CN102369879B - 杉木胚性愈伤组织的继代保存方法及其继代培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了胚性愈伤组织的继代保存方法及其继代培养基。该胚性愈伤组织的继代保存方法是用所述继代培养基继代培养胚性愈伤组织。本发明所提供的胚性愈伤组织的继代保存方法及其继代培养基，对杉木胚性愈伤组织的培养效果好，能较长时间保持杉木愈伤组织的胚性能力，为后续的杉木体细胞胚胎发生和器官发生等研究带来极大的方便，具有较大的实际应用价值。

Description

杉木胚性愈伤组织的继代保存方法及其继代培养基
技术领域
本发明涉及胚性愈伤组织的继代保存方法及其继代培养基，特别涉及杉木胚性愈伤组织的继代保存方法及其继代培养基。
背景技术
杉木是常绿针叶树种之一，是我国特有的速生商品材树种。杉木生长迅速，主茎通直圆满，材质轻而韧，纹理美观，加工容易。目前，社会上对杉木优良种苗的需求极为迫切，而传统方法靠杉木种子园提供种子，易受到自然条件的限制，出现种子大小年的现象而导致良种种子产量不稳定，加上种子本身存在播种品质不稳定的问题，这些都在一定程度上影响着杉木速生丰产林的发展。因此，有必要探索杉木优良种质资源的无性快速繁殖技术。
苗木无性快速繁殖技术主要有三种：一是器官发生；二是丛生芽增殖；三是体细胞胚胎发生。其中体细胞胚是指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性胚状结构。通过胚状体再生植株的优点是：在一个培养物上所能分生的胚状体数往往比不定芽数多，因此成苗率高。因体细胞胚具有双极性、繁殖快、遗传专一的特点，体细胞胚发生成为木本植物尤其是裸子植物快繁的一种非常有效的途径。由于体细胞胚发生为单细胞起源，不会出现嵌合问题，胚性组织高密度、高质量，因此可一次获得大量植株。目前体细胞胚发生不仅是人工种子生产的重要手段，而且也是转基因植株稳定再生的主要方式。
体细胞胚胎发生，即从体细胞转变为胚性细胞，其过程变化复杂，是多种因素共同作用的结果，这些因素包括：一是外植体的选择及处理；二是基本培养基的种类和成分；三是植物生长调节物质；四是附加成分；五是培养条件。
以前虽然有很多杉木组织培养的相关报道，但主要是通过以芽繁牙的快繁方式，容易产生侧芽生长位置效应，导致苗木偏斜生长的位置效应问题，严重打击了林农使用优良无性系组培造林的积极性。目前对于杉属植物的胚性愈伤组织的发生、稳定继代和体细胞胚的成熟、萌发以及植株的再生等问题仍然存在各种难题。其中，如何保持杉木的胚性愈伤组织进行较长时间的继代而不丢失其胚性是其中最重要问题之一。
松杉类植物胚性愈伤组织由胚性胚柄团构成，选择合适的培养基是其正常继代保存的关键。在继代阶段，培养物中有一系列大小不同的胚性胚柄团，只有保持适宜的培养条件，这些胚性胚柄团才能不断地无序分裂，细胞系得以正常继代而保存下来。一些细胞系在长期培养过程中会失去体细胞胚胎发生能力。有体细胞胚胎发生能力的培养物是光滑的，其它培养物表面会出现绳索状生长物。杉木胚性愈伤组织对培养基的各种成分和理化条件非常敏感，迄今为止还没有在常温下有效继代方法及其较专一的培养基，调整继代保存的培养基配方，改进继代方法，显然对于体细胞胚胎发生研究，具有重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于胚性愈伤组织继代的培养基。
本发明所提供的用于胚性愈伤组织继代的培养基由以下成分组成：
大量元素：KNO3、Ca(NO3)2·4H2O、NH4NO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O和MgSO4·7H2O；
微量元素：MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O；
铁盐：FeSO4·7H2O和Na2EDTA·2H2O；
有机成分：盐酸硫胺素、烟酸、盐酸吡哆醇、甘氨酸、肌醇、酶水解酪蛋白、蔗糖和谷氨酰胺；
激素：2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤；
支持物：琼脂或植物凝胶；
水；
以上成分在所述培养基中浓度分别为：
大量元素：KNO3 0.34g/L、Ca(NO3)2·4H2O 0.556g/L、NH4NO3 0.4g/L、KH2PO40.17g/L、CaCl2·2H2O 0.085g/L和MgSO4·7H2O 0.37g/L；
