植物或植物细胞，其中该栽培大豆植物或植物细胞具有2nD的倍性，其中nD是不同家养物种染色体的数量，其中nD为20。在一方面，倍增大豆植物具有4nD的倍性，其中nD是不同家养物种染色体的数量，并且其中nD为20。该倍增大豆植物具有GGGG基因型，并且可以充当雄性或雌性亲本。在一个实施例中，野生大豆属物种是短绒野大豆。在一方面，短绒野大豆具有2nW的倍性，其中nW是不同野生多年生物种染色体的数量，并且其中nW为39。该短绒野大豆具有DDEE基因型，并且可以充当雄性或雌性亲本。该至少一个杂交后代具有GGDE基因型。
在一个实施例中，该野生大豆属物种具有所需的性状、等位基因、或表型。在一方面，所需的性状、等位基因、或表型赋予对亚洲大豆锈病、大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、炭腐病、根腐病、茎溃疡、或其他大豆病原体的增加抗性。可替代地，这种性状、等位基因、或表型可以包括改善的产量、蛋白质含量、油含量、耐旱性、和开花时间。另一个实施例涉及一种包含来自野生大豆属物种的性状、等位基因、或表型的家养大豆植物，其中该性状、等位基因、或表型通过先前所述的方法被渗入。又一个实施例涉及一种通过该方法产生的杂交植物，其中该杂交植物具有GGDE基因型。
在另一个实施例中，提供了一种在野生植物物种与家养植物物种之间产生至少一个杂交后代的方法。所述方法包括a)获得具有4nD条染色体的家养受体基因组的倍增家养植物，b)将该倍增家养植物与具有2nW条染色体的野生物种植物杂交，c)施加生长素，以及d)从中获得至少一个杂交后代，其中该杂交后代包含2nD条家养植物染色体和1nW条野生植物染色体。该方法的倍增受体基因组选自由大豆属、芸苔属、南瓜属、向日葵属、茄科、和碧冬茄属组成的组。在一方面，该方法包括将该至少一个杂交后代杂交到家养植物物种上以获得BC1F1植物。在另一方面，该方法进一步包括将该BC1F1植物与该野生物种植物杂交。该方法的至少一个杂交后代是可育的。
在另一个实施例中，提供了一种在多年生物种与一年生物种之间产生至少一个杂交后代的方法。所述方法包括a)获得具有4n条染色体的受体基因组的倍增一年生植物，b)将该倍增一年生植物与具有2n条染色体的多年生物种植物杂交，c)施加生长素，以及d)从中获得至少一个杂交后代，其中该杂交后代具有2n条一年生植物染色体和1n条多年生植物染色体。在又一个实施例中，提供了一种在供体植物物种与受体植物物种之间产生至少一个杂交后代的方法。所述方法包括a)获得具有4n条染色体的基因组的倍增受体植物，b)将该倍增受体植物与具有2n条染色体的供体植物物种杂交，c)施加生长素，以及d)从中获得至少一个杂交后代，其中该杂交后代具有2n条受体植物染色体和1n条供体植物染色体。
实例
申请人评价了标准渗入的现有技术方法。在这些实践中，申请人获得了倍增的F1植物(F1D)，但无法成功地将F1D与二倍体大豆杂交以产生BC1。这些结果重申了现有技术方法的困难和低效率，以及对于更有效的方法，诸如以下实例中所述的方法的需要。
实例1.用于获得倍增大豆的方法
倍增大豆品系(四倍体大豆)由远缘杂交中常用的两个优良品系(在本文中被称为雌性1和雌性2)生成；这些栽培大豆品系具有40条染色体(G1G1基因组)。将在组织培养基中的未成熟大豆胚胎在25℃下用大约0.25-1.0mg/ml秋水仙碱处理3-4天。将再生植物转移到土壤中，并且采集叶片样品进行倍性分析以确认染色体倍增。允许四倍体植物进行自体受精，并且对胚胎进行倍性分析以确认倍增。通过允许四倍体大豆进行自体受精来产生无限的种子供应。
实例2.将倍增大豆与野生型大豆属杂交的方法
当使用四倍体大豆作为雌性亲本时，通过轻轻去除萼片和花瓣暴露成熟柱头来制备开花之前的大豆花蕾。通过轻轻去除花瓣以暴露成熟花药并将花粉撒到大豆柱头上来从短绒野大豆(2n＝78)的刚开放花中获得花粉。当使用倍增大豆作为雄性亲本时，反转先前所述的过程。所使用的野生多年生大豆属在表1中列出。来自倍增大豆x大豆属杂交的结果可以见于表2中。
表1.与四倍体大豆杂交的野生多年生大豆属品系
| 缩写 | 同工酶组 | 品系 | 2n染色体# |
| M1 | T1 | PI 441001 | 78 |
| M4 | T5 | PI 509501 | 78 |
| M5 | T1 | PI 483224 | 78 |
| M14 | T1 | PI 499939 | 78 |
| M15 | D3 | PI 505267 | 40 |
表2.来自每个倍增大豆x多年生大豆属组合的总数
实例3.生长素施加
将麦草畏(一种合成生长素除草剂)喷洒在四倍体x大豆属杂交上以产生豆荚和胚胎形成。如在表3中所看到的，以3至20mg/L浓度喷洒麦草畏。使用喷雾瓶或雾化器来实现授粉的雌蕊及其附着节点的良好饱和度。还如在表3中所示，评价了不同的施加天数(即，喷洒1-5天)。
表3.示出对所有杂交的不同生长素(麦草畏)处理的表。
| 麦草畏处理＊ | 施加天数的# | 授粉的# | 胚胎的# | 胚胎/杂交 | 幼芽 |
| BC 3D | 5天 | 34 | 15 | 0.44 | 3 |
| BC 5D | 1天 | 4 | 0 | 0.00 | 0 |
| BC 5D | 2天 | 332 | 139 | 0.42 | 10 |
| BC 5D | 3天 | 249 | 110 | 0.44 | 10 |
| BC 7D | 3天 | 86 | 32 | 0.37 | 3 |
| BC 10D | 1天 | 34 | 9 | 0.26 | 0 |
| BC 10D | 2天 | 93 | 53 | 0.57 | 4 |
| BC 10D | 3天 | 38 | 21 | 0.55 | 2 |
| 20D | 2天 | 9 | 2 | 0.22 | 0 |
＊BC含有100mg/L GA3+5mg/L激动素；D＝mg/L麦草畏
