CN100577796C - 一种福建柏体细胞胚胎发生和植株再生技术 - Google Patents

Abstract

一种福建柏体细胞胚胎发生和克隆植株再生技术，其特征是采用未成熟合子胚诱导出胚性胚柄细胞团，经过维持、增殖、预成熟和成熟阶段诱导获得体细胞胚，再经萌发培养实现植株再生，其各阶段使用的基本培养基分别为DCR基本培养基和大量元素减半的改良DCR培养基。采用本发明所提供的方法，可以获得大量遗传基础一致的无性系再生植株，为珍稀遗传资源的保存和福建柏苗木的大量生产提供了一种周期短、繁殖效率高、成本低廉的新技术。

Description

一种福建柏体细胞胚胎发生和植株再生技术

一、技术领域

本发明属林业中的通过组织培养的植物再生技术领域，具体涉及一种福建柏体细胞胚胎发生和植株再生技术。

二、背景技术

福建柏(Fokienia hodginsii(Dunn)Henry et Thomas)，别名杜杉、杜树、建柏、滇柏等，在分类上属于裸子植物门(Gymnospermae)柏科(Cupressacaea)福建柏属(Fokienia Henry et Thomus)。它是福建柏属唯一植物，主产于我国中南、华南至西南，越南和老挝也有分布，是我国第一批二级重点保护的珍稀树种之一。

福建柏为常绿乔木，树高可达20m，胸径可达80cm，树冠阔圆锥形，树皮红褐色，近平滑，为薄片状脱落，枝展开，生针叶的小枝扁平，排成一平面，鳞叶交叉对生，有二型；侧叶对折呈长圆形，长3～9mm，顶端钝或锐尖，稍内弯或直；中叶三角形或菱状卵形，常较侧叶稍短，但近等长，顶端稍凸，上面中叶深绿色，下面中叶的中脉隆起，两侧具凹陷的白色气孔带。球花单性，雌雄同株，单生于枝顶，雄球花近球形，直径1.7-2.5cm，成熟时褐色，种麟6-8对，木质盾形，顶部多角形，中央有小尖头，发育的种麟有2个种子，种子卵形，长约4mm，顶端尖，具3-4棱，上部有大小不等的薄翅。

福建柏自然分布于我国南亚热带的北部和中亚热带中南部中山丘陵地带，主产地有福建、江西、浙江、广东、广西、云南、贵州、四川、和湖南等省，越南和老挝也有分布。整体分布区域呈东西走向长方形窄条状；垂直分布一般在海拔150～1200m之间，多数分布于海拔600～1000m的山地丘陵中。截至目前，福建柏虽然分布比较广，但其天然林多已被毁严重，现存天然种群个体数量少，普遍零星散生于毛竹、杉木和常绿阔叶林中，少有纯林，稀有零星大树分布，仅边远地带存有星散状的群体，且群体株数多在20株以下，少则2-5株。。在其天然分布区域，福建柏多与其他树种形成混交林，混交树种随海拔和地域而有规律地变化，越往西北，混交树种中阔叶树种越少，针叶树种越多，阔叶树中落叶成分越多，林分结构越简单，最后趋向散生、单株。研究同时表明，现存福建柏天然林为明显的异龄林群体，生长参差不齐。

研究表明，福建柏对林地条件要求没有杉木高，生长速度一般也不比同等立地条件下杉木慢，造林和管理成本也比杉木低，而抗病虫害性能却比杉木强，因此在南方各省提出多树种造林应用中，福建柏成为了替代杉木等树种的新兴的、较有发展前途的优良树种之一。截至目前，福建柏人工林的栽培史已有50年之久，但其总体面积仍不大，其中绝大部分(70％)分布在福建省，而福建省的福建柏人工林约有80％分布在闽东南一带，如福州、永泰、南平、闽清、闽侯、龙岩、漳平和永安等市县。对福建柏人工林组成研究表明，目前发展的福建柏人工林多以混交林为主，而且福建柏与其他树种混交后都起到比较好的作用。

研究表明，福建柏木材属于轻木材，吸水性能良好，木材力学性能较好，物理力学性质和工艺性质优于同龄杉木木材；福建柏木材化学成分测定实验表明，福建柏作为造纸纤维原料使用时比杉木好，比马尾松差；同时，其木材可溶物含量高。除了用材以外，福建柏的提取物也可充分利用，尤其是福建柏香精油具有特异香味，它含有42个组分，其中33种化合物目前已经得到鉴定，主要成分为α-蒎烯、柠檬烯和石竹烯氧化物。

