CN103947536A

CN103947536A - 一种不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法

Info

Publication number: CN103947536A
Application number: CN201310643390.XA
Authority: CN
Inventors: 张蜀宁; 李英; 孙成振; 郑金双; 王雅美; 侯喜林
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2013-12-03
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明公开了一种不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法。该育种方法是以同源四倍体不结球白菜为母本，以同源四倍体萝卜为父本，进行人工有性杂交育种，利用重复授粉以及离体胚挽救技术，获得同源四倍体不结球白菜与同源四倍体萝卜远缘杂交新种质。本发明首次采用同源四倍体不结球白菜与同源四倍体萝卜有性杂交育种途径以及离体胚挽救技术，获得远缘杂交新种质，与传统二倍体间杂交获得合子胚再进行倍性加倍相比，无需进行染色体加倍操作，能显著缩短育种时间，且杂种F₁能稳定遗传。本发明创制的新种质具有不结球白菜与萝卜遗传物质，具有更广泛的遗传多样性。

Description

一种不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法

技术领域

本发明属于农作物育种领域，涉及一种不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法。

背景技术

不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)是十字花科芸薹属植物，是人们喜爱的大众化蔬菜，在南方广泛种植，北方也大量引种栽培，有关部门常将其作为衡量蔬菜供应情况的主要标志近年来，日本、美国及东南亚和欧洲一些国家也广泛引种，已逐渐成为世界性蔬菜[1]。萝卜（Raphanus sativus L.）为十字花科萝卜属植物，是我国最大的蔬菜作物之一，亦是世界性蔬菜，具有较高的食用价值和医用价值[2]。在我国，十字花科植物是一个遗传类型极其丰富、变异极其广泛的巨大基因库，育种学家们以丰富的种质资源为材料，采用有性杂交的方法创造出了一大批新种质、新品种，并在不结球白菜生产上发挥了重要作用。

近年来，生物技术的融入，对提高杂交育种的目的性和缩短育种周期等方面起到了促进作用，对常规育种是一种改进和提高。随着育种工作的深入，植物种内的遗传资源利用日益枯竭，同时也发现某些优良性状的基因库贫乏，采用种内资源进行常规育种难以取得很大突破，采用远缘杂交技术结合现代生物技术利用与综合现有栽培种、野生种的优良性状，已成为种质创新的一条有效途径，日益受到育种者的重视。在不结球白菜远缘杂交育种方面，未见相关报道。

传统远缘杂交方法为远缘物种二倍体间杂交获得合子胚，再通过人工诱导染色体加倍等方法获得新种质，育种时间延长，且染色体加倍过程中易发生不稳定变异。

发明内容

本发明目的在于针对上述传统远缘杂交育种方法时间长、杂种F₁易发生不稳定变异问题，提供一种不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法，包含以下步骤：

（1）授粉方法：在盛花期,以同源四倍体白菜为母本，同源四倍体萝卜为父本，于开花前一天套硫酸纸袋，次日开始采用重复授粉法进行人工授粉并套袋；

（2）子房预处理并消毒：取授粉后10天的子房，保湿并置于4℃冰箱中处理24h，然后进行消毒；

（3）子房培养：将消毒后的子房接到子房培养培养基中培养；所述的子房培养培养基为：MS+0.5g/L水解酪蛋白+0.8％琼脂，pH为5.8；

（4）幼胚分离及挽救培养：取培养15天后的子房，剥取幼胚，并接入胚挽救培养基，所述的胚挽救培养基为：MS+5%椰汁+0.5g/L水解酪蛋白+0.8％琼脂，pH为5.8；

（5）分化培养：因大多数幼胚不能直接发育成植株，待幼胚长至子叶形胚时，切取子叶，接入分化培养基诱导不定芽分化，所述的分化培养基为：MS+2mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+5%椰汁+0.8％琼脂,pH为5.8；

