CN109601377A - 一种通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法，旨在解决水松群体数量少，以及生产上通过扦插繁殖导致的遗传多样性低等问题。本发明以浙江省余杭区瓶窑镇水松扦插植株的未成熟球果为起始材料，表面消毒后剥取其胚乳与未成熟胚，通过胚培养技术快速培育水松植株有性后代，短时间内获得数量较多的水松幼苗。本发明的优点是：利用水松带有胚乳的未成熟胚，培养30天后，获得水松有性后代群体，改善水松主要通过扦插繁殖的现状，加快水松幼苗培育速度。该方法可操作性强，简单高效，污染率低，对世界珍稀濒危植物保护以及苗木的快速培育具有重要意义。

Description

一种通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法
技术领域
本发明涉及一种通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法，从而达到珍稀濒危物种保护以及快速繁殖苗木的目的。
背景技术
水松，拉丁学名：Glyptostrobus pensilis；
别名：水莲、水帝松、水杉松、水极、长柏；
科属：柏科落羽杉亚科水松属；
原产地及分布：水松属现仅存水松一种，在第三纪以前广泛分布于北半球，到第四纪冰川过后，水松类植物在欧美灭绝，现仅仅分布于我国和越南。水松生长于纬度13°09′(越南)-37°33′(山东烟台)，经度102°42′(云南昆明)-121°31′(中国台北)，海拔32-1980m的地区。分布于中国广州珠江三角洲和福建中部及闽江下游海拔1000米以下地区。广东东部及西部、福建西部及北部、江西东部、四川东南部、广西及云南东南部也有零星分布。在南京、武汉、庐山、上海、杭州等地为引种栽培。水松作为一种罕见的古生代孑遗树种，由于自然地理因素和人为活动的影响，水松数量日益减少，处于濒危状态。
水松濒危的原因主要有以下几个：生殖生物学障碍、生态因子胁迫、人为干扰和遗传多样性降低。其中，以水松生殖生物学障碍为主。因为水松属雌雄同株的单性花植物，成年后在最初开花的数年内只形成雌花，且花期很短，通常只有2个星期。水松是风媒花，种子萌发条件要求严格，落在水湿之地或干旱的土壤中均不能发芽。水松作为喜湿树种，种子成熟后多掉落于沼泽中，萌芽率极低或没有，且幼苗长期生长在水中，成活率不高。目前我国绝大部分野生水松种群主要是通过营养体扦插繁殖后代。这进一步加剧了种群内部遗传多样性在无性世代之间的下降。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法，包括如下步骤：
(1)采集水松植株上的未成熟球果；
(2)剥取未成熟种子并进行表面灭菌；
(3)用解剖刀切开未成熟种子，剥取带有胚乳的未成熟胚，并接种到培养基上，将其水平放置。20±2℃黑暗条件下培养3d；
(4)暗培养后，在弱光条件下(光照强度为20μmol·m-2·s-1、光照时间为 12h/d)培养，直到胚萌发；
(5)胚萌发后，在正常光照条件下(光照强度为80μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d)培养10d后，将幼苗从胚乳中分离并接种到培养基上进行保存，培养条件为温度20±2℃、光照强度为80μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d。
进一步地，在所述步骤(1)中，所述未成熟球果形态特征为球果呈现绿色。
进一步地，在所述步骤(2)中，所述表面灭菌程序为：将未成熟种子置于流水下冲洗3h，冲洗后在超净工作台上用体积分数为70％乙醇水溶液浸泡并振荡30s，无菌水冲洗3次，每次1min。再用质量分数为0.1％的氯化汞的水溶液浸泡并振荡10min后，用无菌水冲洗5次，每次1min。最后用无菌滤纸吸干种子表面多余的水分。
进一步地，在所述步骤(3)中，所述剥取未成熟胚的方法为左手用无菌镊子固定未成熟种子，右手用无菌解剖刀在距种皮边缘0.5mm，分别进行纵切和横切，用镊子将种皮从未成熟胚及其胚乳上分离。
进一步地，在所述步骤(3)和步骤(5)中，培养基以DCR(Gupta and Durzanmedium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、水解酪蛋白的浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L，培养基的pH为5.8。
进一步地，在所述步骤(4)中，所述胚萌发形态特征为胚根或者子叶从胚乳中伸出。
进一步地，在所述步骤(5)中，所述分离幼苗的方法为用灭菌的解剖刀将胚乳纵向切开后，将幼苗从胚乳中分离。
本发明的优点是：本发明采用的外植体为未成熟胚，利用胚培养技术对其进行培养，克服自然条件下种鳞开裂，种子散落后种子萌发率极低的缺陷，可在短期内快速获得较多的水松后代。该方法可操作性强，简单高效，污染率低，对世界珍稀濒危植物保护与快速繁殖具有重要意义。
附图说明
图1是用于培养的水松胚及胚乳图；
图2是水松未成熟胚培养后萌发图；
图3是萌发幼苗生长图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
材料：本实例以水松未成熟胚及胚乳为培养外植体。
步骤(1)：取材
8月下旬至10月下旬于收集水松未成熟球果，颜色绿色，这种绿色的未成熟果子表面种鳞、苞鳞排列紧密。可放于密封袋中，4℃低温中贮藏备用。
步骤(2)：种子表面灭菌
用镊子分离种鳞和种子，将种子置于流水下冲洗3h，在超净工作台上用70％乙醇处理30s，无菌水冲洗3～5次。再用0.1wt％氯化汞处理10min后，用无菌水冲洗3～5次并用无菌滤纸吸干表面水分。
步骤(3)：未成熟胚分离与接种
将冲洗后的种子置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，左手用无菌镊子固定未成熟种子，右手用无菌解剖刀在距种皮边缘0.5mm，分别进行纵切和横切，用镊子将种皮从未成熟胚及其胚乳上分离(图1)。剥取未成熟胚及其胚乳并接种到培养基上，将其水平放置。培养基以DCR(Gupta and Durzan medium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、水解酪蛋白的浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L，培养基的pH为5.8。
步骤(4)：暗培养与异养期培养
接种后的未成熟胚及其胚乳先于20±2℃黑暗条件下培养3d，再弱光光照条件下培养10天可见种子萌发，所述弱光光照条件为：光照强度为20μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d。
步骤(5)：自养期培养
未成熟胚培养后，萌发率可达95％以上(图2)。然后幼苗从胚乳中分离并接种到培养基上进行自养期培养与保存，培养基以DCR(Gupta and Durzan medium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、水解酪蛋白的浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L，培养基的pH为5.8。培养条件为温度20±2℃、光照强度为80μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d。培养15天后的幼苗如图3所示，由此可见，通过本方法可在短期内获得数量比较多的水松有性后代的无菌幼苗，一方面，可用于濒危植物水松的保育，提高水松的种群数量；另一方面，通过组织培养快速可以大规模培育水松植株用于园林应用。