在开展分布研究、人工林栽培及营林技术研究、木材性质及利用研究同时，研究者还对其抗寒性方面进行了研究，初步解释了福建柏适应不利气温的生理机制调节反应，并试图寻求评估耐寒种源的途径，为福建柏北移引种提供了理论依据。

从以上有关针对福建柏的研究资料可以看出，作为我国第一批二级重点保护树种之一，福建柏用途非常广泛。其树形优美，树干通直，生长快，适应性强，良好的庭园观赏树种和行道绿化树；木材心材黄褐色，材质轻软，纹理直，结构细，加工易，切面光滑，胶粘性良好，耐腐性好，是建筑、装饰、雕刻的优良用材；栽培管理较容易，病虫害较少，适合南方用材林的大面积推广栽培；同时它还是提取香精油的重要原材料。然而，由于人为破坏严重，目前天然资源已被毁殆尽，人工林面积也不大。近年来，福建柏作为珍贵建筑材树种和抗逆性强的造林树种已越来越引起人们的重视，尤其在南方各省(区)，福建柏已成为杉木二代更新不可多得的好树种，其推广前景广阔。基于此，研究者们从20世纪70年代起就陆续开展了优树选择等良种繁育研究。然而，受当时条件选择，优树选择和种子园建设等方面的工作都未能达到预期效果。直至90年代，“福建柏珍贵建材树种良种选育及培育技术研究”和“福建柏良种选育及栽培技术”先后被列为国家“九五”和“十五”林业科技攻关子专题，福建柏良种繁育技术才得以重新开展。

截至目前，有关福建柏良种繁育方面的研究报道较少，而且少数几篇论文都是由关于福建柏攻关课题组成员所写的关于种源苗期实验的阶段成果。此外，由于福建柏种子大小年十分明显，四年中才能有一个结实大年；同时，福建柏种子的发芽率本来就不高，发芽能力的保存期又短，种子贮藏后很快丧失生命力，良种繁育和种苗生产成为福建柏造林良种供应的制约瓶颈。

植物组织培养技术是指在无菌环境下，把植物体的各种结构(根尖、茎段、茎尖、幼叶、幼胚、花药等)作为外植体接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件(温度、湿度、光照等)下进行离体培养的技术与方法。

自1902年德国植物学家Haberlandt在细胞学说的基础上大胆提出植物细胞全能性以来，植物组织培养技术已经取得了巨大的成功。目前，植物组织培养技术不仅是植物生物技术中应用最广、最具现实意义的领域，而且是农业高新技术中最重要、最活跃的领域之一。

与传统的林木繁殖手段相比，林木组织培养技术具有繁殖周期短、繁殖数量大、受天然环境影响小、适合大规模生产等优点。我国植物组织培养研究起步较早，到上世纪70年代以后已在一些领域中处于国际先进水平。近20年来，植物组织培养技术有了极大的进展，其中木本植物的组织培养也取得了巨大的成就，如花药培养、茎尖与嫩叶培养、幼胚培养、原生质体培养、体细胞杂交、突变体筛选、脱毒培养、人工种子等方面进展十分迅速。

在木本植物中，针叶树以树形高大、通直、材质优良等特征著称，它们不仅是主要的实木用材造林树种，而且也是优良的造纸用材树种。近几年的研究发现，针叶树中有很多树种还具有净化空气、保护环境的作用，因此针叶树良种选育和繁育越来越引起人们的重视。然而由于针叶树生长周期长，再生难度大，研究进展缓慢。通过组织培养技术快速繁殖针叶树，不仅是植树造林所需大量苗木的一个重要生产途径，也是生产优良针叶树种和优良无性系的捷径，同时还为植物基因工程技术在针叶树遗传改良的应用提供了前提。因此，针叶树的组织培养研究受到科研者的高度重视，现已成为许多发达国家和发展中国家林木生物技术领域的研究热点之一。