（6）继代培养：将诱导后的不定芽丛芽切成单个芽接入继代培养基进行继代培养,，所述的继代培养基为：MS+0.2mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+0.8％琼脂,pH为5.8；

（7）生根培养：继代2周后选取生长健壮的外植体，接入生根培养基诱导生根，所述的生根培养基为：1/2MS+0.2mg/LNAA+0.8％琼脂,pH为5.8；

（8）驯化移栽：外植体诱导形成根系后开瓶炼苗48-72h，洗净根部栽入培养土中培养2周，前期遮荫处理，当植株长到4-5片叶后移栽到大田；所述的培养土为蛭石、泥炭土及珍珠岩以1：2：1的体积比混合而成；

（9）形态学鉴定：从F₁出苗到成熟，对其主要形态特征进行观察；

（10）细胞学鉴定：按照郑金双[3]的方法，对F₁进行染色体计数；

（11）SSR分子鉴定：利用SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示的一对SSR引物对F₁进行SSR共显性分子标记鉴定；

（12）杂种F₁育性鉴定：在盛花期,对杂种F₁进行单株套袋自交，统计平均结实率。

其中，所述的人工授粉每天授粉一次，重复三次。

所述的子房消毒是将选取的子房用75％的酒精消毒30s,然后用质量比为0.1％的HgCl₂消毒10min,最后用无菌水冲洗3次待用。

有益效果：

本发明首次通过同源四倍体不结球白菜与同源四倍体萝卜有性杂交育种途径以及离体胚挽救技术，获得远缘杂交新种质，得率达到了4%，与传统二倍体间杂交获得合子胚再进行染色体倍性加倍相比，无需进行染色体加倍操作，能显著缩短育种时间，且杂种F₁能稳定遗传。本发明创制的新种质具有不结球白菜与萝卜遗传物质，具有更广泛的遗传多样性。获得的新种质经过形态学、细胞学和SSR共显性分子标记技术证实均为属间杂种。

附图说明

图1远缘杂种F₁鉴定。(a)花期F₁表型；(b)不结球白菜叶片（左）、萝卜叶片（右）、杂种F₁叶片（中）；(c)不结球白菜角果（上）、萝卜角果（中）、杂种F₁角果（下）；(d)雄蕊、雌蕊，不结球白菜（左）、萝卜（右）、杂种F₁（中）；(e)花，不结球白菜（左）、萝卜（右）、杂种F₁（中）；(f)引物Na14D09SSR共显性，Marker（M）、不结球白菜（P₁）、萝卜（P₂）、杂种F₁（1，2，3，4）(g)杂种F₁染色体计数（2n=4X=38）。标尺：1cm。

图2远缘杂种F₁与亲本表型。同源四倍体不结球白菜（左）、同源四倍体萝卜（右）、杂种F₁（中）。

具体实施方式

实施例不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法，包括：

基本培养基为MS培养基；以下培养基于121℃,1.1Mpa条件下灭菌15分钟。

①子房培养培养基（Ⅰ）：MS+0.5g/L水解酪蛋白+0.8％琼脂，pH为5.8；

②胚挽救培养基（Ⅱ）：MS+5%椰汁+0.5g/L水解酪蛋白+0.8％琼脂，pH为5.8；

③分化培养基（Ⅲ）：MS+2mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+5%椰汁+0.8％琼脂,pH为5.8；

④继代培养基（Ⅳ）：MS+0.2mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+0.8％琼脂,pH为5.8；

⑤生根培养基（Ⅴ）：1/2MS+0.2mg/LNAA+0.8％琼脂,pH为5.8。

（1）授粉方法：在盛花期,以同源四倍体不结球白菜[4]（2n=4X=40）为母本，同源四倍体萝卜[5](2n=4X=36)为父本，于开花前一天套硫酸纸袋，次日开始采用重复授粉法进行人工授粉（每天授粉一次，重复三次）并套袋；

（2）子房预处理及消毒：取授粉后10天的子房，保湿并置于4℃冰箱中处理24h；选取的子房用75％的酒精消毒30s,然后用质量比为0.1％的HgCl₂消毒10min,最后用无菌水冲洗3次待用；