＊BC 3D含有3mg/L麦草畏，BC 5D含有5mg/L麦草畏等。
＊20D仅含有20mg/L麦草畏
实例4.回交
一旦通过将倍增大豆与野生大豆属杂交获得了F1，然后就将F1与家养大豆回交以获得BC1F1。与家养大豆进行二次回交，以获得BC2F1后代。使用当前方法，需要更少的胚胎挽救步骤即可获得成熟种子。如表4所示，使用新的更有效四倍体大豆亲本渗入方法实现了BC2F1后代的成功生成。
表4.来自将F1杂交种与两代家养大豆回交的结果
＊土壤中的生根芽，除非另有说明
＊＊成熟种子
＊＊＊小成熟种子；未尝试发芽
实例5.当前方法的对大豆锈病具有增加抗性的F1植物
评价通过使用四倍体大豆的渗入方法产生的F1植物对大豆锈病的抗性。这些植物中的一些的结果在表5中示出。使用三种大豆锈病菌株来评价每个F1植物和大豆对照的抗性。“RB”表示“红棕色”病变，而与首字母缩略词相关联的数字表示与植物对锈病菌株的抗性相关的值。该值越低，它对菌株的抗性越强。“SP”表示“孢子形成”。例如，“no-sp”翻译为植物上“没有孢子形成”，而“sp-medium”和“sp-little”翻译为在植物上主观观察到病原体的少量至中等孢子形成。底行展示了大豆对照数据。在此，“tan”表示易感反应，相关联的数字表示植物的易感性水平。该值越高，该植物的易感性越强，5表示最易感。与对照相比，F1植物显示对锈病病原体的所有三种菌株的增加抗性。
表5.通过四倍体渗入方法产生的F1植物对大豆锈病的抗性
| 植物ID | 大豆锈病菌株1 | 大豆锈病菌株2 | 大豆锈病菌株3 |
| F1-1 | RB4 sp-medium | RB2 no-sp | RB2 no-sp |
| F1-2 | RB4 sp-little | RB2 no-sp | RB2 no-sp |
| F1-3 | RB4 sp-little | RB2 no-sp | RB2 no-sp |
| F1-4 | RB4 sp-little | RB2 no-sp | RB2 no-sp |
| 大豆(对照) | Tan5-sp | Tan4-sp | Tan4-sp |
RB＝红棕色病变；sp＝孢子形成；#＝抗性至易感性的标度(1-5)，其中值越低表示抗性越强，并且值越高表示对锈病病原体的易感性越强
实例6.真杂交种的确认
为了验证杂交产生了真杂交种，完成TaqMan测定。
表6.确认杂交种的所有杂交的Taqman数据
实例7.根染色体分散染色和成像
使用荧光原位杂交(FISH)技术来区分大豆染色体和野生大豆属染色体。图2、3和4中的根材料来自F1植物(2nD1nW＝40+39)，来自倍增大豆(4nD＝80)x短绒野大豆(2nW＝78)杂交。大豆着丝粒被鉴定为细胞学标记物并用于FISH。大豆着丝粒通过切口平移用Alexa
488标记，它不与短绒野大豆杂交，仅与大豆着丝粒杂交。使用染色体复染DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)对大豆染色体进行可视化。使用FISH，将40条大豆染色体与F1植物中的39条短绒野大豆染色体区分开。
对于FISH，首先将根材料在0.05％8-羟基喹啉中阻滞5小时，并在90％乙酸中固定。切割根尖(分生组织区域)并用0.5％果胶酶和1％纤维素酶短暂消化以去除细胞壁。根据文献，通过PCR从大豆基因组DNA扩增大豆着丝粒重复序列CentGm-1和CentGm-2(参见Gill等人，Plant Physiol.[植物生理学]2009第151卷，第1167-1174页)，并且通过切口平移用荧光染料标记着丝粒探针。将染色体分散并与大豆着丝粒探针杂交，并且用DAPI对染色体进行复染，接着在共聚焦显微镜(Zeiss 710)下进行检查和成像。
实例8.使用当前程序的效率增益
如在表7和图1中所看到的，与标准渗入程序相比，当前的方法具有很大的改进。表7展示了根据标准以二倍体大豆开始将两种不同的大豆属品系杂交以及将大豆属品系与四倍体大豆杂交的结果。当前方法不仅通过消除步骤而更快，而且效率更高，产生了280-647倍的效率增益。
表7.此表证明了利用当前程序相对于标准渗入方法的效率改善。
1GGDE遗传学：通过标准途径生成的B1代，通过四倍体大豆途径生成的F1代
2从大豆x大豆属远缘杂交至土壤中产生GGDE幼芽的天数
3与M1标准相比；考虑授粉的总#和获取GGDE幼芽的时间
实例9.与芸苔属的远缘杂交育种
驯养芸苔属物种的染色体倍增。
可以将以上针对大豆所述的方法应用于芸苔属物种。首先，通过使用染色体倍增剂(例如，秋水仙碱)对染色体进行倍增来获得倍增的家养芸苔属物种(例如，甘蓝)。为此，将在组织培养基中的未成熟胚胎在25℃下用大约0.25-1.0mg/ml秋水仙碱处理3-4天。接下来，将再生植物转移到土壤中，并采集叶片样品进行倍性分析以确认倍增。允许四倍体植物进行自体受精，并且对胚胎进行倍性分析以确认倍增。
将倍增家养芸苔属与野生芸苔属物种杂交。
接下来，将倍增物种与野生芸苔属物种(例如，芜菁)杂交。当使用四倍体芸苔作为雌性亲本时，在开花之前轻轻去除萼片和花瓣以暴露成熟柱头，以制备芸苔属花蕾。通过轻轻去除花瓣以暴露成熟花药并将花粉撒到芸苔属柱头上来从野生物种的刚开放花中轻轻取出花粉。如果使用倍增芸苔属作为雄性亲本时，可以反转先前所述的过程。此杂交将产生具有标准渗入方法的BC1F1遗传学的F1。
施加生长素
将麦草畏(一种合成生长素除草剂)喷洒在四倍体x野生芸苔属授粉上，试图产生豆荚和胚胎的形成。麦草畏施加浓度的范围可以是3至20mg/L。为了实现授粉的雌蕊及其附着节点的良好饱和度，使用喷雾瓶或雾化器。可以评价不同的施加天数(例如，喷洒1-5天)。
回交
一旦通过将倍增芸苔属与野生芸苔属杂交获得了F1，就将F1与家养芸苔属回交以获得BC1F1。完成与家养芸苔属的二次回交，以获得BC2F1后代。使用当前方法，需要更少的胚胎挽救步骤即可获得成熟种子。
序列表