针叶树体细胞无性系的成功建立是加速其品种改良和良种繁育的基础，对无性系林业的发展、园林绿化和环境保护等方面也有着十分重要的作用。自从1975年Sommer从长叶松成熟合子胚的离体培养中经器官发生成功获得再生植株以来，针叶树的离体培养技术已经取得了巨大进展。但从目前的情况来看，通过组织培养技术实现针叶树植株的再生仍然是植物组织培养中难度较大的一个领域。人们通常将针叶树的组织培养方式分为体细胞胚胎发生和器官发生两种方式。这两种方式都是以细胞全能性和细胞分化为基础，诱导细胞进一步增殖、分化形成组织和器官，最终形成完整植株。

尽管针叶树通过体细胞胚胎发生实现植株再生的过程比较复杂，不同树种间体细胞胚植株再生频率差异很大，且同一树种内不同基因型间的胚胎发生能力也存在很大差异，但培养程序和发育过程基本相似，都要经过4个共同的步骤，即：胚性胚柄细胞团的诱导(induction of ESM)；胚性胚柄细胞团的维持和增殖(maintenance and proliferation of ESM)；体细胞胚的成熟(maturation of somaticembryo)；体细胞胚的萌发和植株再生(germination and conversion of somaticembryo)。

胚性胚柄细胞团诱导的机制主要来源于植物细胞的全能性。但在实验过程中，不同外植体在不同培养条件下所产生的愈伤在外观状态、生长状况、细胞形态和再生能力等各方面存在较大差别。从大量研究报道来看，在木本植物范围中，阔叶树种的幼嫩和成熟材料均能诱导产生体细胞胚，而在针叶树种中，从成熟外植体成功诱导体细胞胚的报道较少，大多以不同发育阶段合子胚为外植体进行体细胞胚的诱导。研究者认为，在以合子胚为起始材料进行体细胞胚诱导的过程中，通过提供人工培养条件来阻止合子胚的既定发育程序，使其停留在胚性胚柄细胞的分裂和增殖阶段，在成功实现人工增殖的前提下促进胚性胚柄细胞向成熟胚胎的方向发育。

研究胚性胚柄细胞的形成及其随后的形态发生过程的首要前提是诱导出稳定的、具有形态发生能力的胚性胚柄细胞团。在针叶树中，影响胚性胚柄细胞团诱导的重要因素包括：外植体年龄、生理状态及基因型；添加植物生长物质的种类和浓度、基本培养基的种类及具体成分、碳源种类及浓度、有机附加物的种类和含量以及培养条件等。

基本培养基是影响胚性胚柄细胞团的诱导及其随后形态发生能力的主要因素之一。在针叶树的组织培养中，目前还没有建立起一种像在被子植物组织培养中广泛采用的MS一样的通用基本培养基。在许多研究中，MS培养基被证明不适合于松柏类植物的组织培养。因此，研究者纷纷对MS进行改良，同时还设计了一些新的基本培养基，其中使用频率较高的有DCR、LP、GD、BMS、LM、MNCI及SH等。不同基本培养基的区别主要存在在于各大量元素浓度及使用时所采用的倍数上。与MS基本培养基相比，它们最大的特点在于大量元素浓度较MS培养基中的更低；其次，几种基本培养基中NH₄NO₃的含量均较MS中要低，这其中起着重要作用的主要是NO₃ ^-的含量。大量研究证明，LP培养基是诱导云杉属树种体细胞胚胎发生的最佳培养基。在萨哈林云杉和鱼鳞松中，将LP培养基的浓度降至1/2效果更佳。而北美云杉和红云杉体细胞胚诱导的最适培养基是1/2LM。

在基本培养基成分中，氮源是影响体细胞胚胎发生的重要因素，特别是还原态氮，如NH₄NO₃的含量直接影响体细胞胚胎发生。Tremblay的研究发现，黑云杉和红云杉体细胞胚胎发生所需的最适NH₄NO₃浓度分别是272～800mg/L和272～1200mg/L。LP培养基中NH₄NO₃的浓度为1200mg/L，而在MS培养基中却高达1650mg/L。因此，云杉属树种的体细胞胚的诱导常用LP或1/2LP培养基，而很少用MS培养基，其中NH₄NO₃浓度过高可能是主要原因。