微量元素：MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L和CoCl2·6H2O 0.025mg/L；
铁盐：FeSO4·7H2O 15mg/L-45mg/L或15mg/L或27.8mg/L或45mg/L和Na2EDTA·2H2O 20mg/L-60mg/L或20mg/L或37.3mg/L或60mg/L；
有机成分：盐酸硫胺素0.25mg/L-1mg/L或0.25mg/L或0.5mg/L或1mg/L、烟酸0.25mg/L-1mg/L或0.25mg/L或0.5mg/L或1mg/L、盐酸吡哆醇0.25mg/L-1mg/L或0.25mg/L或0.5mg/L或1mg/L、甘氨酸0.1mg/L-0.4mg/L或0.1mg/L或0.2mg/L或0.4mg/L、肌醇500mg/L-1,500mg/L或500mg/L或1,000mg/L或1,500mg/L、酶水解酪蛋白250mg/L-750mg/L或250mg/L或500mg/L或750mg/L、蔗糖20,000mg/L-40,000mg/L或20,000mg/L或30,000mg/L或40,000mg/L和谷氨酰胺300mg/L-600mg/L或300mg/L或450mg/L或600mg/L；
激素：2，4-二氯苯氧乙酸0.25mg/L-1.5mg/L或0.25mg/L或0.5mg/L或1.5mg/L、6-苄基腺嘌呤0.1mg/L-0.4mg/L或0.1mg/L或0.2mg/L或0.4mg/L和6-糠氨基嘌呤0.1mg/L-0.4mg/L或0.1mg/L或0.2mg/L或0.4mg/L；
支持物：琼脂7g/L或植物凝胶2.5g/L。
所述继代培养基的组成中水为双蒸蒸馏水或超纯水或去离子水。
所述继代培养基的pH值为5.0-6.0，具体为5.0、5.8或6.0。
所述胚性愈伤组织为杉科植物的胚性愈伤组织；所述杉科植物为杉木属植物；所述杉木属植物为杉木。
本发明的另一个目的是提供一种胚性愈伤组织的继代保存方法，是用所述继代培养基继代培养胚性愈伤组织。
所述继代培养的条件为：黑暗和温度为21℃-23℃，所述温度具体为21℃、22℃或23℃。
所述方法中，待所述愈伤组织生长至直径为2cm-4cm或2cm或3cm或4cm时，再进行下一次继代。
所述方法中，所述继代培养基的支持物为琼脂时，继代间隔时间为15天-21天，具体为15天、18天或21天；所述继代培养基的支持物为植物凝胶时，继代间隔时间为10天-14天，具体为10天、12天或14天。
所述方法中，所述胚性愈伤组织为杉科植物的胚性愈伤组织；所述杉科植物为杉木属植物；所述杉木属植物为杉木。
所述杉木胚性愈伤组织按照包括如下步骤的方法制备得到：
(1)将胚发育至子叶前合子胚时期的未成熟杉木球果，在4℃冷藏30天；
(2)从步骤(1)冷藏后的杉木球果中取出种子，将种子消毒后，剥出幼胚，将剥出的幼胚作为外植体；
(3)将步骤(2)得到的外植体转入诱导培养基，置于黑暗和温度为25℃的条件下，诱导培养30天，得到杉木胚性愈伤组织；
所述诱导培养基由以下成分组成：
大量元素：KNO3、CaNO3·4H2O、NH4NO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O和MgSO4；
微量元素：HBO3、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、KI、CuSO4·5H2O和CoCl2；
铁盐：FeSO4和Na2EDTA；
有机成分：盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白和蔗糖；
激素：2，4-二氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤；
支持物：琼脂；
水：超纯水；
以上成分在所述诱导培养基中的浓度分别为：
大量元素：KNO3 340mg/L，CaNO3·4H2O 556mg/L，NH4NO3 400mg/L，KH2PO4170mg/L，CaCl2·2H2O 85mg/L和MgSO4 370mg/L；
微量元素：HBO3 6.2mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，MnSO4·H2O 22.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，KI 0.83mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L和CoCl2 0.025mg/L；