<110> Syngenta Crop Protection AG
Liu, Qingli
Schuller, Craig J
Dawson, John L
Kelliher, Timothy J
<120> 远缘杂交育种
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<151> 2020-08-12
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
tctgtccttc ttcacaaaca agtttac 27
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
ctgctctgga cgctggaga 19
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 3
tccactttcg caattccaat ggcttc 26
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tgcctgtcct ccactagtat tgaa 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
aaatgatggg taagtcaacg cat 23
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 6
aaggacacca gagactcaat ttggagctg 29
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
catcaatttg gagcagttgg g 21
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 8
cgagggagtc gagtggca 18
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<212> DNA
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<220>
<223> 探针
<400> 9
ttcctagtga tgtcaacaat ggcagtaagg 30
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 10
ggttttcttt ttcaagctct caga 24
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<220>
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<400> 11
tcgggttcac ccttttcg 18
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<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 探针
<400> 12
aggcatcgtc gccttcaaag gtc 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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caataaatgt tcgccatctg aca 23
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<220>
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aaagctgcgc aaaaacttta gtc 23
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
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<210> 16
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<220>
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<400> 16
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<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
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<210> 18
<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 18
ccattcaaga ttctttg 17
Claims (32)
1.一种在野生多年生大豆属物种与家养一年生大豆属物种之间产生至少一个杂交后代的方法，所述方法包括：
a.获得具有4nD条染色体的家养受体基因组的倍增家养一年生大豆属植物；
b.将所述倍增大豆植物与具有2nw条染色体的野生多年生大豆属物种植物杂交；以及
c.施加生长素；
d.从中获得至少一个杂交后代；
e.其中所述杂交后代具有2nD条家养大豆属染色体和1nw条野生大豆属染色体。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括将所述至少一个杂交后代杂交到二倍体大豆植物上以获得BC1F1大豆植物。