截止目前，世界各地已经成功地从50多种针叶树上诱导出了体细胞胚或体细胞胚的再生植株，从近80种针叶树上通过器官发生获得了幼芽或再生植株。

Laine和David以含有合子胚的胚乳或从胚乳剥离的合子胚为外植体，成功实现加勒比松的体细胞胚胎发生，并获得完整的植株，但诱导率极低，胚性培养物在LPG、LPB和LPA培养基的诱导率分别仅为5％、3％和2％，完全不能实现优良品种苗木的批量生产。Berlyn从次生叶诱导体细胞胚胎发生，诱导出两种愈伤组织，即白色致密型和白色半透明粘型。只有白色半透明粘型的愈伤组织能分化并产生子叶前期胚，但未能诱导出子叶胚和成熟胚。Berlyn同时还获得了两种源自成熟胚的愈伤组织，分别为致密绿色型和半透明白色型，只有半透明白色型的愈伤组织产生了体细胞胚；他们发现胚性胚柄细胞团产生于成熟胚外植体的基端，且在四种不同基本培养基上分别获得了1.5％～7％不等的胚性胚柄细胞团诱导率。由于以上胚性胚柄细胞团诱导率都比较低，他们没能获得土壤条件下的完整再生植株。对于优良无性系的开发和其在无性系造林中进一步应用，体细胞胚的诱导率、成熟率及萌发率都显得尤为重要。

在中国，李映红和郭仲琛等先后从青扦和落叶松的未成熟合子胚培养中获得了体细胞胚的再生植株；黄健秋和卫志明以马尾松和云南松的成熟合子胚为起始材料成功诱导体细胞胚；此外，何子灿等以金钱松成熟合子胚为材料也成功实现了体细胞胚胎发生；唐巍等以火炬松的成熟合子胚为外植体，建立了火炬松的体细胞胚胎发生植株再生体系；齐力旺等以华北落叶松幼嫩合子胚为材料成功实现体细胞胚胎发生，并探讨了不同类型胚性和非胚性细胞的生理生化差异，为针叶树体细胞胚胎发生的生理生化研究提供了一定的科学依据；席梦利等以杉木合子胚的下胚轴和子叶为起始材料成功诱导出了子叶期体细胞胚；张宇等开展了马尾松体细胞胚胎发生的相关研究；杨金玲等利用青青杆和白杆的成熟合子胚为起始材料成功实现了体细胞胚胎发生和植株再生。

但目前尚无关于福建柏体细胞胚胎发生和克隆植株再生技术的研究成果报道。

三、发明内容

本发明的目的是在传统的福建柏第一代遗传改良的基础上选择优良的基因型材料，研究寻找福建柏体细胞胚胎发生和克隆植株的再生技术，快速生产出高质量的苗木，投放市场以供给社会各界对福建柏的需要，填补在这一领域的研究空白。

本发明的技术解决方案为：一种福建柏体细胞胚胎发生和克隆植株再生技术，其特征是采用未成熟合子胚诱导出胚性胚柄细胞团，经过维持、增殖、预成熟和成熟阶段诱导获得体细胞胚，再经萌发培养实现植株再生，其各阶段使用的培养基和培养条件如下：

a.采用福建柏未成熟合子胚进行胚性胚柄细胞团诱导，胚性胚柄细胞团诱导采用DCR基本培养基，附加植物生长物质是2，4-D 1-4mg/L、6-BA0.5mg/L及KT 0.5mg/L；

b.采用DCR固体培养基进行胚性胚柄细胞团的维持，采用DCR液体培养基进行胚性胚柄细胞团的增殖，维持和增殖所采用的基本培养基均为DCR基本培养基，其中固体维持培养基附加2，4-D 0.2mg/L，6-BA0.05mg/L及KT 0.05mg/L；液体悬浮增殖培养基附加2，4-D 0.5mg/L，6-BA 0.1mg/L及KT 0.1mg/L；其中培养物细胞初始密度为0.10％-1.20％，摇床转速为75-90r.p.m，继代周期为7天；

c.采用DCR液体培养基进行体细胞胚的预成熟，附加的植物生长物质是ABA 5～10mg/L，其中培养物细胞初始密度为0.80％，摇床转速为90r.p.m，继代周期为7天；