（3）子房培养：将消毒后的子房接到子房培养培养基（Ⅰ）中培养；

（4）幼胚分离及挽救培养：取培养15天后的子房，剥取幼胚，并接入胚挽救培养基（Ⅱ）；

（5）分化培养：因大多数幼胚不能直接发育成植株，待幼胚长至子叶形胚时，切取子叶，接入分化培养基（Ⅲ）诱导不定芽分化；

（6）继代培养：将诱导后的不定芽丛芽切成单个芽接入继代培养基（Ⅳ）进行继代培养；

（7）生根培养：继代2周后选取生长健壮的外植体，接入生根培养基（Ⅴ）诱导生根；

（8）驯化移栽：外植体诱导形成根系后开瓶炼苗48-72h，洗净根部栽入培养土（V（蛭石）：V（泥炭土）：V（珍珠岩）=1：2：1）中培养2周，前期遮荫处理，当植株长到4-5片叶后移栽到大田。

（9）形态学鉴定：从F₁出苗到成熟，对其主要形态特征进行观察并拍照，结果发现：F₁在株型、生长习性、叶柄颜色方面与不结球白菜一致，但叶柄形状、角果形状、叶脉颜色、花瓣颜色方面与萝卜一致（图1a～e）。

（10）细胞学鉴定：按照郑金双[3]的方法，对F₁进行染色体计数（图1g）。经鉴定F₁染色体数为38（2n=20+18），为同源四倍体不结球白菜（2n=4x=40）与同源四倍体萝卜（2n=4x=36）的远缘杂交种。

（11）SSR（simple sequence repeat）分子鉴定：按照单晓政[6]等的方法，利用SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示的一对SSR引物Na14D09对F₁进行SSR共显性分子标记鉴定（图1f）。

经过形态学、细胞学和SSR共显性分子标记技术证实均为属间杂种。

（12）杂种F₁育性鉴定：在盛花期,对杂种F₁进行单株套袋自交，平均结实率为1.2%。

表1 不结球白菜与萝卜远缘杂交子房培养结果。

参考文献：

[1].侯喜林.不结球白菜育种研究新进展.南京农业大学学报，2003，26（4）：111-115.

[2].张蜀宁，张伟，张红梅.同源四倍体萝卜花粉母细胞减数分裂.南京农业大学学报，2009，32(1):27-30.

[3].郑金双，张蜀宁，孙成振，王雅美.不结球白菜根尖体细胞染色体制片及其二倍体和同源四倍体有丝分裂过程观察.植物资源与环境学报，2011,20(4):58-63.

[4].张振超，张蜀宁，张伟，张红亮.四倍体不结球白菜的诱导及染色体倍性鉴定.西北植物学报，2007，27（1）：0028-0032.

[5].张红亮，张蜀宁，张伟，张振超.秋水仙素诱导同源四倍体萝卜的研究.南京农业大学学报，2008，31（3）：47-50.

[6].单晓政，李英，高素燕，马成英，刘同坤，朱玉英，侯喜林.不结球白菜分子遗传图谱的构建及分析.西北植物学报，2009，29（6）：1116-1121。

Claims

1.一种不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法，其特征在于包含以下步骤：

（10）细胞学鉴定：对F₁进行染色体计数；

2.根据权利要求1所述的一种不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法，其特征在于所述的胚挽救培养基为：MS+5%椰汁+0.5g/L水解酪蛋白+0.8％琼脂，pH为5.8。

3.根据权利要求1所述的一种不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法，其特征在于所述的分化培养基为：MS+2mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+5%椰汁+0.8％琼脂,pH为5.8。

4.根据权利要求1所述的一种不结球白菜与萝卜远缘杂交新种质创制方法，其特征在于所述的生根培养基为：1/2MS+0.2mg/LNAA+0.8％琼脂,pH为5.8。