3.如权利要求2所述的方法，所述方法进一步包括将所述BC1F1大豆植物与所述野生大豆属植物杂交。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个杂交后代是可育的。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述倍增大豆植物是通过抗微管剂获得的，其中所述试剂选自由秋水仙碱、氟乐灵、和拿草特组成的组。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述大豆植物或植物细胞是栽培大豆植物或植物细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述栽培大豆植物或植物细胞具有2nD的倍性，其中nD是不同家养物种染色体的数量。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述栽培大豆植物或植物细胞具有2nD的倍性，其中n是20条不同家养物种染色体。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述倍增大豆植物具有4nD的倍性，其中nD是不同家养物种染色体的数量。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述倍增大豆植物具有4nD的倍性，其中nD是20条不同家养物种染色体。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述倍增大豆植物具有GGGG基因型。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述倍增大豆植物充当雌性亲本。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述倍增大豆植物充当雄性亲本。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述野生大豆属物种是短绒野大豆。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述短绒野大豆具有2nw的倍性，其中nw是不同野生多年生物种染色体的数量。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述短绒野大豆具有2nw的倍性，其中nw是39条不同野生多年生物种染色体。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述短绒野大豆具有DDEE基因型。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述短绒野大豆充当雄性亲本。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述短绒野大豆充当雌性亲本。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个杂交后代具有GGDE基因型。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述野生大豆属物种具有所需的性状、等位基因、或表型。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述所需的性状、等位基因、或表型包括对亚洲大豆锈病、大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、炭腐病、根腐病、茎溃疡、或其他大豆病原体的抗性。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述所需的性状、等位基因、或表型赋予改善的产量、蛋白质含量、油含量、耐旱性、或开花时间。
24.一种大豆植物，所述大豆植物具有如权利要求22-23所述的性状、等位基因、或表型，其中所述性状、等位基因、或表型通过如权利要求1所述的方法渗入。
25.一种通过如权利要求1所述的方法产生的杂交植物，其中所述杂交植物具有GGDE基因型。
26.一种在野生植物物种与家养植物物种之间产生至少一个杂交后代的方法，所述方法包括：
a.获得具有4nD条染色体的家养受体基因组的倍增家养植物；
b.将所述倍增家养植物与具有2nw条染色体的野生物种植物杂交；以及
c.施加生长素；
d.从中获得至少一个杂交后代；
e.其中所述杂交后代包含2nD条家养植物染色体和1nw条野生植物染色体。
27.如权利要求28所述的倍增受体基因组，其中所述受体基因组选自由大豆属、芸苔属、南瓜属、向日葵属、茄科、和碧冬茄属组成的组。
28.如权利要求28所述的方法，所述方法进一步包括将所述至少一个杂交后代杂交到家养植物物种上以获得BC1F1植物。
29.如权利要求30所述的方法，所述方法进一步包括将所述BC1F1大豆植物与所述野生物种植物杂交。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述至少一个杂交后代是可育的。
31.一种在多年生物种与一年生物种之间产生至少一个杂交后代的方法，所述方法包括：
a.获得具有4n条染色体的受体基因组的倍增一年生植物；
b.将所述倍增一年生植物与具有2n条染色体的多年生物种植物杂交；以及
c.施加生长素；
d.从中获得至少一个杂交后代；
e.其中所述杂交后代包含2n条一年生植物染色体和1n条多年生植物染色体。
32.一种在供体植物物种与受体植物物种之间产生至少一个杂交后代的方法，所述方法包括：
a.获得具有4n条染色体的基因组的倍增受体植物；
b.将所述倍增受体植物与具有2n条染色体的供体植物物种杂交；以及
c.施加生长素；
d.从中获得至少一个杂交后代；
e.其中所述杂交后代包含2n条受体植物染色体和1n条供体植物染色体。
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