d.采用DCR固体培养基进行体细胞胚的成熟，附加植物生长物质ABA5～10mg/L、渗透压调节剂聚乙二醇(PEG8000)130-170g/L；

e.采用DCR基本培养基进行体细胞胚的萌发，附加活性炭1g/L；

f.采用固体改良DCR基本培养基进行再生植株的壮苗，蔗糖浓度降至20g/L。

以上培养过程中使用的两种基本培养基的配方分别如下：

DCR(Gupta and Durzan medium)基本培养基

           大量元素

KNO₃               340mg/l

Ca(NO₃)₂·4H₂O     556mg/l

NH₄NO₃             400mg/l

KH₂PO₄             170mg/l

CaCl₂·2H₂O        85mg/l

MgSO₄·7H₂O        370mg/l

          铁盐

Na₂-EDTA·H₂O      37.3mg/l

FeSO₄·7H₂O        27.8mg/l

          微量元素

H₃BO₃            6.2mg/l

MnSO₄·H₂O       22.3mg/l

ZnSO₄·7H₂O      8.6mg/l

Na₂MoO₄·2H₂O    0.25mg/l

CuSO₄·5H₂O      0.25mg/l

KI               0.83mg/l

CoCl₂            0.025mg/l

NiCl₂            0.025mg/l

        有机物质

MyO-Inositol     200mg/l

Glycine          2.0mg/l

Thiamine·HCl    1.0mg/l

Nictinic·acid   0.5mg/l

Pyridoxine·HCl  0.5mg/l

        改良DCR基本培养基

        大量元素

KNO₃              170mg/l

Ca(NO₃)₂·4H₂O    278mg/l

NH₄NO₃            200mg/l

KH₂PO₄            85mg/l

CaCl₂·2H₂O       42.5mg/l

MgSO₄·7H₂O       185mg/l

        铁盐

Na₂-EDTA·H₂O      37.3mg/l

FeSO₄·7H₂O        27.8mg/l

        微量元素

H₃BO₃             6.2mg/l

MnSO₄·H₂O        22.3mg/l

ZnSO₄·7H₂O       8.6mg/l

Na₂MoO₄·2H₂O     0.25mg/l

CuSO₄·5H₂O       0.25mg/l

KI                0.83mg/l

CoCl₂             0.025mg/l

NiCl₂             0.025mg/l

有机物质

MyO-Inositol      200mg/l

Glycine           2.0mg/l

Thiamine·HCl     1.0mg/l

Nictinic·acid    0.5mg/l

Pyridoxine·HCl   0.5mg/l

四、附图说明

图1为诱导完成后的胚性胚柄细胞团的显微照片；

图2为诱导完成后的胚性胚柄细胞的显微照片；

图3为维持和增殖培养后的早期体细胞胚显微照片；

图4为预成熟培养后的早期体细胞胚显微照片；

图5为处于成熟过程中的体细胞胚；

图6为子叶期体细胞胚；

图7为体细胞胚的萌发状态；

图8为移栽后的再生植株。

五、具体实施方式

供试材料为福建柏优良个体不同发育程度的合子胚。球果采集时间为6月底至10月初，相应合子胚发育阶段为幼胚至成熟胚阶段。球果采集后用新鲜菜瓜叶、湿润纱布和牛皮纸信封及时包裹保鲜，随后置于4℃冰箱冷藏保存备用。

将备用球果取出，用含洗涤剂的洗液浸泡10分钟，然后流水冲洗2小时。在超净工作台上用解剖刀将球果切开，用镊子取出带翅种子，去除种翅。用解剖刀和镊子将种皮和胚乳剥去，于75％酒精中浸泡45秒，无菌水冲洗3遍，0.1％升汞+稀释10倍的84消毒液(1∶1)消毒5分钟，无菌水冲洗5遍，将合子胚置于无菌滤纸上吸干，随后接种于诱导培养基。

a.胚性胚柄细胞团诱导阶段采用DCR基本培养基，附加的植物生长物质种类及浓度分别为2，4-D 0、1、2、4、7、10mg/L，6-BA 0、0.5、1、2mg/L，KT0、0.5、1、2mg/L，ZT 0.1、0.2、0.4mg/L。同时附加活性炭浓度为0、0.5、1、2g/L。其中培养基的麦芽糖浓度为30g/L，琼脂5.4g/L，灭菌前将其pH调至5.7，于121℃高温、高压灭菌16分钟。培养温度为23℃，培养条件为暗培养。产生的胚性胚柄细胞团每2周继代一次。