Claims (7)

1.一种通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)剥取水松植株上的未成熟种子并进行表面灭菌；
(2)用解剖刀切开未成熟种子，剥取带有胚乳的未成熟胚并接种到培养基上，将其水平放置。20±2℃黑暗条件下培养3d；
(3)暗培养后，在弱光条件下(光照强度为20μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d)培养，直到胚萌发；
(4)胚萌发后，在正常光照条件下(光照强度为80μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d)培养10d后，将幼苗从胚乳中分离并接种到培养基上进行保存，培养条件为温度20±2℃、光照强度为80μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d。
2.根据权利要求1所述的通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述未成熟球果形态特征为球果呈现绿色且未开裂。
3.根据权利要求1所述的通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述表面灭菌程序为：将未成熟种子置于流水下冲洗3h，冲洗后在超净工作台上用体积分数为70％乙醇水溶液浸泡并振荡30s，无菌水冲洗3次，每次1min。再用质量分数为0.1％的氯化汞的水溶液浸泡并振荡10min后，用无菌水冲洗5次，每次1min。最后用无菌滤纸吸干种子表面多余的水分。
4.根据权利要求1所述的通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，所述剥取带有胚乳的未成熟胚的方法为左手用无菌镊子固定未成熟种子，右手用无菌解剖刀在距种皮边缘0.5mm，分别进行纵切和横切，用镊子将种皮从未成熟胚及其胚乳上分离。
5.根据权利要求1所述的通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法，其特征在于：在所述步骤(2)和步骤(4)中，培养基以DCR(Gupta and Durzan medium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、水解酪蛋白的浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L，培养基的pH为5.8。
6.根据权利要求1所述的通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，所述胚萌发形态特征为子叶从胚乳中伸出。
7.根据权利要求1所述的通过未成熟胚快速培育水松幼苗的方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，所述分离幼苗的方法为用灭菌的解剖刀将胚乳纵向切开后，将幼苗从胚乳中分离。
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