铁盐：FeSO4 5.57g/L和Na2EDTA 7.45g/L；
有机成分：盐酸硫胺素0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、谷氨酰胺400mg/L、酶水解酪蛋白500mg/L和蔗糖30,000mg/L；
激素：2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L和6-苄基腺嘌呤0.5mg/L；
支持物：琼脂7g/L；
所述诱导培养基的pH值为5.8。
本发明所提供的杉木胚性愈伤组织的继代保存方法及其继代培养基，对杉木胚性愈伤组织的培养效果好，能较长时间保持杉木愈伤组织的胚性能力，为后续的杉木体细胞胚胎发生和器官发生等研究带来极大的方便，具有较大的实际应用价值。
附图说明
图1为用所述继代培养基继代保存2年的胚性愈伤组织。
其中，A为用所述继代培养基(以琼脂为支持物)继代保存2年的胚性愈伤组织；B为用所述继代培养基(以植物凝胶为支持物)继代保存2年的胚性愈伤组织。
图2为用对照培养基(即MS培养基)继代保存的生长不良的胚性愈伤组织。
图3为在40倍的光学显微镜下观察到的继代培养基继代保存2年的胚性愈伤组织的胚性细胞发育状况。
其中，A为用所述继代培养基(以琼脂为支持物)继代保存2年的胚性愈伤组织的胚性细胞发育状况；B为用所述继代培养基(以植物凝胶为支持物)继代保存2年的胚性细胞发育状况。
图4为在40倍的光学显微镜下观察到的对照培养基(即MS培养基)继代保存的胚性愈伤组织的胚性细胞发育状况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的百分比浓度如无特殊说明，均为质量百分比浓度。
实施例1、杉木胚性愈伤组织的继代保存
方法I
一、诱导杉木胚性愈伤组织
将胚发育至子叶前合子胚时期的未成熟杉木球果(购自福建省三明市清流县福新苗圃)采摘后，在4℃低温下冷藏30天，然后从球果中取出种子，将种子用70％的酒精浸润1min，无菌水冲洗3次后，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌5min，无菌水冲洗三次后，剥出的幼胚(子叶前合子胚)作为外植体，将外植体转入装有诱导培养基的三角瓶(40ml培养基)中，每个三角瓶中外植体个数为6个，置于黑暗的环境中，温度为25℃，诱导培养30天，得到杉木胚性愈伤组织。
上述诱导培养基由以下成分组成：
大量元素：KNO3、CaNO3·4H2O、NH4NO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O和MgSO4；
微量元素：HBO3、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、KI、CuSO4·5H2O和CoCl2；
铁盐：FeSO4和Na2EDTA；
有机成分：盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白(sigma，C0626)和蔗糖；
激素：2，4-二氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤；
支持物：琼脂；
水：超纯水；
以上成分在所述诱导培养基中的浓度分别为：
大量元素：KNO3 340mg/L，CaNO3·4H2O 556mg/L，NH4NO3 400mg/L，KH2PO4170mg/L，CaCl2·2H2O 85mg/L和MgSO4370mg/L；
微量元素：HBO3 6.2mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，MnSO4·H2O 22.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，KI 0.83mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L和CoCl2 0.025mg/L；
铁盐：FeSO4 5.57g/L和Na2EDTA 7.45g/L；
有机成分：盐酸硫胺素0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、谷氨酰胺400mg/L、酶水解酪蛋白500mg/L和蔗糖30,000mg/L；
激素：2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L和6-苄基腺嘌呤0.5mg/L；