材料接入诱导培养基后约2周开始启动，合子胚基部长出白色、半透明、有粘性的丝状愈伤，即胚性胚柄细胞团(参见附图1)。在显微镜下观察，胚性胚柄细胞团由大量胚性胚柄细胞组成。其中细胞质浓厚的小细胞构成胚头部分，具有大液泡的长细胞形成胚柄部分，两者相互连接构成胚性胚柄细胞(参见附图2)。在诱导培养基上，随着培养时间的延长，部分胚性培养物开始变褐，0.5～1g/L活性炭、5mg/L的抗坏血酸或将培养物及时转接至新鲜培养基均能抑制褐化的产生。

实验表明，添加不同浓度的2，4-D均能诱导胚性胚柄细胞，但在诱导率、诱导物的外观状态和生长状态等方面均存在差异，具体表现参见表1。

表1不同2，4-D浓度对福建柏胚性胚柄细胞团诱导的影响

2，4-D浓度过高，细胞团排列不紧密，含水量较重；2，4-D浓度过低，细胞团粘性较差，含水少，生长缓慢。综合诱导率和所获得细胞团的外观状态考虑，1-4mg/L较适合福建柏未成熟合子胚胚性胚柄细胞团的诱导。

比较了细胞分裂素种类及其浓度、不同碳源种类及其浓度、活性炭浓度以及合子胚成熟程度对胚性胚柄细胞团的影响。结果表明，0.5mg/L 6-BA和0.5mg/LKT的组合使用、30g/L麦芽糖及1g/L活性炭较适合福建柏胚性胚柄细胞团的诱导。处于裂生多胚期至子叶胚前期的合子胚较适合胚性胚柄细胞团的诱导。此外，源自不同优树的合子胚在诱导率上也存在一定的差异。

b.胚性胚柄细胞团的维持和增殖

大量研究表明，在木本植物体细胞胚胎发生过程中，在诱导初始阶段需要高浓度的植物生长物质，随后诱导物的维持和增殖则需要降低其浓度。胚性培养物长期处于高浓度植物生长物质环境将导致畸形胚比例的增加甚至是体细胞胚发生能力的下降。此外，相较于固体培养，胚性培养物的液体悬浮培养过程涉及的影响因素更多，如培养物初始密度、摇床转速、继代周期等，在评价液体悬浮培养的效率时需要将各因素综合考虑。

本实施例中，福建柏胚性胚柄细胞团的维持和增殖继续使用DCR作为基本培养基，同时附加低浓度的生长素和细胞分裂素。在固体DCR培养基上，用于胚性培养物维持和增殖的培养基中植物生长物质供试浓度分别为2，4-D 0.2、0.5、1.0、2.0mg/L，6-BA 0.05、0.1、0.2mg/L，ZT 0.1、0.2mg/L。综合胚性胚柄细胞团增殖系数和和形态发育等方面综合考虑，在固体DCR培养基上，适合于福建柏胚性胚柄细胞团维持的植物生长物质浓度组合为2，4-D 0.2mg/L、6-BA0.05mg/L、KT 0.05mg/L；适合于增殖的植物生长物质浓度为2，4-D 0.5mg/L、6-BA 0.1mg/L、KT 0.1mg/L。

研究证明，在针叶树体细胞胚胎发生过程中，液体悬浮培养有利于胚性胚柄细胞团的增殖和单个体细胞胚向成熟方向发育。在本实施例中，将一定量维持于固体DCR培养基的胚性胚柄细胞团接种于液体悬浮培养基中，置于摇床上进行振荡培养。在胚性胚柄细胞团的液体DCR培养基中，除不含凝固剂外，其余培养基成分与增殖用固体DCR培养基相同，其中培养物供试初始密度为0.10％、0.40％、0.80％和1.20％(w/v)，摇床转速为60、75、90和105r.p.m，继代周期均为7天。综合培养物增殖系数和单个体细胞胚形态发育程度考虑，75-90r.p.m的转速条件更适合于福建柏体细胞胚的发育，而在初始密度方面，四个处理间无明显差异。经过适宜液体悬浮培养后，单个早期体细胞胚的胚头细胞和胚柄细胞数目均明显增加，其中胚头细胞排列紧密，胚柄细胞呈纵向紧密排列(参见附图3)。

c.体细胞胚的预成熟

大量研究表明，液体培养条件下，培养基成分分布均匀，溶氧充足，有利于胚性细胞的分裂和胚性胚柄细胞的增殖；但是，维持和增殖培养基中生长素和细胞分裂素的存在不利于胚性胚柄细胞向单个体细胞胚方向发育。ABA的使用能阻止胚性细胞的无序分裂和增殖，抑制裂生多胚的产生并促进体细胞胚的成熟。经过ABA预成熟培养处理后，能获得胚头发育明显、胚柄细胞呈有序排列的早期体细胞胚结构。

在过程b中，经过液体增殖悬浮培养的胚性培养物由大量大小均一、发育整齐早期体下拨胚组成。此时经液体悬浮液静置后，去除上清，将一定量沉淀转入分别含ABA 5、10、15和20mg/L的预成熟用液体DCR培养基，置于90r.p.m摇床上进行振荡培养。经验证，在同等条件下，5-10mg/L的ABA有利于单个体细胞胚发育，同时单位体积获得的早期体细胞胚数也较多。本实施例中其它培养条件为初始密度0.80％、继代周期7天。

经过本实施例的预成熟培养后，早期体细胞胚的胚头和胚柄部分细胞数目增殖明显，胚头细胞排列紧密，且纵向和横向方向均发育明显；胚柄细胞在纵向上呈平行排列(参见附图4)。

d.体细胞胚的成熟

针叶树体细胞胚的成熟即是在合适的人工培养条件下，早期体细胞胚经过形态成熟和生理成熟，最终达到与成熟合子胚一样具有形态发生能力并产生再生植株的过程。在整个成熟过程中，影响早期体细胞胚成熟的因素主要来自两个方面，即早期体细胞胚自身和培养基及培养环境。其中早期体细胞胚自身主要涉及胚性胚柄细胞团的前期发育，它主要与诱导、维持和增殖阶段的相关因素有关；而与体细胞胚成熟有关的培养基及培养环境因素主要包括ABA水平的优化、培养基渗透压的调节、乙烯水平的控制以及干化处理，此外还有培养基pH值和光周期等都可能对体细胞胚的成熟有影响。

在本实施例中，将经过预成熟培养获得早期体细胞胚转入不同体细胞胚成熟培养基，其中成熟培养基均以DCR为基本培养基，采用固体形式。大量针对针叶树合子胚发育和体细胞胚成熟的研究表明，针叶树体细胞胚的成熟过程需要经历与合子胚发育类似的环境，即需要高渗透压环境和一定浓度ABA的存在。在本实施例中，用于福建柏体细胞胚成熟的PEG浓度为50、90、130、170和210g/L，供试ABA浓度范围为2.5、5、10和20mg/L，同时附加1.0g/L的活性炭。在成熟培养基上培养8周后，单个体细胞胚胚头部分发育明显，胚柄部分纵向排列紧密，最终发育为胚和胚柄相连接的结构(参见附图5、6)。

不同浓度的PEG和ABA对体细胞胚发育状况、单位体积体细胞胚数等的影响参见表2和表3：

表2不同PEG浓度对福建柏体细胞胚成熟的影响

表3ABA浓度对福建柏体细胞胚成熟的影响

综合体细胞胚发育状况、单位体积体细胞胚数等因素考虑，130-170g/L PEG和5-10mg/L ABA有利于福建柏体细胞胚的成熟。

在筛选合适PEG浓度和ABA浓度的同时还比较了不同凝固剂或液体吸附体(凝固剂替代物)对福建柏体细胞胚成熟的影响。结果表明，水晶洋菜较琼脂、岩棉和脱脂棉(作为培养基吸附体)更适合体细胞胚的成熟。此外，在培养物于成熟培养基上培养4周后，将其转接至不含ABA的相同成熟培养基上有利于体细胞胚的正常发育；1g/L的活性炭有利于降低畸形体细胞胚的频率。

e.体细胞胚的萌发及植株再生

与合子胚发育过程类似，体细胞胚在经过形态成熟和生理成熟过程后，形成具备胚根、胚轴和子叶的完整胚结构。在合适的培养条件下，此阶段的胚具有萌发并最终产生完整植株的形态发生能力。

在本实施例中，培养于成熟培养基上的福建柏体细胞胚经过形态成熟和生理成熟后形成长约1mm、具2片子叶的完整胚结构。将成熟体细胞胚转移至以DCR为基本培养基的萌发培养基，以水晶洋菜为凝固剂，附加1g/L活性炭和30g/L蔗糖。培养环境为25℃、2000lx及16/8小时的光/暗培养。培养5天左右，体细胞胚的子叶端开始逐渐变绿，同时胚根端逐渐延长(参见附图7)。培养2周左右，体细胞胚萌发、生长最终形成具备茎端和根端的完整植株。培养4周后统计，福建柏正常萌发并产生再生植株的比例达76％。