支持物：琼脂7g/L；
所述诱导培养基的pH值为5.8。
二、杉木胚性愈伤组织的继代保存
1、配制继代培养基
10×大量元素的配制方法为：将3.4g KNO3、5.56g Ca(NO3)2·4H2O、4g NH4NO3、1.7g KH2PO4、0.85g CaCl2·2H2O、3.7g MgSO4·7H2O混合，用双蒸水溶解，并定容至1升，室温保存；
100×微量元素的配制方法为：将2.23g MnSO4·4H2O、0.86g ZnSO4·7H2O、0.62gH3BO3、83mg KI、25mg Na2MoO4·2H2O、2.5mg CuSO4·5H2O、2.5mg CoCl2·6H2O混合，用水溶解，并定容至1升，室温保存；
200×铁盐的配制方法为：将3.0g FeSO4·7H2O、4.0g Na2EDTA·2H2O分别用200mL水溶解，再混合并定容至1升，室温保存；
有机组分配制方法：将0.025g盐酸硫胺素(VB1)、0.025g烟酸(VB3)、0.025g盐酸吡哆醇(VB6)、0.01g甘氨酸混合，用水溶解，并定容至100毫升，配置成1000×浓度的混合液，记作有机组分溶液I，0.22μm过滤除菌，-20℃保存，使用前从-20℃取出，室温融化并混匀后使用；称取15g谷氨酰胺，用水溶解，并定容至1升，配置成50×的浓度，记作有机组分溶液II，0.22μm过滤除菌后，-20℃保存，使用前从-20℃取出，室温融化并混匀后使用；
激素溶液配制方法：分别将0.25g 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.1g 6-苄基腺嘌呤(6-BA)和0.1g 6-糠氨基嘌呤(KT)用水溶解，并定容至100毫升，得到10,000×激素溶液，4℃保存；
将100mL 10×大量元素、10mL 100×微量元素、5mL 200×铁盐、100μL激素溶液(2，4-D，6-BA和KT)、0.5g肌醇、0.25g酶水解酪蛋白，20g蔗糖混匀，用水定容至0.98L，用1M KOH或1M HCl调pH至5.0，加入琼脂至7g/L或植物凝胶至2.5g/L，然后在121℃下，高压灭菌20分钟；等培养基冷却至50℃左右，在无菌条件下加入1mL 1000×有机组分溶液I和20mL 50×有机组分溶液II，充分混匀，得到继代培养基。倒入三角瓶或培养皿中备用。
配制培养基的水为双蒸蒸馏水；
所配制的继代培养基由以下成分组成：
大量元素：KNO3、Ca(NO3)2·4H2O、NH4NO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O；
微量元素：MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O；
铁盐：FeSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O；
有机成分：盐酸硫胺素(VB1)、烟酸(VB3)、盐酸吡哆醇(VB6)、甘氨酸、肌醇、酶水解酪蛋白、蔗糖和谷氨酰胺；
激素：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)和6-糠氨基嘌呤(KT)；
支持物：琼脂或植物凝胶；
水：双蒸蒸馏水；
以上成分在所述继代培养基中浓度分别为：
大量元素：KNO3 0.34g/L、Ca(NO3)2·4H2O 0.556g/L、NH4NO3 0.4g/L、KH2PO40.17g/L、CaCl2·2H2O 0.085g/L和MgSO4·7H2O 0.37g/L；
微量元素：MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L和CoCl2·6H2O 0.025mg/L；
铁盐：FeSO4·7H2O 15mg/L和Na2EDTA·2H2O 20mg/L；
有机成分：盐酸硫胺素0.25mg/L、烟酸0.25mg/L、盐酸吡哆醇0.25mg/L、甘氨酸0.1mg/L、肌醇500mg/L、酶水解酪蛋白250mg/L、蔗糖20,000mg/L和谷氨酰胺300mg/L；
激素：2，4-二氯苯氧乙酸0.25mg/L、6-苄基腺嘌呤0.1mg/L和6-糠氨基嘌呤0.1mg/L；
支持物：琼脂7g/L或植物凝胶2.5g/L。
同时，设计对照培养基(即MS培养基)：
大量元素：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L和MgSO4·7H2O 0.37g/L；