此外，以改良DCR为基本培养基和降低蔗糖浓度能在一定程度上提高福建柏体细胞胚正常萌发产生再生植株的频率。

值得注意的是，由于体细胞胚胎发生具有两极性的特点，能同时形成芽和根，形成完整的幼苗，很好地解决了组织培养中生根难的问题。

f.再生植株的壮苗、驯化及移栽

待萌发培养基上的体细胞胚再生植株生长至长约1.5cm、胚根明显延长、两片子叶变绿并明显张开后，将其转移至仅含20g/L蔗糖的改良DCR基本培养基，培养条件同萌发阶段，使再生植株达到壮苗目的。体细胞胚胎发生中的难题之一便是较难形成发达的根系，解决的办法是提供低渗培养环境，如降低蔗糖浓度和无机盐浓度，抑制主根过度延长，必要时可加入0.1mg/L的IBA，这样可以诱导根系发达的须根系统。在本实施例中，改良DCR培养基较正常DCR培养基的大量元素减半，其余培养基成分不变，在添加20g/L蔗糖的情况下，培养45天后能形成茎叶生长正常、具2-3条根的健壮植株。

本发明采取体胚出苗后苗木发育阶段控制和生理胁迫相结合的方法，使移苗成活率达到90以上。待经过壮苗培养的体细胞胚再生植株长至2-3cm高、且根叶发达时，将瓶苗转移至驯化环境，在3天的驯化时间内将封口膜逐渐揭开，使幼苗逐渐适应空气湿度。将经过驯化后的幼苗洗去根部培养基，移至由珍珠岩和泥炭土构成(2∶1)的基质中(参见附图8)。在移苗后2周内注意保持温度、空气湿度以及土壤湿度的稳定。移苗后1周开始开始叶面施肥，成活后便可以根部施肥。移栽4周后统计，移栽成活率达82％。

采用本发明所提供的福建柏体细胞胚胎发生成套技术方法进行福建柏大量繁殖的开发，是一种很高效的途径，一旦得到胚性胚柄细胞团后，可以在对特定细胞系进行维持和增殖的同时，利用该技术体系获得大量遗传基础一致的无性系再生植株，形成一个良好的生产循环体系。福建柏体细胞胚胎发生系统的建立为福建柏珍稀遗传资源的保存和福建柏苗木的大量生产提供一个周期短、繁殖效率高、成本低廉的技术体系。

Claims (1)

1.一种福建柏体细胞胚胎发生和克隆植株再生方法，其特征是采用未成熟合子胚诱导出胚性胚柄细胞团，经过维持、增殖、预成熟和成熟阶段诱导获得体细胞胚，再经萌发培养实现植株再生，其各阶段使用的培养基和培养条件如下：

a.采用福建柏未成熟合子胚进行胚性胚柄细胞团诱导，胚性胚柄细胞团诱导采用DCR基本培养基，附加植物生长物质是2，4-D 1-4mg/L、6-BA0.5mg/L及KT 0.5mg/L；

b.采用固体DCR培养基进行胚性胚柄细胞团的维持，采用液体DCR培养基进行胚性胚柄细胞团的增殖，维持和增殖所采用的基本培养基均为DCR基本培养基，其中维持用固体DCR培养基附加2，4-D 0.2mg/L，6-BA 0.05mg/L及KT 0.05mg/L；增殖用液体DCR培养基附加2，4-D0.5mg/L，6-BA 0.1mg/L及KT 0.1mg/L；其中培养物细胞初始密度为0.10％-1.20％，摇床转速为75-90r.p.m，继代周期为7天；

c.采用液体DCR培养基进行体细胞胚的预成熟，附加的植物生长物质是ABA 5～10mg/L，其中培养物细胞初始密度为0.80％，摇床转速为90r.p.m，继代周期为7天；

d.采用固体DCR培养基进行体细胞胚的成熟，附加植物生长物质ABA5～10mg/L、渗透压调节剂聚乙二醇130-170g/L；

e.采用DCR基本培养基进行体细胞胚的萌发，附加活性炭1g/L；

f.采用固体改良DCR基本培养基进行再生植株的壮苗，蔗糖浓度降至20g/L。

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