微量元素：MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、K10.83mg/L、Na2MoO4·2H20 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L和CoCl2·6H2O 0.025mg/L；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8mg/L和Na2EDTA·2H2O 37.3mg/L；
有机成分：盐酸硫胺素0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇100mg/L、酶水解酪蛋白500mg/L和蔗糖30,000mg/L；
激素：2，4二氯苯氧乙酸0.5mg/L、6苄基腺嘌呤0.2mg/L和6-糠氨基嘌呤0.2mg/L；
支持物：琼脂7g/L。
2、杉木胚性愈伤组织的继代保存
将盛有上述步骤一得到的装有杉木胚性愈伤组织的三角瓶用70％的乙醇消毒表面，然后放入超净工作台，用无菌的镊子挑取外周颜色较白的组织块转移到上述配制的继代培养基上，按每块分成2-3块的标准，丢弃中间部分颜色为浅黄的愈伤组织，每瓶放置6-8组织块。将转移后的杉木胚性愈伤组织置于黑暗的环境中、温度为21℃进行培养，待愈伤组织生长至直径为2cm时再进行下一次继代，若所述继代培养基的支持物为琼脂时，继代间隔时间为15天；若所述继代培养基的支持物为植物凝胶时，继代间隔时间为10天。按照此继代保存的方法，保存杉木胚性愈伤组织2年。
从培养结果可见：用所述继代培养基(以琼脂为支持物)继代保存2年的胚性愈伤组织生长良好，表面光滑(图1中A)，在40倍的光学显微镜下观察，大部分细胞壁和细胞质结合比较紧密，细胞质充满整个细胞，细胞内细胞器的结构完整，易于观察到胚性细胞，其胚头细胞和胚柄细胞分别为圆形和长形，区别明显(图3中的A)，具有体细胞胚胎发生能力；用所述继代培养基(以植物凝胶为支持物)继代保存2年的胚性愈伤组织生长良好，表面光滑(图1中B)，在40倍的光学显微镜下观察，细胞壁和细胞质结合比较紧密，细胞质充满整个细胞，细胞内细胞器的结构比较完整清晰，胚头细胞和胚柄细胞分别为圆形和长形，区别明显(图3中的B)，具有体细胞胚胎发生能力；用对照培养基(即MS培养基)继代保存90天的胚性愈伤组织表面出现绳索状生长物(图2)，在40倍的光学显微镜下观察，部分细胞发生质壁分离，细胞质固缩，观察不到特征明显的胚性细胞(图4)，失去体细胞胚胎发生能力。
方法II
一、诱导杉木胚性愈伤组织
除以下1)和2)外，其他方法均与方法I相同：
1)将杉木种子放入0.1％的升汞溶液中灭菌7min；
2)每个三角瓶中外植体个数为7个。
二、杉木胚性愈伤组织的继代保存
1、配制继代培养基
所配制的继代培养基由以下成分组成：
大量元素：与方法I中相同；
微量元素：与方法I中相同；
铁盐：与方法I中相同；
有机成分：与方法I中相同；
激素：与方法I中相同；
支持物：与方法I中相同；
水：超纯水；
以上成分在所述继代培养基中浓度分别为：
大量元素：与方法I中相同；
微量元素：与方法I中相同；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8mg/L和Na2EDTA·2H2O 37.3mg/L；
有机成分：盐酸硫胺素0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸0.2mg/L、肌醇1,000mg/L、酶水解酪蛋白500mg/L、蔗糖30,000mg/L和谷氨酰胺450mg/L；
激素：2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤0.2mg/L和6-糠氨基嘌呤0.2m/L；
支持物：植物凝胶2.5g/L；
所述继代培养基的PH值为5.8。
对照培养基(即MS培养基)也与方法I中相同。
2、杉木胚性愈伤组织的继代保存
将盛有上述步骤一得到的装有杉木胚性愈伤组织的三角瓶用70％的乙醇消毒表面，然后放入超净工作台，用无菌的镊子挑取外周颜色较白的组织块转移到上述配制的继代培养基上，按每块分成2-3块的标准，丢弃中间部分颜色为浅黄的愈伤组织，每瓶放置6-8组织块。将转移后的杉木胚性愈伤组织置于黑暗的环境中、温度为22℃进行培养，待愈伤组织生长至直径为3cm时再进行下一次继代，若所述继代培养基的支持物为琼脂时，继代间隔时间为18天；若所述继代培养基的支持物为植物凝胶时，继代间隔时间为12天。按照此继代保存的方法，保存杉木胚性愈伤组织2年。
培养结果与与方法I无显著差异。
方法III
一、诱导杉木胚性愈伤组织
除以下1)和2)外，其他方法均与方法I相同：
1)将杉木种子放入0.1％的升汞溶液中灭菌10min；
2)每个三角瓶中外植体个数为8个。
二、杉木胚性愈伤组织的继代保存
1、配制继代培养基
所配制的继代培养基由以下成分组成：
大量元素：与方法I中相同；
微量元素：与方法I中相同；
铁盐：与方法I中相同；
有机成分：与方法I中相同；
激素：与方法I中相同；
支持物：与方法I中相同；
水：去离子水；
以上成分在所述继代培养基中浓度分别为：
大量元素：与方法I中相同；
微量元素：与方法I中相同；
铁盐：FeSO4·7H2O 45mg/L和Na2EDTA·2H2O 60mg/L；
有机成分：盐酸硫胺素1mg/L、烟酸1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、甘氨酸0.4mg/L、肌醇1,500mg/L、酶水解酪蛋白750mg/L、蔗糖40,000mg/L和谷氨酰胺600mg/L；
激素：2，4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、6-苄基腺嘌呤0.4mg/L和6-糠氨基嘌呤0.4mg/L；
支持物：琼脂7g/L；
所述继代培养基的PH值为6.0。
对照培养基(即MS培养基)也与方法I中相同。
2、杉木胚性愈伤组织的继代保存
将盛有上述步骤一得到的装有杉木胚性愈伤组织的三角瓶用70％的乙醇消毒表面，然后放入超净工作台，用无菌的镊子挑取外周颜色较白的组织块转移到上述配制的继代培养基上，按每块分成2-3块的标准，丢弃中间部分颜色为浅黄的愈伤组织，每瓶放置6-8组织块。将转移后的杉木胚性愈伤组织置于黑暗的环境中、温度为23℃进行培养，待愈伤组织生长至直径为4cm时再进行下一次继代，若所述继代培养基的支持物为琼脂时，继代间隔时间为21天；若所述继代培养基的支持物为植物凝胶时，继代间隔时间为14天。按照此继代保存的方法，保存杉木胚性愈伤组织2年。
培养结果与与方法I无显著差异。

Claims (1)

1.一种用于胚性愈伤组织继代的培养基，由以下成分组成：
大量元素：KNO3、Ca(NO3)2·4H2O、NH4NO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O和MgSO4·7H2O；
微量元素：MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O；
铁盐：FeSO4·7H2O和Na2EDTA·2H2O；
有机成分：盐酸硫胺素、烟酸、盐酸吡哆醇、甘氨酸、肌醇、酶水解酪蛋白、蔗糖和谷氨酰胺；
激素：2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤；
支持物：琼脂或植物凝胶；
水；
以上成分在所述培养基中浓度分别为：
大量元素：KNO3 0.34g/L、Ca(NO3)2·4H2O 0.556g/L、NH4NO3 0.4g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.085g/L和MgSO4·7H2O 0.37g/L；
微量元素：MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L和CoCl2·6H2O 0.025mg/L；
铁盐：FeSO4·7H2O 15mg/L-45mg/L和Na2EDTA·2H2O 20mg/L -60mg/L；
有机成分：盐酸硫胺素0.25mg/L-1mg/L、烟酸0.25mg/L-1mg/L、盐酸吡哆醇0.25mg/L-1mg/L、甘氨酸0.1mg/L-0.4mg/L、肌醇500mg/L-1,500mg/L、酶水解酪蛋白250mg/L -750mg/L、蔗糖20,000 mg/L -40,000 mg/L和谷氨酰胺300mg/L -600mg/L；
激素：2,4-二氯苯氧乙酸0.25mg/L-1.5mg/L、6-苄基腺嘌呤0.1mg/L -0.4mg/L和6-糠氨基嘌呤0.1 mg/L-0.4mg/L；
支持物：琼脂 7g/L或植物凝胶 2.5g/L；
所述培养基的pH值为5.0-6.0；
所述胚性愈伤组织为杉木的胚性愈伤组织。
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